DE3850379T2

DE3850379T2 - Wasser-unlösliches Reagenz, dieses enthaltende Elemente und Verwendungsverfahren.

Info

Publication number: DE3850379T2
Application number: DE19883850379
Authority: DE
Inventors: Susan Jean Danielson; Richard Calvin Sutton
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-08-03
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2008-08-04
Also published as: EP0323692B1; DE3850379D1; EP0323692A3; EP0323692A2; JPH0795065B2; CA1300499C; JPS6454259A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in Wasser unlösliches Reagens, das sich für verschiedene immunologische Verfahren eignet. Ferner betrifft die Erfindung Elemente, die das Reagens enthalten, sowie immunologische Verfahren, die die Elemente verwenden.
Immunoassays, die Vorteile aus natürlichen immunologischen Reaktionen ziehen, haben eine weit verbreitete Anwendung als analytische Techniken in der klinischen Chemie gefunden. Aufgrund der Spezifizität der Reaktionen eignen sie sich in besonders vorteilhafter Weise für die quantitative Bestimmung von biologischen Analyten, die in sehr geringen Konzentrationen vorliegen und nicht in adäquater Weise durch chemische Techniken quantitativ bestimmt werden können. Zu derartigen Analyten (im folgenden als Liganden bezeichnet) gehören beispielsweise therapeutische Arzneimittel, Narkotika, Antibiotika, Hormone, Proteine und andere dem Fachmann bekannte Stoffe. Man hat sich verschiedene Techniken ausgedacht, um sehr niedrige Konzentrationen von Liganden zu bestimmen. Beispielsweise kann ein Ligand durch verschiedene Maßnahmen markiert werden, um ihn leicht bestimmbar zu machen. Im Falle von Kompetitions-Bindungs-Assays wird ein markiertes Ligandenanalog (im folgenden hier als Ligandenanalog bezeichnet) in Kompetition mit einem nicht markierten Liganden gesetzt, und zwar im Falle einer Reaktion mit einer festen Menge des geeigneten Bindungsmaterials (auch als Rezeptor bezeichnet). Unbekannte Konzentrationen des Liganden lassen sich aus dem gemessenen Signal von entweder dem gebundenen oder ungebundenen (d. h. freien) Ligandenanalog messen.
Die Empfindlichkeit ist von primärer Bedeutung aufgrund der extrem niedrigen Mengen an Liganden, die zu bestimmen sind. Obgleich eine Vielzahl von Markierungen verwendet werden kann, haben sich im allgemeinen doch fluoreszierende Markierungen oder Enzymmarkierungen im Falle der meisten Immunoassays als vorteilhaft erwiesen, aufgrund der erhöhten Empfindlichkeit.
Immunoassays können ferner in entweder heterogene oder homogene Immunoassays klassifiziert werden. Heterogene kompetitive Bindungs-Immunoassays erfordern eine Trennung von gebundenem Ligandenanalog von freiem Ligandenanalog. Diese Trennung ist erforderlich, da die Eigenschaften von gebundenem und freiem Analog nicht wesentlich voneinander verschieden sind. Homogene Immunoassays erfordern keine Trennungsstufe, da die Eigenschaften des gebundenen und des freien Analogs ausreichend voneinander verschieden sind, so daß sie leicht unterschieden werden können.
Biologisch aktive Polypeptide oder Proteine, die an unlösliche Trägermaterialien gebunden werden, beispielsweise polymere Teilchen, wurden in einer Vielzahl von Methoden im Rahmen von Immunoassays verwendet. Beispielsweise wird die Diagnose von pathologischen oder anderen Bedingungen beim Menschen und Tier oftmals unter Verwendung von immunologischen Prinzipien für die Bestimmung einer immunologisch reaktiven Spezies durchgeführt, beispielsweise im Falle von Antikörpern oder Antigenen in den Körperflüssigkeiten des Menschen oder Tieres. Ein Antigen ist im allgemeinen bekannt als eine Fremdsubstanz, wie beispielsweise eine Arzneimittel, Hapten, Toxin, Lektin, Glycoprotein, Polysaccharid, Glycolipid, Polypeptid oder Protein, das, wenn es in den Körper eingeführt worden ist, zur Erzeugung von bestimmten Proteinen führt, die als Antikörper bekannt sind.
Andere Proteine, wie zum Beispiel Enzyme, sind kovalent an verschiedene Trägermaterialien gebunden worden, zur Verwendung im Falle der Affinitäts-Chromatographie, im Falle enzymatischer Reaktionen, spezifischer Bindungsreaktionen sowie Immunoassays. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Erythrocyten des Schafes und des Menschen, bakterielle Zellen, Latexteilchen, harzartige Teilchen und fein verteilte diazotierte Aminocellulose. Beispielsweise sind Trägerteilchen bekannt, die hergestellt werden aus wenig wasserlöslichen Monomeren (wie beispielsweise Epoxygruppen enthaltenden Monomeren) in Abwesenheit von Emulgatoren.
Ferner wurden carboxylierte Latexteilchen zur Herstellung von diagnostischen Reagentien verwendet. Das übliche Verfahren der kovalenten Bindung einer immunologisch reaktiven Spezies an die Teilchen mit Carboxylgruppen an der Oberfläche schließt die Verwendung eines in Wasser löslichen Carbodiimides in einer zusätzlichen Aktivierungsstufe ein. Obgleich hierdurch geeignete Reagentien erzeugt werden, neigt dieses Verfahren doch dazu, die exponierten reaktiven Gruppen der reaktiven Spezies wie auch die Carboxylgruppen zu aktivieren. Das Ergebnis ist eine intramolekulare und intermolekulare Quervernetzung oder Polymerisation der immunologisch reaktiven Spezies und ein beträchtlicher Anteil der Spezies wird somit an einer Komplexbildung mit einem Rezeptormolekül gehindert. Da die reaktive Spezies, beispielsweise ein Antikörper, gewöhnlich sehr kostspielig ist, verursacht dieses Problem einen schwerwiegenden ökonomischen Verlust. Weiterhin kann die Empfindlichkeit des resultierenden Reagens beeinträchtigt werden. Es ist ferner offensichtlich, daß Carbodiimide ein reaktives Zwischenprodukt für die Proteinbindung bilden, das instabil ist und unmittelbar verwendet werden muß. Dies kann ein schwerwiegender Nachteil der Carbodiimidchemie sein.
Es sind verschiedene andere Reagentien hergestellt worden mit Teilchen mit reaktiven Gruppen, wie beispielsweise Epoxid-, Aldehyd-, Chloromethyl-, Amingruppen und Diazoniumsalze. Sämtliche dieser Gruppen haben ihre Nachteile. Beispielsweise sind Epoxidgruppen nicht stabil, so daß die Teilchen nicht über längere Zeiträume hinweg aufbewahrt werden können. Teilchen mit Aldehydgruppen neigen im allgemeinen zu einer vorzeitigen Agglutination. Teilchen mit Aminogruppen verhalten sich wie die carboxylierten Materialien, indem sie eine zusätzliche Aktivierungsstufe erfordern. Diazoniumverbindungen sind instabil, weshalb es nicht leicht ist, mit ihnen zu arbeiten.
Die U.S.-Patentschriften 4 283 382 und 4 259 313 beschreiben immunoreaktive Reagentien mit Europiumchelat-Tracer-Materialien innerhalb der Teilchen. Einige der Reagentien werden hergestellt aus Polymeren mit reaktiven Chloromethylgruppen. Obgleich solche Materialien einige Vorteile bieten, erfordert die Bindung der immunologischen Spezies an solche Polymere die Anwendung erhöhter Temperaturen, ausgedehnter Reaktionszeiten und akuter Mischbedingungen. Sind die Bindungsbedingungen nicht genau richtig, so ist die Bindung unvollständig, was zu einem Reagens mit schlechter Empfindlichkeit führt.
Reagentien aus einem Protein, das an ein in Wasser unlösliches Teilchen gebunden ist, sind sehr geeignet im Falle einer Anzahl von Methoden, einschließlich von Immunoassays, diagnostischen Methoden und dergleichen. Es wäre außerordentlich nützlich, wenn hoch sensitive Reagentien leicht in effektiver Weise und unter Bedingungen hergestellt werden könnten, die nicht begrenzend sind und die die Empfindlichkeit nicht reduzieren oder andere unerwünschte Ergebnisse erzeugen.
Die oben festgestellten Probleme im Falle bekannter Reagentien werden mit einem von einem oberflächenaktiven Mittel freien Reagens überwunden, das aufgebaut ist aus:
(a) einem polymeren Teilchen, das von einem oberflächenaktiven Mittel frei ist und das kovalent über ab stehende reaktive Gruppen gebunden ist an
(b) eine immunologische Spezies, die dazu geeignet ist, an einer immunologischen Reaktion mit einem entsprechenden Rezeptor teilzunehmen,
wobei das Reagens dadurch gekennzeichnet ist, daß sich das Polymer von mindestens einem α,β-ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet mit entweder abstehenden aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen,
wobei das innere des Teilchens frei von einem ermittelbaren Tracer-Material ist und das Polymerteilchen hergestellt worden ist durch Emulsionspolymerisation in Abwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels oder eines Emulgiermittels.
Ein Element umfaßt ein absorbierendes Trägermaterial mit einer oder mehreren Zonen, wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß es in einer oder in mehreren der Zonen ein Reagens wie oben beschrieben enthält.
Weiterhin umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit:
A. Das Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einem Reagens wie oben beschrieben in Gegenwart eines Analog des Liganden,
unter Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen der immunologischen Spezies und sowohl dem immunologischen Liganden als auch dem Ligandenanalog, und
B. die Bestimmung des immunologischen Komplexes als Anzeichen des Vorhandenseins des Liganden in der Flüssigkeit.
Ein Agglutinationsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit umfaßt:
A. Ein Kontaktieren des Liganden mit einem Reagens wie oben beschrieben,
unter Bildung eines Agglutinates des Reaktionsproduktes des Liganden und der immunologischen Spezies,
B. eine Trennung des Agglutinates von nicht agglutinierten Materialien, und
C. die Bestimmung des Agglutinates als ein Anzeichen des Vorhandenseins von Liganden in der Flüssigkeit.
Ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit umfaßt:
A. Ein Kontaktieren der Flüssigkeit mit einem Reagens wie oben beschrieben,
unter Bildung eines unlöslichen immunologischen Komplexes zwischen der immunologischen Spezies und dem Liganden,
B. ein Kontaktieren des Liganden vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe A, mit einer zweiten immunologischen Spezies, die immunologisch reaktiv ist mit dem Liganden, die jedoch nicht immunologisch reaktiv ist mit der ersten immunologischen Spezies, wobei die zweite Spezies mit einem bestimmbaren Tracer-Material markiert ist,
unter Bildung eines markierten unlöslichen Komplexes, und
C. Bestimmung des markierten unlöslichen Komplexes als Anzeichen des Vorhandenseins des Liganden in der Flüssigkeit.
Die vorliegende Erfindung liefert hoch empfindliche Reagentien, die in einer großen Vielzahl von immunologischen Techniken angewandt werden können. Die Polymerteilchen, die dazu verwendet werden, um die Reagentien herzustellen, weisen leicht zugängliche funktionelle Gruppen auf, die leicht mit Proteinen reagieren, mit Kohlehydraten und anderen biologischen Verbindungen, die freie reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppen aufweisen.
Die Reaktion zwischen den funktionellen Gruppen und den Proteinen oder biologischen Verbindungen kann leicht durchgeführt werden unter milden pH-Bedingungen, niedrigen Temperaturen und die Agglutination, die Sensibilisierung und Instabilität von bekannten Reagentien kann vermieden werden. Die Bedingungen der Bindung sind nicht so kritisch, d. h. es können niedrigere Temperaturen, kürzere Zeiten und flexiblere Mischungsbedingungen angewandt werden, ohne die Empfindlichkeit zu schädigen.
Diese Vorteile werden im Falle der vorliegenden Erfindung erzielt, indem die polymeren Teilchen hergestellt werden aus ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren mit abstehenden reaktiven, aktivierten, 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen. Diese Gruppen bleiben auch nach der Polymerisation für Reaktionen vorhanden und ermöglichen eine wirksame Bindung von immunologischen Spezies mit reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppen.
Das Reagens der vorliegenden Erfindung kann in vielen verschiedenen Immunoassays eingesetzt werden, bei denen der Analyt (d. h. der Ligand) eine immunologisch reaktive Spezies ist, die eine spezifische Bindungsaffinität für die immunologische Spezies des Reagenses aufweist.
Das Reagens weist eine immunologische Spezies auf, die an das Polymerteilchen gebunden ist. Diese Spezies ist eine Komponente von physiologischen Flüssigkeiten, Zellen und Gewebeextrakten oder einer chemischen Verbindung, die mindestens eine reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppe aufweist und dazu befähigt ist, an einer immunologischen Reaktion mit einer entsprechenden Rezeptorverbindung teilzunehmen (einer natürlichen oder synthetischen Verbindung), bei der es sich um eine chemische oder biologische Verbindung handelt, die reaktive Zentren aufweist für eine immunologische Reaktion mit der immunologischen Spezies. Unter einer immunologischen Spezies ist zu verstehen entweder:
(1) eine beliebige Substanz, die, wenn sie einem immunokompententen Wirt präsentiert wird, zur Bildung eines spezifischen Antikörpers führt, der eine Bindung mit der Substanz einzugehen vermag, oder (2) der auf diese Weise erzeugte Antikörper, welche Spezies an der Antigen-Antikörper-Reaktion bei Verwendung derselben teilnimmt.
Zu repräsentativen immunologischen Spezies gehören primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Sterine, Steroide, Lipide, Nucleinsäuren, Hormone, Vitamine, Polysaccharide, Kohlehydrate) Glycolipide, Alkaloide, Organismen (Bakterien, Protozoen, Fungi, Viren, Retroviren, Rickettsia und dergleichen) sowie Komponenten hiervon, Blutsubstanzen, Gewebe sowie Organantigene und andere Materialien, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. U.S.-Patentschrift 4 181 636). In manchen Fällen ist die immunologische Spezies ein Antikörper, der gegen ein Hapten, ein Arzneimittel, Hormon, Antibiotikum oder antigenes Material gerichtet ist, wie beispielsweise ein Protein, ein Kohlehydrat, Polypeptid, Glycoprotein, Polysaccharid, Glycolipid und dergleichen (zum Beispiel aus einem Organismus, wie zum Beispiel einem Virus, chlamydialen, gonokokkalen, streptokokkalen oder ähnlichen Organismen). Alternativ kann die immunologische Spezies ein Antigen von bestimmten Typen sein (d. h. einen Polypeptid, Kohlehydrat oder einem proteinartigen Material), das mit einem Antikörper immunologisch reaktiv ist. Im Falle weiterer anderer Ausführungsformen ist die immunologische Spezies ein Antikörper, der gegen einen anderen Antikörper gerichtet ist (d. h. ein Anti-Antikörper). Es können sowohl monoklonale wie auch polyklonale Antikörper verwendet werden und sie können ganze Moleküle darstellen oder verschiedene Fragmente hiervon, solange sie mindestens eine reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppe aufweisen, die mit den abstehenden reaktiven Gruppen der polymeren Teilchen umgesetzt werden kann.
Das in Wasser unlösliche Reagens der vorliegenden Erfindung wird hergestellt durch Bindung der oben beschriebenen immunologischen Spezies an ein in Wasser unlösliches polymeres Teilchen von spezieller Zusammensetzung. Diese Teilchen werden hergestellt aus den oben beschriebenen α,β-ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren derart, daß abstehende (d. h. freie und zu einer Reaktion befähigte) aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen an der Oberfläche der Teilchen vorliegen. Im Falle einiger Ausführungsformen kann das gesamte Teilchen aus dem gleichen Polymer aufgebaut sein. Das heißt, diese Teilchen sind homogen. Im Falle anderer Ausführungsformen jedoch können die Teilchen aus solchen bestehen, die gemäß dem Stande der Technik bekannt sind als Polymerteilchen mit einem Kern und einer Hülle, wobei der Kern aus einem ersten Polymer aufgebaut ist und die Hülle aus einem zweiten Polymer, wie es beschrieben wird in der U.S.-Patentschrift 4 401 765. Im Falle dieser Ausführungsform ist die Zusammensetzung des Kernes nicht kritisch, doch muß die Hülle aufgebaut sein aus den hier beschriebenen Monomeren mit den erforderlichen abstehenden reaktiven Gruppen. Im Falle anderer Ausführungsformen kann das Teilchen aufgebaut sein aus einem ersten Polymer, auf das ein zweites Polymer aufgepfropft ist, das die erforderlichen abstehenden reaktiven Gruppen aufweist (vgl. U.S.- Patentschrift 3 700 609).
Die polymeren Teilchen sind im allgemeinen in Wasser unlösliche Latexteilchen mit einer Teilchengröße von größer als 0,01 Mikrometern,vorzugsweise einer Größe im Bereich von 0,01 bis 5 Mikrometern und in besonders vorteilhafter Weise mit einer Größe von 0,3 bis 3 Mikrometern.
Wie oben beschrieben, sind die polymeren Teilchen, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, aufgebaut aus einem Polymeren, das sich von mindestens einem α,β-ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableitet, mit entweder abstehenden aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen. Eine Anzahl von repräsentativen Monomeren mit den erforderlichen abstehenden Gruppen sind bekannt, einschließlich aus den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870.
Speziell geeignete Polymere sind solche, die durch die folgende Formel wiedergegeben werden:
worin A für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder mehreren hydrophoben, ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten. Derartige Monomere sind in Wasser unlöslich. Zu repräsentativen hydrophoben Monomeren gehören, wobei diese nicht auf die folgende Aufzählung beschränkt sind, Styrol und Styrolderivate (zum Beispiel Vinyltoluol, 2,5-Dimethylstyrol, 4-t- Butylstyrol und 2-Chlorostyrol), Acrylsäure- und Methacrylsäureester (zum Beispiel n-Butylacrylat, Propylmethacrylat, Methylacrylat, Ethylmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat und Methylmethacrylat) sowie Vinylacetat.
Das für diese Erfindung geeignete Polymer kann, falls erforderlich oder erwünscht, quervernetzt werden, und zwar in beliebiger geeigneter Weise. Ein Verfahren besteht darin, eine kleine Menge, d. h. bis zu 15 Mol-%, und vorzugsweise 0,3 bis 5 Mol-%, eines Monomeren zuzugeben, das zwei oder mehrere ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppen aufweist. Diese Monomeren finden sich unter den hydrophoben Monomeren, aus denen sich A ableitet. Repräsentative Monomere werden beschrieben in der Literaturstelle Research Disclosure, Publikation 19551, Juli, 1980, Seite 304, wobei zu diesen beispielsweise gehören Divinylbenzol, Ethylendimethacrylat, N,N'-Methylenbisacrylamid, 2,2-Dimethyl- 1,3-propylendiacrylat, Allylacrylat, Ethylidyntrimethacrylat und Ethylendiacrylat.
Besonders geeignete Monomere, von denen sich A ableitet, sind Styrol, Vinyltoluol, Ethylendimethacrylat, Butylacrylat, Divinylbenzol, 2-Ethylhexylmethacrylat und Methylmethacrylat.
B steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren α,β-ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die durch die folgende Formel dargestellt werden:
worin bedeuten: R ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl oder Hexyl). Vorzugsweise steht R für Wasserstoff oder Methyl.
R¹ steht für -CH=CHR² oder -CH&sub2;CH&sub2;X, worin X eine abspaltbare Gruppe ist, die durch eine nukleophile Gruppe verdrängt wird oder die in Form von HX eliminiert wird, und zwar durch Behandlung mit einer Base (zum Beispiel Halo, Acetoxy, Alkylsulfonyloxy, wie zum Beispiel Methylsulfonyloxy, Arylsulfonyloxy, wie zum Beispiel p-Tolylsulfonyloxy, Trialkylammonio, wie beispielsweise ein Trimethylammoniumsalz oder Pyridiniosalz). R² steht für ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie für R angegeben), oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe (im allgemeinen mit 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Phenyl, Naphthyl, Xylyl oder Tolyl). Vorzugsweise steht R¹ für -CH&sub2;CH&sub2;X. Diese Gruppe, die eine aktivierte 2-substituierte Ethylgruppe ist, kann substituiert werden durch jede beliebige Gruppe, die die Verdrängung der abspaltenden Gruppe X nicht beeinträchtigt.
L ist eine verbindende Gruppe, die aus einer substituierten oder unsubstituierten Alkylengruppe bestehen kann, mit im allgemeinen 1 bis 20 Atomen, ausgewählt aus Kohlenstoff- und Heteroatomen in der Alkylenkette. Diese Definition einer Alkylengruppe bedeutet, daß hierunter Alkylengruppen fallen, die unterbrochen sind oder abgeschlossen werden durch Oxy, Thio, -NR³- [worin R steht für ein Wasserstoffatom, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Methyl, Chloromethyl oder 2-Hydroxyethyl) oder substiuiertes oder unsubstituiertes Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Phenyl, Naphthyl oder Xylyl)], Ester (-COO-)-,
Amid (-CONH-)-, Urylen
Sulfonyl (-SO&sub2;-)-, Carbonat-, Sulfonamid-, Azo-, Phosphono- oder andere ähnliche Gruppen. Zu repräsentativen Alkylengruppen gehören Methylen-, Ethylen-, Isobutylen-, Hexamethylen-, Carbonyloxyethoxycarbonyl-, Methylenbis(iminocarbonyl)-, Carbonyloxydodecyclencarbonyloxyethylen-, Carbonyliminomethyleniminocarbonyliminoethylen-, Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylen- und andere Gruppen, wie sie beschrieben oder vorgeschlagen werden in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870.
L kann ferner stehen für eine substituierte oder unsubstituierte Arylengruppe mit im allgemeinen 6 bis 12 Kernkohlenstoffatomen. Zu repräsentativen Arylengruppen gehören Phenylen, Tolylen, Naphthylen und andere, die in den oben erwähnten Patentschriften aufgeführt sind. Unter diese Definition von L fallen auch divalente Gruppen, bei denen es sich um Kombinationen aus einer oder mehreren einer jeden der oben angegebenen Alkylen- und Arylengruppen handelt (zum Beispiel Arylenalkylen, Alkylenarylenalkylen und andere vom Fachmann leicht bestimmbare Gruppen). Vorzugsweise steht L für eine substituierte oder unsubstituierte Phenylenalkylengruppe, eine Phenylenalkylengruppe, die substituiert ist durch eine oder mehrere Alkylgruppen (wie für R angegeben), Alkoxygruppen (im allgemeinen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methoxy, Propoxy oder Butoxy) oder Halogruppen, oder Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylen.
Zu repräsentativen Monomeren, aus denen B abgeleitet werden kann, gehören m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol, m & p-[2-(p-Tolylsulfonyloxy)ethylsulfonylmethy]styrol, m & p-Vinylsulfonylmethylstyrol, N-[m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)phenyl]acrylamid und N-[2-(2-Chloroethylsulfonyl)ethylformamidomethy]acrylamid. Das zuerst genannte Monomer ist das bevorzugte Monomer.
D steht für wiederkehrende Einheiten, die sich ableiten von einem oder von mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren, die verschieden sind von jenen, die durch A oder B dargestellt werden. Im allgemeinen haben derartige Monomere ionische oder andere hydrophile Gruppen, die zur Dispersionsstabilität der erhaltenen Teilchen in wäßriger Lösung beitragen. Zu geeigneten ionischen Monomeren gehören, ohne daß die folgende Aufzählung eine Begrenzung darstellt, Natrium-2-acrylamido-2-methylpropansulfonat, Natrium-3-acryloyloxypropansulfonat, Natriumacrylat, Natriummethacrylat und Natriumstyrolsulfonat, wie auch andere bekannte Sulfonate, Sulfate, Carboxylate, ihre Salze oder Anhydride und geeignete nicht ionogene polare Monomere, einschließlich 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, Acrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxypropylmethacrylat, Acrylonitril und N-Isobutoxymethylacrylamid. Bevorzugte Monomere sind Natrium-2-acrylamido- 2-methylpropansulfonat, Natriumacrylat, Natrium-3-acryloyloxypropansulfonat, Natriummethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3- Dihydroxypropylacrylat, Acrylamid, N-Isopropylacrylamid sowie Acrylonitril.
In der oben angegebenen Formel steht x im allgemeinen für 0 bis 99,9 Mol-%, y für 0,1 bis 100 Mol-% und z für 0 bis 20 Mol-%. Bevorzugte Mengen liegen bei 50 bis 99,5 Mol-% für x, bei 0,5 bis 50 Mol-% für y und bei 0 bis 10 Mol-% für z.
Zu repräsentativen Polymeren, aus denen die Teilchen aufgebaut sind, gehören:
Poly[styrol-co-m & p-chloroethylsulfonylmethylstyrol](Molverhältnis 99,5 : 4,5), und
Poly{styrol-co-N-[m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)phenyacrylamid} (Molverhältnis 99,3 : 0,7). Das erste Polymer wird bevorzugt verwendet. Weitere Details bezüglich dieser Polymeren und bezüglich repräsentativer Materialien finden sich in den U.S.-Patentschriften 4 161 407 und 4 548 870.
Die polymeren Teilchen können hergestellt werden unter Anwendung von Emulsionsverfahren (einschließlich chargenweiser, halbkontinuierlicher und kontinuierlicher Verfahrensweise) ohne die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln oder Emulgatoren, wie beispielsweise beschrieben in der U.S.-Patentschrift 4 415 700 und in der Literaturstelle Research Disclosure, Publikation 15963 (Juli 1977).
Das allgemeine Verfahren zur Herstellung des Reagens dieser Erfindung durch kovalente Bindung der immunologischen Spezies an die von oberflächenaktiven Mitteln freien Teilchen verläuft wie folgt:
Die Polymerteilchen werden mit der immunologischen Spezies in einer wäßrigen, abgepufferten Lösung (pH-Wert im allgemeinen von 7 bis 10) und bei einer Konzentration der Polymerteilchen von 0,01 bis 40 Gew.-% (vorzugsweise von 0,01 bis 10 Gew.-%) vermischt. Die Menge an immunologischer Spezies liegt in einem Verhältnis von Spezies zu Polymer von 0,1 : 1000 bis 1 : 10 und vorzugsweise von 1 : 100 bis 1 : 10 auf Gewichtsbasis vor. Das Vermischen erfolgt bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 50ºC, vorzugsweise bei 5 bis 25ºC, über einen Zeitraum von 0,5 bis 48 Stunden. Jeder beliebige Puffer kann verwendet werden, doch wird vorzugsweise ein tertiäres Amin verwendet. Die Details dieses Verfahrens werden in Beispiel 1 unten veranschaulicht.
Die polymeren Teilchen, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, enthalten kein feststellbares Tracer-Material innerhalb der Teilchen. Bei Verwendung dieses Reagens würde ein Tracer innerhalb des Teilchens entweder nachteilig sein, nicht erforderlich, wenn ein äußerer Tracer verwendet wird, oder nicht erforderlich, wo die Ermittlung des Reagens bezüglich der Verwendung irrelevant ist. Ein Tracer ist ein Material, das unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung und geeigneter Techniken feststellbar ist. Dies bedeutet, daß das Innere der Teilchen keine feststellbaren Mengen an Tracer-Material enthält, wie beispielsweise colorimetrische oder fluorometrische Farbstoffe oder Verbindungen (wie zum Beispiel Chelate der Seltenen Erden), chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen, Radioisotope oder biolumineszierende Verbindungen. Im Falle einiger Ausführungsformen kann das Reagens ein Tracer-Material (zum Beispiel ein Enzym oder Radioisotop) assoziiert auf der Teilchenoberfläche aufweisen oder an die immunologische Spezies gebunden. Im Falle anderer Ausführungsformen weist das Reagens keinerlei Tracer auf, das mit ihm in irgend einer Weise assoziiert ist.
Das Reagens der vorliegenden Erfindung kann zur Bestimmung (qualitative oder quantitative Messung) eines Analyten in wäßrigen Flüssigkeiten verwendet werden. Die Bestimmung kann folgen im wesentlichen durch Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des Analyten oder durch quantitative Bestimmung der Menge des Analyten. Ist der Analyt durch immunologische Methoden bestimmbar, so wird er hier als Ligand bestimmt. Insbesondere läßt sich die Erfindung verwenden zur Untersuchung biologischer Flüssigkeiten von Tieren, des Menschen oder von Pflanzen, jedoch vorzugsweise des Menschens. Zu derartigen Flüssigkeiten gehören, ohne daß eine Begrenzung hierauf erfolgt, ganzes Blut, Plasma, Seren, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, Spinalflüssigkeit, Sputum, Schweiß und dergleichen wie auch Stuhl-Abscheidungen. Das Reagens ist ferner geeignet zur Untersuchung von flüssigen Präparationen des menschlichen oder tierischen Gewebes, wie beispielsweise des Skelettmuskels, des Herzens, der Niere, der Lungen, des Gehirns, des Knochenmarks, der Haut und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, um eine beliebige Vielzahl von Liganden festzustellen oder quantitativ zu bestimmen, die mit der immunologischen Spezies auf dem Reagens der Erfindung reaktiv sind. Zu derartigen Liganden gehören, ohne eine Beschränkung hierauf, Proteine, Hormone, Arzneimittel, Haptene, Kohlehydrate, Pflanzenlektine oder Lipopolysaccharide, die ein oder mehrere Zentren für die Komplexbildung mit der immunologischen Spezies des Reagens aufweisen. Beispielsweise umfaßt das Reagens Antikörper, die gegen den Liganden gerichtet sind, der ein Arzneimittel oder ein Hapten sein kann. Die Erfindung kann speziell geeignet sein für die Bestimmung von Digoxin, Phenytoin, Phenobarbital, Thyroxin, Tr&ijlig;odothyronin, Gentamicin, Carbamazepin, Primidon, Tobramycin oder Theophyllin.
Alternativ kann der Ligand ein Antikörper sein, der zwei oder mehrere Zentren für eine Komplexbildung mit einer oder mehreren immunologischen Spezies aufweist, wobei ein Zentrum Teil von dem Reagens dieser Erfindung ist. Im Falle diagnostischer Untersuchungsverfahren, wie sie hier beschrieben werden, kann der Ligand bestehen aus Polypeptiden, Enzymen, Pilzen, Protozoen, Streptokokkus A-Antigen, Antigenen von chlamydialen oder gonokokkalen Organismen, einem retroviralen Antigen oder Antikörper (wie zum Beispiel HTLV-Antigenen oder Antikörpern oder HIV-Antigenen oder Antikörpern), thyroiden stimulierenden Hormonen, Apolipoproteinen, menschlichem chorionischem Gonatotropin, leutinisierenden Hormonen, Herpes-Viren und anderen biologischen Verbindungen, Organismen oder Komponenten hiervon.
Das Reagens kann in einer Lösungs-Bestimmungsmethode eingesetzt werden im Rahmen kompetitiver Bindungs-Immunoassays. Unter einer Lösungs-Bestimmungsmethode ist eine Bestimmungsmethode zu verstehen, bei der die Reagentien dieser Erfindung in flüssiger Suspension in einem Immunoassay verwendet werden. Bestimmt werden können entweder gebundene (d. h. komplex gebundene) oder ungebundene (d. h. nicht komplex gebundene) markierte Materialien. Eine physikalische Trennung von gebundenen und ungebundenen Materialien kann, falls erwünscht, unter Anwendung beliebiger Trennungstechniken durchgeführt werden. Bei Verwendung der oben beschriebenen analytischen Elemente kann entweder eine vertikale oder eine horizontale Trennung durchgeführt werden.
Im Falle einer kompetitiven Bindungs-Analyse liegt das Reagens im allgemeinen in einer Konzentration in einer Menge vor, die von der Menge der immunologischen Spezies auf den polymeren Teilchen abhängt und dem Typ des durchgeführten Bestimmungsverfahrens. Die Menge hängt ferner ab von der Bindungskonstante der immunologischen Spezies. Geeignete Mengen lassen sich für ein bestimmtes analytisches Verfahren leicht durch den Fachmann bestimmen. Das entsprechende Ligandenanalog kann in Mengen vorliegen, die ganz allgemein für ein vorgegebenes Bestimmungsverfahren bekannt sind. Andere Materialien, wie beispielsweise Puffer, oberflächenaktive Stoffe, Reagentien für die Farbbildung, können bei der Bestimmung, sofern erwünscht, eingesetzt werden.
Ein Bestimmungsverfahren wird im allgemeinen durchgeführt durch physikalisches Inkontaktbringen und Vermischen des Reagens, des markierten Ligandenanalog und der Probe, die untersucht werden soll, in einem geeigneten Behälter. Die resultierende Suspension kann, falls erwünscht, inkubiert werden, um die Komplexbildung und andere Reaktionen zu unterstützen. Die Probe wird dann unter Anwendung einer geeigneten Bestimmungsvorrichtung und geeigneter Verfahren untersucht.
Im Falle einer anderen Ausführungsform kann das Reagens in einem Verfahren eingesetzt werden, das bekannt ist als ein immunömetrisches Assay, zum Beispiel als "Sandwich"-Assay. Die Details derartiger Assays werden in der U.S.-Patentschrift 4 486 530 beschrieben. Das Reagens der vorliegenden Erfindung ist für solche Assays geeignet, wenn der zu bestimmende Ligand zwei oder mehr epitopische Zentren für eine immunologische Reaktion mit zwei oder mehr Rezeptormolekülen aufweist. Die Rezeptormoleküle können die gleichen sein oder voneinander verschieden. Eines der Rezeptormoleküle wird hier identifiziert als erste immunologische Spezies, die als Teil des Reagens dieser Erfindung gebunden ist. Auch wird eine zweite immunologische Spezies verwendet, die dazu befähigt ist, immunologisch mit dem Liganden an einem Zentrum zu reagieren, das verschieden ist von dem Zentrum, mit der die erste Spezies reagiert. Das Ergebnis des Verfahrens ist die Erzeugung eines Komplexes der zwei ausgeprägten immunologischen Spezies mit dem Liganden. Die zweite Spezies (d. h. diejenige, die nicht Teil des Reagens der Erfindung ist) ist in gewisser Weise markiert, so daß der erhaltene unlösliche Komplex leicht bestimmt werden kann. Im Falle eines immunometrischen Assays sind beide immunologischen Spezies ausgeprägte Antikörper, die gegen ein Antigen gerichtet sind. Sie können aus den gleichen oder verschiedenen Antikörpern bestehen, ganzen Antikörpern oder Fragmenten, monoklonal oder polyklonal.
Im Falle einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt das Reagens dieser Erfindung ein Antigen und der zu bestimmende Ligand ist ein Antikörper. Eine zweite immunologische Spezies, die im Falle des Assays verwendet wird, ist ein zweiter Antikörper, der gegen den ersten Antikörper gerichtet ist. Die zweite immunologische Spezies kann markiert oder unmarkiert sein. Ist der zweite Antikörper unmarkiert, so kann ein markierter dritter Antikörper, gerichtet gegen den zweiten Antikörper, oder ein markiertes zweites Antigenmolekül, reaktiv mit dem zweiten Antikörper verwendet werden.
Die Methoden dieser Erfindung, die oben beschrieben werden, lassen sich ferner mit einem trockenen analytischen Element durchführen. Das einfachste Element kann aus einem absorbierenden Trägermaterial aufgebaut sein, beispielsweise einem dünnen Blatt eines selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Materials, wie beispielsweise Filterpapier oder Streifen mit einer oder mehreren Zonen, wobei mindestens eine Zone das Reagens dieser Erfindung enthält. Andere Zonen können dazu benutzt werden, um andere geeignete Reagenzien aufzunehmen. Derartige Elemente sind als Teststreifen, diagnostische Elemente, Tauchstäbchen oder diagnostische Mittel bekannt.
Geeignete absorbierende Trägermaterialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität, wenn sie der Einwirkung von Wasser oder biologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut oder Serum, ausgesetzt werden, bei. Geeignete Elemente können hergestellt werden aus Papier, porösen teilchenförmigen Strukturen, porösen polymeren Folien, Cellulose, Glasfasern, gewebten und nicht gewebten textilen Gebilden (synthetischen und nicht-synthetischen Ursprungs) und dergleichen. Geeignete Materialien und Verfahren zur Herstellung solcher Elemente sind aus dem Stande der Technik bekannt.
Vorzugsweise stellt das absorbierende Trägermaterial des trockenen analytischen Elementes dieser Elfindung eine poröse Ausbreitzone dar. Diese Zone kann selbsttragend sein (d. h. aus einem Material bestehen, das starr genug ist, um seine Integrität beizubehalten), doch befindet sie sich vorzugsweise auf einem separaten Träger. Ein solcher Träger kann aus irgend einem geeigneten dimensionsstabilen und vorzugsweise nicht porösen und transparenten Material (d. h. ein für Strahlung durchlässiges Material) bestehen, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Ein Träger der Wahl für ein spezielles Element sollte mit der beabsichtigten Art der Bestimmung verträglich sein (Fluoreszenz-, Transmissions- oder Reflektions-Spektroskopie). Geeignete Träger lassen sich herstellen aus Papier, Metallfolien, Polystyrol, Polyester, Polycarbonaten oder Celluloseestern.
Die poröse Ausbreitzone kann aus jedem beliebigen geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Material oder Mischungen von einem oder beiden hergestellt werden. Das Porenvolumen und die mittlere Porengröße dieser Zone können variiert werden, je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck. Geeignete Ausbreitzonen lassen sich herstellen unter Verwendung von Materialien und unter Anwendung von Verfahren, wie sie beispielsweise beschrieben werden in den U.S.-Patentschriften 4 292 272, 3 992 158, 4 258 001 und 4 430 436 sowie in der japanischen Patentpublikation 57(1982)-101760.
Die Elemente können zwei oder mehrere diskrete Zonen aufweisen, und zwar entweder in der gleichen Schicht oder übereinander.
Mindestens eine der Zonen ist vorzugsweise eine poröse Ausbreitzone. Die anderen Zonen können bestehen aus Reagenszonen oder Registrierzonen, wie beispielsweise solchen Zonen, die aus dem Stande der Technik bekannt sind, zusätzlichen Ausbreitzonen, Strahlung blockierenden Zonen oder Filterzonen, Haftzonen oder Trennzonen. Die Zonen befinden sich im allgemeinen in einem fluiden Kontakt miteinander, was bedeutet, daß Fluide, Reagentien und Reaktionsprodukte (zum Beispiel Farbstoffe) durch die übereinander liegenden Bereiche voneinander benachbarten Zonen gelangen oder transportiert werden können. In anderen Worten, wird das Element mit einem Fluid in Kontakt gebracht, so werden die Reagentien innerhalb des Elementes miteinander vermischt und können leicht miteinander reagieren. Vorzugsweise stellt jede Zone eine separat aufgetragene Schicht dar, obgleich zwei oder mehrere Zonen separate Bereiche in einer einzelnen Schicht des Elementes bilden können.
Während das Reagens dieser Erfindung in dem Element vorhanden ist, ist es im Falle einer kompetitiven Bindungs-Analyse nicht kritisch, daß das Ligandenanalog ebenfalls hierin vorliegt. Vielmehr ist es möglich, das Ligandenanalog dem Element zum Zeitpunkt des Assays zuzugeben. Vorzugsweise jedoch sind sowohl das Ligandenanalog wie auch das Reagens dieser Erfindung beide in dem Element enthalten und voneinander isoliert derart, daß sie vor der Bestimmung nicht miteinander reagieren können. Beispielsweise kann eines oder können beide dieser Materialien mittels einer Substanz eingekapselt sein, die sich in der angewandten wäßrigen Probe löst. Alternativ können sie dadurch voneinander isoliert sein, daß man sie in verschiedenen Zonen des Elementes unterbringt, wo sie sich nicht vermischen können, bis die Bestimmung durchgeführt wird.
Im Falle einer Ausführungsform eines kompetitiven Bindungs- Assays weist ein analytisches Element für die immunologische Bestimmung eines Arzneimittels oder Hormons auf: einen nicht porösen Träger, auf dem sich in der folgenden Reihenfolge und in fluidem Kontakt miteinander befinden,
eine Reagensschicht mit einem oder mehreren Reagentien für die Erzeugung eines feststellbaren Signals bei der Bestimmung,
eine wasserlösliche Schicht mit einem mit einem Enzym markierten Analog des Arzneimittels oder Hormons und
eine poröse Ausbreitschicht mit einem Reagens, das im wesentlichen besteht aus:
(a) einem polymeren Teilchen, aufgebaut aus einem Polymer, dargestellt durch die Formel
worin A für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder mehreren hydrophoben, ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten,
worin ferner B steht für wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die dargestellt werden durch die Formel:
wie oben definiert, wobei ferner bedeuten
D wiederkehrende Einheiten, die sich ableiten von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten Monomeren, die verschieden sind von jenen, die dargestellt werden durch A oder B,
x ein Zahlenwert entsprechend 0 bis 99,9 Mol-%, y ein Zahlenwert entsprechend 0,1 bis 100 Mol-% und z ein Zahlenwert entsprechend 0 bis 20 Mol-%,
wobei das Innere des Teilchens praktisch frei von feststellbarem Tracer-Material ist und wobei
das Teilchen kovalent durch die wiederkehrenden Einheiten B an
(b) ein oder mehrere Antikörpermoleküle gebunden ist, die gegen das Arzneimittel oder das Hormon gerichtet sind.
Eine Vielzahl von verschiedenen Elementen, je nach der Methode der Bestimmung, kann gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Elemente können in einer Vielzahl von Formen erstellt werden, einschließlich von langen Bändern einer jeden beliebigen Breite, in Form von Blättern, Slides oder Chips.
Das Bestimmungsverfahren oder Assay dieser Erfindung kann manuell oder automatisch durchgeführt werden. Im allgemeinen erfolgen unter Verwendung der trockenen Elemente analytische Bestimmungen dadurch, daß das Element von einer Vorratsrolle, einem Chippaket oder einem anderen Vorratsbehälter entnommen und physikalisch in Kontakt mit einer Probe (zum Beispiel bis zu 500 ul) der Flüssigkeit gebracht wird, die untersucht werden soll, so daß die Probe und die Reagentien innerhalb des Elementes miteinander vermischt werden. Ein derartiger Kontakt kann in jeder geeigneten Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Eintauchen oder Einbringen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise dadurch, daß auf das Element mit der Hand ein Spot der Probe aufgebracht wird oder maschinell ein Tropfen der Probe mittels einer geeigneten Abgabevorrichtung. Die U.S.-Patentschrift 4 670 381 enthält weitere zusätzliche Details des Aufbringens der Probe. Auch können Waschflüssigkeiten verwendet werden, wie es beispielsweise in der U.S.- Patentschrift 4 517 288 beschrieben wird.
Nach dem Aufbringen der Probe kann das Element konditioniert werden, beispielsweise inkubiert, erhitzt oder dergleichen, wobei die Konditionierung wünschenswert oder zweckmäßig sein kann, um die Zeitspanne bis zur Erzielung des Testergebnisses abzukürzen oder um das Verfahren zu erleichtern.
Im Falle einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann das Reagens der Erfindung im Rahmen eines Agglutinations-Assays angewandt werden, um das Vorhandensein eines Liganden zu bestimmen, der einen Komplex mit der immunologischen Spezies im Rahmen einer immunologischen Reaktion bildet. Der erhaltene Komplex scheidet sich in Form eines feststellbaren Agglutinates aus oder in Form von Klümpchen der Teilchen. Die Agglutination kann beispielsweise visuell festgestellt werden oder mittels einer geeigneten Licht streuenden Bestimmungsvorrichtung. Geeignete Agglutinations-Techniken werden in der U.S.-Patentschrift 4 419 453 beschrieben.
Die folgenden Herstellungen veranschaulichen repräsentative Verfahren zur Herstellung von Polymerteilchen, die sich im Rahmen der Praxis dieser Erfindung verwenden lassen.

Herstellung 1

Herstellung von Poly[styrol-co-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol] (molares Verhältnis 95,5 : 4,5)

Drei Lösungen von Reagentien wurden gleichzeitig in ein Gefäß bei 80ºC zugegeben und miteinander vermischt unter Anwendung einer kontinuierlichen Emulsions-Polymerisationstechnik. Die Lösung 1 enthielt Styrol (739 g), m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol (82 g) und 1-Dodecanthiol (8,2 g). Die Lösung 2 enthielt Ammoniumperoxydisulfat (19,7 g) in destilliertem Wasser (1152 g). Die Lösung 3 enthielt Natriumpyrosulfit (9,85 g) in destilliertem Wasser (1152 g).
Die Lösungen wurden in das Gefäß mit den folgenden individuellen Geschwindigkeiten eingepumpt: Lösung 1, 2,5 g/Min; Lösung 2, 2,14 g/Min.; und Lösung 3, 2,27 g/Min. Nach einer Zugabedauer von 380 Minuten wurde die Reaktion unterbrochen. Die Ausbeute betrug 1218 g bei einem Feststoffgehalt von 33,4%. Der Polymerlatex wurde dann 3 Tage lang dialysiert unter Gewinnung eines Latex mit 27,3% Feststoffen und einem pH-Wert von 5. Dieser Latex wurde auf einen Feststoffgehalt von 13,5% für die Untersuchung verdünnt. Eine nuklearmagnetische Resonanzanalyse des Polymeren ergab ein molares Verhältnis von Styrol zu dem Sulfonylcomonomeren von 96 : 4.

Herstellung 2

Herstellung von Polymerteilchen mit einem Kern und einer Hülle mit einem Kern aus Poly(styrolco-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (molares Verhältnis 85 : 15) und einer Hülle von Poly[styrolco-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol] (molares Verhältnis 95,5 : 4,5)

In einem Verfahren, ähnlich demjenigen, wie es im Falle der Herstellung 1 beschrieben worden ist, wurde ein Polymer mit einem Kern und einer Hülle hergestellt. Drei Lösungen wurden gleichzeitig in ein Gefäß gegeben und hierin miteinander vermischt wie folgt. Lösung 1 enthielt Styrol (179,1 g), 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat (65 g) und 1-Dodecanthiol (2,4 g), wobei die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1,5 g/Min. eingepumpt wurde. Die Lösung 2 enthielt Ammoniumperoxydisulfat (8,14 g) in destilliertem Wasser (828 g) und wurde mit einer Geschwindigkeit von 2,36 g/Min. eingepumpt. Die Lösung 3 enthielt Natriumpyrosulfit (4,1 g) in destilliertem Wasser (828 g) und sie wurde mit einer Geschwindigkeit von 2,44 g/Min. eingepumpt.
Die Lösungen wurden in das Gefäß innerhalb eines Zeitraumes von 164 Minuten eingepumpt. Der Feststoffgehalt lag bei 10,3% und die Verweilzeit betrug 213 Minuten bei 80ºC. Die erhaltenen Polymerteilchen wurden als Kern des herzustellenden Polymeren aus Kern und Hülle verwendet.
Die Hülle wurde aufgebracht durch gleichzeitige Zugabe der folgenden Lösungen zu dem Gefäß, das die Kernteilchen enthielt: Lösung 4 enthielt Styrol (146,7 g), m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol (16,3 g) und 1-Dodecanthiol (1,6 g) und die Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 1,41 g/Min. eingepumpt. Die Lösungen 5 und 6 waren die gleichen wie die Lösungen 2 bzw. 3. Die Zugabedauer dieser Lösungen betrug 111 Minuten bei 80ºC. Es wurden keine neuen Teilchen gebildet, doch polymerisierten die Monomeren der Lösung 4 in Form einer Copolymerhülle auf den Kernteilchen, die zuvor hergestellt wurden. Der Feststoffgehalt an dem angefallenen Kern-Hüllen-Polymer lag bei 13,8% in der Lösung, die 4 Tage lang dialysiert wurde.

Beispiel 1

Herstellung eines Reagens, enthaltend Rinder- Gamma-Globulin

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Reagens der vorliegenden Erfindung. Es veranschaulicht ferner die Verbesserung, die durch die vorliegende Erfindung erreicht wird, gegenüber ähnlichen Reagentien, die nach der Lehre des Standes der Technik hergestellt wurden.
Ein Teil des Latex, hergestellt wie unter Herstellung 1 oben beschrieben, mit 30 mg Polymer, Trockengewicht, wurde mit 0,3 mg tritiiertem Rinder-Gamma-Globulin-Protein kombiniert, und die Lösung wurde mit 0,1 molarem Natriumborat (pH 8,5) in einem Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 10 ml gebracht. Die Umsetzung des Proteins mit den reaktiven Oberflächengruppen der Polymerteilchen wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 30 bis 35 Upm durchgeführt, wobei das Röhrchen auf einer sich drehenden Platte in einem Winkel von 45º montiert war. Ein zweiter Anteil des Latex wurde in entsprechender Weise mit Protein umgesetzt, mit der Ausnahme jedoch, daß die Inkubation bei 37ºC erfolgte.
Ein dritter Anteil des Latex wurde in entsprechender Weise mit 1,5 g tritiiertem Protein bei 25ºC umgesetzt, während ein vierter Anteil mit 1,5 g Protein bei 37ºC umgesetzt wurde. In allen Teilen des Polymeren hatten die Latexteilchen eine mittlere Teilchengröße von 0,68 Mikrometern.
Zu Vergleichszwecken wurden vier Vergleichsreagentien hergestellt, durch Ersatz durch 30 mg eines Kern-Hüllen-Polymeren mit reaktiven Oberflächen-Chloromethylgruppen. Der Kern dieses Polymeren bestand aus Poly(styrol-co-divinylbenzol) (molares Verhältnis 99,2 : 0.8) und die Hülle bestand aus Poly- (vinylbenzylchlorid-co-divinylbenzol) (molares Verhältnis 98,8 : 1,2). Die mittlere Teilchengröße betrug etwa 0,68 Mikrometer. Das Kern-Hüllen-Polymer wurde in vier Anteile aufgeteilt und unter den gleichen Bedingungen mit tritiiertem Rinder-Gamma-Globulin wie oben für das Reagens dieser Erfindung beschrieben, umgesetzt.
Am Ende der beschriebenen Inkubationszeiten wurde eine jede Reaktionsmischung durch Zugabe von überschüssigem Rinderserumalbumin (30 mg, 30 mg/ml Puffer) gelöscht. Die Reagentien wurden dann weitere 4 Stunden nach dieser Zugabe inkubiert.
Die Gesamtmenge an gebundenem Protein wurde bestimmt durch Messung von: (a) der Gesamtzähler pro Minute in einem 500 Mikroliter Aliquot der Reaktionsmischung, (b) der Zähler pro Minute, die übrig blieben in der überstehenden Flüssigkeit nach Zentrifugieren einer 1 ml Probe der Reaktionsmischung, und (c) der Zähler pro Minute von markiertem Protein, das an den Latex gebunden worden war, nach wiederholten Wäschen des in der Stufe (b) erhaltenen Pellets. Die Fraktion des markierten Proteins, das kovalent an die Teilchen gebunden war, wurde bestimmt nach der Inkubation der umgesetzten Teilchen in Gegenwart von 1% Natriumdodecylsulfat als oberflächenaktivem Mittel bei 37ºC für etwa 24 Stunden mit einer End-Über-End-Rotation. Das gleiche Verfahren, wie oben beschrieben, zur Bestimmung der Gesamtmenge an gebundenem Protein wurde dazu angewandt, um die Menge an kovalent gebundenem Protein zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den unten folgenden Tabellen I und II zusammengestellt Tabelle 1 Reagens (Anteil) Inkubationstemperatur tritiiertes Protein verwendet Protein gebunden Polymer Beispiel Vergleich Tabelle 2 (nach Behandlung mit oberflächenaktivem Mittel) Reagens (Anteil) Inkubationstemperatur tritiiertes Protein verwendet Protein gebunden Protein Polymer Verhältnis kovalent/total Beispiel Vergleich
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines geeigneten Reagens in der Praxis dieser Erfindung. Dieses Reagens ist in dem Proteinanteil mit einem Radioisotop markiert. Die oben zusammengestellten Daten zeigen, daß das Protein kovalent an die polymeren Teilchen gebunden werden kann, die reaktive Chloroethylsulfonylgruppen enthalten, unter Anwendung von Umgebungsbedingungen (d. h. Raumtemperatur), wobei die Bindung viel wirksamer erfolgt als im Falle der entsprechenden Vergleichsmaterialien. Die Chloromethylgruppe der Vergleichsteilchen erfordert die Anwendung erhöhter Inkubationstemperaturen, um eine wirksame Bindung (d. h. einen hohen Bindungsgrad) zu erzielen. Der Vorteil des Reagens dieser Erfindung liegt darin, daß niedrigere Temperaturen erforderlich sind, um bestimmte immunoreaktive Spezies oder Enzyme zu binden, die bei den höheren Temperaturen inaktiviert werden.
Aus diesem Beispiel ist ebenfalls offensichtlich, daß das Reagens dieser Erfindung hergestellt werden kann ohne Zuhilfenahme von Aktivierungsstufen oder Reagentien, wie es im Falle einiger Verfahren des Standes der Technik üblich ist.

Beispiele 2 und 3

Herstellung und Verwendung von Reagentien in Immunoassays für Phenobarbital

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von zwei Reagentien der vorliegenden Erfindung und ihre Anwendung in Immunoassays zur Bestimmung des Vorhandenseins des Arzneimittels Phenobarbital.
Ein monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen Phenobarbital, wurde in den Laboratorien der Firma Eastman Kodak Company unter Anwendung von Standard-Verfahren der Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit Phenobarbital-menschlichem Serumalbumin hergestellt. Die Milz der immunisierten Mäuse wurde mit Myoloma- Zellen (SP1/Φ-Ag14) fusioniert, unter Erzeugung von Hybridomas, welche die gewünschten monoklonalen Antikörper erzeugten.
Im Falle des Beispiels 2 wurde dieser Antikörper kovalent an polymere Teilchen gebunden, entsprechend jenen, die in Beispiel 1 oben beschrieben wurden mit reaktiven Chloroethylsulfonylgruppen. Im Falle des Beispiels 3 wurden die Antikörper kovalent an polymere Teilchen gebunden, die bestanden aus Poly- [styrol-co-N-(p-chloroethylsulfonylmethylphenyl)acrylamid] (molares Verhältnis 99,27 : 0,73) mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,83 Mikrometern. Die Masse des an die Teilchen gebundenen Antikörpers wurde in einem parallelen Versuch bestimmt, bei dem tritiiertes Rinder-Gamma-Globulin anstelle von dem Anti- Phenobarbital-Antikörper verwendet wurde. Die Menge an aktivem Protein, das an die Teilchen gebunden wurde, wurde verglichen mit dem unten beschriebenen Versuch einer Enzymmarkierungsbindung.
Eine Probe der Latexteilchen (30 mg Trockengewicht des Polymeren) wurde mit 0,3 mg des Anti-Phenobarbital-Antikörpers in 10 ml von 3-[{Tris(hydroxymethyl)methyl]amino}propansulfonsäurepuffer (ph-Wert 8,5, 0,1 molar) vermischt. Eine zweite Probe des Latex wurde vermischt mit 1,5 mg des Antikörpers in 10 ml des gleichen Puffers. Die Bindungsreaktionen erfolgten durch Inkubation über 24 Stunden unter Rotation (end-over-end) bei Raumtemperatur. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Rinderserumalbumin (30 mg, 30 mg/ml) unterbrochen und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden dann zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Pellets wurden einmal mit einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,4) gewaschen und dann in der Salzlösung resuspendiert.
Eine Probe (30 mg trockenes Polymer) eines Vergleichs-Latex, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in entsprechender Weise inkubiert mit dem Anti-Phenobarbital-Antikörper (0,3 mg) in 10 ml einer 0,1 molaren Natriumboratpufferlösung bei einem pH-Wert von 8,5. Ein zweiter Anteil des Latex wurde in entsprechender Weise mit 1,5 mg des Antikörpers in dem gleichen Puffer inkubiert. Die Bindungsreaktionen wurden bei 37ºC anstelle bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Masse des Antikörpers, der an eine jede Latex-Herstellung gebunden war, wurde ermittelt durch Bestimmung der Anzahl von Zählern von Proben, die in einem Parallelversuch getestet wurden mit tritiiertem Rinder-Gamma-Globulin, das an die Teilchen, wie in Beispiel 1 beschrieben, gebunden wurde. Das Verhältnis kovalent/total wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, berechnet nach einer Inkubation mit Natriumdodecylsulfat als oberflächenaktivem Mittel. Die relative Menge an aktivem Antikörper in jeder Herstellung wurde in einem Versuch bestimmt, in dem Reihen-Verdünnungen des Reagens vermischt wurden mit einer festen Konzentration an mit Glucoseoxidase markiertem Phenobarbital (5 · 10&supmin;¹&sup0; molar). Die verwendeten Reagensmengen wurden verändert von 6,3 · 10&supmin;¹&sup0; molaren bis 2,0 · 10&supmin;&sup7; molaren theoretischen Phenobarbital-Bindungszentren, bezogen auf die Masse an gebundenem Antikörper.
Die Reagensverdünnungen und das markierte Arzneimittel wurden etwa eine Stunde lang unter konstantem Rühren bei Raumtemperatur in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, die 1% Rinderserumalbumin enthielt, inkubiert. Die Menge an Phenolbarbital-Glucoseoxidasemarkierung, die in der Lösung verblieb, nachdem diese zentrifugiert worden war, wurde bestimmt und die Konzentration an Phenobarbital-Bindungszentren, die erforderlich war, um 50% der Enzymmarkierung zu binden, wurde bestimmt. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in den Tabellen III und IV unten zusammengestellt. Tabelle 3 (Massenbindungsversuch) Reagens Menge an verwendetem markiertem Protein Bindung Protein Polymer kovalent/total Beispiel Vergleich Tabelle 4 (Latex-Enzym-Markierungs-Titration) Reagens Menge an verwendetem Protein Theoretische Phenobarbital-Bindungszentren zur Bindung von der Markierung Beispiel Vergleich
Dieses Beispiel zeigt, daß der Anti-Phenobarbital-Antikörper kovalent an die polymeren Teilchen mit reaktiven Chloroethylsulfonylgruppen gebunden werden kann, und zwar unter Reaktionsbedingungen bei Raumtemperatur mit sehr großer Wirksamkeit. Demgegenüber muß das Vergleichsreagens bei erhöhten Temperaturen hergestellt werden, um eine wirksame Bindung zu erzielen. Das Beispiel zeigt ferner, daß der Antikörper unter Bildung des Reagens dieser Erfindung unter milden Bedingungen gebunden werden kann, unter Beibehaltung einer 3- bis 4-fach größeren Beibehaltung der Antikörperaktivität als im Falle des Vergleichsreagens.

Beispiel 4

Herstellung und Verwendung von Reagens in einem Immunoassay für Digoxin

Ein monoklonaler Antikörper, der gegen Digoxin (DASS) gerichtet war, wurde von der Firma Beckman bezogen.
Dieser Antikörper wurde kovalent an polymere Teilchen mit reaktiven Chloroethylsulfonylgruppen gebunden. Die Teilchen bestanden aus kugelförmigen Teilchen mit einem Kern und einer Hülle mit einem Kern aus Poly(styrol-co-divinylbenzol) (molares Verhältnis 99 : 1), einer Hülle aus Poly[styrol-co-m- & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol-co-divinylbenzol] (molares Verhältnis 94,5 : 4,5 : 1) und einem mittleren Durchmesser von etwa 0,)65 Mikrometern.
Eine Probe der Latexteilchen (100 mg Trockengewicht des Polymeren) wurde mit 3,0 mg des Anti-Digoxin-Antikörpers in 10 ml eines 3-[{Tris(hydroxymethyl)methyl]amino}propansulfonsäure Puffer (pH 8,5, 0,1 molar) vermischt. Die Bindungsreaktion wurde durch eine Inkubation über 24 Stunden durchgeführt mit einer End-over-End-Rotation bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Rinderserumalbumin (100 mg, 50 mg/ml) unterbrochen und die Inkubation wurde weitere 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Pellets wurden einmal mit einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (pH 7,4) gewaschen und dann in der Salzlösung resuspendiert.
Eine Probe eines Vergleichslatex, wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme jedoch, daß er eine mittlere Teilchengröße von 0,79 um hatte (100 mg trockenes Polymer), wurde in entsprechender Weise mit dem Anti-Digoxin-Antikörper (3 mg) in 10 ml eines 0,1 molaren Natriumboratpuffers bei pH 8,5 inkubiert. Die Bindungsreaktionen erfolgten bei 37ºC anstelle bei Raumtemperatur.
Die relative Menge an aktivem Antikörper in jeder Herstellung wurde in einem Versuch bestimmt, bei dem Reihenverdünnungen des Reagens mit einer bestimmten Konzentration an mit Meerrettich-Peroxidase markiertem Digoxin (5 · 10&supmin;¹¹ molar) vermischt wurden. Die Reagensmengen variierten von 2,5 · 10&supmin;¹&sup0; bis 2,5 · 10&supmin;&sup4; g Kügelchen, die den immobilisierten Antikörper enthielten.
Die Reagensverdünnungen und das markierte Arzneimittel wurden etwa eine Stunde lang bei konstantem Rühren bei Raumtemperatur in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, inkubiert. Die Menge an Digoxin- Peroxidasemarkierung, die in der Lösung nach dem Zentrifugieren verblieb, wurde bestimmt und weiterhin wurde bestimmt die Konzentration an Kügelchen, die erforderlich war, um 50% der Enzymmarkierung zu binden. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt. Tabelle 5 (Latex-Enzym-Markierungs-Titration) Menge an verwendetem Protein Kügelchen, um der Markierung zu binden Beispiel Vergleich
Dieses Beispiel zeigt, daß der Anti-Digoxin-Antikörper gebunden werden kann unter Bildung des Reagens dieser Erfindung, wobei das Reagens eine fünf mal größere Retention der Antikörperaktivität aufweist als das Vergleichsreagens.

Claims

1. Ein von oberflächenaktiven Stoffen freies Reagenz, zusammengesetzt aus:

(a) einem von oberflächenaktiven Stoffen freien polymeren Teilchen, das durch reaktive, abstehende Gruppen kovalent gebunden ist an

(b) eine immunologische Spezies, die dazu befähigt ist, an einer immunologischen Reaktion mit einem entsprechenden Rezeptor teilzunehmen, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer sich von mindestens einem α,β-ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monoren ableitet, das entweder abstehende aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen aufweist,

wobei das Innere des Teilchens von feststellbarem Tracermaterial frei ist und das Polymerteilchen hergestellt worden ist durch Emulsionspolymerisation in Abwesenheit eines oberflächenaktiven Stoffes oder eines Emulgators.

2. Reagenz nach Anspruch 1, in dem das Polymer durch die folgende Formel wiedergegeben wird:

worin A für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder von mehreren hydrophoben, α,β-ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, wobei ferner

B für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder von mehreren α,β-ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die durch die folgende Formel wiedergegeben werden:

worin R für Wasserstoff steht oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

R¹ für -CH=CHR² oder -CH&sub2;CH&sub2;X steht, worin X eine abspaltbare Gruppe ist, die ersetzbar ist durch ein Nukleophil oder die in Form von HX eliminiert wird durch Behandlung mit einer Base, wobei R² für Wasserstoff steht oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, und wobei

L eine verbindende Gruppe darstellt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Alkylengruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylengruppen mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen und einer Kombination von einer oder mehreren von jeder der Alkylen- und Arylengruppen, und wobei

D für wiederkehrende Einheiten steht, die sich von einem oder mehreren α,

Bezugszeichenliste

-ethylenisch ungesättigten Monomeren ableiten, die verschieden sind von jenen, die durch A oder B wiedergegeben werden, und wobei

x einen Zahlenwert entsprechend 0 bis 99,9 Mol-% darstellt,

y ein Zahlenwert, entsprechend 0,1 bis 100 Mol-% und z ein Zahlenwert, entsprechend 0 bis 20 Mol-%

3. Reagenz nach Anspruch 2, worin x für 50 bis 99,5 Mol-%

steht, y für 0,5 bis 50 Mol-% und z für 0 bis 10 Mol-% in dem definierten Polymer.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 2 oder 3, in dem sich die durch B dargestellten wiederkehrenden Einheiten ableiten von den definierten Monomeren, worin R für Wasserstoff steht oder Methyl, worin R¹ steht für -CH&sub2;C H&sub2;X und worin L eine substituierte oder unsubstituierte Phenylenalkylengruppe ist oder eine Carbonyliminomethyleniminocarbonylethylengruppe.

5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem die immunologische Spezies ein Antikörper ist, der gerichtet ist auf Digoxin, Phenytoin, Phenobarbital, Thyroxin, Triiodothyronin, Gentamicin, Carbamazepin, Primidon, Tobramycin, Theophyllin, menschliches chorionisches Gonadotropin, leutinisierendes Hormon, ein chlamydiales Antigen, ein gonokokkales Antigen, ein Herpesantigen, ein retrovirales Antigen oder Antikörper oder ein streptokokkales Antigen.

6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem die immunologische Spezies ein retroviraler Organismus, Herpes-, chlamydialer oder gonokokkaler Organismus oder eine antigene Komponente hiervon, oder ein Arzneimittel oder ein Hapten ist.

7. Element mit einem absorbierenden Trägermaterial mit einer oder mehreren Zonen, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer oder mehreren der Zonen ein Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

8. Element nach Anspruch 7, weiter dadurch gekennzeichnet, daß es ein Liganden-Analog enthält.

9. Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei dem man:

A. in Gegenwart eines Analogen des Liganden eine Probe der Flüssigkeit mit einem Reagenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kontakt bringt,

um einen immunologischen Komplex zwischen der immunologischen Spezies und sowohl dem immunologischen Liganden wie auch dem Liganden-Analog zu bilden, und bei dem man

B. den immunologischen Komplex als Anzeichen für das Vorhandensein des Liganden in der Flüssigkeit bestimmt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Liganden-Analog mit einem Enzym markiert ist, und das Verfahren in Gegenwart eines Reagenz durchgeführt wird, das mit dem Enzym unter Erzeugung eines feststellbaren Farbstoffes reagiert.

11. Agglutinationsmethode zur Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei dem man:

A. die Flüssigkeit mit einem Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kontakt bringt,

unter Erzeugung eines Agglutinates des Reaktionsproduktes des Liganden und der immunologischen Spezies, bei dem man

B. das Agglutinat von nicht agglutinierten Materialien trennt, und bei dem man

C. das Agglutinat als Anzeichen des Vorhandenseins des Liganden in der Flüssigkeit bestimmt.

12. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei dem man:

unter Erzeugung eines unlöslichen immunologischen Komplexes zwischen der immunologischen Spezies und dem Liganden, bei dem man

B. vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe A, den Liganden mit einer zweiten immunologischen Spezies in Kontakt bringt, die immunologisch reaktiv mit dem Liganden ist, jedoch nicht immunologisch reaktiv mit der ersten immunologischen Spezies, wobei die zweite Spezies mit einem bestimmbaren Tracermaterial markiert ist,

um einen markierten unlöslichen Komplex zu erzeugen, und bei dem man

C. den markierten, unlöslichen Komplex als Anzeichen für das Vorhandensein des Liganden in der Flüssigkeit bestimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Ligand ein Antigen ist, und bei dem die erste und die zweite immunologische Spezies Antikörper bezüglich des Antigens sind.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Ligand ein Antikörper ist, bei dem die erste immunologische Spezies ein Antigen ist, das reaktiv mit dem Liganden ist, und bei dem die zweite immunologische Spezies ein Antikörper für den Liganden ist.