DE3021208A1

DE3021208A1 - Verfahren zur bestimmung von antigen, antikoerper oder antigen-antikoerperkomplex sowie ein bestimmungsreagenziensatz hierfuer

Info

Publication number: DE3021208A1
Application number: DE19803021208
Authority: DE
Inventors: Takashi Kudo; Ei Mochida; Hiroyuki Shinkai; Toshiyuki Sugawara
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-06-05
Filing date: 1980-06-04
Publication date: 1980-12-18
Also published as: FR2458809A1; JPS55162059A; NL181461C; NL181461B; BR8003501A; JPS6215825B2; FR2458809B1; US4332788A; DE3021208C2; IT1145374B; CA1140850A; IT8048878A0; GB2053468B; NL8003294A; GB2053468A; US4690908A

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Messung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes in einer Probenlosung, wobei die Ergebnisse einer immunchemischen Agglutinationsreaktion oder Agglutinationshemmungsreaktion spektrofotometrisch gemessen werden, und wobei man nach dem Start der Agglutination zwischen dem Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex, welches oder welcher bestimmt werden soll, und sensibilisierten Trägerteilchen, denen man einen Stoff zusetzt, welcher spezifisch an das genannte Antigen _r Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex gebunden wird, eine fixierende Verbindung zur Fixierung der durch die Agglutination gebildeten Aggregate zusetzt. Ferner betrifft die Erfindung einen Bestimmungsreagenziensatz (Kit), welcher alle zur Durchführung des genannten Verfahrens zu verwendenden Komponenten umfasst.

Es ist bekannt, dass die Bestimmung des Vorliegen^ eines Antigens oder Antikörpers in Körperflüssigkeiten eine grosse Signifikanz bei der Diagnose oder Therapie von Erkrankungen oder abnormen oder pathologischen Zuständen oder Bedingungen besitzt.In neuerer Zeit wurden bestimmte Antigen-Antikörperkomplexe oder -konjugate, die in engem Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen, wie etwa sjstemischem Lupus eruthematodes, rheumatoider Arthritis und gewissen Glomeruloxnephritiden, stehen, gefunden. Dementsprechend ist es derzeit noch wichtiger geworden_t ein Antigen _y einen Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex oder -konjugat in Körperflüssigkeiten zu bestimmen, und so zur Diagnose oder Therapie von physiologischen oder pathologischen Zuständen oder Bedingungen sowohl beim Menschen als auch bei Tieren beizutragen.

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Unter den Ausdrücken "Antigen oder Antikörper" sowie "Antigene oder AntiKÖrper", wie sie hier verwendet werden, sollen auch ein "Antigen-Antikörperkomplex" und "Antigen-Antikörperkomplexe" zu verstehen sein, falls dies nicht ausdrücklich anders angegeben ist. Ferner sollen im Vorliegenden die Ausdrücke "Antigen-Antikörperkomplex" und "Antigen-Antikörperkomplexe" ein "Antigen-Antikörperkonjugat" und "Antigen-Antikörperkonjugate" mituinfassen, falls dies nicht anders angegeben ist.

Eines der üblichen Verfahren zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern oder Antigen-Antikörperkomplexen ist die sogenannte Objektträgermethode- Sie besteht aus zwei Verfahrensschritten. Im ersten Schritt wird ein Stoff, der spezifisch an ein Antigen oder einen Antikörper gebunden werden kann, auf die Oberfläche eines Trägers, welcher aus feinkörnigen, unlöslichen Teilchen besteht, gebunden und die gebundenen Stoffe werden in einer geeigneten Flüssig-Keit suspendiert. Im zweiten Schritt wird die Suspension, welche im ersten Schritt hergestellt wurde, mit einer Prcbenlösung, welche das Antigen oder den Antikörper, welches (welcher) bestimmt werden soll, enthält, gemischt. Nach dieser Methode können zahlreiche verschiedene Arten von Antigenen oder Antikörper semiquantitativ durch Beobachtung der Agglutination der Suspension bestimmt werden.

Es gibt auch Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers, welches in einer Probenlösung bestimmt werden soll, durch spektrofotoEetrische oder elektrische Kessung der Ergebnisse einer Agglutinationsreaktion, wobei man die gleichen Materialien wie beim Objektträgerverfahren verwendet (hierfür siehe z.B. Croatica Chemica Acta, 42_: 457-466 (1970); European Journal of Biochemistry, 20: 555-560 (1971); JA-OS Nr. 24 015/1978; JA-OS Nr. 69 824/1978).

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Unter diesen quantitativen Bestimraungsverfahren lässt sich das Verfahren zur spektrofotometrischen Messung der Ergebnisse der Agglutinationsreaktion wie folgt skizzieren: Ein Stoff, welcher spezifisch an ein Antigen oder einen Antikörper, welche bestimmt werden sollen, gebunden werden kann, wie etwa beispielsweise das dem Antigen bzw. Antikörper, weiche bestimmt werden sollen, jeweils entsprechende Antigen oder Antikörper, wird physikalisch oder chemisch an feinverteilte, unlösliche Trägerteilchen gebunden, so dass man sensibilisierte Trägerteilchen erhält, welche dann in einer geeigneten Flüssigkeit suspendiert und mit einer Probenlösung, welche das Antigen oder den Antikörper, welches (welcher) bestimmt werden soll, enthält unter vorgewählten Bedingungen zur Reaktion gebracht werden, und im Reaktionsgemisch wird dann die Absorption oder Trübung zur quantitativen Bestimmung des in der Probenlösung vorliegenden, zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers gemessen. Unter den Begriff "sensibilisierte Trägerteilchen" oder "sensibilisiertes Trägerteilchen", wie sie hier verwendet werden, ist das unlösliche Trägerteilchen, das durch Bindung eines Stoffes, welcher spezifisch an das zu bestimmende Antigen oder den Antikörper gebunden werden kann, -sensibilisiert wurde, zu verstehen.

Bei der oben erwähnten spektrofotometrischen Methode treten jedoch Schwierigkeiten beim Erzielen einer genauen quantitativen Bestimmung des Antigens oder Antikörpers auf. Bei diesem Verfahren wird die Absorption oder Trübung eines Reaktionsgemisches gemessen, während die Reaktion darin immer noch abläuft, so dass die Absorption oder Trübung dieses Reaktionsgemisches eine Neigung zu beträchtlichen Schwankungen im zeitlichen Verlauf aufweist, weil die Reaktion selbst nach Ablauf der vorgewählten Reaktionszeit noch weiterläuft. Dementsprechend muss bei diesem Verfahren die Messung der Absorption oder Trübung sofort nach Ablauf

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der vorgewählten Reaktionszeit durchgeführt werden. Andernfalls werden die Schwankungen der gemessenen Werte so gross, dass die Genauigkeit der Messungen herabgesetzt wird. Diese Schwierigkeiten bringen Probleme bei der praktischen Anwendung dieses Verfahrens für die tatsächliche quantitative Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers mit sich.

Bei den üblichen quantitativen Verfahren kann die Reaktion einer Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen mit einer Probenlösung oft durchgeführt werden, indem man rührt, um die Reaktion zu beschleunigen. Durch die Anti— gen-Antikörperreaktion gebildete Aggregate können jedoch leicht durch mechanische Schläge oder Reize, wenn diese die Bindungslcraft der durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate übersteigen, zerstört werden. Darüber hinaus unterliegt der Grad, zu welchem die Aggregate zersetzt werden, grossen Schwankungen in Abhängigkeit von den Rührbedingungen, so dass die Genauigkeit oder Empfindlichkeit der Messung herabges-etzt wird.

Auf der Suche nach einem spektrofotoinetrischen Verfahren mit verbesserter Empfindlichkeit und Genauigkeit zur Bestimmung des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers in einer Probenlösung wurden umfangreiche Studien angestellt unter der Annahme,- dass verschiedene Probleme und Schwierigkeiten, die mit den üblichen spektrofotometrischen Techniken verbunden sind, zu lösen sein, falls die Agglutinationsreaktion oder die Agglutinationshemmungsreaktion auf einer geeigneten Stufe der Reaktion unterbrochen würde und die durch die Reaktion gebildeten Aggregate fixiert wurden, wodurch ihre Zersetzung aufgrund mechanischer Einflüsse, wie etwa Rühren, verhindert werden könnte.

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Nun wurde gefunden, dass der Einsatz einer fixierenden Verbindung die Agglutinations- oder Agglutinationshennnungsreaktion auf einer gewünschten Stufe der Reaktion unterbrechen und die gebildeten Aggregate vor der Zersetzung bewahren kann.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist also ein spektrofotometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit.

Ferner ist Ziel der Erfindung ein Verfahren zur spektrofotometrischen quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Probenlösung, worin die Agglutinationsreaktion oder Agglutinationshemmungsreaktion auf einer gewünschten Stufe der Reaktion unterbrochen werden kann.

Ziel der Erfindung ist ferner ein spektrofotometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Probenlösung, worin die durch die Agglutinationsreaktion oder Agglutinationshemmungsreaktion gebildeten Aggregate fixiert werden, wodurch ihre Zersetzung aufgrund mechanischer Einflüsse, wie etwa Rühren, verhindert wird.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Bestimmungsreagenziensatz (Kit) zur Verwendung bei der spektrofotometrischen, quantitativen Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers, ausserdem ein Bestimmungsreagenziensatz, der zur Durchführung des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens geeignet ist.

Zur besseren Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung wird im folgenden eine Ausführungsform dieser Erfindung als Beispiel beschrieben, wobei auf die beiliegenden Zeichnungen

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bezuggenommen wird, hierbei ist

Pig. 1 ein Diagramm, welches die erfindungsgemässe Bestimmungsinethode mit üblichen Methoden bezüglich der Messgenauigkeit vergleicht;

Fig. 2 ein Diagramm, welches die Wirkungen verschiedener fixierender Verbindungen vergleicht;

Fig. 3 ein Diagramm, welches Standardkurven der Bestimmungsmethode gemäss der vorliegenden Erfindung unter Verwendung verschiedener feinteiliger Träger zeigt;

Fig. 4- ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von oC-Fötoprotein im Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung zeigt;

Fig. 5 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von Human-Chorion-Gonadotrophin (HCG) im Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 6 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von östriol durch Igglutinationshemmungsreaktion in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 7 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung des Rheumafaktors nach der Trübungsmethode in Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung erläutert;

Fig. 8 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Bestimmung von nenschlichem gamma-Globulin in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung zeigt;

Fig. 9 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Be-

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Stimmung von iX-Fötoprotein in Beispiel 6 der vorliegenden Anmeldung zeigt; sowie

Fig. 10 ein Diagramm, welches eine Standardkurve zur Messung von Östriol in Beispiel 7 der vorliegenden Anmeldung zeigt.

Die vorliegende.Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes oder -konjugates sowie einen Reagenziensatz (Kit) zur Verwendung bei dieser Bestimmung.

Zu den iinmunchemischen Reaktionen, auf welchen die erfindungsgemässe Methode basiert, gehören die immunchemische Agglutinationsreaktion und die Agglutinationshemmungsreaktion. Die auf der immunchemischen Agglutinationsreaktion basierende Methode gemäss der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass man die immunchemische Agglutinationsreaktion von Antigenen, Antikörpern und/oder Antigen-Antikörperkomplexen, welche bestimmt werden sollen, mit sensibilisierten Trägerteilchen, die man durch Bindung eines dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entsprechenden Antigens oder Antikörpers an unlösliche Trägerteilchen erhalten hat, durchführt und im Reaktionsgemisch dessen Absorption oder Trübung durch Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge misst. Die auf der Agglutinationshemmungsreaktion gemäss der vorliegenden Erfindung basierende Methode andererseits umfasst eine immunchemische Agglutinationshemmungsreaktion, worin ein Antigen oder Antikörper, welches bestimmt werden soll, die immunchemische Agglutinationsreaktion der unlöslichen Trägerteilchen mit einem Agglutinationsmittel hemmt,, sowie die Messung im Reaktionsgemisch auf die gleiche Weise, wie oben ausgeführt.

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G-emäss der vorliegenden Erfindung kann die auf der immunchemischen Agglutinationsreaktion basierende Methode so ausgeführt werden, wie im folgenden im Detail beschrieben wird. Das auf der immunchemisehen Agglutinationshemmungsreaktion beruhende Verfahren andererseits kann im wesentlichen auf dieselbe Weise, wie die Agglutinationsreaktion durchgeführt werden, falls dies im folgenden nicht ausdrücklich anders festgestellt wird.

Das Bestimmungsverfahren, worauf die Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens beruht, umfasst als Schritte, dass man (1) eine Antigen-Antikörperreaktion zwischen (a) sensibilisierten Trägerteilchen als erster Komponente und (b)' einem Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex oder -konjugat als aweiter Komponente in einer Probenlösung bewirkt, wobei die erste Komponente durch Bindung von (I) Antigenen, Antikörpern oder Antigen-Antikörperkomplexen, welche den Antigenen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplexen und -konj'ugaten, welche bestimmt werden sollen, entsprechen, mit (II) feinverteilten, unlösliche Trägerteilchen, so dass mindestens zwei Einheiten der genannten Stoffe an jeden teilchenförmigen Träger gebunden werden, gebildet wird, und dass diese zweite Komponente die immunchemische Agglutinationsreaktion mit dem an die sensibilisierten Trägerteilchen gebundenen Stoff bewirken kann, die durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate durch Zusatz einer fixierenden Verbindung zur Probenlösung fixiert und (2) das Reaktionsgemisch mit Strahlen einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt und die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches misst und hierdurch die Menge oder Konsentration des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers bestimmt.

Bei der immunchemischen Agglutinationsreaktion, welche der erfindungsgemässen Messmethode zugrundeliegt, wird ein

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Antigen oder Antikörper, welcher an das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper spezifisch gebunden werden kann und diesem beispielsweise entspricht, zuerst physikalisch oder chemisch an feinverteilte, unlösliche Trägerteilchen gebunden. Eine Anzahl von Methoden zur Bindung eines Antigens oder Antikörpers, welche spezifisch an das zu bestimmende Antigen oder den zu bestimmenden Antikörper gebunden werden, an feinverteilte Trägerteilchen sind bekannt. Im allgemeinen werden physikalische Sorptionsverfahren oder chemische Bindungsverfahren durchgeführt (siehe JA-OS 16 623/1972 und JA-OS 8868/1973).

Der Träger, v/elcher als feinteiliger Träger gemäss der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden soll, kann ein beliebiger Träger sein, wie er üblicherweise als sensibilisierte Trägerteilchen zur Verwendung in Reagensien für den Objektträgertest verwendet wird, hierzu gehören ein organischer Polymerlatex, wie z.B. Polystyrollatex, carboxylierter Polystyrollatex, Styrol-divinylbenzolcopolymerlatex, hydroxylierter oder carboxylierter Styrol-divinylbenzol-copolymerlatex, Polyvinylalkohollatex, Polyacrylesterlatex oder Vinylacetat-acrylatcopolymeres, ein anorganisches Material, wie etwa beispielsweise Kieselerde, Russ oder Tonerde, oder Zellen, wie etwa beispielsweise Bakterien oder Erythrocyten.

Eine Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen kann hergestellt werden, indem man die sensibilisierten Trägerteilchen in einer geeigneten Lösung, wie sie üblicherweise für die Zwecke einer Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen verwendet wird, suspendiert. Die sensibilisierten Trägerteilchen können darin in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 200 mg, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 50 mg pro Milliliter der Lösung suspendiert werden. Die Lösung, worin die sensibilisierten Trägerteilchen suspendiert wer-

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den, kann Wasser oder jede andere Flüssigkeit umfassen, welche keine nachteilige Wirkung auf die Reaktion und die mit den Bestimmungsverfahren gemäss der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang stehenden Bedingungen ausübt.

Eine ein zu bestimmendes Antigen oder Antikörper enthaltende Lösung wird, dann der Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen zugesetzt, so dass die immunchemische Agglutinationsreaktion des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers mit den sensibilisierten Trägerteilchen bewirkt wird. Eine geringe Menge, wie ca. 0,05 bis 1,0 ml des durch die immunchemische Agglutinationsreaktion erhaltenen Reaktionsgemisches kann im allgemeinen für diesen Zweck eingesetzt werden. Wenn die Menge an Reaktionsgemisch zu gering ist, so dass die Messung des Reaktionsgemisches bezüglich der Absorption oder Trübung schwierig würde, so kann ein geeignetes Lösungsmittel, wie etwa physiologische Kochsalzlösung_;nach Abschluss der Fixierung der immunchemischen Agglutinationsreaktion durch eine fixierende Verbindung zugesetzt werden, so dass das Volumen des Reaktionsgemisches vergrössert wird und die Messung der Absorption des Reaktionsgemisches durchgeführt werden kann.

Die Temperaturen, bei welchen die Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen mit einer Probenlösung zur Reaktion gebracht wird, ist nicht besonders beschränkt und es kann im allgemeinen jede beliebige Temperatur sein, bei welcher die Antigen-Antikörperreaktion bewirkt wird. Die Zeiten für die Reaktion der sensibilisierten Trägerteilchensuspension mit der Probenlösung können im allgemeinen von ca. 1 Minute bis 24 Stunden betragen, liegen jedoch vorzugsweise bei etw8 3 Minuten bis 120 Minuten, wobei man die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Messung und die Praktikabilität in Betracht zu ziehen hat. Um die Reaktion homogen und gleichmässig ablaufen zu lassen, wird das

Reactions genii sch vorzugsweise allmählich und langsam gerührt.

Geraäss der vorliegenden Erfindung wird eine fixierende Verbindung zum Stoppen der Antigen-Antikörperreaktion, welche die Agglutination der sensibilisierten Trägerteilchen in der Suspension mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper bewirkt, verwendet.

Zu den fixierenden Verbindungen, welche gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gehören mehrfunktionelle Verbindungen, wie etwa beispielsweise Carbodiimide, z.B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (im folgenden als' "Propylcarbodiimid" bezeichnet) und 1-Cyclohexyl—3-(2-morpholinoethyl)carbodiiniid (im folgenden als "Morpholinocarbodiimid" bezeichnet), Dialdehyde, z.B. Glutaraldehyd und Succinaldehyd, und Acylierungsmittel, z.B. N-Ethyl-5-phenylisoxazonium—3¹—sulfonat, Succinylchlorid, und dergleichen, sowie proteindenaturierende Mittel, wie etwa Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Thiocyansäure und Thioglykolsäure, und dergleichen.

Die gemäss der vorliegenden Erfindung zu verwendenden fixierenden Verbindungen können dem Reaktionsgemisch zu jeder Zeit beginnend vom Start bis zum Abschluss der Agglutinationsreaktion zugesetzt werden. Xm allgemeinen wird die erfindungsgemässe fixierende Verbindung zugesetzt werden, nachdem die Reaktionssuspension mit einer Probenlösung über einen gewissen Zeitraum reagiert hat, welchen man unter Berücksichtigung des eingesetzten Systems bestimmt.

Die fixierende Verbindung kann jedoch dem System zusammen mit den anderen Bestandteilen zugesetzt werden, um die Reaktionsschritte zu vereinfachen und zu verkürzen.

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Der für die Fixation der Aggregate erforderliche Zeitraum und die optimale Konzentration der fixierenden Verbindung, die zur Fixation nötig ist, sind miteinander korreliert und können ausserdem in Abhängigkeit von der Art der fixierenden Verbindung variieren, so dass hier keine allgemeinen Grenzen für bestimmte Fälle angegeben werden können. Im besonderen kann der Zeitraum für die Fixation von etwa 3 bis etwa 120 Minuten reichen und die optimale Konzentration der fixierenden Verbindungen zur Zeit der Fixation kann vorzugsweise von etwa 0,1 bis 40 % für Propylearbodiimid, ca. 0,1 bis 5 % für Morpholinocarbodiimid, ca. 0,1 bis 20 % für Glutaraldehyd und ca. 1 bis 30 # für Formalin betragen. Die Konzentration der fixierenden Verbindung kann jedoch etwas niedriger sein, wenn die zu fixierende Verbindung dem System zusammen mit der Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen und der Probenlösung zugesetzt wird.

Die zugesetzte Menge der fixierenden Verbindung zum Reaktionssystem geraäss der vorliegenden Erfindung kann im allgeminen von etwa 0,001 bis 10 ml, vorzugsweise von ca. 0,01 bis 3 ml j unter Berücksichtigung des zu bestimmenden Reaktionsgemisches, betragen.

Die Reaktionsabläufe können wesentlich durch Verdünnung des Reaktionsgemisches gestoppt werden, da diese zur Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit neigt. Werden grosse Mengen an Lösung, welche fixierende Verbindungen löst, dem Reaktionssystem zugesetzt, so kann dies den Stop des Reaktionsablaufs und die gleichzeitige Fixation der Aggregate bewirken. Wird dementsprechend das Reaktionsgemisch verdünnt, dann kann die fixierende Verbindung in einer Konzentration zugesetzt werden, die nur zur Fixierung des- Aggregates ausreicht, so dass sie die Antigen-Antikörperreaktion nicht notwendigerweise stoppt.

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Die Pufferlösung, die zur Verdünnung des Reaktionsgemisches bei einer geeigneten Konzentration eingesetzt wird, ist ■eine Lösung, wie sie üblicherweise auf dem Gebiet der Immuneheraie verwendet wird und umfasst beispielsweise eine glycingepufferte Kochsalzlösung, eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung und eine boratgepufferte Kochsalzlösung. Eine geeignete Menge eines Proteins, wie etwa Rinderserumalbumin und/oder Kaninchenserumglobulin, kann einer solchen Pufferlösung zugesetzt werden, um die Reproduzierbarkeit der Reaktion zu erhöhen. Der Zusatz der Pufferlösung kann auch dazu dienen, im Reaktionssystem einen geeigneten pH und eine geeignete Ionenstärke aufrechtzuerhalten.

Nach Abschluss der Fixation der Aggregate wird das diese Aggregate enthaltende Reaktionsgemisch der Messung der Absorption nach üblichen Methoden zugeführt·. Obwohl beliebige Strahlen mit Wellenlängen im Bereich von 520 bis 2400 nm, vorzugsweise 400 bis 900 nm, eingesetzt v/erden können, kann eine geeignete Wellenlänge für die Messung leicht aus dem oben angegebenen Wellenlängenbereich gewählt werden, weil die geeignete Menge in Abhängigkeit von den verschiedenen, in einer Probenlösung enthaltenen Arten von Bestandteilen und den Arten von feinteiligem Träger und/ oder seiner Teilchengrösse gewählt werden kann. Anstelle der Absorption kann auch die Trübung des Reaktionsgemisches auf übliche Weise gemessen werden.

Die quantitative Bestimmung von zu messendem Antigen oder Antikörper dm Reaktionsgemisch kann durch Vergleich mit einer Standardkurve für das zu bestimmende Antigen oder Antikörper durchgeführt werden. Zum Auftragen der Standardkurve für jedes der zu bestimmenden Antigene oder Antikörper kann eine Reihe von Verfahrensweisen durchgeführt werden, indem man eine Referenzsubstanz, die an sich oder

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in ihrer Reaktivität dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper identisch ist, in verschiedenen Mengen einer geeigneten Pufferlösung, wie oben erwähnt, auflöst und so eine Standardtestlösung mit einer gegebenen Menge der Suspension des sensibilisierten Trägerteilchens unter vorgewählten Bedingungen herstellt, sofort danach die fixierende Verbindung zusetzt, um die Reaktion am Weiterlaufen zu hindern, so dass die gebildeten Aggregate fixiert werden, und schliesslich die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches in einer Messzelle bestimmt, wobei das Reaktionsgemisch mit einer geeigneten Flüssigkeit oder Pufferlösung nötigenfalls verdünnt v/erden 2;ann. Die Standardkurve kann gezeichnet v/erden, so dass die Menge oder

Konzentration der Standardsubstanz mit ihrer Absorption oder Trübung in Beziehung ggesetzt wird. Die quantitative Bestimmung von zu bestimmendem Antigen oder Antikörper kann durchgeführt werden, indem man das sensibilisierte Trägerteilchen mit einer unbekannten Probe im wesentlichen auf die gleiche Weise und unter den im wesentlichen gleichen Bedingungen, wie im Falle der Standardkurve für die Standardprobenlösung zur Reaktion bringt und dann die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches misst und die Ergebnisse dieser Bestimmung mit der so erarbeiteten Standardkurve vergleicht, wodurch die quantitative Bestimmung des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers in der unbekannten Probe ermöglicht wird.

Um die Empfindlichkeit der Bestimmung zu erhöhen, wird die Verwendung einer Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen mit einer etwas höheren Konzentration bevorzugt.

Gemäss der vorliegenden Erfindung kann eine verhältnisroässig hohe Konsentration der Suspension des sensibilisierten Trägerteilchens verwendet werden, so dass die Messempfindlichkeit vergrössert wird.

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Bei den üblichen Bestimmungsverfahren wird das Reaktions-Gemisch direkt der Messung zugeführt, ohne dass es vorher verdünnt wird, da die Verdünnung des Reaktionsgemisches die gebildeten Aggregate zerstören kann. Ist dementsprechend die Konzentration der Suspension zu hoch, dann ist es schwierig, das Reaktionsgemisch zu messen, so dass die Brauchbarkeit der üblichen Messverfahren auf ein Reaktionsgemisch begrenzt ist, worin die Konzentration der Suspension niedriger als 0,6 Gew.-% liegt (siehe JA-OS 24 OI5/I978). In der vorliegenden Erfindung jedoch kann das Reaktionsgemisch eingesetzt werden, selbst wenn es nötigenfalls verdünnt ist, so dass nach der vorliegenden Erfindung eine höchste Empfindlichkeit der Reaktion selbst dann erreicht wird, wenn die Konzentration der Suspension etwa 1 Gew.-^ ausmacht.

Das auf der immunchemipchen Agglutinationshemmungsreaktion basierende Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Messung von Änderungen der Absorption oder Trübung, die durch die immunchemische Agglutinationshemmungsreaktion bewirkt wird, worin das zu bestimmende- Antigen oder Antikörper die immunchemische Agglutinationsreaktion der oben genannten unlöslichen Trägerteilchen mit einem Agglutinationsmittel hemmt.

Das in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zu verwendende Agglutinationsmittel ist ein Mittel, welches die Induktion der Agglutination der Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen bewirken kann, wo kein oder wenig oder eine sehr kleine Menge Antigen oder Antikörper, die bestimmt werden sollen, in einer Probenlösung vorliegen.

Es kann allgemein ein Antigen oder einen Antikörper umfassen, welches (welcher) spezifisch an die sensibilisierten Trägerteilchen gebunden werden kann, sowie ein Antigen und einen

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Antikörper, welches oder v/elcher an die unlöslichen, feinen teilchenförmigen Träger gebunden wird.

Das Messverfahren, worauf die andere Aur-führungsform des erfindungsgemässen Verfahrens beruht, umfasst, dass man die Antigen-Antikörperreaktion zwischen sensibilisierten Trägerteilchen als erster Komponente, einem Antigen oder Antikörper, welche bestimmt werden sollen, als zweiter Komponente und einem Agglutinationsmittel als dritter Komponente bewirkt, wobei die erste Komponente durch Bindung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes, der dem zu bestimmenden Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex entspricht, an feinverteilte, unlösliche Trägerteilchen erhalten wurde, so dass mindestens zwei Einheiten der genannten Substanzen jeweils an ein Trägerteilchen gebunden werden, und wobei die zweite Komponente zur immunehend sehen Agglutinationsreaktion mit der an die sensibilisierten Trägerteilchen gebundenen Substanz befähigt ist, und die dritte Komponente ein Antigen, Antikörper und/oder Antigen-Antikörperkomplex ist, welcher oder welche zur immunchemischen Reaktion mit der ersten Komponente befähigt ist oder sind, dann die durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate durch Zusatz einer fixierenden Verbindung zur Probenlösung fixiert und das Reaktionsgemisch mit Strahlen einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt und die Absorption oder Trübung des Reaktionsgemisches misst, wodurch man die Menge oder Konzentration des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers bestimmen kann.

Der Probenlösung, zu der man das Agglutinationsmittel zugegeben hat, wird dann eine gegebene Menge der fixierenden Verbindung zugesetzt. Der Zusatz der fixierenden Verbindung kann sofort nach der Hemmung der Antigen-Antikörperreaktion geschehen. Es ist jedoch auch möglich, das Agglutinations-

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mittel zusammen mit den anderen für das erfindungsgercässe Bestimmungsverfahren, das auf der immunehemischen Agglutinationsheramungsreaktion beruht, nötigen Bestandteile zuzusetzen, um das Vorgehen zu vereinfachen und abzukürzen.

Wenn die beabsichtigte Antigen-Antikörperreaktion eine Agglutinationsreaktion ist, dann umfasst das erfindungsgemässe Messreagenzienkit (a) eine Suspension der sensibilisier-ten Trägerteilchen, (b) eine Pufferlösung und (c) eine fixierende Verbindung. Ist die beabsichtigte Antigen-Antikörperreaktion eine Agglutinationshemmreaktion, dann umfasst der Messreagensiensatz gemäss der vorliegenden Erfindung

(a) eine Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen,

(b) eine Pufferlösung, (c).ein Agglutinationsmittel und (&) eine fixierende Verbindung.

Einige oder alle der Reagenzien des erfindungsgemässen Bestimmungssatzes können gefriergetrocknete Reagenzien sein. In diesem JFall kann dem Bestimmungssatz ein geeignetes Lösungsmittel beigefügt werden, das dann zum Auflösen der gefriergetrockneten Reagenzien verwendet wird\ wenn das Kit tatsächlich verwendet wird. Zur bequemeren Verwendung des erfindungsgemässen Bestimmungssatzes können darin ein Reagenzglas, eine Pipette und andere zusätzliche Bestandteile enthalten sein.

Antigene oder Antikörper, welche nach dem erfindungsgemässen Verfahren und mit dem Bestiinmungssatz der vorliegenden Erfindung bestimmt werden können, sind beispielsweise Proteinhormone, wie etwa Human-Choriongonadotrophin (HCG), Insulin und menschliches Wachstumhormon, Proteine, wie £X-Fötoprotein, Hepatitis-B-Virus (HBs), Immunglobulin, Antigen-Antikörperkomplexe, Coeruloplasmin und Transferrin, und Heptene, wie etwa Thyroxin, Testosteron, Phenytoin und Phenobarbital.

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Das erfindungsgemässe Verfahren hat die folgenden Vorteile:

Da die Antigen-Antikörperreaktion in ihrem Ablauf durch Zusatz der fixierenden Verbindung zum Reaktionsgemisch gestoppt wird, kann sie nicht v/eiterlaufen, während die Absorption gemessen wird. Dementsprechend können Variationen der gemessenen Werte verringert und die Messgenauigkeit verbessert werden.

Da die durch die Reaktion gebildeten Aggregate durch die fixierende Verbindung fixiert werden, wird die mechanische Festigkeit der Aggregate erhöht und die Desintegration der einmal gebildeten Aggregate durch Rühren des Reaktionsgemisches oder Übertragen des Reaktionsgemisches beispielsweise in eine Messzelle zur Absorptions- oder Trübungsmessung kann merklich verringert werden. Dementsprechend kann die Schwankung der gemessenen Werte oder die Verringerung der Messgenauigkeit aufgrund der Desintegration der einmal gebildeten Aggregate verhindert und die Messung mit hoher Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass keine spezielle Messvorrichtung erforderlich ist. Insbesondere bleibt, da bei dem erfindungsgemässen Messverfahren ein weiteres Ablaufen der Reaktion durch Zugabe der fixierenden Verbindung verhindert wird, genügend Zeit, das Reaktionsgemisch in eine Messzelle für die Absorptionsmessung zu überführen. Da weiterhin die gebildeten Aggregate stabil fixiert sind, kann die Desintegration der Aggregate durch das Überführen des Reaktionsgemisches wirksam verhindert werden. Dementsprechend kann der gesamte Arbeitsgang unter Verwendung eines gewöhnlichen Reaktionsgefässes ohne spezielle Vorrichtung durchgeführt werden.

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Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens liegt darin, dass alle Stufen der Bestimmung automatisiert werden können. Insbesondere kann, wie bereits oben beschrieben, die mechanische Beständigkeit der Aggregate durch Zugabe der fixierenden Verbindung im erfindungsgemässen Bestimmungsverfahren erhöht werden und die Desintegration der einmal gebildeten Aggregate durch Transport und Überführen des Reaktionsgemisches kann beträchtlich verringert werden. Dementsprechend können alle Verfahrensschritte einschliesslich des Transports und des Rührens automatisiert werden.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die quantitative Messung unter Verwendung der Reagenzien für die übliche, auf einem Objektträger durchgeführte halbquantitative Messung durchgeführt werden kann. Der Bestxinmungsreagenziensatz gemäss der vorliegenden Erfindung weicht von den üblichen halbquantitativen Bestimmungsreagenziensätzen nur in dem Punkt ab, dass die fixierende Verbindung zugefügt wird. Wenn demzufolge der erfindungsgemässe Bestimmungssatz verwendet wird, dann wird die Reaktion, welche bisher auf einem Objektträger durchgeführt wurde, in einem Reagenzglas ausgeführt und die Absorption oder die Trübung wird dann gemäss dem oben beschriebenen Vorgehen gemessen, wodurch man eine quantitative Messung erreicht.

Wenn deshalb die fixierende Verbindung gemäss der vorliegenden Erfindung mit dem üblichen Reagenziensatz kombiniert wird, dann kann man je nach Wunsch und Notwendigkeit das halbquantitative Objektträger-Bestimmungsverfahren oder das quantitative Bestimmungsverfahren mit Messung der Absorption wählen.

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Es folgt eine detailierte Beschreibung der beiliegenden Zeichnungen.

Die Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Messgenauigkeit, die mit dem erfxndungsgeraassen Verfahren, worin die Aggregate durch Zugabe einer fixierenden Verbindung zum Reaktionsge-Biisch fixiert werden, erreichbar ist, mit der mit üblicher Methode ohne Verwendung einer fixierenden Verbindung erzielbaren Genauigkeit vergleicht. Es wird insbesondere nach dem im später ausgeführten Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ein anti-Of-fötoprotein-sensibilisiertes Latexreagenz mit einer Lösung einer Standardprobe von £(-Fötoprotein umgesetzt und man gibt dann eine 10 #ige Propylcarbodiimid-Suspension als fixierende Verbindung zum Reaktionsgemisch oder gibt sie nicht zu. In jedem Fall transportiert man das Reaktionsgemisch einige Male in verschiedene Gefässe und misst dann jeweils die Absorption des Reaktionsgemisches, um die Änderungen der gemessenen Werte aufgrund des beschriebenen wiederholten Transportes zu erfassen. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, nimmt bei dem üblichen Verfahren ohne Verwendung einer fixierenden Verbindung die Absorption jedesmal, wenn das Reaktionsgemiseh transportiert wird, zu. Hieraus lässt sich ersehen, dass die einmal gebildeten Aggregate durch mechanische Einflüsse die durch den Transport bewirkt werden, desintegrieren.

Im Gegensatz dazu ist bei dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung einer fixierenden Verbindung die Änderung der gemessenen Werte sehr gering und man kann hieraus ersehen, dass eine Desintegration der Aggregate kaum bewirkt wird.

Die Fig. 2 zeigt die Ergebnisse eines Vergleichs der Wirkungen verschiedener fixierender Verbindungen. Insbesondere wird auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben, ein anti-

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0^-fötoprotein-antikörper-sensibiIisiertes Latexreagenz mit einer Standardprobenlösung von 0(-Fötoprotein umgesetzt und. man gibt dann verschiedende fixierende Verbindungen zum Reaktionsgemische um Standardkurven, die in Fig. 2 gezeigt sind, zu erhalten. Aus der Fig. 2 ist ersichtlich, dass bei Verwendung dieser fixierenden Verbindungen steilere Standardkurven erreicht werden und dass man eine gute Brauchbarkeit durch Fixieren der durch die Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregate erzielt.

Beispiele für Standardkurven, die man durch Herstellung von Reagenzien, die gegen einen Anti-D(-fötoprotein-antikörper sensibilisiert wurden, gemäss dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren, unter Verwendung von verschiedenen feinteiligen Trägern und Bestimmung einer Standardprobe von 0(-Fötoprotein unter Verwendung dieser Reagenzien erhalten hat, sind in der Fig. 3 gezeigt.

Aus dieser Fig. 3 ist ersichtlich, dass man ohne Rücksicht auf die Art des verwendeten Trägers ähnliche Standardkurven erhält.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Bestimmung von Οξ-Fötoprotein

(a) Ein Anti-OFP-Antikörper wurde in einer Konzentration von 0,08 % in einer glycingepufferten Kochsalzlösung (Glycinpuffer) mit einem pH von 8,2 gelöst und 5 ml dieser Lösung wurden zu 5 ml einer 10 #igen Suspension von Polystyrollatex (ein Produkt von Dow Chemical Co., mittlere Teilchengrösse 0,4-8 um) gegeben und man inkubierte 60 Minuten

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BAD ORiGfNAL

bei 4-5⁰C, um den Polystyrollatex mit dem Anti-(\FP-Anti-Irörper zu inkubieren. Nach der Sensibilisierung wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt und der Niederschlag wurde in 50 ml Glycinpuffer, der 0,1 % Rinderserumalbumin (RSA) enthielt, zur Herstellung eines Anti-o^-FP-Antikörper sensibilisierter Latexreagenz suspendiert.

(b) o(-Fötoprotein wurde aus der Ascitesflüssigkeit eines Patienten mit Hepatom gemäss dem "Vorgehen von Nishi et al (Cancer Res., JO: 2507-2523 (197O)) extrahiert und das gereinigte <\FP in einer 0,1 ^igen Lösung von RSA in einer

"^i P 1

Konzentration von 10 , 10 , 10 oder 0 ng/ml als Standardprobenlösung gelöst.

Dann wurden 25 pl der Standardlösung, 50 ul Glycinpuff er und 25 pl des anti-Q(FP—antikörpersensibilisierten Latexreagenz, das unter (a) hergestellt wurde, in ein Reagenzglas gegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über 4-0 Minuten bei leichtem Schütteln durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer 10 $igen Lösung von Propylcarbodiimid in Glycinpuffer als fixierende "Verbindung zugesetzt und die Reaktion wurde 20 Minuten unter Schütteln ausgeführt. Nach dieser Reaktion wurden 4- ml einer physiologischen Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Absorption wurde unter Verwendung eines Spektrofotometers (Hitachi Model 624 der Firma Hitachi Ltd., Tokio/Japan) bei einer Wellenlänge von 500 nm gemessen. Die Messung wurde für jede Standardlösung zweimal ausgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in einer Kurve als Standardkurve in Fig. 4 aufgetragen.

(c) die Konzentration von (\-Fötoprotein in den Seren von Eepatom-Patienten wurde vorher nach dem halbquantitativen Verfahren bestimmt und jedes Serum wurde auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse entsprechend verdünnt. 25 pl des ver-

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dünnten Serums wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Absorption wurde nach, dem in (b) beschriebenen Verfahren geraessen. Die Konzentrationen von CAFP in den Patientenseren wurden aus den jeweils erhaltenen Werten unter Verwendung der unter (b) erhaltenen Standardkurve bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Iatient Nr.	Probe	Verdünnungs- verhältnis (χ)	Absorption	Of KP- Konzen trat ion (ng/ml)
1	Material	1	0,611	62
2	Serum	40	0,541	4520
•3	Serum	40	0,581	3450 ;
4	Serum	Serum 1	0,321	298 ■
5	Serum 30	0,553 j	3600

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Messung von Human-chroniogonadotrophin (HCG).

(a) Räch dem in Beispiel 1(a) beschriebenen Vorgehen wurden ein Anti-HCG-Antikörper und ein carboxylierter Polystyroliatex (ein Produkt der Dow Chemical Co., mittlere Teilchengrösse 0,25 ,um) gemischt und zur Herstellung eines anti-HCG-antikörpersensibilisierten Latexreagenz inkubiert.

(b) HCG (mit einer spezifischen Aktivität von 6000 IU/mg) wurde in Glycinpuffer in einer Konzentration von 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0,25 IU/mL als_RStandardlösungen gelöst. 25^1

der Standardlösung, 50 ul einer Pufferlösung und 25 ul des in (a) hergestellten anti-HCG-antikörpersensibilisierten Latexreagenz wurden in ein Epagenzglas gegeben. Die Reaktion wurde über 60 Minuten unter mildem Schütteln bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 4- ml einer 10 #igen Lösung von Glutaraldehyd dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Reaktion wurde über weitere 30 Minuten ausgeführt. Die Absorption bei 500 nm wurde gemessen und man erhielt die in Fig. 5 gezeigte Standardkurve.

(c) Humanserum oder Urin wurde, wie in (b) beschrieben, behandelt und die Absorption wurde bestimmt. Dann wurde die Menge an HCG in der Serum- oder Urinprobe auf der Basis der unter (b) erhaltenen Standardkurve bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt. Ausserdem sind in der Tabelle 2 die nach der Objektträgermethode (minimale Empfindlichkeit: 1 IU/ml) und nach der Radio-Immunassay-Methode (RIA-Methode) erhaltenen Ergebnisse als Bezug angeführt.

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Tabelle 2

Patient	Probe	Verdün- nungs- verhält-	Absorp	HCG-	Objekt-	RIA-
Nr.	Material	nis	tion (Mittel)	Konzen- tration (Iü/ml)	träger- methode	yiethode (Iü/ml)
		(X)
		1
1	Urin	1	0,589	0,28		0,41
2	Urin	1	0,421	0,99	+	1,02
3	Urin	1	0,458	0,86	+	0,89
4	Urin	10	0,212	.2,93	+	3,21
5	Urin	1	0,339	13,67	++	17,36
6	Serum		0,5^3	0,54	-	0,66
7	Serum	1	0,203	3,32	++	3,12
8	Serum	1	0,551.	0,86	+	0,91
-9	Serum	1	0,458	0,50	-	0,57 '
10	Serum	0,309 .	■ 1,55	+	! 2,26

-: kein HGG oder <1 Iü/ml HCG
±: ca. 1 IU/ml HCG
+: >1 IU/ml HCG
++: ^1 IU/ml HCG

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert eine Ausführungsform des auf der Agglutinationshemmreaktion basierenden Verfahrens.

(a) Nach dem in Beispiel 1(a) beschriebenen Vorgehen wurde hydroxylierter Styrol-divinylbenzol-copolymerlatex (ein Produkt der Rhone-Poulenc, Paris, Frankreich, mittlere Teilchengrösse 0,33 JJm) mit einem Antiöstriol-Antikörper sensibilisiert, welcher unter Verwendung von an Rinder-

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serumalbumin konjugiertem ö,striol-16,17-dihemissucinat (im folgenden als "E^-RSA" bezeichnet) hergestellt war, unter Bildung eines anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreasenz sensibilisiert.

(b) E^-RSA wurde in physiologischer Kochsalzlösung in Konzentrationen von 160, 80, 40, 20, 10 oder 5 ηg/ml als Standardlösung gelöst. 25 ul des in (a) hergestellten anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz, 25 yl einer Lösung eines Komplexes von östron-17-(0-carboxymethyl)oxim mit Rinderserumalbumin (im folgenden als "E^-RSA" bezeichnet) in einer Konzentration von 100 ug/ml als Agglutinationsmittel und 25 yl der Standardlösung wurden zugesetzt und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über 40 Minuten ausgeführt. Nach dem Abschluss der Reaktion wurden 4- ml einer 10 #igen Lösung von Propylcarbodiimid zugesetzt und die Reaktion wurde 20 Minuten weitergeführt. Dann wurde die Absorption des Reaktionsgemisches gemessen und man erhielt die in Fig. 6 gezeigte Standardkurve.

(c) Der Urin einer schwangeren Frau wurde mit physiologischer Kochsalzlösung geeignet verdünnt in einem Verdünnungsverhältnis, das aus den Ergebnissen der Voruntersuchung mit der halbquantitativen Bestimmung gewählt wurde, Nach dem in (b) beschriebenen Vorgehen wurde die Konzentration von Qstriol im Urin quantitativ bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt.

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Tabelle 3

Nr.der Patien tin	Schwan- gersch.—- woche ι t	Probe	Verdünnungs- verhältni s (χ)	Absorp tion	Östriol- konzen- tration (mg/1) .
1	I 4	Material	1	0,455	0,08 j
2	16	Urin	10	0,299	0,48 j
3	28	Urin	50	0,200	1,21
4	31	Urin	500	0,534	5,30
5	36	Urin	1000	0,483	9,80
Urin

Beispiel 4

(a) Ein Polystyrollatex wurde mit denaturiertem Immunglobulin (IgG) nach dem in Beispiel 1(a) beschriebenen Vorgehen zu einem gegen denaturiertes IgG sensibilisierten Latexreagenz sensibilisiert.

(b) Rheumafaktor-positives Serum als Standardprobe wurde in einem Verdümungsverhältnis von 1600, 800, 400, 200 und 100-facher Verdünnung zur Herstellung einer Standardlösung verdünnt. 25 ul der Standardlösung, 50 ul Pufferlösung und 25 pl des in (a) hergestellten Latexreagenz, das gegen denaturiertes IgG sensibilisiert war, wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde über 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer 10 #igen Propylcarbodiimidlösung zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 20 Minuten ausgeführt. Dann wurden 4 ml physiologischer Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Trübung wurde mit einem Turbidimeter (Corona UT-11) gemessen, wobei ein voller Skalenausschlag gleich 100 gesetzt wurde. Ein Beispiel der Standardkurven

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ist in Fig. 7 gezeigt.

(c) Unter Verwendung eines Patientenserums anstelle der Standardlösung wurde der Rheumafaktor in Serum, wie in (b) oben beschrieben, bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Probe Nr.	Probe	Trübung	Verdünnungsverhältnis (x) von Rheumfaktor-positivem Standardserua	Beurtei lung
1	Serum	89,0	O	_
2	Serum	66,8	700
3	Serum	89,7	0	-
4	Serum	56,5	300	+++
5 ;	Serum	77,9	1000	+

-: Rheumafaktor negativ

+, ++, +++: Rheumafaktor positiv.

Beispiel 5

(a) Nach dem in Beispiel 1(a) beschriebenen Vorgehen wurde ein Polystyrollatex mit einem Antikörper gegen menschliches gamma-Globulin (HGG) als anti-HGG-antikörper-sensibilisiertes Latexreagenz sensibilisiert.

(b) Die Standardlösung wurde durch Lösen von HGG in einer Pufferlösung in einer Konzentration von 80, 40, 20, 10 und 5 mg/ml hergestellt. 25 pl der Standardlösung, 50 ul einer Pufferlösung und 0,1 ml einer 1 #igen Propylcarbodiimidlösung wurden in ein Reagenzglas gegeben und 25 ul

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des unter (a) hergestellten anti-HGG-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz wurden zugesetzt und die Reaktion wurde 4-0 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 4 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zugesetzt und die Absorption bei 500 nm wurde gemessen. Ein Beispiel der so erhaltenen Standardkurven ist in Fig. 8 gezeigt. Die Konzentration von HGG konnte unter Verwendung der in Fig. 8 gezeigten Standardkurve bestimmt werden.

Beispiel 6

Russ ("Show Black", der Firma A. A. Chemical, mittlere Teilchengrösse 0,02 bis 0^4- }jm) wurde in Glycinpuffer in einer Konzentration von 10 % suspendiert. Dann wurden 0,5 ml der Suspension mit 2 ml einer Lösung eines Anti-Q^FP-Antikörpers gemischt und 20 Minuten bei 5S°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Überstand durch Zentrifugation entfernt und der verbleibende Rückstand wurde in 5,5 ml Glycinpuffer, der 0,1 % RSA enthielt, als anti-CpT-antikörper-sensibilisiertes Russreagenz suspendiert.

(b) 25 la 1 der in Beispiel 1(b) hergestellten ^FP-Standardlösung, 50 ul einer Pufferlösung und 25 ul des unter (a) hergestellten anti-j^FP-antikörper-sensibilisierten Russreagenz wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer 10 i&Lgen Propylcarbodiimidlösung zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 20 Minuten ausgeführt. Dann wurden 4 ml physiologische Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Absorption wurde bei 500 nm gemessen. Ein Beispiel einer Standardkurve ist in Fig. 9 gezeigt. Die Konzentration von(^FP im Serum konnte unter Verwendung der Standardkurve bestimmt werden.

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Beispiel 7

(a) Nach dem in Beispiel 1(a) beschriebenen Vorgehen wurde ein Copolymerlatex von hydroxyliertem Styrol-divinylbenzol mit Exj-RSA zur Herstellung von E^-RSA-sensibilisertem Latexreagenz sensibilisiert.

(b) 25 ul des unter (a) hergestellten Εχ,-RSA-sensibilisierten Latexreagenz, 25 ul einer Pufferösung und 25/J1 der

in Beispiel 3(b) hergestellten Standardlösung wurden in ein Reagenzglas gegeben und man setzte 25 »1 des in Beispiel 3(a) hergestellten anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz zu. Im folgenden verfuhr man wie in Beispiel 3 beschrieben. Die so erhaltene Standardkurve ist in Fig. 10 gezeigt.

Beispiel 8

Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Vorgehen wurden 25 pl des anti-östriol-antikörper-sensibilisierten Latexreagenz, 2^> ul der Standardlösung, 25 ^l des Agglutinationsmittels und 1 ml einer Pufferlösung in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur ausgeführt. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer 10 #igen Propylcarbodiimidlösung zugesetzt und die Reaktion wurde weitere 20 Minuten durchgeführt. Die Absorption des Reaktionsgemisches wurde gemessen und man trug eine Standardkurve auf. Das obige Vorgehen wurde in ähnlicher-Weise unter Vorgehen von Urin einer schwangeren Frau anstelle der Standardlösung ausgeführt. Man beobachtete Ergebnisse, die den in Beispiel 3 ähnlich waren.

Beispiel 9

(a) Serratia marcescens wurde in einer Konzentration von 10 Gew.-^ in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung

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(Phopshatpuffer) vom pH 7,2 suspendiert und man setzte der Suspension eine gleiche Menge einer 3 #iren Lösung von Formalin in Ehosphatpuffer zu und rührte das Gemisch 4 Stunden bei 37 C- Die Zellen wurden durch Zentrifugetion gesammelt, mit ausreichend destillierten V/asser gewaschen und in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 5 Gew.-^ suspendiert. Die Suspension wurde 20 Minuten auf 120 G erhitzt und die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt.

(b) Die Konzentration, von WFP im Serum eines Patienten wurde wie in Beispiel 1 bestimmt, wobei man die nach (a) erhaltenen Zellen als Träger verwendete. Die Ergebnisse waren den in Beispiel 1 erhaltenen ähnlich.

Beispiel 10

Dieses Beispiel erläutert einen Bestimmungsreagenziensatz oder -kit für die auf der Agglutinationsreaktion beruhenden Messung.

Es wurde ein HCG-Reagenziensatz hergestellt, welcher die folgenden Reagenzien umfasste:

(a) 5 Ampullen mit einer lyophilisierten Standardprobe von HCG in einer Menge von 4- IU/Ampulle;

(b) eine Flasche mit 1,5 ml eines anti-HCG-antikörpersensibilisierten Latexreagenz;

(c) eine Flasche mit 3 ml einer glycingepufferten Kochsalzlösung (pH 8,2);

(d) 5 Ampullen, die jweils ein lyophilisiertes Produkt enthielten, das man durch Gefriertrocknung von 0,5 ml einer #igen Propylcarbodiimidlösung erhielt.

Die Bestimmung und Verwendung dieses Reagenziensatzes wurde beispielsweise wie im folgenden beschrieben durehge-

0300S1/Ot?3

führt.

Eine Ampulle der Standardprobe von HCG wurde in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und man stellte Standardlösungen in Konzentrationen von 4, 2, 1, 0,5 und ο lU/ml her. 25 ul der Standsrdlösung, 50 ul der glycingepufferten Kochsalzlösung und 25 .ul des anti-HCG-antikörper-sensibilisierten Latex wurden in ein Reagenzglas gegeben und die Reaktion wurde unter mildem Schütteln über 40 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. 1,2 ml physiologische Kochsalzlösung wurden dem Inhalt einer Ampulle mit Propylcarbodiimid zugesetzt und man erhielt eine Lösung der fixierenden Verbindung vor Abschluss der obigen Reaktion. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml der Lösungg der fixierten Verbindung dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die I"ixierungsreaktion wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur ausgeführt. Nach dieser Fixierungsreaktion wurden 4 ml physiologische Kochsalzlösung dem Reaktionsgemisch zugegeben und die Absorption bei 500 nm wurde gemessen und eine Standardkurve aufgetragen. Das obige Vorgehen wurde unter Verwendung von Serum oder Urin eines Patienten anstelle der Standardlösung wiederholt und die Konzentration von HCG im Serum oder Urin wurde bestimmt.

Beispiel 11

Dieses Beispiel erläutert einen Bestimmungsreagenziensatz für die auf der Agglutinationshemmreaktion beruhende Messung.

Ein östriol-Bestimmungssatz wurde hergestellt, der die folgenden Reagenzien enthielt:

(a) Vier Fläschchen mit jeweils 1 ml von Standardlösungen, welche E^ in Konzentrationen von 200, 100, 50 und 25 ng/ml

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in physiologischer Kochsalzlösung enthielten;

(b) ein Fläschchen mit 1,7 ml eines anti-östriol-sntikörpersensibilisierten Latexreagenz;

(c) sechs Ampullen mit jeweils einem lyophilisierten Produkt, das durch Gefriertrocknung von 0,5 ml einer 2^JV $igen LÖaung von Propylcarbodiimid hergestellt war;

(d) ein Fläschchen mit 3,2 ml einer Lösung von E^-BSA

(5 ug/ml) als Agglutinationsmittel in einer Pufferlösung.

(e) Eine graduierte Pipette (1,2 ml);

(f) 30 Tropfpipetten (15 ul/Tropfen).

Die Bestimmung der Verwendung dieses Reagenziensatzes wurde beispielsweise nach dem folgenden Vorgehen durchgefünrt: 25 ul des anti-ösuriol-anti-KÖrper-sensibilisierten Latexreagenz und 50 ul der Lösung von E^-RSA (Agglutinationsmittel) wurden in ein Reagenzglas gegeben und 25 ul der Standardlösung wurden zugesetzt und die Reaktion 4Ό Minuten bei mildem Schütteln bei Raumtemperatur durchgeführt. Arbeitsgänge, wie " Zusatz der Lösung der fixierenden Verbindung wurden-wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt und die östriolkonzentration im Serum oder Urin wurde bestimmt.' Da die graduierte Pipette und die Tropfpipetten dem Reagenziensatz beigelegt waren, konnte die Bestimmung, wenn dieser Reagenziensatz verwendet wurde, leicht auch an einem Ort durchgeführt werden, der mit Laborgeräten oder Ausrüstung nicht ausgestattet ■ war.

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Claims

MÜLLER-HOHE · I)EUFKL · SCHÖN · HEKTEL·

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALT VON 1927 - 1975) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.- CH EM. DR. ALFRED SCHÖN, D1PL.-CHEM. WERNER HERTEL, DIPL.-PHYS.

ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT MANDATAIHCS AGRiES fRtS L¹OFFICE EUHOPEEN DES BREVETS

dt/n - H 3643

- 4, Juni 1380

MOCHIDA SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, Tokio, Japan

Verfahren zur Bestimmung von Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex sowie ein Bestirnmungsreagenziensatz hierfür

PATENTANSPRÜCHE :

1J Verbesserung eines Verfahrens zur Bestimmung von •—/
Antigen, Antikörper oder eines Antigen-Antikörper-^omplexes

oder -konjugates, wobei man (1) eine Antigen-Antikörperreaktion zwischen (a) einem sensibilierten Trägerteilchen, das durch Bindung (I) eines Antigens, Antikörpers und/oder u* Antigen-Antikörperkomplexes und/oder -konjugates an (II) ^ einen Träger gebildet ist, welcher aus unlöslichen, feinver-⁰^ teilten Teilchen besteht, so dass mindestens zwei Einheiten ^ dieses Stoffs an den teilchenförmigen Träger gebunden sind, ^Jf und (b) einem Antigen, Antikörper und/oder Antigen-Anti-Γ? körperkomplex und -konjugat, welches (welcher)bestimmt werden soll(en) und zu einer immunologischen Reaktion mit dem genannten Stoff (i), welcher an das sensibilisierte Trägerteilchen gebunden ist, befähigt ist (sind), bewirkt und

MÜNCHEX 8β · SIEBEIiTSTR. 4 · POSTFACH 800720 · KABEL: MTJEBOPAT · TEL. (OSS) 474005 · TELEX 5-24

ORIGINAL INSPECTED

(2) die Absorption oder 'Trübung des im Schritt (1) gebildeten Reaj'tionsgemisches durch Bestrahlung dieses Gemisches mit Strahlen einer Wellenlänge von etwa 320 bis etwa 2400 nm bestimmt, wobei die Bestimmungsmethode darin besteht, die Menge oder Konzentration des in dieser Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregates zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass man dem im Reaktionssystem des Schrittes (1) gebildeten Reaktions^enisch eine fixierende Verbindung zusetzt.
2. Verbesserung eines Verfahrens zur Bestimmung eines Antigens, Antikörpers oder Antigen-Antikörperkomplexes oder -konjugates, worin man (1) eine Antigen-Antikörperreaktion zwischen (a) einem sensibilisierten Trägerteilchen, welches durch Bindung (I) eines Antigens, Antikörpers und/oder Antigen-Antikörperliomplexes und/oder -konjugates an (II) einem Träger, welcher aus unlöslichen, feinverteilten Teilchen besteht, so dass mindestens zwei Einheiten der genannten Stoffe an den teilchenförmigen Träger gebunden sind, (b) einem Antigen, Antikörper und/oder Antigen-Antikörperkomplexe und/oder -konjugate,. welches (welche) bestimmt werden soll(en) und die Antigen-Antikörperreaktion mit dem genannten Stoff (I), welcher an das sensibilisier-te Trägerteilchen gebunden ist, bewirken kann (können), und (c) einem Agglutxnierungsinittel, welches ein Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex und/oder -konjugat ist und zur immunchemischen Reaktion mit dem genannten sensibilisierten Trägerteilchen (a) befähigt ist, bewirkt und (2) die Absorption oder Trübung des im Schritt (1) gebildeten Reaktionsgemisches durch Bestrahlung dieses Reaktionsgemisches mit Strahlen einer Wellenlänge von etwa 320 bis etwa 2400 nm misst, wobei die Messmethode darin besteht, die Menge oder konzentration des in der genannten Antigen-Antikörperreaktion gebildeten Aggregats zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet,

BAD ORIGfMAL

dans nan dem Reakticnssystem des Schrittes (1) eine fixierende Verbindung zusetzt.
3- Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die fixierende Verbindung dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird, nachdem im Schritt (1) eine Antigen-Antikörperreaktion bewirkt wurde.
4-. Verfahren nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die fixierende Verbindung gleichzeitig mit dem Start der Antigen-Antikörperreaktion im Schritt (1) zugesetzt wird, wodurch die Aggregatbildung durch diese Reaktion und die Fixation dieser Aggregate gleichzeitig bewirkt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als fixierende Verbindung mehrfunktionale Verbindungen und/oder proteindenaturierende Mittel verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5? dadurch gekennzeichnet, dass als polyfunktionale Verbindung Carbodiimid, Dialdehyd, Imidester oder ein Acylierungsmittel verwendet wird.
7- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als polyfunktionale Verbindung 1-Ethyl-3-(3-ä.imethylaminopropyl)carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, N-Ethyl-5-phenylisoxazoniura-3-sulfonat oder Succinylchlorid verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, dass als piOteinaenaturierenaes Mittel Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Thiocyansäure oder Thioglykolsäure verwendet wird.

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>'■·■-
9- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,-dass der Stoff (b) an einen Träger gebunden wird, welcher aus feinverteilten Teilchen besteht.
10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die fixierende Verbindung dein Reaktionsgemisch zugesetzt wird, nachdem im Schritt (1) eine Antigen-Antikörpexreaktion bewirkt wurde.
11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die fixierende Verbindung gleichzeitig mit dem Start der Antigen-Antikörperreaktion im Schritt (1) zugesetzt wird, wodurch die Aggregatbildung durch diese Reaktion und die Fixation dieser Aggregate gleichzeitig bewirkt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als fixierende Verbindung eine polyfunktionelle Verbindung und/oder ein proteindenaturisierendes Mittel verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als polyfunktionelle Verbindung Carbodiimid, Diealdehyd, Imidester oder Acylierungsmittel verwendet werden.
14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, dass als polyfunktionelle Verbindung 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, K-Ethyl-5-phenylisoxazonium-3-sulfonat oder Succinylchlorid verwendet wird.
15· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als proteindenaturierendes Kittel Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Thiocyan-

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säure oder Thioglykolsäure verwendet wird.
16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stoff (b) an einen Träger gebunden wird, welcher aus feinverteilten Teilchen besteht.
17- Bestimmungssatz (Kit) zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 für eine iffimunchemische Agglutinationsreaktion zur Bestimmung der Menge oder Konzentration an Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkoinplex oder -Z-conjUjgat, dadurch gekennzeichnet, dass er als unverzichtbare Bestandteile umfasst:

(a) eine Suspension von sensibilisierten Trägert-eilchen, die durch Bindung von Antigenen, Antikörpern und/oder Antigen-Antikörperkomplexen und-konjugaten an einen aus unlöslichen feinverteilten Teilchen bestehenden Träger gebildet wurden,

(b) eine Pufferlösung und

(c) eine fixierende Verbindung.
18. Bestimmungssatz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2 für die immunchemische Agglutinationshemnmngsreaktion zur Bestimmung der Menge oder Konzentration an Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex oder -konjugat, dadurch gekennzeichnet, dass er als unverzichtbare Bestandteile enthält:

(a) eine Suspension von sensibilisierten Trägerteilchen, die man durch Bindung von Antigenen, Antikörpern und/ oder Antigen-Antikörperkomplexen und -konjugaten an einen aus unlöslichen, feinverteilten Teilchen bestehenden Träger erhält,

(b) eine Pufferlösung,

(c) eine fixierende Verbindung und

(d) ein Agglutinationsmittel.

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19· Bestimmungssatz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die fixierende Verbindung ein polyfunktionelles Reagenz und/oder ein protei-ndenaturierendes Reagenz ist.
20. Bestimmungssatz nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrfunktionelle Verbindung ein Carbodiimid, Dialdehyd, ein Imidester. oder ein Acylierungsmittel ist.
21. Bestimmungssatz nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrfunktionelle Verbindung 1-Ethyl-3-(3-dimethyl-3minopropyl)carbodiimid, 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide Glutaraldehyd, Succinaldehyd, N-Ethyl-5-phenylisoxazonium-3-sulfonat oder Succinylchlorid ist.
22. Bestimmungssatz nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das proteindenaturierende Mittel Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Thiocyansäure oder Thioglykolsäure ist.
23- Bestimmungssatz nach Anspruch I7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Bestandteile gefriergetrocknet ist.
24. Bestimmungssatz nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Agglutinierungsmittel ein Antigen, Antikörper oder Antigen-Antikörperkomplex oder -konjugat ist, welches (welcher) entweder ungebunden oder an einen aus unlöslichen, feinverteilten Teilchen bestehenden Träger gebunden vorliegt.
25. Bestimmungssatz nach Anspruch I7» dadurch gekennzeichnet, dass die fixierende Verbindung ein polyfunktio-

030061/0773 .

nelles Reagenz und/oder ein proteindenaturierendes Reagenz ist.
26. Bestimmungssatz nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrfunktioneHe Verbindung ein Carbodiimid, Dialdehyd, Imidester oder ein Acylierungsmittel ist.
27. Bestimmungssatz. nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die mehrfunktionelle Verbindung 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, 1-Cyelohexyl-3>-(2-n}orpholinoethyl)carbodiimid, Glutaraldehyd, Succinaldehyd, E-Ethyl-5-phenylisoxazoniun-3-sulfonat oder Succinylehlorid ist.
28. Eestiminungssatz nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das proteindenaturierende Kittel Tanninsäure, Formalin, Perchlorsäure,_ TriChloressigsäure, Thiocyansäure "oder Thioglykolsäure ist.

Bestimmungssatz nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der enthaltenen Reagenzien gefriergetrocknet ist.

030.061/0779