DE3685600T2 - Stabilisierte fluoreszierende seltenerd-indikatoren und physiologisch-reaktive kennsatz-spezies. - Google Patents
Stabilisierte fluoreszierende seltenerd-indikatoren und physiologisch-reaktive kennsatz-spezies.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft fluoreszierende Markierungen und fluoreszierend markierte physiologisch reaktive Spezies, die in biomedizinischen Studien und klinischen chemischen Bestimmungsmethoden verwendet werden können. Diese Markierungen und markierten Spezies sind insbesondere in spezifischen Bindungstests verwendbar, z.B. Immunoassays, um in menschlichen biologischen Flüssigkeiten einen spezifischen Bindungsliganden, wie zum Beispiel ein Hapten, zu bestimmen.
- Auf dem Gebiet der Medizin und klinischen Chemie werden viele Studien und Bestimmungen von physiologisch reaktiven Spezies, beispielsweise Zellen, Proteine, Enzyme, Cofaktoren, Nucleinsäuren, Substrate, Antigene, Antikörper, etc., unter Verwendung von Markierungen durchgeführt, die die Bestimmung oder Trennung der in Betracht gezogenen Materialien bei niedrigen Konzentrationen ermöglichen. Bei einer solchen Anwendung werden pathologische Zustände und Arzneimittel oder Narkotika in Menschen und Tieren dadurch bestimmt bzw. diagnostiziert, daß markierte Materialien in spezifischen Bindungsassays unter Verwendung der Prinzipien der kompetitiven Bindung eingesetzt werden.
- Wann immer Markierungen verwendet werden, ist die Empfindlichkeit von hervorstechender Wichtigkeit, da die zu bestimmende biologische Spezies im allgemeinen in sehr geringer Konzentration vorhanden ist. Verfahren, die sich radiometrischer Markierungen bedienen, sind im allgemeinen zur Bestimmung einer Reihe von Analyten geringer Konzentration nicht empfindlich genug. Darüberhinaus weisen radiometrische Markierungen den Nachteil auf, daß sie von geringer Lebenszeit sind und Gefahren bei der Handhabung mit sich bringen.
- Fluoreszensspektroskopie hat als eine der empfindlichsten und vielseitigsten Analysemethoden in den zurückliegenden Jahren zunehmend an Popularität bei der Überwindung der Nachteile der anderen Markierungsmethoden gewonnen. Bei der Fluoreszensspektroskopie wird eine Probe, die eine fluoreszierende Spezies enthält, mit dem Licht einer bekannten spektralen Verteilung innerhalb des Anregungsspektrums der fluoreszierenden Zielspezies bestrahlt. Die Intensität des sich ergebenden charakteristischen Emissionsspektrums des fluoreszierenden Zielmoleküls wird dann bestimmt und in Bezug gesetzt zu der Anzahl an Zielmolekülen, die in der Probe anwesend sind. Fluoreszensspektroskopie wird besonders für Studien der Proteinstruktur, bei bakteriellen Zellwandreaktionen und Konfirmationsänderungen in Enzymen, sowie zur Bestimmung von immunologisch aktiven Liganden in einem spezifischen Bindungsassay eingesetzt.
- Fluoreszierende Markierungen mit Chelaten eines Elementes der seltenen Erden, die in polymere Latexteilchen eingebracht wurden, werden in US-A-4 259 313 und US-A-4 283 382 beschrieben. Diese Markierungen zeichnen sich durch eine verbesserte Fluoreszenseffiziens aus und sind besonders mit Immunoassays einsetzbar. Die polymeren Teilchen dienen als Träger für immunologisch aktive Spezies, die direkt daran gebunden sind. Obwohl die beschriebenen Markierungen in den angegebenen Patentschriften wegen ihrer verbesserten Fluoreszenseffiziens einen Durchbruch in der klinischen Chemie ausmachen, besteht das Bedürfnis, diese wässrigen Lösungen stabiler zu machen. Die Markierungen der zuvor genannten Patentschriften neigen zu spontaner Agglutination und Sedimentierung der Suspensionen. Deshalb haben sie eine verkürzte Lagerzeit. Darüberhinaus neigen sie zu einer vorzeitigen Agglutination während eines Tests. Die Markierungen der oben genannten Patentschriften werden aus irgendeiner von drei Comonerenarten hergestellt, aber die verschiedenen erhaltenen Copolymere lassen die gewünschte Suspensionsstabilität vermissen.
- Die zuvor beschriebenen Probleme werden durch eine Flüoreszensmarkierung gelöst, die ein fluoreszierendes Chelat auf Basis seltener Erden enthält, das in eine Polymerteilchen einverleibt ist, das sich von einem beladbaren Latex mit einer diskontinuierlichen Phase und einer wässrigen Phase ableitet, wobei die diskontinuierliche Phase ein Polymer umfaßt:
- (a) aus 50 bis 96 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten, die sich von einem hydrophoben, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren ableiten,
- < (b) 2 bis 30 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten, die sich von einem nicht-ionogenen, hydrophilen, ethlenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableiten und
- (c) 2 bis 30 Gew. -% wiederkehrenden Einheiten, die sich von einem anionischen, ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren mit mindestens einer Carboxygruppe ableiten.
- Die Erfindung stellt darüberhinaus eine fluoreszierende markierte physiologisch aktive Spezies bereit, die eine physiologisch aktive Spezies ist, gebunden an eine fluoreszierende Markierung, die einen fluoreszierenden Seltenerdchelaten umfaßt, der in ein Polymerteilchen einverleibt ist, das sich von einem beladbaren Latex mit einer diskontinuierlichen Phase und einer wässrigen Phase ableitet, wobei die fluoreszierende markierte physiologisch aktive Spezies dadurch gekennzeichnet ist, daß die fluoreszierende Markierung, die zuvor beschriebene ist.
- Darüberhinaus stellt die Erfindung ein trockenes analytisches Element mit einem adsorbierenden Trägermaterial und einein Gehalt einer fluoreszierend markierten physiologisch aktiven Spezies bereit, wobei die physiologisch aktive Spezies an die fluoreszierende Markierung gebunden ist, und das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß die Markierung die oben beschriebene ist.
- Insbesondere umfaßt ein trockenes analytisches Element zur Bestimmung von immunologisch reaktiven Liganden in einem Immunoassay einen Träger mit einer porösen Ausbreitungszone darauf, der ein fluoreszierendes markiertes spezifisches bindendes Liganden-Analoges eines Liganden enthält, wobei das markierte Analogon den an die fluoreszierende Markierung gebundenen Liganden umfaßt und das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß die Markierung die oben beschriebene ist.
- Ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Liganden in einer wässrigen Flüssigkeit umfaßt die folgenden Schritte:
- A. In Gegenwart eines Rezeptors für den Liganden wird eine Probe der Flüssigkeit mit einem fluoreszierend markierten immunologisch aktiven Liganden-Analogen kontaktiert, wobei das Liganden-Analogoe den an die fluoreszierende Markierung gebundenen Liganden, wie oben beschrieben, umfaßt, unter Bildung eines Komplexes zwischen dem Rezeptor und dem Liganden-Analogen und
- B. fluorometrische Bestimmung des Liganden-Analogon.
- Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostischer Test- Kit für die Bestimmung eines immunologisch aktiven Liganden mit
- (i) einem Receptor für den Liganden und
- (ii) einem fluoreszierend markierten immunologisch aktiven Liganden-Analogen mit dem an eine fluoreszierende Markierung gebundenen Liganden, wobei das Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß die Markierung die oben beschriebene ist.
- Es wurde festgestellt, daß gewisse fluoreszierende Markierungen und markierte Spezies mit darin enthaltenen Seltenerdchelaten in wässrigen Lösungen besonders stabil sind. Die Materialien dieser Erfindung neigen nicht zu einer vorzeitigen Agglomerierung während sowohl der Lagerung als auch der Verwendung. Diese Materialien sind besonders bei spezifischen Bindungsassays einzusetzen. Aber sie können darüberhinaus in einer Vielzahl von biomedizinischen Untersuchungen eingesetzt werden, bei denen eine Markierung irgendeiner physiologisch reaktiven Spezies erwünscht ist. Diese Markierungen zeichnen sich durch die gewünschte hohe Empfindlichkeit, die mit der Verwendung der Fluoreszensspektroskopie verbunden ist, aus. Die unerwarteten und signifikant verbesserten Eigenschaften der Materialien gemäß der Erfindung werden erhalten, weil Polymere verwendet werden, die durch eine spezifische Kombination der ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Polymere, wie oben beschrieben, erhalten wurden.
- Ganz besonders können die fluoreszierenden Markierungen der Erfindung als Sonden oder markierende Materialien bei einer Vielzahl biomedizinischer Untersuchungen und Bestimmungen der klinischen Chemie verwendet werden. Sie können als markierte Zellen oder andere physiologisch aktive Spezies zum Einsatz gelangen, eingeschlossen Proteine, Nucleinsäuren (zum Beispiel DNS), Enzyme, Enzymsubstrate, Cofaktoren, Viren, Leukozyten, Wachstumsfaktoren, Leptine, Antigene, Antikörper, Haptene, Metaboliten, Hormone, Toxine, Radioisotope und andere dem Fachmann bekannte Substanzen. Die Markierungen werden in einer geeigneten Weise an die biologischen Materialien angeheftet, beispielsweise covalent oder durch Adsorption.
- Die Markierungen sind ganz besonders bei spezifischen Bindungsassays brauchbar, bei denen Analyten bestimmt werden (beispielsweise immunologisch aktive Spezies). Bei diesen Tests wird die zu bestimmende Spezies an eine Markierung gebunden und die markierte Spezies dann kompetitiv nicht-markierten Spezies der Testprobe mit einem gemeinsamen Reaktanden zur Reaktion gebracht. Der zu bestimmende Analyt ist hier als Ligand anzusehen, der markierte Analyt als Liganden-Analoges. Verbindungen, die spezifisch den Liganden und das Liganden-Analogon erkennen und mit diesen unter Bildung eines Komplexes reagieren, werden hier als Rezeptoren bezeichnet. Bei der Durchführung eines derartigen Tests wird der Ligand kompetitiv mit dem Liganden-Analogen zur Bindung an den Rezeptor eingesetzt. Unbekannte Konzentrationen des Liganden können aus den gemessenen Signalen des markierten Liganden-Analogen abgeleitet werden. Die Komplexierungsreaktion verläuft wie folgt:
- Ligand + markiertes Liganden-Analoges + Rezeptor Ligand - Rezeptor + markiertes Liganden-Analoges - Rezeptor.
- Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist der Ligand ein Antigen oder Antikörper, das markierte Liganden-Analogen ein markiertes Antigen oder markierter Antikörper und der spezifische Bindungsassay ein Immunoassay. Bei der nun folgenden Diskussion und Vorstellung der Beispiele wird in erster Linie auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, wobei aber der Umfang der Erfindung alle anderen denkbaren spezifischen Bindungsassay mitumfaßt.
- Die erfindungsgemäßen Markierungen umfassen polymere Latexteilchen, die ein Seltenerd-Chelat enthalten. Diese Markierungen sind "wässrig stabilisiert", was im Kontext der Anmeldung bedeutet, daß die Fluoreszens der Chelate in einer wässrigen Umgebung nicht gelöscht wird.
- Im allgemeinen ist irgendein fluoreszierendes Seltenerd-Chelat, das ein fluoreszierendes Verhalten aufweist, zur Durchführung der Erfindung geeignet. Insbesondere umfassen die Chelate Seltenerd-Metalle (beispielsweise ein Lanthanidenmetall) wie Europium oder Terbium. Europium wird ganz besonders bevorzugt.
- Das Chelat umfaßt auch geeignete Chelatierungsmittel. Besonders geeignete Chelatierungsmittel sind 1,3-Diketone (beispielsweise Acetylacetonat, p-Benzoylacetonat, p-Benzoylbenzoat, Trifluor-2-Furylacetylaceton, etc.), Phthalate, Naphthoate (beispielsweise Dinaphthoylmethid, etc.), Dipyridine (beispielsweise 2,2'-Dipyridin-1,1'-Dioxid, 4,4'-Dimethyl-2,2'-Dipyridin, etc.), Terpyridine (beispielsweise 2,2',6',2"-Terpyridin, etc.) und Phenanthroline (beispielsweise o-Phenanthrolinisothiocyanat, etc.). Andere Chelatierungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Die 1,3-Diketone werden bevorzugt.
- Die erfindungsgemäßen Markierungen werden mit beladbarem Latex hergestellt. Einzelheiten der "Beladung" des Latex der erfindungsgemäß zu verwenden ist, enthalten die zuvor erwähnten US-A-4 259 313 und US-A-4 283 382.
- Im allgemeinen werden die Chelate in die polymeren Teilchen dadurch einverleibt, daß allmählich die Hydrophilität einer Lösung des Chelats in einem wassermischbaren Lösungsmittel in Gegenwart der nicht-coagulierten, nicht-gelösten beladbaren polymeren Latexteilchen bis zu einem Punkt erhöht wird, bei dem im wesentlichen kein Chelat gelöst im wassermischbaren Lösungsmittel zurückbleibt. Mit bis zu 7,5% (bezogen auf das Polymergewicht) des Chelats können die Polymerteilchen auf diese Weise "beladen" oder durchtränkt werden. Die Konzentration des Chelates in den polymeren Teilchen wird in gewissen Grenzen variieren, entsprechend der besonderen Verwendung der beabsichtigten Markierung. Die Herstellung einer fluoreszierenden Markierung nach der Errfindung wird im Beispiel 1 unten beschrieben.
- Verwendbares beladbares Polymerlatex umfaßt eine polymere diskontinuierliche Phase (Teilchen), die im wesentlichen aus einem oder mehreren Polymeren besteht, die aus ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, wie unten beschrieben erhalten wurden, und einer wässrigen Phase. Die polymeren Teilchen dieses Latex haben im allgemeinen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,01 bis 2 um und vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 um.
- Die polymeren Teilchen sind Copolymere umfassend:
- (a) 50 bis 96 Gew.-%, vorzugsweise 75 bis 92 Gew.-5 wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren hydrophoben ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableiten,
- (b) 2 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-% wiederkehrende Einheiten, die sich von einem oder mehreren nichtionogenen hydrophilen ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableiten und
- (c) 2 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten, die sich von einem oder mehreren anionischen ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren mit mindestens einer Carboxygruppe ableiten.
- Verwendbare hydrophobe Monomere der Gruppe (a) schließen Vinylaromaten, substituierte oder unsubstituierte Styrole und Vinylnaphtaline, und Acryl- und Methacrylsäurealkylester ein. Die substituierten oder unsubstituierten Styrole werden bevorzugt. Beispielhafte Monomere schließen Styrol, α-Methyl-Styrol, p-Bromstyrol, Vinyltoluol, 1-Vinylnaphthalin, Methylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, n-Butylacrylat, Propylacrylat und andere dem Fachmann bekannte ein. Diese Monomere sind hydrophob, was bedeutet, daß sie allgemein in Wasser unlöslich sind (beispielsweise weniger als 30 mg/ml Wasser). Styrol und Vinyltoluol sind besonders geeignete Monomere.
- Die Monomere der Gruppe (b) sind nicht-ionisch, aber hydrophil, beispielsweise sind sie wasserlöslich oder wasserdispergierbar (beispielsweise größer als 100 mg/ml Wasser). Im allgemeinen haben sie eine oder mehrere ungeladenen Gruppen, die die Löslichkeit bewirken, so Hydroxy, Amid (substituiert oder unsubstituiert), cyclisches Amid, Sulfon-Amid und dergleichen. Beispielhafte Monomere umfassen Acrylamid, Methacrylamid, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat, 2-Acrylamido-2-Hydroxymethyl-1,3-Propandiol, N-Methylmethacrylamid, N-Vinylpyrrolidon und andere, die dem Fachmann bekannt sind. Acrylamid, Methacrylamid, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat und 2-Hydroxyethylmethacrylat sind besonders verwendbar, wobei Monomere mit Amidgruppen besonders bevorzugt sind.
- Verwendbare anionische Monomere der Gruppe (c) umfassen Monomere mit einer oder mehreren Carboxygruppen und entsprechenden Salzen. Beispielhafte Monomere schließen Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure und Alkali- und Ammoniumsalze dieser Säuren sowie andere dem Fachmann geläufige ein. Acrylsäure, Methacrylsäure und Itaconsäure sind besonders verwendbar.
- Beispielhafte Polymere, die bei der Durchführung der Erfindung verwendbar sind, schließen Poly (Styrol-co-Acrylamid-co-Methacrylsäure) (85:10:5 Gewichtsverhältnis), Poly(Styrol-co-Methacrylamid-co-Methacrylsäure) (85:10:5 Gewichtsverhältnis), Poly(Vinyltoluol-co-N-Isopropylacrylamid-co-Itaconsäure) (65:20:15 Gewichtsverhältnis), Poly(n-Butylacrylat-co- Styrol-co-Methacrylamid-co-Methacrylsäure) (45:45:2:8 Gewichtsverhältnis), Poly (Methylmethacrylat-co-2-Hydroxyethylacrylat-co-Acrylsäure) (90:5:5 Gewichtsverhältnis) und Poly(n-Butylacrylat-co-Styrol-co-Acrylamid-co-Methylsäure) (54:38:5:3 Gewichtsverhältnis) ein. Das zuerst genannte Polymer ist ein bei der Verwendung der Erfindung bevorzugtes Polymer. Der beladbare Polymerlatex, der zur Herstellung der fluoreszierenden Markierungen verwendet wird, kann durch allgemein bekannte Emulsionspolymerisationstechniken hergestellt werden. Im allgemeinen werden diese unter Verwendung einer durch freie Radikale initiierten Reaktion der Monomere, in einem wässrigen Medium mit einem oder mehreren geeigneten oberflächenaktiven Substanzen, hergestellt. Die markierten physiologisch reaktiven Spezies der Erfindung können durch Vermischung der fluoreszierenden Markierung mit der physiologisch aktiven Spezies über einen geeigneten Zeitraum (beispielsweise bis zu 72 Stunden) erhalten werden, wodurch die Adsorption der Spezies an der Oberfläche der polymeren Teilchen erleichtert wird. Alternativ können die Spezies covalent an die Oberfläche der polymeren Teilchen gebunden werden, wobei sowohl Spezies als auch Teilchen chemisch modifiziert werden, so daß sich eine geeignete Reaktionsstelle ergibt. Einzelheiten der Herstellung einer beispielhaft markierten Spezies sind im Beispiel 1 unten angegeben. Das fluoreszierende markierte spezifisch bindende Liganden-Analogen der Erfindung kann in spezifischen Bindungsimmunoassays eingesetzt werden, insbesondere bei solchen, die eine temporäre Auflösung des spezifischen Bestimmungssignals einsetzen, um es von einem Hintergrund abzusetzen. Bei diesem Immunoassay wird eine Probe der wässrigen Testflüssigkeit in intermittierender Weise erregt und Informationen nur während der Dunkelphasen angenommen, während der die langlebige fluoreszierende Markierung noch immer stark emittiert und während andere Ursachen der Fluoreszens abgeklungen sind. Diskontinuierliche Anregung kann auf eine Vielzahl von Arten erreicht werden, wobei gepulste Laser, mechanisches Abschneiden eines kontinuierlichen Anregungsstrahls, wobei die Probe in den Anregungsstrahl hinein und herausbewegt wird, etc. Im allgemeinen sind Fluoreszensimmunoassaymethoden im Stand der Technik bekannt.
- Bei der Durchführung der Erfindung zeigt das markierte Liganden-Analogen die Menge des unbekannten Liganden in der Testprobe an. Sowohl die gebundene als auch die ungebundene Fraktion des markierten Liganden-Analogens kann bestimmt werden. Falls erforderlich, kann bei der Durchführung des spezifischen Bindungsassays mittels bekannter Techniken die physikalische Trennung von gebundenem und ungebundenem Liganden vorgenommen werden.
- Bei einem Lösungsassay ist das fluoreszierend markierte spezifische Liganden-Analogen im allgemeinen in Konzentrationen von bis zu 1, vorzugsweise von 0,01 bis 1 mg/dl Lösung vorhanden. Der dem zu bestimmenden Liganden (oder Analyten) entsprechende Rezeptor ist im allgemeinen in Mengen von bis zu 1 und vorzugsweise von 10&supmin;&sup6; bis 1 g/dl Lösung vorhanden. Andere Materialien, wie beispielsweise Puffer, oberflächenaktive Substanzen, etc. können in geeigneten Mengen falls erwünscht zugegeben werden.
- Sowohl das Liganden-Analoge als auch das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl an Lösungs- als auch trockene Assays angepaßt werden. Das Liganden-Analogen, zusammen mit seinem Rezeptor, kann als Teil eines diagnostischen Testkits für entweder trockene oder Lösungsassays bereitgestellt werden. Bei Lösungsassays können die Kitkomponenten als gefriergetrocknete Reagenzien in individueller Verpackung mit vorbestimmter Menge vorgesehen sein. Alternativ können sie in Flaschen oder andersartig verpackten Lösungen vorgesehen sein, so daß sie für ein oder mehrere Assays ausreichen. Andere optionelle Reagenzien können ebenfalls in dem Kit enthalten sein, zusammen mit geeigneten Assayutensilien oder Behältern zur Durchführung des Assays. Ein trockenes analytisches Element (weiter unten beschrieben) mit einem Liganden-Analogen kann ebenso als Teil eines diagnostischen Kits bereitgestellt werden.
- Im allgemeinen werden das Liganden-Analogen, der entsprechende Rezeptor und die Testprobe, von der angenommen wird, daß sie einen Ligandenanalyten enthält, in physikalischen Kontakt gebracht und in einem geeigneten Behälter gemischt (beispielsweise Teströhrchen, Petrischale, Becherglas, Küvette, etc.). Die enthaltende Lösung kann dann gewünschtenfalls über einen Zeitraum (beispielsweise 0,5-4 Stunden) bei einer Temperatur von bis zu 37ºC inkubiert werden, um die Bildung des Rezeptorkomplexes mit sowohl der Liganden-Analogen als auch dem Liganden in der Testprobe zu fördern. Die Probe wird dann durch Messung der Fluoreszens an gebundener (beispielsweise komplexiert) oder ungebundener (beispielsweise nicht-komplexiert) Markierung bewertet. Eine solche Bewertung kann visuell oder mittels geeigneter fluorometrischer Bestimmungsausrüstungen und Verfahren durchgeführt werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mittels eines trockenen analytischen Elementes angewandt werden, wobei das Element aus einem adsorbierenden Trägermaterial besteht, beispielsweise dünne Schichten eines selbsttragenden adsorbierenden oder saugfähigen Materials, wie Filterpapier oder Streifen, die die erfindungsgemäße markierte physiologische markierte Spezies enthalten. Ein solches Element kann darüberhinaus einen Rezeptor für einen spezifischen Bindungsassay enthalten, der in geeigneter Weise immobilisiert und vor einem Test von dem entsprechenden Liganden-Analogen isoliert gehalten wird. Solcherlei Elemente sind im Stand der Technik bekannt als Teststreifen, diagnostische Elemente, Tauch-Stäbchen, diagnostische Mittel und dergleichen.
- Wenn ein trockenes analytisches Element eingesetzt wird, kann das Liganden-Analogen der Erfindung in ein geeignetes adsorbierendes Trägermaterial durch Imprägnierung oder Eintauchen eingebracht werden oder das geeignete adsorbierende Material kann damit beschichtet werden. Brauchbare Trägermaterialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität, wenn sie Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten wie Urin oder Serum ausgesetzt werden. Brauchbare Trägermaterialien können aus Papier, porösen partikulären Strukturen, Cellulose, porösem polymeren Film, Holz, Glasfasern, gewebten oder nicht-gewebten Stoffen (synthetisch und nicht synthetisch) und dergleichen hergestellt werden. Brauchbare Materialien und Verfahren zur Herstellung solcher Elemente sind im Stand der Technik gut bekannt, wie beispielsweise aus US-A-3 092 465, US-A-3 802 842, US-A-3 915 647, US-A-3 917 453, US-A-3 936 357, US-A-4 248 829, US-A-4 255 384, US-A-4 270 920 und GB-B-2 052 057.
- Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elemente wenigstens eine poröse Ausbreitungszone als das adsorbierende Trägermaterial. Diese Zone kann selbsttragend sein (beispielsweise bestehend aus einem Material, das seine Integrität aufrechterhält), vorzugsweise ist sie auf einem separaten nicht-porösen Träger angeordnet. Ein solcher Träger kann aus jedem geeigneten dimensionsstabilen und vorzugsweise transparentem Material (beispielsweise strahlungsdurchlässig) bestehen, das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen etwa 200 bis etwa 900 nm durchläßt. Brauchbare Trägermaterialien schließen Papier, Metallfolien, Polystyrol, Polyester (beispielsweise Polyethylenterephthalat), Polycarbonate, Celluloseester (beispielsweise Celluloseacetat) ein.
- Die poröse Ausbreitungszone kann aus irgendeinem geeigneten faserigen oder nicht faserigen Material oder Mischungen davon hergestellt werden, wie beschrieben in US-A-4 292 272, US-A-3 992 158, US-A-4 258 001 und US-A-4 430 436, sowie der japanischen Offenlegungsschrift 57(1982)-101760. Es ist erwünscht, daß die Ausbreitungszone isotrop porös ist, was bedeutet, daß die Porosität, wie sie durch miteinander verbundene Räume oder Poren zwischen Teilchen, Fasern, polymeren Strängen und dergleichen hervorgerufen wird, in der Zone in jeder Richtung die gleiche ist.
- Die Elemente können eine oder mehrere Reagenzzonen, Ausbreitungszonen, Aufzeichnungszonen, beizende Zonen, Strahlungs-Sperr- oder Filterzonen, Grundierungszonen, Grenzzonen, Pufferzonen und dergleichen sein. Die Zonen sind im allgemeinen in flüssigem Kontakt untereinander, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und Reaktionsprodukte aufeinander folgende Regionen angrenzender Zonen passieren können. Vorzugsweise sind die Zonen separat übereinandergeschichtete Schichten, obwohl 2 oder mehr Zonen getrennte Flächen in einer Schicht ausmachen können.
- Das fluoreszierend markierte Liganden-Analogen der Erfindung kann in irgendeiner Zone des Elementes enthalten sein. Alternativ kann es einer Testprobe hinzugegeben werden, die darauf mit dem Element in Kontakt gebracht wird oder das Liganden-Analogen kann separat (entweder aufeinanderfolgend oder simultan) dem Element mit der Testprobe zugeführt werden. Der dem zu bestimmenden Liganden entsprechende Rezeptor kann in irgendeiner Zone des Elementes in immobilisierter Form vorliegen oder dem Element zugleich mit der Testprobe zugeführt werden. Falls sowohl das Liganden-Analogen als auch der Rezeptor in dem Element enthalten sind, müssen diese voneinander getrennt gehalten werden, bis der Assay durchgeführt wird.
- In den erfindungsgemäßen Elementen kann die Beschichtungsstärke mit dem Liganden-Analogenn weit variieren. Im allgemeinen ist die Beschichtungsstärke bis zu 1 vorzugsweise von 10&supmin;&sup6; bis 1 g/m². Der Rezeptor kann mit einer Beschichtungsstärke von bis zu 200, vorzugsweise von 40 bis 200 g/m² vorhanden sein. Eine Vielzahl anderer gewünschter aber optionaler Reagenzien und Zusätze kann in dem Element in Mengen vorhanden sein, die dem Fachmann geläufig sind. Solcherlei Materialien schließen interaktive Reagenzien, oberflächenaktive Substanzen, Puffer, Binder, Pigmente, Aktivatoren, etc. ein.
- Eine Vielzahl unterschiedlicher Elemente, abhängig von dem Testverfahren, kann nach der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Die Elemente können in einer Vielzahl von Formen bereitgestellt werden, einschließlich längerer Bänder irgendeiner gewünschten Breite, Blätter, Objektträger oder Chips. Der erfindungsgemäße Assay kann manuell oder automatisiert betrieben werden. Bei Verwendung der trockenen Elemente wird die Bestimmung eines Liganden im allgemeinen so durchgeführt, daß ein Element von einer Vorratsrolle, einer Chippackung oder anderen Quelle genommen und in physikalischen Kontakt mit einer Probe der zu untersuchenden Flüssigkeit (beispielsweise 1-100 ul) in Gegenwart eines Rezeptors gebracht wird, so daß die Testprobe, die Reagenzien und der Rezeptor innerhalb des Elementes vermischt werden. Eine solche Kontaktierung kann in jeder geeigneten Weise erreicht werden, beispielsweise durch Eintauchen oder Untertauchen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise durch Betröpfeln des Elementes von Hand oder durch eine Maschine mit einem Tropfen der Probe mittels eines geeigneten Spenders.
- Nach dem Auftragen der Probe wird das Element Bedingungen unterworfen, wie beispielsweise Inkubation, Erhitzen oder dergleich, die zur Beschleunigung oder anderen Erleichterung zum Erhalt des Testergebnisses erwünscht sind. Die Bestimmung des Liganden wird durch Messung der Fluoreszens, entweder des gebundenen (beispielsweise komplexierten) oder ungebundenen (beispielsweise nicht-komplexierten) markierten Liganden-Analogen erhalten.
- Die folgenden Beispiele sollen die Durchführung der vorliegenden Erfindung näher erläutern. In diesen Beispielen wurden die vorliegenden Materialien eingesetzt: BRIJ 98 oberflächenaktives Mittel von ICI Americas, Inc. (Wilmington, Delaware, U.S.A.), SURFACTANT 10G oberflächenaktives Mittel von Olin Corp. (Stamford, Connecticut, U.S.A.), bovines Rindergammaglobulin von Miles Research Products (Elkhart, Indiana, U.S.A.), 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoethyl)carbodiimid Metho-p-Toluolsulfonat von Bio-Rad Laboratories (Richmond, California, U.S.A.), die übrigen Substanzen wurden entweder durch an sich bekannte Verfahren hergestellt oder von Eastman Organic Chemicals (Rochester, New York, U.S.A.) erhalten.
- In einem 1-Liter Kolben, der mit einem Zusatzkolben ausgestattet ist, wurde SURFACTANT 10G oberflächenaktives Mittel (1 g) und Wasser (350 ml) bei 95ºC unter mäßigem Rühren erhitzt. In dem Zusatzkolben wurde eine Mischung von Styrol (85 g), Acrylamid (10 g), Methacrylsäure (5 g), Na&sub2;S&sub2;O&sub5; (0,15 g) und H&sub2;O (50 ml) gründlich mit 1 g von SURFACTANT 10G oberflächenaktives Mittel (50%) emulgiert, wobei der Inhalt des Kolbens unter ständigem Rühren gehalten wurde. Die Polymerisation wurde durch Zusatz von K&sub2;S&sub2;O&sub5; (0,75 g) und Na&sub2;S&sub2;O&sub5; (0,15 g) in den Reaktionskolben initiiert, woran sich die Zugabe der emulgierten Monomermischung unmittelbar anschloß. Die Monomeren wurden über einen Zeitraum von 15 bis 20 Minuten zugeführt und die Polymerisation über zusätzliche 2 Stunden fortgesetzt. Das erhaltene beladbare Latex wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und gefiltert. Nach einer Dialyse gegen distilliertes Wasser über etwa 100 Stunden wurde ein Latex mit einem Gesamtfeststoffgehalt von 8,5 Gew.-%, einem pH von 3,6 und einer Oberflächenspannung von 6,32 x 10&supmin;&sup4; N/cm (63,2 dynes/cm). Die Teilchengröße war recht einheitlich (0,09-0,1 um Durchmesser).
- Zur Entfernung von gelösten Polymeren und überschüssigem oberflächenaktivem Mittel von dem Latex wurde das Verfahren der Diafiltration/Ultrafiltration unter Verwendung einer kommerziellen Diafiltrationsvorrichtung mit einer Membran einer Ausschlußgrenze von 300 000 MW durchgeführt. Nach etwa 100 Durchführungen wurde das Latex durch Ultrafiltration auf einen Gesamtfeststoffgehalt von etwa 8% konzentriert. Alternativ kann das Latex auch dadurch gereinigt werden, daß die Verfahren der Zentrifugation und Redispergierung mehrere Male wiederholt werden unter Verwendung einer kommerziellen präparativen Beckmann-Ultrazentrifuge, die unter Vakuum mit 40 000 Umdreh./min. über eine Stunde betrieben wird, woraufhin der Überstand dekantiert wird. Die polymeren Teilchen können durch destilliertes Wasser redispergiert und das Verfahren drei oder viermal wiederholt werden. Die folgende Tabelle I zeigt die Wirkungen einer Diafiltration oder Ultrazentrifugierung auf analysierte Wasserphasenpolymere. Tabelle I % Feststoffe (insgesamt) % Polymer der wässrigen Phase Methacrylsäure* in der wässrigen Phase (Original) (diafiltriert) *freie oder polymerisierte Methacrylsäure gelöst in der wässrigen Phase.
- Die obenstehenden Resultate zeigen, daß im wesentlichen keinerlei freie Methacrylsäure in der wässrigen Phase nach der Reinigung zurückbleibt.
- Es wurde eine 0,5 Gew.-%ige Lösung von Europiumchelat in Aceton durch Auflösung von 0,8695 g Europium-Thenoyltrifluoracetonat (10&supmin;³ Mol) und 0,7732 g Trioctylphosphinoxid (2 x 10&supmin;³ Mol) in Aceton und Einstellung des Gesamtgewichts auf 328,5 g mit zusätzlichen Mengen Aceton erhalten.
- 50 g der sich ergebenden Lösung wurde mit 20 ml Aceton verdünnt. Gereinigtes Latex, enthaltend 5 g Polymer, wurde ebenso auf 65,6 g mit Wasser verdünnt und dann unter mäßigem Rühren der Eu&spplus;³ Chelatlösung hinzugegeben. Aceton wurde im Anschluß daran unter Vakumm bei 60ºC entfernt. Nach Filtration durch ein grobes Papier wurde eine gute Dispersion erhalten. Kein Coagulum wurde gesammelt. Die endgültige Dispersion enthielt die stabile fluoreszierende Markierung mit 8,0 Gew.-%.
- Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurde ein stabiler Latex aus Poly(Styrol-co-Methacrylamid-co-Methacrylsäure) (85 : 10 : 5 Gewichtsverhältnis) mit einem Feststoffgehalt von 21,6% erhalten. Das Latex wurde auf 10% Feststoffgehalt verdünnt und mit 40 000 U/min zentrifugiert, wodurch ein gereinigtes Latex erhalten wurde, das in der wässrigen Phase im wesentlichen frei von Methacrylsäure war. Europiumchelat wurde in die Latexteilchen unter Verwendung des Verfahrens des Beispiels 1 einverleibt, wobei sich eine stabile fluoreszierende Markierung ergab.
- Die Herstellung eines fluoreszierend markierten Thyroxinanalogen umfaßt ein zweistufiges Verfahren: Synthese eines L-Thyroxin-bovines-Gammaglobulinkonjugats, woran sich die Bindung des Konjugats an eine fluoreszierende Latexmarkierung, die nach dem Beispiel 1 erhalten wurde, anschließt.
- Die Konjugate können in verschiedenen Hapten/Protein-Verhältnissen hergestellt werden, beispielsweise 1 : 1, 2 : 1, etc., in Abhängigkeit von dem molaren Verhältnis der verwendeten Partner. Ein Beispiel für ein Hapten:Protein-Konjugat mit einem 1 : 1 Verhältnis wird weiter unten beschrieben. Das Molverhältnis L-Thyroxin (T&sub4;) von bovinem Gammaglobulin (BGG) wurde entweder durch spektrophotometrische Analyse mit einem kommerziellen Cary 219 Spektrophotometer oder durch Jodanalyse bestimmt. Der Prozentgehalt an Jod wurde durch Reaktionsaktivationsanalyse bestimmt. Eine flüssigchromatographische Analyse an freiem Thyroxin wurde auf einer kommerziellen Lichrosorb 11 uRP8 4,6 x 250 mm Säule unter Verwendung 2%iger Phosphorsäure und Acetonitril als mobile Phase durchgeführt.
- L-Thyroxin wurde direkt an BGG gekoppelt über die Bildung einer Amidbindung gemäß der folgenden Gleichung:
- In 300 ml gerührtem entsalztem Wasser wurden 1,0 g (6,7 x 10&supmin;&sup6; Mol) BGG gelöst. Der pH der Lösung wurde auf 7,5 mit 0,3 normalem Natriumhydroxid eingestellt.
- Zu 20 ml N,N-Dimethylformamid wurden 0,08 g (1,0 x 10&supmin;&sup4; Mol) Thyroxin zugefügt. Der pH der gerührten Mischung wurde mit einer 0,3 normalen Natriumhydroxidlösung so lange erhöht bis das gesamte Thyroxin aufgelöst war.
- Nachdem der gerührten Proteinlösung 0,08 g (1,9 x 10&supmin;&sup4; Mol) 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoethyl) carbodiimid Metho-p-Toluolsulfonat hinzugefügt wurde, wurde die Thyroxinlösung tröpfchenweise zugefügt. Der pH der Reaktionsmischung wurde auf Werte zwischen 7,5 und 8,0 während der Zugabe gehalten und bei einem pH von 7,5 über 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und schließlich gegen laufendes destilliertes Wasser über 48 Stunden dialysiert. Die Dialyse wude fortgesetzt gegen 4 Liter 1%iger Rinderserumalbumin (BSA) Lösung über 24 Stunden und im Anschluß daran über eine Stunde gegen laufendes destilliertes Wasser. Die gefriergetrockneten Konjugate wogen 0,85 g. Ein Molverhältnis 3 von Thyroxin zu BGG wurde durch spektrophotometrische Analyse bestimmt.
- In einer gerührten Mischung, die aus 40 ml N,N-Dimethylformamid und 120 ml entsalztem Wasser bestand, wurde eine Probe von 0,4 g des Konjugats gelöst. Die Lösung wurde gegen 4 Liter destilliertes Wasser bei einem pH von 7,5 über 48 Stunden (enthaltend 4,5 g 8-Anilino-1-Naphtalinsulfonsäure) dialysiert, woran sich eine Dialyse gegen laufendes destilliertes Wasser über 72 Stunden anschloß. Als gefriergetrocknetes Dialysat wurden 0,37 Konjugat erhalten. Bei einem Verhältnis Thyroxin:BGG = 1 errechnet sich die Jodanalyse zu 0,33. Die festgestellte Analyse ergab 0,22. Der Gehalt an freiem Thyroxin wurde mittels einer flüssig-chromatographischen Analyse als kleiner als 0,1% festgestellt.
- Alternativ wurde T&sub4; an BGG über einen Triethylentetraaminextender an einen Kohlenwasserstoffteil gemäß folgender Gleichungen gebunden:
- In 20 ml Natriumacetatpuffer (0,1 Molar, pH 8,0) wurden 0,5 g (3,6 x 10&supmin;&sup6; Mol) BGG gelöst. Zu dieser Lösung wurde 40 ml 0,02 molare Natriumperiodatlösung eines pHs von 8,0 hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, dann wurden 3 ml Ethylenglykol hinzugefügt und das Rühren über 45 Minuten fortgesetzt.
- Triethylentetraamin (2 ml) wurde der Reaktionsmischung hinzugefügt und das Rühren bei Raumtemperatur über 72 Stunden fortgesetzt. Es wurde Natriumborhydrid (0,4 g) hinzugegeben und das Rühren über 2 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde schließlich gegen laufendes destilliertes Wasser über 48 Stunden dialysiert.
- Das Dialysat wurde auf 150 ml verdünnt und 0,06 g (1,4 x 10&supmin;&sup4; Mol) 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoethyl)carbodiimid Metho-p-Toluolsulfonat hinzugefügt. Nachdem das Carbodiimid sich aufgelöst hatte, wurde der pH der Reaktionsmischung auf 7,5 mit einer 0,3 normalen Hydroxidlösung eingestellt und in 20 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöste 0,01 g (1,2 x 10&supmin;&sup5; Mol) Thyroxin tröpfchenweise hinzugefügt (Zusatz von 0,3 normalem Natriumhydroxid war erforderlich, um das Thyroxin in DMF aufzulösen). Während der Zugabe wurde der pH der Reaktionsmischung mittels Zusätzen an verdünnter Salzsäure auf einen pH von 7,5 gehalten. Zusätzliche 0,05 g Carbodiimid wurden hinzugefügt und die Reaktionsmischung über 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über 48 Stunden gegen 4 Liter destilliertes Wasser dialysiert, woran sich die Dialyse über 72 Stunden gegen 1%ige BSA-Lösung anschloß. Das gefriergetrocknete Produkt wog 0,39 g. Eine errechnete Jodanalyse für ein Molverhältnis Thyroxin zu BGG von 2 ist 0,67. Die gefundene Analyse zeigte 0,56.
- Direkt gekoppelte Konjugate mit einem Thyroxin:BGG Verhältnis von 2:1 oder 1:1 wurden an die Markierung des Beispiels 1 über die Bildung von Amidbindungen zwischen der Aminogruppe des Proteins und der Carbonsäuregruppe des Latex gebunden. Carbodiimid wurde als Kondensierungsmittel verwendet.
- Das Molarverhältnis Konjugat zu Latex wurde in der Reaktionsmischung zwischen 17,5 und 140, wie die Tabelle II zeigt, variiert. Nach der Reaktion des Latex mit dem Konjugat wurden nicht abreagierte Carbonsäuregruppen auf der Oberfläche des Latex durch Behandlung mit Ethanolamin blockiert.
- Zu 24 ml entalztem Wasser, eingestellt auf einen pH von 7,7, wurden 5,3 Liter der Markierung des Beispiels 1 hinzugefügt (8% Feststoffgehalt, 3,2 x 10-9 Mol). Der pH der gerührten Suspension wurde auf 7,7 gehalten und 0,0084 g (1,9 x 10&supmin;&sup5; Mol) 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoethyl)-Carbodiimid Metho-p-Toluolsulfonat wurden hinzugefügt, gefolgt von 0,068 g (4,4 x 10&supmin;&sup7; Mol) Thyroxin-BGG. Die Reaktionsmischung wurde bei 11ºC über 48 Stunden geschüttelt. Ethanolamin (0,1 ml) wurde hinzugefügt, das Schütteln wurde über 24 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde schließlich auf eine 2,5 x 24 cm Bio-Gel A5M chromatographische Säule aufgebracht und mit Wasser von pH 7 eluiert. Die Chromatographie wurde wiederholt. Das Eluat wurde zweimal durch Whatman No. 1 Filterpapier filtriert und dann in einer kommerziellen Ultrafiltrationsvorrichtung (0,05 um Membran) aufkonzentriert. Das Produkt wurde mit 200 ml Wasser mit einem pH von 7 während der Konzentrierung gewaschen (50 ml Teile jeweils). Das endgültige Latexvolumen von 9 ml hatte einen Feststoffgehalt von 1,9%. Tabelle II unten zeigt die Ergebnisse der Bindung des Konjugats an die Latexteilchen bei unterschiedlichen Konjugat: Latex-Verhältnissen. Tabelle II L-Thyroxin Bovines Gammaglobulin (EU+3) Latexmarkierung Thyroxin :BGG (Mol :Mol) Thyroxin&supmin;BGG :Latex-Eu+ (Mol :Mol) Latexausbeute (Prozent) Prozent Berechn. Jod Gefunden
- Für eine optimale Interaktion der Immuno-Reagenzien mit dem Thyroxin-Antikörper ist die Verteilung des Thyroxins (Antigens) auf dem Protein derart, daß nicht alle Aminosäuremoleküle auf dem Teil des Proteins angeordnet sind, der in Kontakt mit der Oberfläche der Latexmarkierung steht. Es wurde eine Reinigung des Konjugats von freiem L-Thyroxin durchgeführt, da freie Aminosäuren (Aminosäuren, die nicht kovalent an das Protein gebunden sind) mit den immunochemischen Reaktionen interferieren.
- Bovines Gammaglobulin (BGG) wurde als Proteinanalyt (Antigen) verwendet, um die Verwendbarkeit der fluoreszierenden Markierungen zu demonstrieren.
- In 48 ml gerührtem, entsalztem Wasser, welches auf einen pH-Wert von 7,7 eingestellt war, wurde bovines Gammaglobulin (0,136 g, 9 x 10&supmin;&sup7; Mol) aufgelöst. Der gerührten Lösung wurden 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinoethyl)carbodiimid Metho-p-Toluolsulfonat (0,0168 g, 3,9 x 10&supmin;&sup5; Mol) hinzugefügt, gefolgt von 10,6 ml der Markierung des Beispiels 1 (Feststoffgehalt 8%). Der pH der gerührten Suspension wurde auf 7,7 gehalten und die Mischung wurde bei 11ºC über 24 Stunden geschüttelt.
- Festes Rinderserumalbumin (0,12 g) wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung bei 11ºC über zusätzliche 24 Stunden geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf eine 2,5 x 25 cm Bio-Gel A5M chromatographische Säule aufgebracht und zur Eluierung des Latex mit Wasser von einem pH-Wert von 7 eluiert. Das Säulenverfahren wurde mit einer frisch hergestellten Säule wiederholt. Das Eluat wurde zweimal durch Whatman No. 1 Filterpapier filtriert und unter Verwendung einer kommerziellen Ultrafiltrationsvorrichtung (0,05 um Membran) auf 10 ml konzentriert. Während der Konzentration wurde 200 ml Wasser mit einem pH von 7 durch die Zelle hindurchgeführt; 50 ml jeweils zur Zeit. Das erhaltene Volumen von 10 ml hatte einen Feststoffgehalt von 7,2%. Elementformat Polystyrolperlen beschichtet mit Anti-BGG-Antikörper Träger
- Eine Probe des obenbezeichneten Elementes wurde mit einem Tropfen von 5 ul des fluoreszierenden Markierungslatex beaufschlagt. Eine andere Probe des Elementes wurde mit einem Tropfen von 5 ul an 0,2 molaren Glycin-Acetatpuffer (pH 7) beaufschlagt. Die verbleibenden Elementproben wurden mit 10&supmin;&sup9; molarem fluoreszierendem Markierungs-BGG Analogen und BGG (Analyt) einer Konzentration von 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup9; Mol beaufschlagt. Die Proben der Elemente wurden über 1 bis 3 Minuten inkubiert, woran sich eine Behandlung mit einer Waschlösung mit 0,2 Mol Glycinacetat, 0,1 Mol NaCl und 1,0% Brijtm 98 oberflächenaktives Mittel bei pH 7,0 bei jeder Probe über etwa 30 Sekunden anschloß. Bei der Fluoreszensmessung gebundener Markierung bediente man sich zeit-verzögerter Lumineszens auf einem modifizierten kommerziellen Ferrand Fluorometer. Eine Dosis/Empfindlichkeitskurve, die aus den gemessenen Daten erhalten wurde, zeigte daß die Probenelemente, die lediglich mit der Markierung allein beaufschlagt wurden, die höchste Menge an Fluoreszens aufwiesen, und daß bei den anderen Elementen die gemessene Fluoreszens mit steigender Konzentration des BGG-Ana lyten abnahm.
- Dieses Beispiel zeigt die verbesserte Stabilität der erfindungsgemäß markierten Liganden im Vergleich zu ähnlich markierten Liganden, die in US-A-4 283 382 und US-A-4 259 313 offenbart sind, welche aber von der Erfindung nicht umfaßt werden. Dieser Vergleich wurde in der folgenden Weise durchgeführt.
- Fluoreszierende Markierung (Eu&spplus;³ Chelate) wurden entsprechend der Lehre der US-A-4 283 382 und US-A-4 259 313 unter Verwendung von Poly(Styrol-co-Methacrylsäure) (95:5 Gewichtsverhältnis) (Latex 1) und Poly(Styrol-co-Acrylamid) (90:10 Gewichtsverhältnis) (Latex 2) hergestellt. Die erfindungsgemäße Markierung, hergestellt nach dem Beispiel 1, wurde mit dem Latex 1 und 2 verglichen. Alle 3 Markierungen wurden bei 10ºC über mehrere Monate gelagert und im Anschluß daran ihre Stabilität bewertet.
- Große Aggregationen von ausgefälltem Latex wurden in beiden Markierungen nach dem Stand der Technik (Latex 1 und 2) beobachtet, während in der erfindungsgemäßen Markierung im wesentlichen keine Ablagerungen beobachtet werden konnten.
Claims (14)
1. Fluoreszierende Markierung mit einem fluoreszierenden Chelat
auf Basis seltener Erden, das in ein Polymerteilchen
einverleibt ist, das sich von einem beladbaren Latex mit einer
diskontinuierlichen Phase und einer wäßrigen Phase ableitet,
dadurch gekennzeichnet, daß die diskontinuierliche Phase
ein Polymer umfaßt aus:
(a) 50 bis 96 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten, die sich von
einem hydrophoben, ethylenisch ungesättigten,
polymerisierbaren Monomeren ableiten,
(b) 2 bis 30 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten, die sich von
einem nicht-ionogenen, hydrophilen, ethylenisch
ungesättigten polymerisierbaren Monomeren ableiten und
(c) 2 bis 30 Gew.-% wiederkehrenden Einheiten, die sich von
einem anionischen, ethylenisch ungesättigten
polymerisierbaren Monomeren mit mindestens einer Carboxygruppe
ableiten.
2. Fluoreszierende Markierung nach Anspruch 1, in der das
Chelat aus Europium oder Terbium und einem 1,3-Diketon-,
Phthalat-, Naphthoat-, Dipyridin-, Terpyridin- oder
Phenanthrolin-Chelatbildner gebildet ist.
3. Fluoreszierende Markierung nach einem der Ansrüche 1 oder
2, in der das Polymer umfaßt:
(a) 75 bis 92 Gew.-% wiederkehrende Einheiten, die sich
von einem Styrol oder einem Styrolderivat ableiten,
(b) 5 bis 15 Gew.-% wiederkehrende Einheiten, die sich von
einem nicht-ionogenen, hydrophilen, ethylenisch
ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren mit einer
Hydroxy- oder Amidgruppe ableiten und
(c) 3 bis 10 Gew.-% wiederkehrende Einheiten, die sich von
einem anionischen, ethylenisch ungesättigten,
polymerisierbaren Monomeren mit mindestens einer Carboxygruppe
ableiten.
4. Fluoreszierende Markierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
in dem das Polymer umfaßt:
(a) wiederkehrende Einheiten, die sich von Styrol oder
Vinyltoluol ableiten,
(b) wiederkehrende Einheiten, die sich von Acrylamid,
Methacrylamid, N-Isopropylacrylamid,
2-Hydroxyethylacrylat oder 2-Hydroxyethylmethacrylat ableiten und
(c) wiederkehrende Einheiten, die sich von Methacrylsäure,
Acrylsäure oder Itaconsäure ableiten.
5. Fluoreszierende Markierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
in der das Polymer
Poly(styrol-co-acrylamid-co-methacrylsäure) ist.
6. Fluoreszierende markierte physiologisch aktive Spezies,
mit einer physiologisch aktiven Spezies, die an eine
fluoreszierende Markierung gebunden ist, dadurch
gekennzeichnet, daß die fluoreszierende Markierung eine Markierung
nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
7. Fluoreszierend markierte physiologisch aktive Spezies nach
Anspruch 6, in dem die physiologisch aktive Spezies ein
Hapten, Antigen, Antikörper, Enzym, Enzymsubstrat, Protein,
Metabolit, Vitamin, Nukleinsäure, Toxin, Wachstumsfaktor,
Hormon, Hormonreceptor oder Lectin ist.
8. Markierte Spezies nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in dem
die markierte physiologisch aktive Spezies ein markiertes,
spezifisch bindendes Liganden-Analoges ist.
9. Trockenes analytisches Element mit einem absorbierenden
Trägermaterial und einem Gehalt an einer fluoreszierend
markierten physiologisch aktiven Spezies, dadurch
gekennzeichnet, daß das Element eine fluoreszierend markierte
physiologisch aktive Spezies nach einem der Ansprüche 6
bis 8 enthält.
10. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 9, mit einem
Träger, auf den eine poröse Ausbreitzone als absorbierendes
Trägermaterial aufgetragen ist, und in dem die fluoreszierend
markierte physiologisch aktive Spezies ein spezifisch
bindendes Liganden-Analoges eines Liganden, der von Interesse
ist, ist.
11. Element nach Anspruch 10, weiter aufweisend einen
immobilisierten Receptor für den Liganden, der in dem Element in
einer Weise immobilisiert ist, die ihn vor dem Immunoassay
von dem Liganden-Analoges isoliert hält.
12. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Liganden
in einer Flüssigkeit mit den Stufen:
A. Kontaktieren einer Probe des Liganden mit einem
fluoreszierend markierten immunologisch aktiven
Liganden-Analogen in Gegenwart eines Receptors für
den Liganden,
wobei das Liganden-Analoges den Liganden, der an eine
fluoreszierende Markierung nach einem der Ansprüche
1 bis 5 gebunden ist, umfaßt, unter Bildung eines
Komplexes zwischen dem Receptor und dem Liganden-
Analogen und
B. fluorometrische Bestimmung des Liganden-Analogen.
13. Diagnostischer Test-Kit für die Bestimmung eines
immunologisch aktiven Liganden mit
(i) einem Receptor für den Liganden; und
(ii) einem fluoreszierend markierten immunologisch aktiven
Liganden-Analogen mit dem an eine fluoreszierende
Markierung gebundenen Liganden, dadurch gekennzeichnet,
daß die Markierung eine Markierung nach einem der
Ansprüche 1 bis 5 ist.
14. Verwendung der fluoreszierenden Markierung nach einem der
Ansprüche 1 bis 5, für die Herstellung einer fluoreszierend
markierten physiologisch aktiven Spezies.
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