CN114047338B - 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法。具体地,本发明提供一种转铁蛋白检测试剂盒,所述的试剂盒包括用于检测转铁蛋白的检测试剂,所述的检测试剂包括检测试剂R1和检测试剂R2。本发明所述的转铁蛋白检测试剂盒能够对检测样本中的转铁蛋白进行定性和定量测定,且具有检测重复性高、准确度高、稳定性强、涵盖了临床上大部分超高值样本和避免抗原过剩导致的假阴性结果等优势。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域,具体地涉一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
转铁蛋白又名运铁蛋白(TRF),是血浆中主要的含铁蛋白质,负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁进入骨髓中,供成熟红细胞的生成所利用。TRF主要由肝细胞合成,半衰期为7天,血浆中TRF的浓度受铁供应的调节,在缺铁状态时,血浆TRF浓度上升,经铁济有效治疗后恢复到正常水平,因此血浆中TRF水平可用于缺铁性贫血的诊断和对治疗的监测。TRF分子量较白蛋白稍大,但它所带电荷较少,负电荷越少就越容易透过肾小球的负电荷屏障,因此当糖尿病或高血压患者的肾小球滤过膜出现电荷改变时,TRF就较微量白蛋白更容易从肾小球滤过,因此它能更敏感地反映肾小球电荷屏障的受损情况,又因为肾损伤往往是先出现电荷屏障损伤,然后才是滤过膜损伤,因此尿转铁蛋白检测有助于比尿微量白蛋白更早发现肾早期损伤,值得在临床推广使用。
目前常常采用免疫比浊法测定尿转铁蛋白,免疫比浊法是基于抗原抗体结合后形成的复合物能引起液体介质出现浊度改变的原理,形成的浊度使光线的透过量减少,则光线被吸收的量与免疫复合物(immune complex,IC)形成量呈正相关,从而根据所测吸光度值即可推算出待测抗原的量。然而,现有的免疫比浊法的检测试剂测定尿转铁蛋白大多线性范围较窄,如百奥泰康、美康生物、柏荣生物等,其最高检测范围为30mg/L,不能覆盖大多数病患的检测需求,且未标注HOOK效应范围,或HOOK效应范围小于1000mg/L,难以符合检测的要求。
因此,本领域需要开发一种尿转铁蛋白的检测方法,提高转铁蛋白的测定范围、重复性和准确度等。
发明内容
本发明的目在于提供一种尿转铁蛋白的检测方法,提高转铁蛋白的测定范围、重复性和准确度等。
本发明第一方面,提供一种转铁蛋白检测试剂盒,所述的试剂盒包括用于检测转铁蛋白的检测试剂,所述的检测试剂包括检测试剂R1和检测试剂R2;
所述的检测试剂R1包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、聚乙二醇、表面活性剂和水;
所述的检测试剂R2包括第一转铁蛋白胶乳抗体分散液和第二转铁蛋白胶乳抗体分散液;
所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液包括转铁蛋白抗体和第一羧基聚苯乙烯微球,所述的转铁蛋白抗体偶连在第一羧基聚苯乙烯微球上;
所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液包括转铁蛋白抗体和第二羧基聚苯乙烯微球,所述的转铁蛋白抗体偶连在第二羧基聚苯乙烯微球上。
在另一优选例中,所述的转铁蛋白包括尿转铁蛋白。
在另一优选例中,所述的转铁蛋白为人转铁蛋白。
在另一优选例中,所述的第一羧基聚苯乙烯微球的粒径为40-100nm,较佳地50-90nm,更佳地60-80nm,更佳地65-85nm。
在另一优选例中,所述的第二羧基聚苯乙烯微球的粒径为150-250nm,较佳地170-230nm,更佳地185-210nm,更佳地190-200nm。
在另一优选例中,所述的第一羧基聚苯乙烯微球与所述第二羧基聚苯乙烯微球的重量比为1:0.5-5,较佳地1:0.5-3,更佳地1:1-2,更佳地1:1.3-1.7,最佳地1:1.5。
在另一优选例中,所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液与所述第二转铁蛋白胶乳抗体分散液的体积比为1:0.5-5,较佳地1:0.5-3,更佳地1:1-2,更佳地1:1.3-1.7,最佳地1:1.5。
在另一优选例中,所述的转铁蛋白抗体包括羊抗人转铁蛋白抗体。
在另一优选例中,所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液中的分散介质包括胶乳保护缓冲液。
在另一优选例中,所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液中的分散介质包括胶乳保护缓冲液。
在另一优选例中,所述的胶乳保护缓冲液包括磷酸盐缓冲液、血清白蛋白、氯化钠和蔗糖的水溶液。
在另一优选例中,所述的胶乳保护缓冲液包括磷酸盐缓冲液、血清白蛋白、氯化钠、蔗糖和叠氮钠的水溶液。
在另一优选例中,所述的胶乳保护缓冲液的pH为7.0-7.4,较佳地7.2。
在另一优选例中,所述的血清白蛋白为牛血清白蛋白。
在另一优选例中,所述的磷酸盐缓冲液的含量为0.01-0.05mol/L,较佳地0.01-0.03mol/L,最佳地0.02mol/L。
在另一优选例中,所述的血清白蛋白的含量为0.08-0.5wt%,较佳地0.1-0.3wt%,更佳地0.15-0.25wt%,最佳地0.2wt%。
在另一优选例中,所述的氯化钠的含量为1.5-2.6wt%,较佳地1.8-2.4wt%,更佳地2.0-2.2wt%,最佳地2.12wt%。
在另一优选例中,所述的蔗糖的含量为1.5-2.5wt%,较佳地1.8-2.2wt%,更佳地1.9-2.1wt%,最佳地2.0wt%。
在另一优选例中,所述的叠氮钠的含量为0.3-1.8wt%,较佳地0.5-1.5wt%,更佳地0.8-1.2wt%,最佳地1.0wt%。
在另一优选例中,所述的胶乳保护缓冲液包括0.01-0.03mol/L磷酸盐缓冲液、0.15-0.25wt%血清白蛋白、1.8-2.3wt%氯化钠和1.8-2.2wt%蔗糖的水溶液。
在另一优选例中,所述的胶乳保护缓冲液包括0.01-0.03mol/L磷酸盐缓冲液、0.15-0.25wt%血清白蛋白、1.8-2.3wt%氯化钠、1.8-2.2wt%蔗糖和0.8-1.2wt%叠氮钠的水溶液。
在另一优选例中,所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液通过以下方法制备:
(1)将转铁蛋白抗体偶连在第一羧基聚苯乙烯微球后,分散在胶乳保护缓冲液,得到第一转铁蛋白胶乳抗体分散液。
在另一优选例中,所述的步骤(1)包括:
(1-1)所述的第一羧基聚苯乙烯微球经活化剂活化后,得到活化的第一羧基聚苯乙烯微球;
(1-2)所述活化的第一羧基聚苯乙烯微球用MES缓冲液分散后,加入转铁蛋白抗体进行偶联反应,离心得到的沉淀用封闭剂封闭后,离心得到的沉淀分散在胶乳保护缓冲液中,得到第一转铁蛋白胶乳抗体分散液。
在另一优选例中,所述步骤(1-1)中,所述的第一羧基聚苯乙烯微球经活化剂活化后,离心,去除上清液,得到活化的第一羧基聚苯乙烯微球
在另一优选例中,所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液通过以下方法制备:
(a)将转铁蛋白抗体偶连在第二羧基聚苯乙烯微球后,分散在胶乳保护缓冲液,得到第二转铁蛋白胶乳抗体分散液。
在另一优选例中,所述的步骤(a)包括:
(a-1)所述的第二羧基聚苯乙烯微球经活化剂活化后,得到活化的第二羧基聚苯乙烯微球;
(a-2)所述活化的第二羧基聚苯乙烯微球用MES缓冲液分散后,加入转铁蛋白抗体进行偶联反应,离心得到的沉淀用封闭剂封闭后,离心得到的沉淀分散在胶乳保护缓冲液中,得到第二转铁蛋白胶乳抗体分散液。
在另一优选例中,所述步骤(a-1)中,所述的第二羧基聚苯乙烯微球经活化剂活化后,离心,去除上清液,得到活化的第二羧基聚苯乙烯微球。
在另一优选例中,所述的活化剂包括EDC。
在另一优选例中,所述的活化为充分活化。
在另一优选例中,所述活化的温度为23-27℃。
在另一优选例中,所述活化的时间为8-12min。
在另一优选例中,所述MES缓冲液的浓度为0.1-0.3mol/L,较佳地0.15-0.25mol/L。
在另一优选例中,所述MES缓冲液的pH为5.5-6.5,较佳地6.0-6.5,更佳地6.0-6.4。
在另一优选例中,所述的偶联反应的温度为18-25℃,较佳地18-22℃。
在另一优选例中,所述的偶联反应的时间为1.5-2.5h,较佳地1.8-2.2h。
在另一优选例中,所述的偶联反应为充分反应。
在另一优选例中,所述的封闭剂包括血清白蛋白水溶液。
在另一优选例中,所述的血清白蛋白为牛血清白蛋白。
在另一优选例中,所述的血清白蛋白的含量为0.1-0.3wt%,较佳地0.15-0.25
在另一优选例中,所述的封闭的温度为18-25℃,较佳地18-22℃。
在另一优选例中,所述的封闭的时间为1.5-2.5h,较佳地1.8-2.2h。
在另一优选例中,所述的封闭为充分封闭。
在另一优选例中,在所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液中,所述的转铁蛋白与所述第一羧基聚苯乙烯微球的重量比为60-100:1,较佳地70-90:1,更佳地75-85:1,较佳地78-82:1。
在另一优选例中,在所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液中,所述的胶乳保护缓冲液与所述的第一羧基聚苯乙烯微球的体积重量比(ml:mg)为60-100:1,较佳地70-90:1,更佳地75-85:1,较佳地78-82:1。
在另一优选例中,在所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液中,所述的转铁蛋白与所述第二羧基聚苯乙烯微球的重量比为60-100:1,较佳地70-90:1,更佳地75-85:1,较佳地78-82:1。
在另一优选例中,在所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液中,所述的胶乳保护缓冲液与所述的第二羧基聚苯乙烯微球的体积重量比(ml:mg)为60-100:1,较佳地70-90:1,更佳地75-85:1,较佳地78-82:1。
在另一优选例中,所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液通过以下方法制备:
取0.8-1.2mL含有4.8-5.2wt%第一羧基聚苯乙烯微球胶乳加入反应容器中,在反应容器中加入0.2-0.4mL 3.1-3.5wt%EDC溶液,震荡,将第一羧基聚苯乙烯微球在23-27℃充分活化8-12min,离心得到的沉淀用1.8-2.2mL0.15-0.25mol/L MES缓冲液(pH6.0-6.4)分散后,加入转铁蛋白抗体3.8-4.2mg在18-22℃下充分反应1.8-2.2h,离心得到的沉淀加入1.8-2.2mL 0.18-0.22wt%牛血清白蛋白水溶液在18-22℃下充分封闭反应1.8-2.2h,离心得到的沉淀用胶乳保护缓冲液3.8-4.2mL充分分散后即得第一转铁蛋白胶乳抗体分散液。
在另一优选例中,所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液通过以下方法制备:
取0.8-1.2mL含有4.8-5.2wt%第二羧基聚苯乙烯微球胶乳加入反应容器中,在反应容器中加入0.2-0.4mL 3.1-3.5wt%EDC溶液,震荡,将第二羧基聚苯乙烯微球在23-27℃充分活化8-12min,离心得到的沉淀用1.8-2.2mL0.15-0.25mol/L MES缓冲液(pH6.0-6.4)分散后,加入转铁蛋白抗体3.8-4.2mg在18-22℃下充分反应1.8-2.2h,离心得到的沉淀加入1.8-2.2mL 0.18-0.22wt%牛血清白蛋白水溶液在18-22℃下充分封闭反应1.8-2.2h,离心得到的沉淀用胶乳保护缓冲液3.8-4.2mL充分分散后即得第二转铁蛋白胶乳抗体分散液。
在另一优选例中,所述的检测试剂R1为液体。
在另一优选例中,所述的磷酸氢二钠包括十二水合磷酸氢二钠。
在另一优选例中,所述的磷酸二氢钠包括二水合磷酸二氢钠。
在另一优选例中,所述的聚乙二醇的分子量为200-10000.
在另一优选例中,所述的聚乙二醇包括聚乙二醇-6000(PEG-6000)。
在另一优选例中,所述的表面活性剂包括吐温。
在另一优选例中,所述的吐温选自:吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80,或其组合。
在另一优选例中,所述的检测试剂R1还包括防腐剂。
在另一优选例中,所述的防腐剂包括叠氮钠。
在另一优选例中,所述的磷酸氢二钠的含量为0.4-0.5wt%,较佳地0.45-0.48wt%,以检测试剂R1的重量计。
在另一优选例中,所述的磷酸二氢钠的含量为0.04-0.08wt%,较佳地0.05-0.06wt%,以检测试剂R1的重量计。
在另一优选例中,所述的氯化钠的含量为2.5-3.5wt%,较佳地2.7-3.1wt%,以检测试剂R1的重量计。
在另一优选例中,所述的聚乙二醇的含量为1.5-2.1wt%,较佳地1.6-2.0wt%,以检测试剂R1的重量计。
在另一优选例中,所述表面活性剂的含量为0.15-0.25wt%,较佳地0.18-0.22wt%,以检测试剂R1的重量计。
在另一优选例中,所述吐温的含量为0.15-0.25v/v%,较佳地0.18-0.22v/v%,以检测试剂R1的体积计。
在另一优选例中,所述吐温的的含量为0.05-0.15wt%,较佳地0.08-0.12wt%,以检测试剂R1的重量计。
在另一优选例中,所检测试剂R1通过以下方法制备:
将磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、聚乙二醇、表面活性剂、水和任选地防腐剂混合,得到检测试剂R1。
在另一优选例中,所检测试剂R1通过以下方法制备:
取磷酸氢二钠4.4-4.8g、磷酸二氢钠0.5-0.65g、氯化钠28-31g溶于780-820ml纯化水后,加入PEG-6000 17-19g、1.8-2.2ml吐温20和任选地4.8-5.2mL 18-22wt%叠氮钠水溶液,混合溶解后,用纯化水定容至980-1020mL,得到检测试剂R1。
本发明第二方面,提供一种如本发明第一方面所述的转铁蛋白检测试剂盒的用途,用于制备检测样品中转铁蛋白的检测试剂盒。
在另一优选例中,所述的样品包括待测样品。
在另一优选例中,所述的样品中含有待测的转铁蛋白。
在另一优选例中,所述的样品为尿液或血液。
在另一优选例中,所述的样品来源于人。
在另一优选例中,所述的转铁蛋白包括尿转铁蛋白。
在另一优选例中,所述的转铁蛋白为人转铁蛋白。
在另一优选例中,所述的检测为体外检测。
在另一优选例中,所述的检测为辅助性检测。
在另一优选例中,所述的检测为非诊断和非治疗性检测。
在另一优选例中,所述的检测为定性和/或定量检测。
在另一优选例中,所述的检测为免疫比浊法检测。
在另一优选例中,所述检测包括生化分析仪检测。
在另一优选例中,所述的生化分析仪包括全自动生化分析仪。
在另一优选例中,所述的生化分析仪的参数包括选自下组的一种或多种参数:
样品量:1-3μL;
检测试剂R1量:200-220μL;
检测试剂R2量:60-80μL;
反应温度:35-37℃;
反应时间(T1/T2):290-310秒/290-310秒;
检测波长:560-580nm;
反应方向:Increase(向上);和/或
标准曲线拟合方式:6点定标,非线性计算模式,如log/Spline。
在另一优选例中,所述检测波长为570nm。
在另一优选例中,所述的检测的方法包括:
样品与检测试剂R1孵育反应后,加入检测试剂R2继续孵育反应,先读取第一测光点的吸光度,再读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据反应度对转铁蛋白进行定性和/或定量检测。
在另一优选例中,第一测光点的吸光度均为同一检测波长处的吸光度。
在另一优选例中,第一测光点的吸光度和第二测光点的吸光度的时间间隔为3.8-4.2min。
在另一优选例中,所述的孵育反应的温度为35-37℃。
在另一优选例中,与检测试剂R1孵育反应的时间为4.5-5.5min。
在另一优选例中,加入检测试剂R2孵育反应的时间为0.8-1.2min。
在另一优选例中,所述的检测的方法包括:
样品与检测试剂R1在35-37℃下混合孵育反应4.5-5.5min后加入检测试剂R2继续孵育反应,0.8-1.2min后读取第一测光点的吸光度,4.5-5.5min后读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据反应度对转铁蛋白进行定性和/或定量检测。
在另一优选例中,所述的检测的方法包括:
样品、检测试剂R1和检测试剂R2的加样量依次分别为1-3μL、200-220μL和60-80μL,样品与检测试剂R1在35-37℃下混合孵育反应4.5-5.5min后加入检测试剂R2继续孵育反应,0.8-1.2min后读取第一测光点的吸光度,4.5-5.5min后读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据反应度对转铁蛋白进行定性和/或定量检测。
在另一优选例中,第一测光点的吸光度为加入检测试剂R2反应0.8-1.2min后的吸光度。
在另一优选例中,第二测光点的吸光度为加入检测试剂R2反应4.5-5.5min后的吸光度。
在另一优选例中,所述的定量检测包括标准曲线法检测。
在另一优选例中,所述的标准曲线法检测包括根据不同转铁蛋白标准品溶液的浓度与反应度绘制标准曲线。
在另一优选例中,所述标准曲线的横坐标为不同转铁蛋白标准品溶液的浓度,纵坐标为反应度。
在另一优选例中,所述不同转铁蛋白标准品溶液通过以下方法制备:
将不同量的人转铁蛋白标准品加入到标准品稀释液中,从而制备得到不同转铁蛋白标准品溶液。
在另一优选例中,所述标准品稀释液包括:
磷酸氢二钠4.4-4.8g/L、磷酸二氢钠0.5-0.7g/L、氯化钠2.4-3.0wt%、牛血清白蛋白0.6-1.0wt%、蔗糖1.8-2.2wt%、海藻糖1.8-2.2wt%和任选地4.8-3.2wt%叠氮钠(18-22wt%),溶剂为水。
在另一优选例中,将样品中的转铁蛋白的反应度代入标准曲线中,计算得到样品中的转铁蛋白含量。
本发明第三方面,提供一种检测样品中转铁蛋白的方法,所述的方法包括用如本发明第一方面所述转铁蛋白检测试剂盒检测样品中转铁蛋白。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为标准品溶液中人转铁蛋白的浓度与反应度的标准曲线。
具体实施方式
本发明开发了一种转铁蛋白检测试剂盒,所述的试剂盒包括用于检测转铁蛋白的检测试剂,所述的检测试剂包括检测试剂R1和检测试剂R2。本发明所述的转铁蛋白检测试剂盒能够对检测样本(如尿液)中的转铁蛋白进行定性和定量测定,且具有检测重复性高、准确度高、稳定性强、涵盖了临床上大部分超高值样本和避免抗原过剩导致的假阴性结果等优势。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用,术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用,不仅包括开放式定义,还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之,所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用,术语“PEG”是指聚乙二醇。
如本文所用,术语“吐温”为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯。
如本文所用,术语“MES”是指2-(N-吗啉)乙磺酸。
如本文所用,术语“EDC”是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
如本文所用,术语“wt%”是指重量百分比。
如本文所用,术语“v/v%”是指体积百分比。
在本发明中,20wt%叠氮钠水溶液是指叠氮钠水溶液中,叠氮钠的重量百分数为20wt%。
如本文所用,术语“第一”和“第二”等仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。
转铁蛋白检测试剂盒
本发明提供一种转铁蛋白检测试剂盒,所述的试剂盒包括用于检测转铁蛋白的检测试剂,所述的检测试剂包括检测试剂R1和检测试剂R2;
所述的检测试剂R1包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、聚乙二醇、表面活性剂和水;
所述的检测试剂R2包括第一转铁蛋白胶乳抗体分散液和第二转铁蛋白胶乳抗体分散液;
所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液包括转铁蛋白抗体和第一羧基聚苯乙烯微球,所述的转铁蛋白抗体偶连在第一羧基聚苯乙烯微球上;
所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液包括转铁蛋白抗体和第二羧基聚苯乙烯微球,所述的转铁蛋白抗体偶连在第二羧基聚苯乙烯微球上。
在本发明的一个优选例中,所述的第一羧基聚苯乙烯微球的粒径为40-100nm,较佳地50-90nm,更佳地60-80nm,更佳地65-85nm。
在本发明的一个优选例中,所述的第二羧基聚苯乙烯微球的粒径为150-250nm,较佳地170-230nm,更佳地185-210nm,更佳地190-200nm。
在本发明的一个优选例中,所述的第一羧基聚苯乙烯微球与所述第二羧基聚苯乙烯微球的重量比为1:0.5-5,较佳地1:0.5-3,更佳地1:1-2,更佳地1:1.3-1.7,最佳地1:1.5。
在本发明的一个优选例中,所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液与所述第二转铁蛋白胶乳抗体分散液的体积比为1:0.5-5,较佳地1:0.5-3,更佳地1:1-2,更佳地1:1.3-1.7,最佳地1:1.5。
在本发明的一个优选例中,所述的第一转铁蛋白胶乳抗体分散液中的分散介质包括胶乳保护缓冲液。
在本发明的一个优选例中,所述的第二转铁蛋白胶乳抗体分散液中的分散介质包括胶乳保护缓冲液。
在本发明的一个优选例中,所述的胶乳保护缓冲液包括磷酸盐缓冲液、血清白蛋白、氯化钠和蔗糖的水溶液。
在另一优选例中,所述的胶乳保护缓冲液包括磷酸盐缓冲液、血清白蛋白、氯化钠、蔗糖和叠氮钠的水溶液。
在本发明的一个优选例中,所述的胶乳保护缓冲液的pH为7.0-7.4,较佳地7.2。
更具体地,本发明所述的转铁蛋白检测试剂盒如上本发明第一方面所述。
用途和方法
本发明还提供一种本发明所述转铁蛋白检测试剂盒的用途,用于制备检测样品中转铁蛋白的检测试剂盒。
本发明还提供一种检测样品中转铁蛋白的方法,所述的方法包括用如如本发明所述转铁蛋白检测试剂盒检测样品中转铁蛋白。
在本发明的一个优选例中,所述的样品为尿液或血液。
在另一优选例中,所述的检测为体外检测。
在另一优选例中,所述的检测为辅助性检测。
在另一优选例中,所述的检测为非诊断和非治疗性检测。
在另一优选例中,所述的检测为定性和/或定量检测。
在另一优选例中,所述的检测为免疫比浊法检测。
在另一优选例中,所述检测包括生化分析仪检测。
在另一优选例中,所述的生化分析仪包括全自动生化分析仪。
在本发明的一个优选例中,所述的生化分析仪的参数包括选自下组的一种或多种参数:
样品量:1-3μL;
检测试剂R1量:200-220μL;
检测试剂R2量:60-80μL;
反应温度:35-37℃;
反应时间(T1/T2):290-310秒/290-310秒;
检测波长:560-580nm;
反应方向:Increase(向上);和/或
标准曲线拟合方式:6点定标,非线性计算模式,如log/Spline。
在另一优选例中,所述检测波长为570nm。
在本发明的一个优选例中,所述的检测的方法包括:
样品与检测试剂R1孵育反应后,加入检测试剂R2继续孵育反应,先读取第一测光点的吸光度,再读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据反应度对转铁蛋白进行定性和/或定量检测。
在另一优选例中,第一测光点的吸光度均为同一检测波长处的吸光度。
在另一优选例中,第一测光点的吸光度和第二测光点的吸光度的时间间隔为3.8-4.2min。
在另一优选例中,所述的孵育反应的温度为35-37℃。
在另一优选例中,与检测试剂R1孵育反应的时间为4.5-5.5min。
在另一优选例中,加入检测试剂R2孵育反应的时间为0.8-1.2min。
在另一优选例中,所述的检测的方法包括:
样品与检测试剂R1在35-37℃下混合孵育反应4.5-5.5min后加入检测试剂R2继续孵育反应,0.8-1.2min后读取第一测光点的吸光度,4.5-5.5min后读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据反应度对转铁蛋白进行定性和/或定量检测。
在另一优选例中,所述的检测的方法包括:
样品、检测试剂R1和检测试剂R2的加样量依次分别为1-3μL、200-220μL和60-80μL,样品与检测试剂R1在35-37℃下混合孵育反应4.5-5.5min后加入检测试剂R2继续孵育反应,0.8-1.2min后读取第一测光点的吸光度,4.5-5.5min后读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据反应度对转铁蛋白进行定性和/或定量检测。
在另一优选例中,第一测光点的吸光度为加入检测试剂R2反应0.8-1.2min后的吸光度。
在另一优选例中,第二测光点的吸光度为加入检测试剂R2反应4.5-5.5min后的吸光度。
在本发明的一个优选例中,所述的定量检测包括标准曲线法检测。
在另一优选例中,所述的标准曲线法检测包括根据不同转铁蛋白标准品溶液的浓度与反应度绘制标准曲线。
在另一优选例中,所述标准曲线的横坐标为不同转铁蛋白标准品溶液的浓度,纵坐标为反应度。
在另一优选例中,所述不同转铁蛋白标准品溶液通过以下方法制备:
将不同量的人转铁蛋白标准品加入到标准品稀释液中,从而制备得到不同转铁蛋白标准品溶液。
在另一优选例中,所述标准品稀释液包括:
磷酸氢二钠4.4-4.8g/L、磷酸二氢钠0.5-0.7g/L、氯化钠2.4-3.0wt%、牛血清白蛋白0.6-1.0wt%、蔗糖1.8-2.2wt%、海藻糖1.8-2.2wt%和任选地4.8-3.2wt%叠氮钠(18-22wt%),溶剂为水。
在另一优选例中,将样品中的转铁蛋白的反应度代入标准曲线中,计算得到样品中的转铁蛋白含量。
本发明的主要效果包括:
本发明开发了一种转铁蛋白检测试剂盒,所述的转铁蛋白检测试剂盒能够对检测样本(如尿液)中的转铁蛋白进行定性和定量测定,且具有检测重复性高、准确度高、稳定性强、涵盖了临床上大部分超高值样本和避免抗原过剩导致的假阴性结果等优势,且检测方法操作简单、方便和易于大批量检测。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1尿转铁蛋白的测定
羊抗人转铁蛋白抗体购买自上海钹乐诗生物技术有限公司。
1.试剂和仪器
1.1试剂
1.1.1试剂R1:
取十二水合磷酸氢二钠4.65g、二水合磷酸二氢钠0.56g、氯化钠29.25g溶于800ml纯化水后,加入PEG-6000 18g、2ml吐温20和5mL 20wt%叠氮钠水溶液,混合溶解后,用纯化水定容至1000mL,得到试剂R1。
1.1.2试剂R2:
胶乳保护缓冲液:0.02mol/L磷酸盐缓冲液、0.2wt%牛血清白蛋白、2.12wt%氯化钠、2wt%蔗糖、1wt%叠氮钠的水溶液,测定的pH为7.2。
试剂R2的制备方法如下:
取1mL含有5wt%羧基聚苯乙烯微球胶乳(日本JSR集团)加入反应容器中,在反应容器中加入0.3mL 3.3wt%EDC溶液,震荡,将羧基聚苯乙烯微球在25℃充分活化10min,离心得到的沉淀用2mL 0.2mol/L MES缓冲液(pH6.2)分散后,加入羊抗人转铁蛋白抗体4mg在20℃下充分反应2h,离心得到的沉淀加入2mL 0.2wt%牛血清白蛋白水溶液在20℃下充分封闭反应2h,离心得到的沉淀用胶乳保护缓冲液4mL充分分散后即得转铁蛋白胶乳抗体分散液。
其中,小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液采用70nm的羧基聚苯乙烯微球制备而得;大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液采用195nm的羧基聚苯乙烯微球制备而得;将小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1.5的比例进行混合后,得到试剂R2。
1.2.仪器
全自动生化分析仪,型号:日立7180。
日立7180生化分析仪属于分立式多通道分析仪通过对加样加试剂损拌孵育、测光清洗等动作进行自动控制来实现对多样本、多项目的检测,日立7180生化分析仪是一台可连续监测反应液吸光度化的多波长分光光度计。测量原理是:根据朗伯比尔定律,即在单色光垂直透过一定厚度的溶液后,得到的吸光度与溶液的浓度成正比。
2.标准曲线的制备
在全自动生化仪上测定标准曲线:
测定原理
测定原理是免疫比浊法,免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是:当抗原与抗体在特殊稀释***中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时,形成的可溶性免疫复合物在稀释***中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下,自液相析出,形成微粒,使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出检样中抗原的含量。
设定参数:样本量:2μL;试剂量(R1/R2):210μL/70μL,反应温度:37℃;反应时间(T1/T2):300秒/300秒;波长:570nm;单位:mg/L;反应方向:Increase(向上);标准曲线拟合方式:6点定标,非线性计算模式,如log/Spline。
标准品稀释液的处方如下:
磷酸氢二钠4.65g/L、磷酸二氢钠0.56g/L、氯化钠2.7wt%、牛血清白蛋白0.8wt%、蔗糖2wt%、海藻糖2wt%和5wt%叠氮钠(20wt%),溶剂为水。
含有不同浓度人转铁蛋白的标准品溶液的配制:将不同量的人转铁蛋白标准品加入到标准品稀释液中,从而制备得到含有不同浓度人转铁蛋白的标准品溶液。
测定方法:
含有不同浓度人转铁蛋白的标准品溶液、试剂R1和试剂R2加样量依次分别为2μL、210μL和70μL,含有不同浓度人转铁蛋白的标准品溶液与试剂R1在37℃下混合孵育反应5min后加入试剂R2继续孵育,1min后读取第一测光点的吸光度,5min后读取第二测光点的吸光度,两个测光点吸光度差值即为反应度,根据标准品浓度与对应反应度绘制出标准曲线,标准品溶液中人转铁蛋白的浓度与反应度的关系如表1和图1所示。
第一测光点的吸光度为加入试剂R2反应1min后的反应吸光度,第二测光点的吸光度为加入试剂R2反应5min后的反应吸光度,吸光度值随时间(抗原抗体反应)增加而增强,两点吸光度的差值即为该标准品浓度下的反应度。
表1标准品溶液中人转铁蛋白的浓度与反应度的关系
从表1和图1中可以看出,标准品溶液中人转铁蛋白的浓度在0-60mg/L范围内具有良好的线性关系,能够准确用于转铁蛋白的定量测定。
3.重复性测定
分别取1mg/L或5mg/L人转铁蛋白的标准品溶液,按照“2.标准曲线的制备”中的方法对每个样本测定10次,计算两个浓度下试剂的重复性,结果见下表2。
表2重复性测定(反应度)
从表2中可以看出,高低值两个样本重复性均小于4%,且低值1mg/L时为3.3%,优于市面上一般试剂的10%要求,因此,试剂R1和试剂R2用于免疫比浊法测定转铁蛋白具有优异的重复性,从而提高测定的准确度。
尿液转铁蛋白医学决定水平在2mg/L,而此试剂在1mg/L时亦具有优异重复性,在临床测定样本时可提高低值样本测定的准确度,从而提高分布在医学决定水平左右测值的准确性。
4.HOOK效应
取人转铁蛋白高值,按一定比例混合在低值尿液样本中,组成浓度分别为100mg/L,500mg/L,1000mg/L,2000mg/L,4000mg/L,6000mg/L,8000mg/L的尿液样本,按照“2.标准曲线的制备”中的方法测定其测值,结果如下表3所示。
表3不同浓度的人转铁蛋白测定值
由表3的测试结果可以看出,从100mg/L到8000mg/L的测值均大于试剂的线性60mg/L,涵盖了临床上99%的超高值样本,本试剂可大大避免抗原过剩导致的假阴性结果。
5.测量准确度
准确度测定:取有证参考物质,用试剂R1和试剂R2,按照“2.标准曲线的制备”中在全自动生化分析仪上重复检测3次,取测试结果均值(M),按公式(1)计算相对偏差(B),应≤10%。
公式中:M—测试结果均值;
T—有证参考物质标示值
有证参考物质为:ERM-DA470K/IFCC人血清标准品,来源:欧洲标准局。其中转铁蛋白(TRF)靶值为2.36±0.08g/L。
测定方法:将ERM-DA470K/IFCC用生理盐水分别进行100倍及1000倍稀释,取试剂R1和试剂R2,按照“2.标准曲线的制备”中在全自动生化分析仪上对其进行测量三次,取测试结果均值(M),按公式(1)计算相对偏差(B),数据如下表4所示:
表4测量准确度
稀释倍数 | 1000倍 | 100倍 |
测值1 | 2.26 | 23.22 |
测值2 | 2.23 | 23.21 |
测值3 | 2.28 | 23.16 |
平均值 | 2.26 | 23.20 |
靶值 | 2.36mg/L | 23.6mg/L |
偏差 | -4.38% | -1.71% |
从表4的结果可以看出,试剂R1和试剂R2,在全自动生化分析仪上测定国际标准物质偏差在5%以内,表明试剂R1和试剂R2,在全自动生化分析仪上测定准确度高。
6.开瓶稳定性
将试剂R1和试剂R2分别放在试剂瓶中,试剂瓶开瓶放置在仪器试剂盘中,定标后,留样观察14天,每天按照“2.标准曲线的制备”中在全自动生化分析仪上测质控。结果如下表5所示:
表5开瓶稳定性
从表5中可以看出,试剂R1和试剂R2开瓶14天损失率在5%以内,具有良好的开瓶稳定性。
对比例1
对比例1同实施例1,不同点在于,
试剂R2中,小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1、1:2或1:3的比例进行混合后,得到试剂R2
重复性测定
按照实施例1中的“3.重复性测定”的方法测定重复性。
小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1、1:2或1:3的比例进行混合后得到试剂R2测定的重复性结果依次分别为表6、表7和表8。
表6小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1的比例进行混合后得到试剂R2测定的重复性结果
表7小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:2的比例进行混合后得到试剂R2测定的重复性结果
表8小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:3的比例进行混合后得到试剂R2测定的重复性结果
从表6-8中可以看出,小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1、1:2或1:3的比例进行混合后得到试剂R2测定的重复性结果较差,CV大于2.0%。
HOOK效应
按照实施例1中的“4.HOOK效应”的方法测定HOOK效应。
小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1、1:2或1:3的比例进行混合后得到试剂R2测定的HOOK效应依次分别为表9、表10和表11。
表9小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:1的比例进行混合后得到试剂R2测定的HOOK效应
浓度(mg/L) | 测值(mg/L) |
100 | 101.22 |
500 | 95.43 |
1000 | 96.15 |
2000 | 84.37 |
4000 | 77.66 |
6000 | 72.14 |
8000 | 70.18 |
表10小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:2的比例进行混合后得到试剂R2测定的HOOK效应
表10小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:3的比例进行混合后得到试剂R2测定的HOOK效应
浓度(mg/L) | 测值(mg/L) |
100 | 80.13 |
500 | 71.25 |
1000 | 68.87 |
2000 | 61.24 |
4000 | 58.85 |
6000 | 51.24 |
8000 | 47.33 |
从结果中可看出,小粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液和大粒径转铁蛋白胶乳抗体分散液按照体积为1:2或1:3的比例进行混合后得到试剂R2测定的HOOK效应较差。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种转铁蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒用于检测尿液,所述的试剂盒包括用于检测转铁蛋白的检测试剂,所述的检测试剂包括检测试剂R1和检测试剂R2,和标准品稀释液;
所述的检测试剂R1通过以下方法制备:
取磷酸氢二钠4.4-4.8g、磷酸二氢钠0.5-0.65g、氯化钠28-31g溶于780-820ml纯化水后,加入PEG-6000 17-19g、1.8-2.2ml 吐温20和4.8-5.2mL 18-22 wt%叠氮钠水溶液,混合溶解后,用纯化水定容至980-1020mL;
所述的检测试剂R2通过以下方法制备:
取第一羧基聚苯乙烯微球和第二羧基聚苯乙烯微球加入反应容器中,在反应容器中加入3.3 wt% EDC溶液,将第一羧基聚苯乙烯微球和第二羧基聚苯乙烯微球在25℃充分活化10min,离心得到的沉淀用0.2mol/L MES缓冲液分散后,加入羊抗人转铁蛋白抗体在20℃下充分反应2h,离心得到的沉淀加入0.2 wt%牛血清白蛋白水溶液在20℃下充分封闭反应2h,离心得到的沉淀用胶乳保护缓冲液充分分散后即得转铁蛋白胶乳抗体分散液;
所述的第一羧基聚苯乙烯微球的粒径为65-85nm;
所述的第二羧基聚苯乙烯微球的粒径190-200nm;
所述的第一羧基聚苯乙烯微球与所述第二羧基聚苯乙烯微球的重量比为1:1.3-1.7;
所述标准品稀释液的组分如下:
磷酸氢二钠4.65g/L、磷酸二氢钠0.56g/L、氯化钠2.7 wt%、牛血清白蛋白0.8 wt%、蔗糖2 wt%、海藻糖2 wt%和5 wt%叠氮钠,溶剂为水。
2.如权利要求1所述的转铁蛋白检测试剂盒,其特征在于,所述的第一羧基聚苯乙烯微球与所述第二羧基聚苯乙烯微球的重量比为 1:1.5。
3.如权利要求1所述转铁蛋白检测试剂盒的用途,其特征在于,用于制备检测样品中转铁蛋白的检测试剂盒。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的检测为免疫比浊法检测。
5.一种检测样品中转铁蛋白的方法,其特征在于,所述的方法包括用如权利要求1所述转铁蛋白检测试剂盒检测样品中转铁蛋白,所述试剂盒用于检测尿液。
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---|---|
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Citations (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5522192A (en) * | 1978-08-02 | 1980-02-16 | Hoffmann La Roche | Immunine reagent |
US4342739A (en) * | 1979-01-09 | 1982-08-03 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Novel material for immunological assay of biochemical components and a process for the determination of said components |
WO2010011315A2 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Viral Genetics, Inc. | Proteins for use in diagnosing and treating infection and disease |
CN102128924A (zh) * | 2010-01-12 | 2011-07-20 | 上海景源医疗器械有限公司 | 乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒及其制备方法 |
CN102628867A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 双抗体胶乳增强视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
CN102628864A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒 |
WO2012123419A1 (en) * | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Vib Vzw | Molecules and methods for inhibition and detection of proteins |
CN103954766A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-07-30 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 转铁蛋白受体检测试剂盒及制备方法 |
CN104215770A (zh) * | 2014-08-14 | 2014-12-17 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
CN105044352A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-11 | 南京普朗医疗设备有限公司 | 一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂及其制备方法 |
CN105675887A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-06-15 | 柏荣诊断产品(上海)有限公司 | 一种高性能的人尿液微量白蛋白检测试剂盒 |
CN106053838A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-10-26 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定转铁蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN106324239A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-11 | 武汉景川诊断技术股份有限公司 | C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用 |
CN106918708A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒 |
CN106932588A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-07 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 检测α1-微球蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN107643282A (zh) * | 2016-07-20 | 2018-01-30 | 长春市诺克因生物科技有限公司 | 一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN107727867A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-23 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种补体c3检测试剂盒的制备方法 |
CN108593940A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-09-28 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒 |
CN108761070A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-11-06 | 柏荣诊断产品(上海)有限公司 | 一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒 |
CN109613257A (zh) * | 2018-12-01 | 2019-04-12 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种转铁蛋白(trf)检测试剂盒 |
CN109813910A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-28 | 宁波普瑞柏生物技术股份有限公司 | 利用竞争性免疫反应消除钩状效应的方法及试剂盒 |
CN110133270A (zh) * | 2018-02-09 | 2019-08-16 | 长沙文瀚生物技术有限责任公司 | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 |
CN110596405A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-20 | 上海捷门生物技术有限公司 | 胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白含量的试剂盒 |
CN111766381A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-10-13 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用 |
CN112129934A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-25 | 上海捷门生物技术有限公司 | 铁蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
CN113406323A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-17 | 上海奥普生物医药股份有限公司 | 一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法 |
-
2021
- 2021-11-10 CN CN202111323621.XA patent/CN114047338B/zh active Active
Patent Citations (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5522192A (en) * | 1978-08-02 | 1980-02-16 | Hoffmann La Roche | Immunine reagent |
US4342739A (en) * | 1979-01-09 | 1982-08-03 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Novel material for immunological assay of biochemical components and a process for the determination of said components |
WO2010011315A2 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Viral Genetics, Inc. | Proteins for use in diagnosing and treating infection and disease |
CN102128924A (zh) * | 2010-01-12 | 2011-07-20 | 上海景源医疗器械有限公司 | 乳胶增强免疫比浊法测定尿液转铁蛋白试剂盒及其制备方法 |
WO2012123419A1 (en) * | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Vib Vzw | Molecules and methods for inhibition and detection of proteins |
CN102628864A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒 |
CN102628867A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 双抗体胶乳增强视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
CN103954766A (zh) * | 2014-01-24 | 2014-07-30 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 转铁蛋白受体检测试剂盒及制备方法 |
CN104215770A (zh) * | 2014-08-14 | 2014-12-17 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
CN105044352A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-11 | 南京普朗医疗设备有限公司 | 一种尿转铁蛋白免疫比浊试剂及其制备方法 |
CN106918708A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒 |
CN106932588A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-07 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 检测α1-微球蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN105675887A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-06-15 | 柏荣诊断产品(上海)有限公司 | 一种高性能的人尿液微量白蛋白检测试剂盒 |
CN106053838A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-10-26 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定转铁蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN107643282A (zh) * | 2016-07-20 | 2018-01-30 | 长春市诺克因生物科技有限公司 | 一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN106324239A (zh) * | 2016-07-28 | 2017-01-11 | 武汉景川诊断技术股份有限公司 | C‑反应蛋白免疫胶乳微球制备方法及应用 |
CN107727867A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-23 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种补体c3检测试剂盒的制备方法 |
CN110133270A (zh) * | 2018-02-09 | 2019-08-16 | 长沙文瀚生物技术有限责任公司 | 一种增强免疫抑制比浊抗体筛选试剂及其制作和使用方法 |
CN108761070A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-11-06 | 柏荣诊断产品(上海)有限公司 | 一种宽检测范围的尿液转铁蛋白检测试剂盒 |
CN108593940A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-09-28 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒 |
CN109613257A (zh) * | 2018-12-01 | 2019-04-12 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种转铁蛋白(trf)检测试剂盒 |
CN109813910A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-28 | 宁波普瑞柏生物技术股份有限公司 | 利用竞争性免疫反应消除钩状效应的方法及试剂盒 |
CN110596405A (zh) * | 2019-09-20 | 2019-12-20 | 上海捷门生物技术有限公司 | 胶乳增强免疫比浊法检测心型脂肪酸结合蛋白含量的试剂盒 |
CN111766381A (zh) * | 2020-06-11 | 2020-10-13 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种基于胶乳免疫比浊法的测定试剂盒及其应用 |
CN112129934A (zh) * | 2020-09-25 | 2020-12-25 | 上海捷门生物技术有限公司 | 铁蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
CN113406323A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-17 | 上海奥普生物医药股份有限公司 | 一种胶乳免疫比浊第二试剂、含其的组合及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Dissociation of Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) from Immobilised Anti—HBsAg Antibody in a Two Site Immunoradiometric Assay: Its Relevance to Hook Effect and Recycled Assay;S L Ch\'ng 等;J Immunoassay;20061206;8(2-3);全文 * |
双抗体夹心ELISA法检测嗜酸性粒细胞阳离子蛋白;赵俊芳;王学谦;李桂珍;李会强;;临床检验杂志;20110815(05);全文 * |
血清和尿液中黄醇结合蛋白胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备及性能评价;方亮;王芬;刘献文;邬期望;;国际检验医学杂志;20180115(01);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Chen Xiao Inventor before: Chen Yitao Inventor before: Mao Xiaobo Inventor before: Gu Lili Inventor before: Wang Lijiao |
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CB03 | Change of inventor or designer information |