DE68908432T2

DE68908432T2 - Schwellwertimmunoassay.

Info

Publication number: DE68908432T2
Application number: DE89100758T
Authority: DE
Inventors: Izak Bahar
Original assignee: Hygeia Sciences Inc
Current assignee: Hygeia Sciences Inc
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1989-01-18
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2009-01-19
Also published as: ES2058344T3; RU2058032C1; DE68908432D1; CA1302876C; JPH01227963A; US4952517A; JP2656970B2; EP0327843A1; EP0327843B1; AU2598388A; AU611971B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Prozeduren zur Bestimmung und/oder zum Nachweis immunologisch reaktiver Analyten, wie etwa Liganden und Ligandenrezeptoren. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Methodik, die sich zur Bestimmung und/oder zum Nachweis des Vorhandenseins von Schwellenwerten von Analyten, wie etwa therapeutischen Arzneimitteln, toxischen Materialien, Mißbrauchdrogen und Hormonen und dgl., die ein Hinweis für einen physiologischen Zustand sind, eignet. In dieser letztgenannten Hinsicht betrifft die Erfindung in einem speziellen Aspekt Prozeduren zum Nachweis des Vorhandenseins von Schwellenwerten von Hormonen, wie etwa Progestin- und Östrogenderivaten und luteinisierendem Hormon (LH) in humanen Urinproben. Die Erfindung betrifft auch Kits von Materialien zur Verwendung bei der Durchführung solcher Testprozeduren.
Seit langem besteht ein Bedürfnis zum Messen von Substanzen mit einem hohen Grad an Sensitivität und Spezifität. Insbesondere in Gebieten wie etwa der klinischen Medizin, der forensischen Wissenschaft, der Untersuchung der umweltqualität, der Nahrungsmittelqualitätkontrolle, dem Drogentest und anderen verwandten Gebieten ist das Vorhandensein und/oder die Menge von Spurensubstanzen in Testproben oft von großer Bedeutung. Auf solchen Gebieten ist oft die Messung von sehr geringen Konzentrationen in der Größenordnung von Teilen pro Million oder weniger notwendig. Weiterhin erfordert ein solcher Test oder eine solche Messung im allgemeinen die Identifizierung von bestimmten Molekülen, während andere Moleküle mit ähnlichen, aber unterschiedlichen Strukturen nicht wahrgenommen werden.
Das Bedürfnis nach sensitiven und spezifischen Tests ist in der Vergangenheit durch die Entwicklung einer Anzahl von Immunoassay-Prozeduren auf Basis der hochspezifischen und sensitiven Wechselwirkung zwischen einem Antigen und einem gegen ein solches Antigen gerichteten Antikörper befriedigt worden. Antigene und Antikörper wurden anfangs als die Mitwirkenden beim Immunprozeß eines Lebewesens erkannt, d.h. wenn ein Lebewesen mit einer fremden Substanz injiziert wird, die ein Antigen ist, reagiert das Lebewesen mit der Zeit durch Produktion von Antikörpern, bei denen es sich um Proteinmoleküle handelt, die das eindringende Antigen erkennen und fest binden, wodurch eine Entfernung oder Zerstörung des letztgenannten erleichtert wird. Der Immunprozeß ist hochspezifisch und die Verwendung von Immunoassay-Prozeduren zur Identifizierung spezifischer Substanzen wurde mit großem Erfolg genutzt. Solche Prozeduren wurden weiterhin durch die wichtige, von Milstein und Köhler in Nature 256: 495-497, 1975 berichtete Entdeckung erleichtert, welche die Herstellung sogenannter monoklonaler Antikörper betrifft. Die Einzelheiten dieser Arbeit sind wohlbekannt und es besteht daher kein Bedürfnis, sie hier zu wiederholen; als Ergebnis der Arbeit von Milstein und Köhler wurde jedoch die Entwicklung hochsensitiver und spezifischer Reagenzien besonders erleichtert.
Bekannte Assayprozeduren umfassen Radioimmunoassay (RIA)-Prozeduren, Enzymimmunoassays (EIA), Enzym-gekoppelte Immmunosorbensassays (ELISA), Fluoreszenzassays, Chemielumineszenzassays und Assays, worin Metallteilchen wie etwa Goldsolteilchen als Marker oder Markierungen verwendet werden. Eine Bezugnahme und Beschreibung dieser bekannten Prozeduren findet sich in einer anhängigen Patentanmeldung des gleichen Anmelders, US-Serien-Nr. 105,285, am 07. Oktober 1987 eingereicht, deren gesamter Inhalt hiermit spezifisch durch Bezugnahme eingeschlossen wird.
Manche der bekannten Assays funktionieren auf der Basis einer kompetitiven Immunreaktion. Bei der Durchführung kompetitiver Immunoassays mischt man im allgemeinen (1) eine erste immunreaktive Substanz (in einer unbekannten Probe enthalten), (2) eine zweite immunreaktive Substanz, die mit der ersten Substanz spezifisch reaktiv ist, und (3) eine Menge einer dritten immunreaktiven Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind. Die dritte Substanz trägt eine nachweisbare Markierung. Während des Ablaufs der Immunreaktion kompetitieren die erste und die dritte Substanz miteinander um Bindungsstellen auf der zweiten Substanz. Nach einer vorbestimmten Zeit der Immunreaktion wird die zweite Substanz abgetrennt und die Menge an daran gebundener dritter Substanz wird bestimmt. Wenn die erste Substanz anfänglich in geringen Konzentrationen vorhanden ist, dann ist die Menge an dritter Substanz und daher die Menge an nachweisbarer Markierung, die an die zweite Substanz gebunden ist, erhöht. Wenn andererseits die Menge der ersten Substanz erhöht ist, dann ist die Menge an nachweisbarer Markierung, die über die dritte Substanz an die zweite Substanz gebunden ist, gering. Daher ist die Menge an nachweisbarer Markierung, die an die zweite Substanz gebunden wird, bei allen Konzentrationen umgekehrt proportional zur Menge an erster immunreaktiver Substanz in der Probe. Bei mittleren Konzentrationen ist die Menge an nachweisbarer Markierung, die an die zweite Substanz gebunden ist, monoton und umgekehrt proportional zur Konzentration der ersten immunreaktiven Substanz in der Probe.
Kompetitive Immunoassays haben weitverbreitete Anwendung in klinischen Labors gefunden, was zu genauen Messungen einer großen Anzahl klinisch relevanter Analyten führte. Es gibt jedoch zwei Eigenschaften der kompetitiven Assayform, die ohne eine komplizierte klinische Laboreinrichtung weniger wünschenswert sind. Erstens ist, wie oben diskutiert, das resultierende Signal umgekehrt proportional zu der Menge der nachzuweisenden Substanz. Im Idealfall würde man jedoch bevorzugen, daß erhöhte Konzentrationen des Analyten erhöhte Konzentrationen an Signal erzeugen sollen. Demnach wäre bei einer Untersuchung ohne Instrumente, z.B. visuell, die erzeugte Signalmenge direkt proportional zur Menge des nachgewiesenen Analyten. Zweitens ändert sich bei der oben beschriebenen kompetitiven Immunoassayform die Menge an nachweisbarem Signal als monoton abnehmende Funktion der Analytenmenge in der Probe. Für sehr dicht nebeneinander liegende Analytenkonzentrationen werden daher nur geringe Änderungen in der Signalintensität erzeugt. Eine solche geringe Änderung kann, obwohl sie mit modernen Instrumenten einfach nachweisbar ist, oft zu klein für einen verläßlichen Nachweis durch das menschliche Auge zu Zwecken der direkten visuellen Untersuchung sein.
Wenn toxische und/oder für die Umwelt schädliche Substanzen betroffen sind, ist es nach Wahl einer ungefährlichen Schwellenkonzentration als Kriterium günstig, Tests zu verwenden, die ein vollständig negatives Ergebnis bei Konzentrationen ergeben, die nur gering unterhalb der Schwellenkonzentration liegen, und die dennoch eine klar positive Anzeige ergeben, wenn die Konzentration den ausgewählten Schwellenwert übersteigt.
In einem spezifischeren Sinne hat seit langem ein Bedürfnis für eine einfache, aber dennoch verläßliche Methodik zum Nachweis der menschlichen Fruchtbarkeitsperiode während des Menstruationszyklus bestanden, d.h. die Periode, in der lebensfähiges Sperma und ein lebensfähiges Ei im Fortpflanzungstrakt der Frau vorhanden sind. Aus unterschiedlichen Gründen können kontrazeptive Vorrichtungen und Materialien nicht zur Verwendung verfügbar sein und demnach sind Techniken zur Ermittlung der Fruchtbarkeitsperiode des Menstruationszyklus wünschenswert geworden. Es ist offensichtlich, daß Techniken zur Ermittlung der Fruchtbarkeitsperiode des Menstruationszyklus sowohl für die gewollte Vermeidung einer Schwangerschaft als auch für die Erleichterung der Empfängnis, wenn Schwangerschaft gewünscht wird, von Nutzen sind.
Der Menstruationszyklus wird durch die Freisetzung von Hormonen aus den weiblichen Drüsen und Organen gesteuert. Eine solche Freisetzung ist vorhersehbar und steht in spezifischem Zusammenhang mit der Ovulation, durch die Eier aus den Ovarien freigesetzt werden und die Haut des Uterus zur Schwangerschaft bereitgemacht wird und die Hormone und/oder Metaboliten daraus ihren Weg in den Urin finden. Die spezifischen biologischen Phänomene sind detailliert und klar in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 086 095 beschrieben, die am 17. August 1983 im Amtsblatt 83/33 des Europäischen Patentamts veröffentlicht wurde. Es ist daher die Feststellung ausreichend, daß während eines normalen Menstruationszyklus die Konzentration von Östron-3-glucuronid (E&sub1;3G) in weiblichem Urin etwa 6 Tage vor der Ovulation anzusteigen beginnt und ihren Höhepunkt etwa einen Tag vor der Ovulation erreicht und während und nach der Ovulation rasch abfällt. Die Konzentration an Pregnandiol-3-glucuronid (P&sub3;G) in weiblichem Urin beginnt am Tag der Ovulation zu steigen und erreicht zwei bis drei Tage nach der Ovulation einen Spitzenwert und bleibt für die Dauer der lutealen Phase erhöht. Gleichermaßen ist die Beziehung zwischen den Konzentrationen von P&sub3;G und E&sub1;3G wohlbekannt und in der oben genannten europäischen Patentanmeldung '095 wurde festgestellt, daß das Verhältnis von Östrogen- zu Progestinmetaboliten im Urin sich für die Überwachung des Verlaufs des Menstruationszyklus eignet.
Von besonderer Bedeutung bei der Verfolgung des Menstruationszyklus durch Bestimmung der hormonellen Aktivität ist die Tatsache, daß etwa während der Ovulation die Konzentration von P&sub3;G im Urin auf Konzentrationen über 4 ug/ml steigt. Daher wäre ein einfacher und verläßlicher Test, der zur Bestimmung und/oder zum Nachweis des Vorhandenseins von mindestens eines solchen Schwellenwerts an P&sub3;G im Urin fähig ist, bei der Bestimmung, ob eine Ovulation eingetreten ist, extrem wertvoll.
Die Positivschritt-Immunoassayprozedur gemäß vorliegender Erfindung vermeidet alle Nachteile, die den kompetitiven Immunoassays des Standes der Technik innewohnen. Erstens treten, da die Reaktion positiv ist, erhöhte Signale in Gegenwart erhöhter Analytkonzentrationen auf. Weiterhin findet man entsprechend der Positivschritt-Funktion der Immunoassays gemäß vorliegender Erfindung keine monotone Abnahme (oder Zunahme) des Signals als Funktion der Analytkonzentration, sondern die Signalstärke steigt unerwarteterweise sehr scharf bei einer zuvor gewählten Schwelle an. Dies bedeutet, daß Analytkonzentrationen knapp unterhalb der ausgewählten Schwelle zu geringen oder kaum nachweisbaren Signalstärken führen, während Analytkonzentrationen knapp oberhalb der Schwelle die volle Signalstärke erzeugen, die mit der jeweils verwendeten Markierung erreichbar ist.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Methodik und Kits von Materialien, die im Zusammenhang mit Immunoassays allgemein nützlich sind. Insbesondere liefert die Erfindung einen Positivschritt-Assay, bei dem ein Signal in Gegenwart von Schwellenwerten einer immunreaktiven Substanz erzeugt wird. Gebräuchliche Tests beruhen, abhängig von der Form, auf einer Kompetition zwischen markierten und nicht markierten immunreaktiven Substanzen und der Positivschritt-Assay gemäß vorliegender Erfindung kehrt das Signal um, so daß der Anwender in der Lage ist, auf einfache Weise das Vorhandensein der immunreaktiven Substanz in der Probe zu ermitteln. Durch Anwendung der vorliegenden Erfindung wird daher der Nachweis plötzlicher Anstiege in den Konzentrationen von Hormonen wie etwa P&sub3;G, E&sub1;3G und LH im Urin erleichtert.
Die Positivschritt-Immunoassayform gemäß vorliegender Erfindung findet eine bedeutende Anwendung in Bereichen, die von Fertilitätstests verschieden sind. In dieser Hinsicht gibt es eine Reihe von Situationen, in denen die Bestimmung der tatsächlichen Menge einer in einer Probe vorhandenen Substanz weniger bedeutsam ist, als ob die Substanz in einer Menge vorhanden ist, die über oder unter einem bestimmten Schwellenwert liegt. Ein sofort ins Auge fallendes Beispiel ist im Bereich von forensischen Tests auf kontrollierte oder mißbrauchte Drogen. Z.B. ist ein Schwellenwert von 0,1 % beim Test auf Alkoholkonzentrationen im Blut bedeutsam, da Werte von größer als 0,1 % als Nachweis einer Vergiftung erachtet werden. Gleichermaßen werden für Marijuana oder THC Urinkonzentrationen von 10 oder in anderen Fällen 100 ng/ml als Beweis des Mißbrauchs der Substanz angesehen. Es ist offensichtlich, daß die Positivschritt-Immunoassayformen gemäß vorliegender Erfindung, die keine Farbe bei Analytkonzentrationen unterhalb eines Schwellenwerts erzeugen und bei denen eine Verfärbung bei Analytkonzentrationen über dem Schwellwert erzielt wird, in einem solchen Zusammenhang anwendbar sind.
Der Positivschritt-Immunoassay gemäß vorliegender Erfindung ist auch auf dem Gebiet der Überwachung therapeutischer Arzneimittel anwendbar. Es gibt eine Anzahl äußerst nützlicher therapeutischer Arzneimittel, wie etwa Theophyllin (ein Antiasthmatikum), Digoxin (ein Herzregulator) und Aminoglycosidantibiotika, um einige zu nennen, die durch ein therapeutisches Fenster gekennzeichnet sind. Das therapeutische Fenster ist der Bereich von Konzentrationen des jeweiligen Arzneimittels von der minimalen Konzentration für therapeutische Wirksamkeit bis zur Konzentration, worin unerwünschte oder toxische Reaktionen auftreten können. Es ist klar, daß ein dualer Positivschritt-Immunoassay extrem wertvoll wäre, wobei ein Assay zum Nachweis der minimalen therapeutischen Schwelle kalibriert ist und der andere zum Nachweis der toxischen Schwelle kalibriert ist.
Erfindungsgemäß wird eine Immunoassayprozedur bereitgestellt, um das anfängliche Vorhandensein von mindestens einer zuvor spezifizierten (Schwellen-) Menge einer ersten immunreaktiven Substanz in einer flüssigen Probe zu bestimmen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß zuerst eine immunchemische Reaktionsphase bereitgestellt wird, indem eine flüssige Probe, die eine anfangs unbekannte Menge der ersten immunreaktiven Substanz enthält, mit (1) einer bekannten Menge einer zweiten immunreaktiven Substanz, die mit der ersten Substanz spezifisch immunreaktiv ist, und (2) einer Menge einer dritten immunreaktiven Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika besitzt, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind, vermischt wird,
wobei die bekannte Menge der zweiten Substanz immunchemisch äquivalent (gerade zur immunspezifischen Bindung ausreichend) bezüglich der Gesamtheit der zuvor spezifizierten Schwellenmenge der ersten Substanz und der Menge der dritten immunreaktiven Substanz ist, wodurch wenn die Menge der ersten immunreaktiven Substanz in der flüssigen Probelösung ihre zuvor spezifizierte Schwellenmenge übersteigt, nicht-reagierte dritte Substanz für eine weitere immunspezifische Reaktion in der Reaktionsphase verfügbar ist,
Kontaktieren der so bereitgestellten Reaktionsphase mit einer Menge einer vierten immunreaktiven Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der zweiten Substanz sind, wobei die vierte Substanz eine nachweisbare Markierung trägt. Daher kann das anfängliche Vorhandensein von mehr als der zuvor spezifizierten Schwellenmenge der ersten Substanz in der Probe durch Nachweis des Vorhandenseins eines spezifischen Immunreaktionsprodukts, welches die nachweisbare Markierung enthält, bestimmt werden.
Vorzugsweise wird die dritte immunreaktive Substanz an einen festen Träger gebunden, wodurch die dritte immunreaktive Substanz immobilisiert wird (wie etwa, wenn der feste Träger eine permeable Membran umfaßt) oder gesammelt werden kann (wie etwa, wenn der feste Träger ein dispergierbares, teilchenförmiges, sainmelbares festes Material umfaßt).
In einer bevorzugten Form der Erfindung wird die flüssige Probe, die die erste immunreaktive Substanz enthält, mit einer bekannten Menge einer zweiten immunreaktiven Substanz, die mit der ersten immunreaktiven Substanz immunspezifisch reaktiv ist, vorgemischt, um dadurch eine erste Reaktionsphase zu erzeugen. Die erste Reaktionsphase wird dann mit einer Menge der dritten immunreaktiven Substanz in Kontakt gebracht, um eine zweite Reaktionsphase zu erzeugen. In dieser Form eignet sich die Erfindung insbesondere zur Durchführung eines Tests auf kleine Moleküle einschließlich Arzneimittel und Haptenen, wie etwa P&sub3;G und E&sub1;3G.
In einer bevorzugten praktischen Form der Erfindung zur Bestimmung der Menge einer ersten immunreaktiven Substanz in einer flüssigen Probe umfaßt die erfindungsgemäße Immunoassayprozedur die Schritte der Bereitstellung einer flüssigen Probe, die eine anfänglich unbekannte Menge der ersten immunreaktiven Substanz enthält, und das Teilen der Probe in eine Vielzahl von Aliquotportionen. Jeweils unterschiedliche Mengen einer zweiten immunreaktiven Substanz, die mit der ersten immunreaktiven Substanz spezifisch immunreaktiv ist, werden zu den Aliquotportionen gegeben, um eine Vielzahl von ersten Reaktionsphasen zu erzeugen, von denen jede eine jeweils unterschiedliche bekannte Menge der zweiten Substanz enthält. Die ersten Reaktionsphasen werden dann mit einer Menge einer dritten immunreaktiven Substanz kontaktiert, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die Immunreaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind. Somit wird eine Vielzahl von zweiten Reaktionsphasen erzeugt, von denen jede die gleiche Menge der dritten Substanz und jeweils unterschiedliche Mengen der zweiten Substanz enthält. Erfindungsgemäß werden die jeweils bekannten Mengen der zweiten Substanz in den zweiten Reaktionsphasen so vorbestimmt, daß sie immunspezifisch äquivalent (gerade genug zur immunspezifischen Reaktion und Blockierung) der gesamten Menge der dritten Substanz plus einer jeweils entsprechenden vorbestimmten Menge der ersten Substanz sind, wodurch, wenn die unbekannte Menge der ersten Substanz in der Probe weniger oder gleich ihrer jeweils entsprechenden vorbestimmten Menge ist, keine nicht-reagierte dritte Substanz für eine weitere immunspezifische Reaktion in der zweiten Reaktionsphase verfügbar ist. Wenn die unbekannte Menge der ersten Substanz in der Probe größer als ihre jeweils entsprechende vorbestimmte Menge ist, wird nicht-reagierte dritte Substanz für eine weitere immunspezifische Reaktion in der entsprechenden zweiten Reaktionsphase verfügbar sein. Die zweiten Reaktionsphasen werden dann mit einer Menge einer markierten vierten immunreaktiven Substanz in Kontakt gebracht, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der zweiten Substanz sind. Somit wird eine Vielzahl von jeweiligen Nachweisphasen erzeugt, die jeweils den zweiten Reaktionsphasen entsprechen, wodurch ein markierters Immunreaktionsprodukt durch spezifische Immunreaktion zwischen nicht-reagierter dritter Substanz und markierter vierter Substanz in jeder Reaktionsphase gebildet wird, die einer zweiten Phase entspricht, wo die Menge von erster Substanz in der Probe ihre jeweils entsprechend vorbestimmte (Schwellen-) Menge übersteigt. Das Vorhandensein oder Fehlen eines markierten Immunreaktionsprodukts kann dann in jeder Nachweisphase als Anzeige des anfänglichen Vorhandenseins von mindestens der jeweils entsprechend vorbestimmten Menge der ersten Substanz in der Probe nachgewiesen werden.
Durch die Verwendung der gerade beschriebenen Prozedur kann die Menge der ersten immunreaktiven Substanz in der flüssigen Probe innerhalb eines spezifischen engen Bereichs abhängig von der jeweils kalibrierten Menge der zweiten immunreaktiven Substanz, die in die verschiedenen Reaktionsphasen eingebracht wird, bestimmt werden. Dies bedeutet, daß ein erstes Reaktionssystem so kalibriert werden kann, daß die entsprechende Reaktionsphase markiertes Immunreaktionsprodukt enthält, wenn die Menge an erster immunreaktiver Substanz in der Probe größer als 1 ug/ml ist, ein zweites Reaktionssystem kann so kalibriert werden, daß die entsprechende Reaktionsphase markiertes Immunreaktionsprodukt enthält, wenn die Konzentration an erster mmunreaktiver Substanz in der Probe größer als 2 ug/ml ist, ein drittes Reaktionssystem kann so kalibriert werden, daß die entsprechende Reaktionsphase markiertes Immunreaktionsprodukt enthält, wenn die Menge an erster immunreaktiver Substanz in der flüssigen Probe 3 ug/ml übersteigt usw.. Wenn daher die Prozedur so aufgebaut ist, daß das Vorhandensein eines markierten Immunreaktionsprodukts in der Nachweisphase eine Verfärbung erzeugt, sind die Nachweisphasen von Systemen gefärbt, die zum Nachweis von geringeren Konzentrationen als der bestimmten Menge an erster immunreaktiver Substanz vorkalibriert sind, während die Nachweisphasen der Systeme farblos sind, die zum Nachweis von größeren Konzentrationen als der bestimmten Menge an erster immunreaktiver Substanz vorkalibriert sind.
In einem weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung wird ein Kit von Materialien zur Durchführung einer Immunoassayprozedur bereitgestellt, um das Vorhandensein von mindestens einer vorbestimmten Menge einer ersten immunreaktiven Substanz in einer flüssigen Probe nachzuweisen. Der Kit umfaßt eine bekannte Menge an zweiter immunreaktiver Substanz, die spezifisch mit der ersten Substanz immunreaktiv ist, eine bekannte Menge einer dritten immunreaktiven Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind, und eine Menge an markierter vierter immunreaktiver Substanz mit immunologischen Reaktionscharakteristika, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der zweiten Substanz sind. Die dritte immunreaktive Substanz kann vorzugsweise an einen festen Träger gebunden sein und in einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung kann der feste Träger ein dispergierbares, teilchenförmiges, sammelbares festes Material umfassen. In einem sogar noch mehr bevorzugten Aspekt der Erfindung kann die vierte immunreaktive Substanz unter Verwendung einer Goldsolteilchenmarkierung markiert sein, die eine rote Verfärbung auf einem Filterelement erzeugen kann, wenn Materialien, welche die Markierung enthalten, darauf gesammelt werden.
Obwohl sich die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit allen immunreaktiven Substanzen, d.h. spezifischen Bindeproteinen und entsprechenden bindefähigen Substanzen, eignet, ist die Erfindung besonders im Zusammenhang mit kleinen monoepitopischen Molekülen wie etwa Drogen und Haptenen geeignet, die Hormone und hormonellen Metaboliten einschließlich P&sub3;G und E&sub1;3G und verwandte, von menschlichen Frauen während des Menstruationszyklus erzeugte Materialien sind.
In allen oben genannten Aspekten der Erfindung ist die dritte immunreaktive Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika hat, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind, im allgemeinen grundsätzlich die gleiche Substanz wie die erste immunreaktive Substanz. Dies bedeutet, wenn die Prozedur und/oder der Kit zum Zwecke der Bestimmung des anfänglichen Vorhandenseins von P&sub3;G in einer flüssigen Probe ist, daß die dritte immunreaktive Substanz in den allermeisten Fällen ebenfalls P&sub3;G umfaßt. Entsprechend ist die vierte immunreaktive Substanz in den allermeisten Fällen gleich wie die zweite immunreaktive Substanz, wobei jede der gleiche Antikörper gegen das Hormon ist. Wenn in dieser Hinsicht die erste immunreaktive Substanz derart ist, daß sie mehrere für die Immunreaktion verfügbare immunreaktive Stellen besitzt, sollten die zweite und vierte immunreaktive Substanz spezifisch immunreaktiv gegen die gleiche Stelle oder die gleichen Stellen sein.
Gemäß vorliegender Erfindung verändert die Positivschritt- Assayform ein umgekehrt kompetitives Signal in einen positiven Schritt in Gegenwart steigender Konzentrationen von Hapten oder einer anderen immunreaktiven Substanz in der flüssigen Probe. Weiterhin kann die Testform so vorgesehen sein, daß ein positives Signal bei einer vorbestimmten Konzentration an immunreaktiver Substanz in der flüssigen Probe (z.B. dem Schwellenwert von P&sub3;G, der das Auftreten einer Ovulation anzeigt) und kein Signal bei einer geringeren Konzentration erzeugt wird. Da die physiologische Bestimmung von P&sub3;G wichtig zwischen 2,5 und 5 ug/ml in Urinproben ist, kann der Test beispielsweise eingerichtet werden, daß er kein Signal bei 2,5 ug/ml, aber ein maximales Signal bei 5 ug/ml P&sub3;G ergibt.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Assayprozedur und einen Kit von Materialien zur Bestimmung und/oder zum Nachweis einer Reihe immunologisch reaktiver Analyten, wie etwa Liganden und Ligandenrezeptoren in wäßrigen Proben. Die Analyten sind immunreaktive Substanzen, wie etwa mono- oder polyepitopische Liganden, einschließliche Antigene und Haptene; die Erfindung eignet sich insbesondere im Zusammenhang mit monoepitopischen Haptenen, wie etwa Hormonen und insbesondere den Metaboliten von Östrogen- und Progestinverbindungen, wie etwa E&sub1;3G und P&sub3;G. Ein Charakteristikum der immunreaktiven Substanzen, mit denen die vorliegende Erfindung befaßt ist, besteht darin, daß diese zur immunspezifischen Bindung an eine andere immunreaktive Substanz in der Lage sind. Wenn eine immunreaktive Substanz mit einer anderen immunreaktiven Substanz spezifisch immunreaktiv ist, wird eine der Substanzen oder Moleküle als Ligand und die andere als der Rezeptor oder Antiligand bezeichnet. Die Moleküle sind unterschiedlich und eines hat einen Bereich an der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der spezifisch an eine bestimmte räumliche und/oder polare Struktur auf dem anderen bindet.
Wenn man eine immunreaktive Substanz mit einer immunreaktiven Substanz vermischt, die damit spezifisch immunreaktiv ist, stellen die beiden eine immunchemische Reaktionsphase dar, die, sofern ausreichende Zeit zur Inkubation verfügbar ist, zum Auftreten einer spezifischen Immunreaktion zwischen den beiden Substanzen führt, um ein Immunreaktionsprodukt zu erzeugen.
Antigene immunreaktive Substanzen können ein oder mehrere Epitope besitzen, die zum Eingehen einer immunspezifischen Reaktion in der Lage sind. Diese Epitope können gleich oder verschieden sein. Jedoch nur diejenigen Epitope, die gleich sind, können eine spezifische Immunreaktion mit einem gegebenen Bindepartner eingehen. Wenn man eine immunchemische Reaktionsphase für eine ausreichende Zeitdauer inkubieren läßt, geht die Reaktion bis zum Gleichgewicht derart, daß wenn die Mengen an immunspezifisch reaktiven Substanzen immunchemisch äquivalent sind, keine weiteren Stellen für eine immunspezifische Reaktion verfügbar sind. Wenn dieser Zustand erreicht ist, kann man sagen, daß keine nicht-reagierte immunreaktive Substanz für eine immunspezifische Reaktion in der Reaktionsphase verfügbar ist. Und wenn ein oder das andere der spezifisch immunreaktiven Materialien in einer Menge vorhanden ist, die größer als die immunchemische äquivalente Menge ist, wird nichts von der anderen immunreaktiven Substanz in der Reaktionsphase für eine weitere immunspezifische Reaktion verfügbar sein. Daher sagt man, daß eine solche andere immunreaktive Substanz blockiert ist.
Es ist klar, daß die spezifische immunchemische Äquivalenz einer gegebenen immunreaktiven Substanz keine präzise, mathematisch berechenbare Größe ist. Stattdessen wird die spezifische immunchemische Äquivalenz einer gegebenen immunreaktiven Substanz bezüglich einer anderen immunreaktiven Substanz, die damit spezifisch immunreaktiv ist, im allgemeinen empirisch bestimmt. Dies kann im vorliegenden Falle einfach durch Bereitstellen einer Anzahl von Standards, die unterschiedliche Mengen des unbekannten Materials enthalten, und experimentelles Bestimmen der Menge der anderen Substanz, die zum Blockieren der ersten Substanz erforderlich ist, erfolgen. Eine solche Bestimmung kann beispielsweise durch Titration gemäß wohlbekannen Prozeduren durchgeführt werden.
Gemäß vorliegender Erfindung wird gesagt, daß eine immunreaktive Substanz immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika einer anderen Substanz sind, wenn diese beiden Substanzen in der Lage sind, die identische spezifische immunchemische Reaktion einzugehen. Dies bedeutet, daß die Substanzen eine immunspezifische Reaktion auf analoge Weise eingehen können. Dieses Phänomen kann beispielsweise auftreten, wenn eine der Substanzen ein Teil der anderen Substanz ist und das gleiche spezifische Epitop enthält. Das Phänomen kann ebenfalls auftreten, wenn die Substanzen im Grunde gleich sind, aber eine in der Reaktionsphase frei beweglich ist und die andere immobilisiert und/oder konjugiert an eine feste Phase ist, welche das Einsammeln erleichtert. Das Phänomen kann auch vorliegen, wenn eine der Substanzen in ihrer natürlichen und nicht-reagierten Form vorhanden ist und die andere mit einer nachweisbaren Markierung markiert oder versehen ist, wodurch die Identifizierung und/oder Quantifizierung als Teil der Assayprozedur erleichtert wird. Im allgemeinen ist festzustellen, daß im Falle der vorliegenden Erfindung ein Hapten, das in der Reaktionsphase frei ist, und das gleiche Hapten, das an einen festen Träger konjugiert ist, immunologische Reaktionscharakteristika aufweisen, die immunspezifisch gleich sind. Auch ein Antihapten-Antikörper, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, besitzt immunologische Reaktionscharakteristika, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika des gleichen Antihapten-Antikörpers sind, der nicht markiert ist. Von solchen Substanzen kann man sagen, daß sie analoge immunologische Reaktionscharakteristika besitzen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist das Ergebnis, wenn die unbekannte Menge an immunreaktiver Substanz in der flüssigen Probe die zuvor spezifizierte oder Schwellenmenge übersteigt, die Erzeugung eines markierten Immunreaktionsprodukts. Das markierte Immunreaktionsprodukt kann in Form eines Immunreaktionsprodukts (oder Komplexes) sein, das entweder durch Bindung an einen festen Träger, wie etwa eine Membran, immobilisiert wird oder an ein anfänglich dispergiertes, dispergierbares, teilchenförmiges, sammelbares festes Material gebunden wird, das z.B. auf einem Filterelement gesammelt worden ist. In beiden Fällen enthält das Immunreaktionsprodukt eine Markierung, die von sich aus gefärbt ist, wie etwa ein Goldsolteilchen, oder die eine Farbbildungsreaktion erleichtert, wie etwa im Falle einer enzymatischen Farbbildung. Bei enzymatischen Farbbildungssystemen werden die farbbildenden Materialien in einem farbbildenden Zustand durch Bildung des Immunreaktionsprodukts zusammengebracht. Solche Prozeduren und Materialien sind wohlbekannt und brauchen hier nicht detailliert diskutiert werden. Die Bildung einer nachweisbaren Farbe als Ergebnis einer Goldsolteilchen- Markierung ist Teil der in der anhängigen Anmeldung Serien Nr. 105 285 offenbarten und beanspruchten Erfindung, auf die oben Bezug genommen wurde. Es reicht aus zu sagen, daß die Goldsolteilchen durch Bildung des Immunreaktionsprodukts gesammelt und konzentriert werden und daß ihr Sammeln derart ist, daß eine visuell beobachtbare Verfärbung entsteht.
Die Erfindung ist ausführlicher mit Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 - Platten-ELISA-Assay unter Verwendung einer Positivschritt-Prozedur

Herstellung von Gelatine-P&sub3;G

Pregnandiol-3-glucuronid (P&sub3;G) (Sigma) in der freien Säureform wurde durch die gemischte Säureanhydridmethode an Gelatine (Sigma) gekoppelt, genau wie von Erlanger et al., J.Biol.Chem. 228, 713-727 (1957) beschrieben ist. Durch diese Prozedur wird das Steroid als Peptidbindung über die Glucuronidcarbonsäure an E-Aminogruppen von Lysinresten in der Polypeptidkette des Proteins gebunden.

Anheftung von Gelatine-P&sub3;G an einen festen Träger

Wie oben angegeben hergestellte Gelatine-P&sub3;G wurde auf den Platten einer PVC-96 Loch-Mikrotiterplatte passiv adsorbiert. 50 ul einer Gelatine-P&sub3;G-Lösung, die 0,250 ug/ml des Steroids in einer Lösung mit 10 mM KPO&sub4; und 0,145 M NaCl (pH 7,4) (PBS) enthielten, wurden in jedes der Löcher gegeben und die Lösung wurde auf den Platten in den Löchern für 1 Stunde bei Raumtemperatur (22ºC) stehengelassen. Dann wurde die Lösung von den Löchern abdekantiert und die Platten wurden zur Vermeidung unspezifischer Bindung blockiert, indem sie mit einer PBS/0,02 % NaAzid-Lösung (pH 7,2) mit 1 % Gelatine für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur kontaktiert wurden. Die behandelten Löcher wurden erneut dekantiert und zwei Mal mit einer PBS-Lösung gewaschen, die 0,1 % Tween (eingetragenes Warenzeichen) 20 (v/v) (pH 7,4) enthielt.

Platten-ELISA-Assay

Es wurden Standardlösungen, die Anti-P&sub3;G-Antikörper in PBS enthielten, in acht unterschiedlichen Konzentrationen bereitgestellt, d.h. 1,0, 2,0, 4,0, 8,0, 16,0, 32,0, 64,0 und 128,0 ug/ml, und Probelösungen, die P&sub3;G in PBS enthielten, wurden in sechs verschiedenen Konzentrationen bereitgestellt, d.h. 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,156 und 0 ug/ml. 150 ul jeder Anti-P&sub3;G-Antikörper-Standardlösung wurden mit 30 ul jeder P&sub3;G-Probelösung vermischt, um 48 separate Reaktionsphasen zu ergeben. Zwei separate 60 ul Portionen jeder Reaktionsphase wurden in die Löcher gegeben.
Die Lösungen wurden in den Löchern für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Lösungen aus den Löchern dekantiert und die Platten wurden zwei Mal mit einer Waschlösung gewaschen, die 0,1 % Tween 20 in PBS enthielt. 50 ul einer Lösung, die 62,5 ng/ml eines Anti-P&sub3;G-Antikörper/Meerrettich-Peroxidase (HRP) Konjugats (hergestellt durch die wohlbekannte Methode von Nakane et al.) in 0,1 M Tris- Acetat (pH 7,0) enthielt, wurden auf jede Platte gegeben und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Löcher fünf Mal mit der PBS/Tween -Waschlösung gewaschen, um sicherzustellen, daß alle unspezifisch gebundene HRP entfernt wird. 50 ul einer Farbentwickler-Substratlösung, die ein frisches Gemisch von 3 ml 0,125 % Tetramethylbenzidin in Methanol und 7 ml 0,03 % Wasserstoffperoxid in einer wäßrigen 0,1 M Phosphat und 50 mM Zitronensäurelösung (pH 5,0) enthielt, wurden auf jede Platte gegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Intensität der Farbbildung wurde auf einem Dynatech-Plattenablesegerät (Dynatech, Virginia) bei 630 mn mit einer Referenzwellenlänge von 490 nm abgelesen.
Die Ergebnisse sind im folgenden in Tabelle I dargestellt. TABELLE I Konzentration von P&sub3;G. ug/ml Konzentration von Anti-P&sub3;G-Antikörper, ug/ml
Dieser Test von Beispiel 1 wurde zur Veranschaulichung des Nachweises und der Bestimmung von P&sub3;G in den Probelösungen und des Nachweises und der Bestimmung, ob die Menge an P&sub3;G in einer gegebenen Probelösung einen jeweiligen bekannten vorherbestimmten Wert übersteigt, durchgeführt. Das P&sub3;G in der Probelösung kann als erste immunreaktive Substanz bezeichnet werden, der Anti-P&sub3;G-Antikörper in den Standardlösungen kann als zweite immunreaktive Substanz bezeichnet werden. Die erste und zweite immunreaktive Substanz sind miteinander spezifisch immunreaktiv. Das an die Platte (einen festen Träger) durch Gelatineverknüpfung gebundene P&sub3;G ist eine dritte immunreaktive Substanz, die analog zur ersten immunreaktiven Substanz ist und daher immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch die gleichen wie die immunologischen Reaktionscharakteristika von P&sub3;G, der ersten immunreaktiven Substanz, sind. Der Anti-P&sub3;G-Antikörper, der an HRP konjugiert ist, ist eine vierte immunreaktive Substanz, die mit der zweiten immunreaktiven Substanz analog ist und daher immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch die gleichen wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der zweiten Substanz sind. Die an den Anti-P&sub3;G-Antikörper konjugierte HRP ist ein enzymatischer Marker oder eine enzymatische Markierung, die durch bekannte Methoden und Prozeduren nachgewiesen werden kann. Daher ist das Anti-P&sub3;G-Antikörper/HRP-Konjugat eine markierte vierte immunreaktive Substanz.
Beim Versuch von Beispiel 1 wird eine bekannte Menge an Anti- P&sub3;G-Antikörper (zweite immunreaktive Substanz) mit vorbestimmten Mengen an P&sub3;G (erste immunreaktive Substanz) kontaktiert. P&sub3;G ist normalerweise ein nachzuweisender oder zu bestimmender Analyt, aber für den Zweck des vorliegenden anschaulichen Beispiels ist das P&sub3;G in bekannten Mengen vorhanden. Somit wird eine Serie von ersten Reaktionsphasen bereitgestellt, von denen jede jeweils unterschiedliche bekannte Mengen an Anti-P&sub3;G-Antikörper enthält. Die ersten Reaktionsphasen werden dann jeweils in Kontakt mit dem P&sub3;G (dritte immunreaktive Substanz) gebracht, das an die jeweiligen Platten auf der Mikrotiterplatte gebunden ist, um eine zweite Reaktionsphase in jedem Loch der Mikrotiterplatte zu erzeugen. Die Platten der Löcher wurden alle mit der gleichen P&sub3;G-Gelatine-Lösung unter identischen Bedingungen kontaktiert und daher enthalten die zweiten Reaktionsphasen die gleiche Menge an P&sub3;G, das an die Platte gebunden ist, und jeweils unterschiedliche bekannte Mengen an Anti-P&sub3;G-Antikörper.
Es ist festzustellen, daß in jeder zweiten Reaktionsphase, wenn die gesamte bekannte Menge an Anti-P&sub3;G-Antikörper zur immunspezifischen Reaktion mit dem gesamten P&sub3;G in der Probe und dem gesamten gebundenen P&sub3;G ausreicht, das gebundene P&sub3;G durch den Antikörper blockiert ist und eine weitere Immunreaktion verhindert wird. Wenn jedoch die gesamte Menge an Anti-P&sub3;G-Antikörper zur Reaktion mit dem gesamten P&sub3;G in der zweiten Reaktionsphase nicht ausreicht, bleibt gebundenes P&sub3;G unblockiert und zur weiteren immunspezifischen Reaktion verfügbar. Wenn daher die zweiten Reaktionsphasen gewaschen und mit der Anti-P&sub3;G-Antikörper/HRP-Konjugatlösung kontaktiert werden, tritt eine immunspezifische Reaktion in denjenigen Löchern auf, wo unblockiertes gebundenes P&sub3;G vorhanden war (wo das P&sub3;G in der Probe die kalibrierte Menge überschritt) und der enzymatische HRP-Farbbildner wird an die Platte durch die Immunreaktion zwischen dem unblockierten P&sub3;G und dem Antikörper/HRP-Konjugat gebunden. Es ist klar, daß bei einem Anstieg der Menge an P&sub3;G in der Probe die Fähigkeit einer gegebenen Menge an Antikörper zur Blockierung des gebundenen P&sub3;G abnimmt. An einem empirisch bestimmbaren Punkt führt ein weiterer Anstieg des P&sub3;G in der Probe zum Vorhandensein von unblockiertem P&sub3;G auf der Platte und zur anschließenden Bindung von HRP an die Platte nach Zusatz des markierten Antikörpers. Wenn HRP auf diese Weise an die Platte gebunden wird, bildet sich durch Zugabe der TMB-Lösung eine Farbe.
Aus Tabelle I ist ersichtlich (rechte Spalte), daß keine Farbe in den Löchern erzeugt wurde, wo kein P&sub3;G in der Probe war. (Die numerischen Werte in Tabelle I steigen direkt mit zunehmender Farbe an und die sehr kleinen Zahlen zeigen eine sehr geringe Farbe, während die relativ viel größeren Zahlen eine bestimmte Verfärbung angeben.) Auch in der untersten Zeile von Tabelle I, wo die bekannte Konzentration des Anti- P&sub3;G-Antikörpers 128 ug/ml war, wurde keine Farbe in einer der Zellen erzeugt, da diese Antikörpermenge ausreichend war, um das gesamte P&sub3;G zu blockieren, sogar wenn die Konzentration von P&sub3;G in der Probe 2,5 ug/ml war. Im Falle, wo die Antikörperkonzentration 64 ug/ml war, trat jedoch eine volle Verfärbung der Platte ein, wenn die Konzentration von P&sub3;G in der Probe 2,5 ug/ml erreichte; wo die Antikörperkonzentration 32 ug/ml war, trat eine volle Verfärbung bei einer P&sub3;G-Konzentration von 1,25 ug/ml ein; wo die Antikörperkonzentration 16 ug/ml war, trat eine volle Verfärbung bei einer P&sub3;G-Konzentration von 0,625 ug/ml ein; bei einer Antikörperkonzentration von 8 ug/ml trat der Sprung bei 0,3125 ug/ml P&sub3;G ein und wo die Antikörperkonzentration 1 oder 2 ug/ml war, trat der Sprung bei 0,156 ug/ml P&sub3;G ein. Es ist deutlich zu erkennen, daß der Punkt des Sprungs von keiner Farbe zur vollständigen Verfärbung extrem sensitiv ist und empirisch eingestellt und kalibriert werden kann, indem einfach die Menge an P&sub3;G-Antikörper in der Standardlösung und/oder die Menge von an den Träger gebundenem P&sub3;G modifiziert wird.

Beispiel 2 - Durchfluß-ELISA-Assay unter Verwendung einer Positivschritt-Prozedur

Herstellung einer Membran

In diesem Beispiel wurde eine mikroporige Durchflußmembran als Träger eines immobilisierten Festphasenreaktanden verwendet. Die verwendete Membran war eine Pall-Immunaffinitätsmembran der im US-Patent Nr. 4,066,512 beschriebenen Art. Die Membran wurde präpariert, indem sie mit 3 ul einer Lösung betüpfelt wurde, die wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Gelatine-P&sub3;G und 100 ug/ml Glucoseoxidase in PBS enthielt. Insgesamt wurden fünf Sätze betüpfelter Membranen unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Gelatine-P&sub3;G hergestellt, d.h. 10, 1, 0,1, 0,01 und 0,001 ug/ml. Die betüpfelten Membranen wurden zur Vermeidung einer unspezifischen Bindung unter Verwendung von 2 ml einer Lösung blockiert, die 0,5 % Carnation Milch (registriertes Warenzeichen) und 0,02 % Tween 20 in PBS (pH 7,4) enthielt. Dann wurden die Membranen in Durchflußvorrichtungen des Typs eingebaut, der in der anhängigen Anmeldung des gleichen Anmelders, Serien-Nr. 107,240, eingereicht am 13. Oktober 1987, beschrieben ist.

Durchfluß-Assay

Es wurde eine Anti-P&sub3;G-Antikörper-Standardlösung, die 32 ug/ml des Antikörpers in PBS enthielt, und Probelösungen, die jeweils 2,5, 1,25 und 0 ug/ml P&sub3;G in PBS enthielten, bereitgestellt. 40 ul jeder Probelösung wurden mit 400 ul der Antikörper-Standardlösung vorgemischt und die Gemische wurden separat auf und durch die Membran einer wie oben beschrieben hergestellten Durchflußvorrichtung gegossen. 400 ul einer wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Anti-P&sub3;G-Antikörper/HRP-Konjugatlösung wurden dann durch jede Membran gegossen und die Membranen wurden mit 1 ml einer Waschlösung gewaschen, die 3 % Igepal und 1 % Natriumdodecylsulfat in PBS enthielt. Die Membranen wurden dann mit 0,4 ml einer Substratlösung in Kontakt gebracht, die aus einem Gemisch von 7 Teilen einer 7,0 % Dextrose und 0,01 % TMB in 0,034 M Citrat, 0,071 M Natriumphosphat enthaltenden Lösung und 3 Teilen Methanol bestand. Die visuell nach 3 bis 5 Minuten ermittelten Ergebnisse variierten nicht mit der Konzentration der Tüpfellösung und waren wie folgt: Ablesung + (blaue Farbe)

Beispiel 3 - Sol-Einfang-Assay unter Verwendung einer Positivschritt-Prozedur

Herstellung von Festphasenteilchen

Es wurde eine Latex-Gel-P&sub3;G-Dispersion durch kovalente Kopplung von P&sub3;G an Gelatine, wie oben beschrieben (Beispiel 1), und Kopplung der Gelatine-P&sub3;G-Komponente an monodisperse Polybead-Carboxylat-Mikrokugeln unter Verwendung genau derselben Prozedur wie in Beispiel II(g) der oben zitierten Anmeldung Serien Nr. 105,285 beschrieben, hergestellt. Es wurde eine Serie von Probelösungen, die 0,625, 1,25, 2,5, 5,0, 10 bzw. 20 ug/ml P&sub3;G in PBS enthielten, bereitgestellt. 20 ul jeder Probelösung wurden mit 300 ul der oben in Beispiel 2 beschriebenen Antikörper-Standardlösung vorgemischt und 20 ul der Latex-Gel-P&sub3;G-Dispersion wurden danach zu jeder vorgemischten Phase gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch einen Filter gegossen, der aus regenerierter Cellulose (1 Mikrometer) hergestellt war, um die Latexteilchen einzufangen und zu sammeln. Ein mit Goldsolteilchen markierter Anti-P&sub3;G-Antikörper wurde, wie in Beispiel II(b) der anhängigen Anmeldung Serien-Nr. 105,285 beschrieben, hergestellt und der goldmarkierte Antikörper wurde in einer Lösung suspendiert, die 40 mM MgSO&sub4;, 1 % RSA und 0,02 % NaAzid enthielt. Das Gemisch wurde durch den Filter gegossen, wobei die Latexteilchen gesammelt wurden, und der Filter wurde mit einer Waschlösung gewaschen, die 1,234 mM Thimerosal, 3 % Igepal CA720 und 1 % Natriumdodecylsulfat in PBS (pH 7,2) enthielt. Die visuellen Ergebnisse waren wie folgt: Ablesung + (rosa Färbung)
Somit war, wenn das P&sub3;G in der Probe 2,5 ug/ml überschritt, der blockierende Antikörper aufgebraucht und mindestens ein Teil des mit dem Latex gekoppelten P&sub3;G blieb unblockiert. Nach Sammeln der Latexkörner auf dem Filter konnte der unblockierte P&sub3;G-Latex auf dem Filter mit dem Goldsolteilchenmarkierten Anti-P&sub3;G-Antikörper reagieren und es wurde ein gesammelter Latex-P&sub3;G-Anti-P&sub3;G-Gold-Immunkomplex gebildet. Dieser gesammelte Komplex auf dem Filter ergab eine visuell erkennbare rosa Verfärbung. Andererseits, wenn das P&sub3;G in der Probe 2,5 ug/ml oder weniger war, stand der blockierende Antikörper zur Blockierung des gesamten P&sub3;G-Latex zur Verfügung und der Gold-markierte Antikörper blieb einfach unkomplexiert und in Dispersion und in einer solchen Form, daß er einfach den Filter passierte.
Das voranstehende Beispiel 3 wurde unter Verwendung von Glasteilchen für die feste Phase anstelle von Latexteilchen wiederholt, und es wurden im wesentlichen identische Ergebnisse erhalten.

Beispiel 4

Zum Test auf Östron-3-glucuronid (E&sub1;3G) wurden Prozeduren durchgeführt, die im wesentlichen gleich wie die Prozeduren der Beispiele 1 bis einschließlich 3 waren. In solchen Assays wurde Rinderserumalbumin (Fraktion 5) anstelle von Gelatine zur Verknüpfung des Haptens mit dem festen Träger verwendet. Die RSA-Verknüpfungsprozedur ist von Erlanger et al. (supra) beschrieben. Die erhaltenen Assay-Ergebnisse waren im wesentlichen mit den in den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen Ergebnissen identisch.
Unter Praxisbedingungen können die P&sub3;G- und E&sub1;3G-Assays gemäß vorliegender Erfindung zur Vorhersage der Ovulation im Voraus, zur Verifizierung der Ovulation, zur Bewertung der lutealen Funktion, zum Nachweis des Beginns und des Endes der Fruchtbarkeitsperiode, zur Bewertung der follikulären Phase und zur Diagnose der Schwangerschaft verwendet werden. Die Assays können im allgemeinen unter Verwendung des ersten Morgenurins (FMU) durchgeführt werden.
Der P&sub3;G-Assay kann zur Messung des Anstiegs von P&sub3;G im FMU während der Ovulation und während der lutealen Phase verwendet werden, und er kann kalibriert werden, um eine positive Farbanzeige zu ergeben, wenn P&sub3;G über den Schwellenwert von etwa 4 ug/ml steigt. Die Farbe (die einen P&sub3;G-Wert von über 4 ug/ml zeigt) bleibt während der lutealen Phase, um die Länge und Angemessenheit des Ovulationsprozesses anzuzeigen.
Der E&sub1;3G-Test kann zum Nachweis des Anstiegs der E&sub1;3G-Konzentration in FMU 3 bis 6 Tage vor der Ovulation verwendet werden. Der Assay ist dem P&sub3;G-Assay ähnlich und kann verwendet werden, um E&sub1;3G-Konzentrationen von größer als 30 bis 50 ng/ml als Hinweis anzuzeigen, daß eine Ovulation bevorsteht.

Claims

1. Immunoassay-Prozedur zur Bestimmung des anfänglichen Vorhandenseins von mindestens einer zuvor spezifizierten Menge einer ersten immunreaktiven Substanz in einer flüssigen Probe, wobei die Prozedur die Schritte umfaßt:

Bereitstellen einer immunchemischen Reaktionsphase durch Vermischen einer flüssigen Probe, die eine anfänglich unbekannte Menge der ersten immunreaktiven Substanz enthält, mit (1) einer bekannten Menge einer zweiten immunreaktiven Substanz, die spezifisch mit der ersten Substanz immunreaktiv ist, und (2) einer Menge einer dritten immunreaktiven Substanz, die iininunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind,

wobei die Menge der zweiten Substanz immunchemisch äquivalent zur Gesamtheit der zuvor spezifizierten Menge an erster Substanz und der Menge an dritter immunreaktiver Substanz ist, wodurch, wenn die Menge der ersten immunreaktiven Substanz in der flüssigen Probelösung die zuvor spezifizierte Menge überschreitet, nicht-reagierte dritte Substanz für eine weitere immunspezifische Reaktion in der Reaktionsphase verfügbar ist,

Kontaktieren der so bereitgestellten Reaktionsphase mit einer Menge einer vierten immunreaktiven Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der zweiten Substanz sind, wobei die vierte Substanz eine nachweisbare Markierung trägt, und

Bestimmen des anfänglichen Vorhandenseins von mehr als der zuvor spezifizierten Menge an erster Substanz in der Probe durch Nachweis des Vorhandenseins eines spezifischen Immunreaktionsprodukts, welches die nachweisbare Markierung enthält.

2. Prozedur nach Anspruch 1, worin die dritte Substanz an einen festen Träger gebunden ist.

3. Prozedur nach Anspruch 2, worin der feste Träger ein dispergierbares, teilchenförmiges, sammelbares festes Material umfaßt und die Bestimmung den Schritt des Sammelns des sammelbaren Materials und den Nachweis des Vorhandenseins der nachweisbaren Markierung im gesammelten Material umfaßt.

4. Prozedur nach Anspruch 3, worin das Sammeln das Einfangen des festen sammelbaren Materials auf einem Filterelement umfaßt.

5. Prozedur nach Anspruch 4, worin die Markierung ein Goldsolteilchen umfaßt.

6. Prozedur nach Anspruch 2, worin der feste Träger eine permeable Membran umfaßt, der Schritt des Kontaktierens der bereitgestellten Reaktionsphase den Schritt umfaßt, einen Durchfluß der die vierte Substanz enthaltenden Lösung durch die Membran zu bewirken, und der Schritt der Bestimmung den Nachweis des Vorhandenseins der Markierung auf der Membran umfaßt.

7. Prozedur nach Anspruch 6, worin die Markierung ein Goldsolteilchen umfaßt.

8. Prozedur nach Anspruch 6, worin die Markierung eine erste enzymatische Farbbildungskomponente umfaßt, wobei eine entsprechende zweite enzymatische Farbbildungskomponente an die Membran in Nachbarschaft der dritten Substanz gebunden ist, wobei die Wechselwirkung zwischen der ersten und zweiten enzymatischen Komponente die Erzeugung einer nachweisbaren Farbe auf der Membran bewirkt, wenn immer eine vierte Substanz immunspezifisch an die dritte Substanz auf der Membran gebunden wird.

9. Prozedur nach Anspruch 1, worin die erste immunreaktive Substanz ein therapeutisches Arzneimittel ist, das durch ein therapeutisches Fenster gekennzeichnet ist.

10. Prozedur nach Anspruch 1, worin die erste immunreaktive Substanz eine kontrollierte Droge oder Substanz ist.

11. Prozedur nach Anspruch 1, worin die erste immunreaktive Substanz durch einen Schwellenwert gekennzeichnet ist.

12. Prozedur nach einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend:

Zugeben der zweiten immunreaktiven Substanz zur flüssigen Probe, die die erste immunreaktive Substanz enthält, um eine erste Reaktionsphase zu erzeugen, Kontaktieren der ersten Reaktionsphase mit der dritten immunreaktiven Substanz, um eine zweite Reaktionsphase zu erzeugen,

Inkontaktbringen der zweiten Reaktionsphase mit der vierten immunreaktiven Substanz, die markiert ist, um eine Nachweisphase zu erzeugen, und Nachweisen des Vorhandenseins von markiertem Immunreaktionsprodukt in der Nachweisphase.

13. Prozedur nach Anspruch 12, worin ein fester Träger für die dritte immunreaktive Substanz, sofern vorhanden, ein dispergierbares, sammelbares, teilchenförmiges Trägermaterial umfaßt, die vierte Substanz mit einer Goldsolteilchen-Markierung markiert ist und der Nachweisschritt den Schritt des Sammelns des mit der Goldsolmarkierung markierten Immunreaktionsprodukts auf einem Filterelement und des Beobachtens der resultierenden Verfärbung des Elements, die durch das Sammeln von Goldsolteilchen darauf verursacht wird, umfaßt.

14. Prozedur nach Anspruch 12 oder 13, worin die erste und dritte Substanz jeweils Haptene sind und die zweite und vierte Substanz jeweils Antihapten-Antikörper sind, die spezifisch mit den Haptenen immunreaktiv sind.

15. Prozedur nach Anspruch 14, worin jedes Hapten Pregnandiol-3-glucuronid ist.

16. Prozedur nach Anspruch 14, worin jedes Hapten Östron- 3-glucuronid ist.

17. Modifikation der Prozedur nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend die Schritte:

Unterteilen der die erste immunreaktive Substanz enthaltenden flüssigen Probe in eine Vielzahl von Aliquotportionen,

Zugeben jeweils unterschiedlicher Mengen der zweiten immunreaktiven Substanz zu den Portionen, um eine Vielzahl von ersten Reaktionsphasen zu erzeugen, von denen jede eine jeweils unterschiedliche bekannte Menge der zweiten Substanz enthält,

Kontaktieren von jeder der ersten Reaktionsphasen mit einer Menge der dritten immunreaktiven Substanz, um dadurch eine Vielzahl von zweiten Reaktionsphasen zu erzeugen, von denen jede die gleiche Menge der dritten Substanz und jeweils unterschiedliche Mengen der zweiten Substanz enthält,

wobei die jeweilige bekannte Menge der zweiten Substanz in jeder der zweiten Reaktionsphasen so vorbestimmt ist, daß sie immunchemisch äquivalent zur gesamten Menge an dritter Substanz plus einer jeweiligen entsprechenden vorgewählten Menge an erster Substanz ist, wodurch, wenn die unbekannte Menge der ersten Substanz in der Probe geringer oder gleich ihrer jeweiligen entsprechenden vorgewählten Menge ist, keine nicht-reagierte dritte Substanz fur eine weitere immunspezifische Reaktion in der entsprechenden zweiten Reaktionsphase verfügbar ist, und wenn die unbekannte Menge der ersten Substanz in der gleichen Probe größer als ihre jeweilige entsprechende vorgewählte Menge ist, nicht-reagierte dritte Substanz für eine weitere immunspezifische Reaktion in der entsprechenden zweiten Reaktionsphase verfügbar ist,

Inkontaktbringen von jeder der zweiten Reaktionsphasen mit einer Menge der vierten immunreaktiven Substanz, die markiert ist, um dadurch jeweils eine Vielzahl von Nachweisphasen zu erzeugen, die jeweils den zweiten Reaktionsphasen entsprechen, wodurch ein markiertes Immunreaktionsprodukt durch eine spezifische Immunreaktion zwischen nicht-reagierter dritter Substanz und markierter vierter Substanz in jeder Reaktionsphase gebildet wird, die einer zweiten Phase entspricht, in der die Menge an erster Substanz in der Probe ihre jeweilige entsprechende vorgewählte Menge übersteigt, und

Nachweisen des Vorhandenseins oder des Fehlens eines markierten Immunreaktionsprodukts in jeder Nachweisphase als Anzeige des anfänglichen Vorhandenseins von mindestens der jeweiligen entsprechenden vorgewählten Menge an erster immunreaktiver Substanz in der Probe.

18. Prozedur nach Anspruch 17, worin die erste immunreaktive Substanz ein therapeutisches Arzneimittel ist, das durch ein therapeutisches Fenster gekennzeichnet ist.

19. Prozedur nach Anspruch 17, worin die erste immunreaktive Substanz eine kontrollierte Droge oder Substanz ist.

20. Prozedur nach Anspruch 17, worin die erste immunreaktive Substanz durch einen Schwellenwert gekennzeichnet ist.

21. Kit von Materialien zur Durchführung einer Immunoassay-Prozedur nach Anspruch 1 zum Nachweis des Vorhandenseins von mindestens einer vorbestimmten Menge einer ersten immunreaktiven Substanz in einer flüssigen Probe, wobei der Kit umfaßt:

eine bekannte Menge einer zweiten immunreaktiven Substanz, die spezifisch mit der ersten Substanz immunreaktiv ist,

eine bekannte Menge einer dritten immunreaktiven Substanz, die immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der ersten immunreaktiven Substanz sind,

eine Menge an markierter vierter immunreaktiver Substanz, wobei die vierte immunreaktive Substanz immunologische Reaktionscharakteristika aufweist, die immunspezifisch gleich wie die immunologischen Reaktionscharakteristika der zweiten Substanz sind.

22. Kit nach Anspruch 21, worin die dritte immunreaktive Substanz an einen festen Träger gebunden ist.

23. Kit nach Anspruch 22, worin der feste Träger ein dispergierbares, teilchenförmiges, sammelbares festes Material umfaßt.

24. Kit nach Anspruch 21, worin die vierte immunreaktive Substanz unter Verwendung einer Goldsolteilchen-Markierung markiert ist.

25. Kit nach Anspruch 21 zum Nachweis des Vorhandenseins eines Haptens in der Probe, worin die zweite und vierte immunreaktive Substanz Antihapten-Antikörper umfassen und die dritte immunreaktive Substanz das Hapten umfaßt.

26. Kit nach Anspruch 25 zum Nachweis des Vorhandenseins von Pregnandiol-3-glucuronid in einer flüssigen Probe, worin die dritte immunreaktive Substanz Pregnandiol-3- glucuronid umfaßt und die zweite und vierte immunreaktive Substanz jeweils Anti-Pregnandiol-3-glucuronid- Antikörper umfassen.

27. Kit nach Anspruch 25 zum Nachweis des Vorhandenseins von Östron-3-glucuronid in einer flüssigen Probe, worin die dritte immunreaktive Substanz Östron-3-glucuronid umfaßt und die zweite und vierte immunreaktive Substanz jeweils Anti-Östron-3-glucuronid-Antikörper umfassen.

28. Kit nach Anspruch 21, umfassend ein Behältermittel zur Aufnahme einer bekannten Menge der Probe und zur Erleichterung einer Immunreaktion zwischen darin vorhandenen immunreaktiven Substanzen.

29. Kit nach Anspruch 28, umfassend ein Mittel zum Sammeln von in dem Behältermittel gebildeten Immunreaktionsprodukten.

30. Kit nach Anspruch 29, worin das Mittel zum Sammeln ein Filterelement umfaßt.

31. Kit nach Anspruch 21 zum Nachweis des Vorhandenseins eines therapeutischen Arzneimittels, worin die zweite und vierte immunreaktive Substanz jeweils Antikörper gegen das Arzneimittel umfassen und die dritte immunreaktive Substanz das Arzneimittel umfaßt.

32. Kit nach Anspruch 21 zum Nachweis des Vorhandenseins einer kontrollierten Droge oder Substanz, worin die zweite und vierte immunreaktive Substanz jeweils Antikörper gegen die kontrollierte Droge oder Substanz umfassen und die dritte immunreaktive Substanz die kontrollierte Droge oder Substanz umfaßt.