DE3879000T2

DE3879000T2 - Immunoassaymethode zum auffinden von antikoerpern zu antigenen.

Info

Publication number: DE3879000T2
Application number: DE8888108967T
Authority: DE
Inventors: Paul A Ijamsville Barstad; William J Todd
Original assignee: Louisiana State University
Current assignee: Louisiana State University
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1988-06-04
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2008-06-05
Also published as: JPS6488155A; CA1300500C; US4962023A; EP0296398B1; EP0296398A1; DE3879000D1

Description

1. Hintergrund der Erfindung

Gegenwärtig zur Verfügung stehende Assay-Verfahren zum Nachweis von beispielsweise in klinischen Proben vorhandenem Antikörpern können technisch allgemein in zwei Gruppen unterteilt werden: (a) mehrstufige Verfahren und (b) Reaktionen des Agglutinations- oder Präzipitations-Typs. Die erstgenannten schließen viele veröffentlichte Assay-Verfahren ein, bei denen Markersubstanzen wie Enzyme, radioaktive Marker, Fluoreszenzmarker, Kolloidmarker oder Komplementbindung eingesetzt werden. Diese Verfahren erfordern zum Erhalt eines definitiven und beständigen Ergebnisses mehrere Schritte wie Binden van Antikörpern an die Ziel-Antigene, Abspülen ungebundener Antikörper und anschließendes Nachweisen der verbleibenden gebundenen Antikörper durch Verwendung einer der Markersubstanzen. Nachfolgende Schritte zum Konservieren oder Befestigen sind in einigen Fällen ebenfalls notwendig. Die Reaktionen des Agglutinations- und Präzipitations-Typs sind von Antikörpern mit agglutinierenden der präzipitierenden Eigenschaften abhängig und daher auch auf den Nachweis derartiger Antikörper beschränkt. Diese Tests sind schwierig auf mehr als ein Test-Antigen in einem einzigen Verfahren anwendbar und relativ unsensitiv. Veröffentlichte Berichte über Festphasen-Immunoassays unter Verwendung von markiertem kolloidalen Gold oder anderen markierten suspendierten Partikeln zum Nachweis von Antikörpern folgen dem seit langem etablierten, ermüdenden und zeitaufwendigen Protokoll und der Assay-Anordnung, welche langwierige Inkubationen der Test-Probe zur Bindung der Antikörper, gefolgt von einer Serie von Spülschritten und mindestens einer zusätzlichen langwierigen Inkubation mit der kolloidalen Markersubstanz erfordern. Vergleiche Moeremans et al., J. Immunological Methods, Band 74, 1984, Seiten 353-360; Moeremans et al., "Sensitive Colloidal Metal (Gold or Silver) Staining of Protein Blots an Nitrocellulose Membranes", Analytical Biochemistry, Band 145, 1985, Seiten 315, 321; Surek und Latzko, "Visualization of Antigenic Proteins Blotted Onto Nitrocellulose Using the Immuno-Gold-Staining (IGS) Method", Biochemical and Biophysical Research Communications, Band 121, Nr. 1., 1984, Seiten 284-289; und Yau-Heiu Hsu, "Immunogold for Detection of Antigen an Nitrocellulose Paper", Analytical Biochemistry, Band 142, 1984, Seiten 221-225, zum Nachweis der Antigen-gebundenen Antikörper.
Ein Verfahren zur Sichtbarmachung für einen Immunoassay gemäß der allgemeinen Methodik des Blot-Overlay-Assays unter Verwendung von kolloidalen Metallpartikeln ist im Europäischen Patent Nr. 158 746, veröffentlicht am 23. Oktober 1985, dargestellt. Dieses Patent lehrt die Verwendung von Nitrocellulosepapier als Blottingmedium, welches entweder mit Tubulin oder Calmodulin betropft wird, wobei die verbleibenden Bindungsstellen durch Inkubation mit bovinem Serumalbumin (BSA) abgesättigt werden, nachfolgend die das Antigen enthaltenden Nitrocellulosestreifen mit Anti-Tubulin- bzw. Anti-Calmodulin-Serum inkubiert und nachfolgend dreimal mit BSA-Tris gewaschen wurden. Anschließend wurden die gewaschenen Streifen mit dem markierenden Material aus kolloidalem Gold inkubiert und vor der Auswertung wiederum mit BSA-Tris gewaschen. Ein Vergleich mit einer immobilisierten Peroxydaseinkubation zeigte eine ähnliche Positivreaktion, jedoch unterschiedlich exprimiert. Obwohl das vorhergehende Verfahren von einer neuen Blot-Markierungstechnik Gebrauch macht, z.B. Sole aus kolloidalen Metallpartikeln, ist das Verfahren als solches den zuvor bekannten Enzym-markierten Immunoassay-Verfahren recht ähnlich. Dieses wird aus Beispiel 1 deutlich, in welchem dasselbe Verfahren unter Einsatz der beiden verschiedenen Markierungstechniken im direkten Vergleich und mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt wurde.
Während die vorbekannten Assay-Verfahren exakte Ergebnisse liefern, ist es immer wünschenswert, diese Ergebnisse schneller, mit einfacheren und verläßlicheren Verfahren mit gesteigerter Sensitivität und zu niedrigeren Kosten hinsichtlich des teuren biologischen Materials und der Arbeit des Analysetechnikers zu erreichen.

2. Ziele

Es ist demgemäß ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, diese und andere Bedürfnisse zu befriedigen.
Insbesondere ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Immunoassay-Verfahren bereitzustellen, welches einfacher als die vorbekannten Verfahren ist.
Ein weiteres, spezifischeres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines einstufigen Immunoassay-Verfahrens, welches schneller ist und einen sehr sensitiven Nachweis ohne instrumentelle Ausstattung erlaubt.
Ein weiteres besonderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Immunoassay-Kits Serien-Untersuchung von menschlichen und veterinären Proben oder zur Anwendung in einem professionellen Labor.

3. Die Erfindung

Die vorhergehenden und andere Ziele werden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erreicht, die allgemein ein einstufiges Immunoassay-Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Antikörpern zu Antigenen infektiöser Agenzien (oder Antigenen zu Antikörpern infektiöser Agenzien) verkörpert, bei dem (1) die Antigene auf ein festes Substrat geblottet werden, (2) ein Nachweisreagens, z.B. mit Protein A beschichtetes kolloidales Gold, und (3) ein Serum als Quelle für Antikörper zugegeben und diese drei Komponenten miteinander inkubiert werden. Ein positives Assay-Ergebnis wird angezeigt durch das Auftreten eines Signals (Farbreaktion infolge der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes; und ein negatives Assay wird durch Ausbleiben einer Farbreaktion angezeigt). In seiner bevorzugten Ausführungsform ist der Test so ausgestaltet, daß die Anwesenheit von Antikörpern zu Antigenen infektiöser Agenzien nachgewiesen wird.
In seinen bevorzugten Ausführungsformen verkörpert die Erfindung ein Immunoassay-Verfahren zur Analyse einer Test-Probe auf Test- Antigen-spezifische Antikörper in Gegenwart von nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern und umfaßt das Inkubieren einer detektierenden Menge von mindestens einem bekannten Test-Antigen, welches auf einem Festphasen-Substrat an einer lokalisierten Stelle gebunden ist, mit einer Test-Probe in Gegenwart eines Signal-entwickelnden Reagens, welches sowohl gegenüber den Test- Antigen-spezifischen Antikörpern als auch gegenüber den nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern derart reaktiv ist, daß ein positives Ergebnis für Test-Antigen-spezifische Antikörper in der Test-Probe an besagter Stelle zu einem Signal führt, an dieser bei einem negativen Ergebnis aber kein Signal erscheint. Ein bevorzugtes Reagens zur Ausbildung des Signals ist ein mit kolloidalen Metallpartikeln markierter Ligand, der gegenüber den Antikörpern in der Test-Probe reaktiv ist. In am meisten bevorzugter Weise ist der Antikörper-spezifische Ligand, mit dem die suspendierten Partikel beschichtet sind, Staphylokokken-Protein A, markiert mit kolloidalem Gold.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann am bequemsten ausgeführt werden mittels Verwendung eines immunologischen Diagnosekits, d.h. eines zur Analyse einer Test-Probe auf Test-Antigen-spezifische Antikörper in Gegenwart von nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern brauchbaren Kits, umfassend (a) ein festes Substrat, an das an einer lokalisierten Stelle eine detektierende Menge von mindestens einem bekannten Test-Antigen zum Nachweis eines Test-Antigen-spezifischen Antikörpers gebunden ist, welcher in der interessierenden Test-Probe enthalten sein kann, (b) eine darin enthaltene Menge eines Signal-entwickelnden Reagens, welches sowohl gegenüber den Test-Antigen-spezifischen Antikörpern als auch gegenüber den nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern reaktiv ist, wobei die Inkubation des Substrats mit der Test-Probe in Gegenwart des Signal-entwickelnden Reagens als ein positives Ergebnis für die Test-Antigen-spezifischen Antikörper die Bildung eines Signals an der Stelle verursacht, und die Stelle als negatives Ergebnis für die Test- Antigen-spezifischen Antikörper kein Signal ausbildet.
Das erfindungsgemäße Immunoassay-Verfahren schließt ein Antigen ein, welches das Ziel eines spezifischen Antikörpers ist, der gegebenenfalls in der biologischen flüssigen Test-Probe gefunden werden kann. Für die Zwecke dieser Erfindung wird der Antikörper, der ein gebundenes Antigen als Ziel hat, als Test-Antigenspezifischer Antikörper bezeichnet, und sämtliche anderen, nicht interessierenden Antikörper sind nicht-Test-spezifische Antikörper. Das Antigen wird gewöhnlich und vorzugsweise in einer relativ reinen Form bereitgestellt, also ohne andere konkurrierenden Antigene, die andernfalls die Antigen-Antikörper-Reaktion stören oder vermindern würden. Jedes identifizierbare Antigen, das an das Festphasen-Substrat fixiert sein kann und lediglich mit spezifischen Antikörpern reagiert, ist zur praktischen Ausführung dieser Erfindung geeignet. Es ist wichtig für die Erfindung, daß das Antigen an eine feste Phase oder an ein festes Substrat gebunden ist. Dieses Merkmal der Erfindung ermöglicht eine einfache Auswertung, Abtrennung von den Assay-Reagenzien und Sicherstellung der Testergebnisse.
Die feste Phase oder das feste Substrat kann jedes bekannte, bei herkömmlichen Immunoassay-Verfahren verwendete Substrat sein. Typischerweise sollten derartige Festphasen-Materialien oder -substrate nach Anheftung des Antigens an die feste Phase biologisch neutral sein oder durch Blockierungsmittel zur biologischen Neutralität konvertiert werden, d.h., daß sie das Antigen in einer für die Zwecke dieses Tests ausreichenden Weise, nicht aber die anderen Komponenten der biologischen flüssigen Test- Probe oder das Entwicklungsreagens binden sollten. Die bei herkömmlichen und vorbekannten Immunoassay-Verfahren eingesetzten Festphasen-Materialien oder -substrate schließen Membranen und Papier wie Nitrocellulose, Nylon, Polysil, mikroporöse Kunststoffmatten (MPS), ZETA-PROBE , APT (2-Aminophenylthioether)polystyrol, GENE-SCREEN , diazotierte Membranen, Blot-Absorbens- Membranen, oder andere Trägermaterialien ein, die Kügelchen, Röhrchen, Objektträger und dergleichen einschließen. Das bevorzugte Festphasen-Material oder -substrat ist Nitrocellulosepapier, da es kostengünstig ist, Antigene aufnimmt und sie in geeigneter Weise bindet, ohne jedoch ebenfalls andere biologische Flüssigkeiten oder die kolloidale Markersubstanz zu binden, insbesondere, wenn sie direkt nach der Anheftung der Antigene oder später mittels Blockierungsmitteln, die in der Assayflüssigkeit vorhanden sind oder unter Anwendung beider Verfahren blockiert werden, wie es im Stand der Technik in bekannter Weise unter Verwendung von bovinem Serumalbumin (BSA), Polyethylenglykol (PEG), Gelatine, fettfreier Trockenmilch und anderen nachfolgend beschriebenen Substanzen durchgeführt wird.
Im Falle von Nitrocellulosesubstraten wird das Antigen typischerweise auf den Teststreifen in einer Menge aufgetropft, die zum Nachweis mittels Bindung des Komplexes des Antikörpers mit dem Entwicklungsreagens ausreichend ist. Die Menge an auf das Substrat auf getropftem Antigen sollte in ausreichender Weise konzentriert sein, um eine positive Reaktion zu zeigen oder anzuzeigen, sollte aber nicht so konzentriert sein, daß Bereiche des Antigens von der Bindung an das Substrat abgehalten werden und damit das Risiko entsteht, daß sie während der Inkubation von dem Substrat entfernt werden. Im allgemeinen ist ein Antigenspot mit einem Durchmesser von etwa 1 bis etwa 5 Millimeter enthaltend etwa 1 bis etwa 5 Mikroliter Antigenmaterial geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren. Zwar sind höhere oder niedrigere Mengen geeignet, aber das Färbemittel zeigt bei niedrigeren Konzentrationen und Mengen und höheren Konzentrationen und Mengen nicht so gute Ergebnisse, und höhere Konzentrationen sind verschwenderisch und unnötig und neigen dazu, die Ablösung des gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexes von dem festen Substrat zu verursachen, wenn mehrere Schichten Antigen vorliegen. Vorzugsweise können Spots von einem oder mehreren bekannten Antigenen zum Nachweis ihrer entsprechenden Antikörper, d.h. Test- Antigen-spezifischer Antikörper, auf ein einziges Substrat aufgetragen werden, wenn man darauf achtet, daß die individuellen Antigenspots nicht in gegenseitigen Kontakt geraten. Demgemäß kann ein Teststreifen des Festphasen-Substrats, welcher eine Anzahl von Antigenen wie beispielsweise 20 bis 30 verschiedene Antigene aufweist, eingesetzt werden, um die entsprechenden Antikörper in einer einzigen Untersuchung mit exakten Ergebnissen ohne Beeinträchtigung von nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern zu bestimmen, die in der Test-Probe an das Festphasen-Substrat binden.
Das Signal-entwickelnde Reagens ist jedes geeignete Mittel, welches die Bindung des Test-Antigens mit den Test-Antigen-spezifischen Antikörpern nicht beeinträchtigt, welches an die Test- Antigen-spezifischen Antikörper in ausreichender Weise bindet und welches einen in geeigneter Weise nachweisbaren Signal- oder Markierungsstoff darstellt. Vorzugsweise ist es ein Komplex aus kolloidalen Metallpartikeln und Staphylokokken-Protein A, wobei bekannt ist, daß beide Substanzen sowohl an Test-Antigen-spezifischen Antikörper als auch an nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern binden, um eine rötliche Farbe auszubilden, die mikroskopisch und makroskopisch nachgewiesen werden kann. Sofern bei dem vorliegenden Verfahren eingesetzt, ist der Nachweis mit dem Auge ohne Hilfsmittel leicht möglich. Das Entwicklungsmittel färbt den Antigenspot an der lokalisierten Stelle auf dem Substrat nach einer Zeit von lediglich etwa 15 Minuten und im allgemeinen innerhalb von 2 Stunden unter Bereitstellung eines Teststreifens oder einer Probe mit einem klar erkennbaren Spot, sofern der entsprechende Antikörper in der Test-Probe vorhanden ist. Bei Proben, die hinsichtlich spezifischer Antikörper verdünnt sind, ist eine verlängerte Inkubation von 24 bis 48 Stunden akzeptabel, da die Reagenzien des Assays im Verlaufe der Zeit nicht überreagieren oder zu Artefakten führen.
Obgleich vorhergehend in spezifischer Weise beschrieben, ist das Signal-entwickelnde Reagens allgemein ausgedrückt ein Komplex aus einer Detektorsubstanz und einem Liganden, welcher in der Lage ist, die Detektorsubstanz sowohl an die Test-Antigen-spezifischen Antikörper als auch an die nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörper zu binden. Vorzugsweise wird der Ligand aus Protein-Liganden und -substanzen ausgewählt, die als Anti-Antikörper bezeichnet sind. Es ist lediglich erforderlich, daß der Ligand sich sowohl an die Detektorsubstanz als auch an die Antikörper der Test-Probe anlagert.
Die Detektorsubstanz kann geeigneterweise aus einer Reihe bekannter Signalstoffe oder Markersubstanzen ausgewählt werden. Beispielsweise sind bevorzugte Detektorsubstanzen kolloidale Metallsole, radioaktiv markierte Substanzen, Fluoreszenzmoleküle, Enzyme und Kombinationen derselben, wobei diese Kombinationen den Signaleffekt lichtempfindlich machen und intensivieren.
Das Signal-entwickelnde Reagens schließt als die bevorzugte Detektorsubstanz feinverteilte Goldgranula oder -partikel ein, die zum Nachweis von Antikörpern in immunochemischen Verfahren bekannt und eingesetzt worden sind. Vergleiche Europäisches Patent Nr. 158 746, a.a.O. Die feinverteilten Granula können nach einer Reihe bekannter Vorgehensweisen hergestellt und markiert werden. Das Verfahren für mit Protein A markierten kolloidalen Goldmarkern wurde zuerst von Romano und Romano publiziert, Immunochemistry, Band 14, 1977, Seiten 711-715. Die drei grundlegenden Verfahren zur Herstellung von kolloidalem Gold, auch als monodisperse Goldsole bezeichnet, basieren alle auf der kontrollierten Reduktion einer wäßrigen Lösung von Aurochlorwasserstoffsäure unter Verwendung von Phosphor-gesättigtem Ether als Reduktionsmittel für 3 nm und ±5 nm Gold, Natriumascorbat für 10-15 nm Gold, oder Natriumcitrat für größere Partikel von 15- 150 nm. Vergleiche DeMay, "Colloidal Gold Probes in Immunocytochemistry", Immunocytochemistry, Practical Applications in Pathology and Biology, Herausgeber Polak and Van Noorden, 1983, Seiten 82, 83. Demgemäß weisen bevorzugte Partikelgrößen eine Partikelgröße im Bereich von 5 bis 150 Nanometer und in am meisten bevorzugter Weise von etwa 15 bis etwa 50 Nanometer auf. Ferner liegt die Konzentration von kolloidalem Metall in einer solchen Konzentration für den gesamten Oberflächenbereich des Metalls, vorzugsweise Gold, vor, daß etwa 0,5 bis etwa 50 Mikrogramm des Liganden pro Milliliter des kolloidalen Metallsols und am meisten bevorzugt, 1 bis etwa 50 Mikrogramm pro Milliliter gebunden werden.
Eine weitere Detektorsubstanz schließt monodisperse, aus Polymeren wie Polystyrol und Latex hergestellte Mikropartikel oder Mikrokügelchen ein. Diese feinverteilten Granula sind bekannt und zuvor zum Nachweis von Antikörpern in immunochemischen Mehrschrittverfahren eingesetzt worden. Vergleich Gridnau, T.C.J. et al., J. Chromotography, Band 376, 1984, Seiten 175-189, und Bangs, L.B., "Uniform Latex Particles", Seragen Diagnostics, Inc., Indianapolis, Indiana, 1984. Sie können mit Antikörperbindenden Liganden wie Protein A durch Adsorption bei einem hohen pH-Wert und mittels anderer bekannter Verfahren kovalent markiert werden. Typischerweise eingesetzte Granula weisen einen Durchmesser in der Partikelgröße im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 5,0 Mikrometer auf. Derartige Polymerpartikel sind von verschiedenen Herstellern in einer Vielzahl von Farben oder mit Fluoreszenzfarbstoffen erhältlich und mit Antikörper bindenden Liganden wie Protein A vormarkiert.
Sowohl das Metallsol als auch die polymeren Detektorsubstanzen können radioaktiv markiert werden oder mit angelagerten Enzymen oder Fluoreszenzmarkern zur Amplifizierung des durch den Antigen-Antikörperkomplex entwickelten Reaktionssignals hergestellt werden.
Obgleich hinsichtlich des kolloidalen Goldes auf spezifische Verfahren Bezug genommen worden ist, sind andere Schwermetalle und Metallverbindungen ebenfalls geeignet. Derartige andere Schwermetalle und Metallverbindungen schließen typischerweise Silber, Platin, Kupfer, Silberjodid, Silberbromid, Kupferoxidhydrat, Eisenoxid, Eisenhydroxid und dergleichen ein. Es ist lediglich erwünscht, daß die Partikelgröße klein genug ist, um wie ein Kolloid zu agieren, d.h. daß es in Lösung suspendiert verbleibt oder leicht resuspendiert werden kann, wenn sich die Partikel nach langem Stehen absetzen, damit die Partikel reagieren, um an die Antikörper entweder selbst oder mit einem komplexierenden Liganden wie einem Protein-bindenden Agens wie Staphylokokken-Protein A, Protein G oder Anti-Antikörper zu binden, wobei sie alle entweder monoklonal als auch polyklonal sein können, und damit die Konzentration des anwesenden Entwicklungsmittels hoch genug ist, um im wesentlichen alle Antikörper in der Test-Probe zu binden, oder ausreichend ist, um an die Antigene auf dem Substrat gebundene Antikörper nachzuweisen, ohne daß es zu einer wirksamen kompetitiven Hemmung durch in der Probe anwesende Antikörper kommt, die für das an das Substrat gebundene Antigen nicht spezifisch sind. Da die Bindungsaffinität für Protein A für an ihre Antigene gebundene Antikörper höher ist als für freie oder ungebundene Antikörper, fördern die Kinetiken der Protein A-Reaktion den Nachweis der Antikörper, die an ihre entsprechenden, auf dem Festphasen-Substrat plazierten Antigene gebunden sind, selbst in Gegenwart eines Überschusses an für das gewählte Antigen nicht-spezifischen Antikörpern. Protein A ist daher ein bevorzugter Ligand, um die suspendierten Partikel der Detektorsubstanz mit den Antikörpern zu verknüpfen, die an die Antigene an einer lokalisierten Stelle des Festphasen-Substrats gebunden sind. Protein A ist im allgemeinen als ein geeigneter und wirksamer Ligand für das kolloidale Gold und andere suspendierte partikelförmige Detektorsubstanzen bekannt und sämtliche Seren der Säugetiere enthalten Antikörper, die das Protein A binden. Das Protein A ist jedoch im Falle von Seren aus Vögeln oder Fischen nicht wirksam.
Die Test-Probe, die mit dem vereinfachten erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden kann, schließt praktisch jede Körperflüssigkeit oder klinische Flüssigkeit ein, die nachzuweisende Antikörper enthalten könnte. Typische Körperflüssigkeiten schließen Vollblut, Blutserum, Plasma, Speichel, Tränen, geklärte Diarrhoe-Flüssigkeiten oder Verdünnungen derselben ein. Blutserum ist bevorzugt, da es leicht erhältlich ist und lediglich kleine Mengen für Testzwecke erforderlich sind. Typischerweise reichen 0,1 bis 20 Mikroliter der klinischen oder Körperflüssigkeit für die Zwecke der erfindungsgemäß eingesetzten Test-Probe aus. Serumverdünnungen, die sich im Bereich von etwa 1:100 bis etwa 1:100 000 (Volumen Flüssigkeit zu Volumen Verdünnungsmittel) bewegen, bleiben für die Zwecke des Nachweises ausreichend, obgleich der positive Test im Falle der höheren Verdünnungen recht schwach ausfällt. Die Konzentration an Antikörpern wirkt sich auf den Test geringfügig aus, da sie die Geschwindigkeit der Farbbildung an dem Antigenspot auf dem Festphasen-Substrat beeinflußt. Niederschwellige Infektionen oder Infektionen, die vor langer Zeit auftraten, weisen üblicherweise eine niedrigere Konzentration an Antikörpern auf, wohingegen eine virulente oder schwerwiegende gegenwärtige oder neue Infektion zu einer proportional höheren Konzentration an Antikörpern führt.
Die Bedingungen, unter denen das vorliegende Verfahren durchgeführt wird, sind wichtig, aber nicht kritisch, und bewegen sich innerhalb eines normalen Bereichs allgemeiner immunocytochemischer Tests. Typischerweise bewegt sich die Inkubationsdauer der Antigen-Kolloidalmarker-Antikörpermischung im Bereich von etwa 15 Minuten bis zu mehreren Stunden in Abhängigkeit von der Konzentration der Reagenzien, der Temperatur und des pH- Wertes des Systems. Die Temperatur des Testverfahrens kann sich im Bereich von etwa Raumtemperatur bis zu physiologischer Temperatur, d.h. zwischen etwa 25 und etwa 40ºC bewegen. Die Geschwindigkeit der Bindung und der positiven Reaktion steigert sich proportional mit der Temperatur. Bei Temperaturen von mehr als 40ºC beginnen jedoch die Proteine und andere biologische Materialien zu denaturieren und ihre Eigenschaften zu verlieren. Ferner kann die Steigerung der Konzentration an Antikörpern die Geschwindigkeit der Reaktion bis zu einem Punkt erhöhen, an dem die Konzentration an für das Test-Antigen nicht-spezifischen Antikörpern die Bindung des kollodialen Markers an das Antigen kompetitiv hemmt, was zu einer verminderten Wirksamkeit des Assays führt. Im Falle des Protein A variiert die Konzentration, bei der eine Hemmung auftritt, für jede Tierspezies. Aufgrund der hohen Sensitivität kann das Assay jedoch in einfacher Weise mit Mengen an Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten bei Antikörperkonzentrationen durchgeführt werden, die ein gutes Stück unterhalb einer nachweisbaren kompetitiven Hemmung liegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bezugnahme auf die folgenden, erläuternden aber nicht beschränkenden Beispiele noch besser verständlich.

Beispiel 1

Das FestPhasen-Substrat wurde vor dem Testverfahren unter Verwendung von Ovalbuminprotein als Antigen hergestellt, indem ein Mikrogramm Ovalbumin auf Nitrocellulosepapier aufgezogen wurde. Dies wurde durch Auftragen von einem Mikroliter 0,05 M Tris- Puffer, pH-Wert 7,2, enthaltend ein Milligramm Ovalbumin pro Milliliter erreicht. Der Spot wurde mittels Vakuum getrocknet und die verbleibenden ungebundenen Nitrocellulosestellen wurden mittels kurzer Inkubation in ein gewichtsprozentigem bovinem Serumalbumin (BSA), gefolgt durch Vakuumtrocknen, blockiert. Die hergestellte Nitrocellulose wurde bei Raumtemperatur bis zur Verwendung aufbewahrt.
Das Entwicklungsreagens wurde hergestellt durch Reduktion von Goldchlorid mit Natriumcitrat, wie von Frens, G., "Controlled nucleation for regulation of the Particle size in monodisperse gold suspensions", Nature Physical Science, Band 241, 1973, Seiten 20-22, worauf hier vollständig Bezug genommen wird, beschrieben, um kollodiale Goldpartikel der gewünschten Größe von 15 nm bis 150 nm bereitzustellen. Für dieses Assay wurden Kolloidpartikel mit einem Durchmesser von etwa 30 nm hergestellt und mit Staphylokokken-Protein A im wesentlichen nach dem Verfahren von Romano und Romano, a.a.O., beschichtet.
Die Testseren, die Antikörper gegen das Ovalbuminprotein enthielten, wurden in einem Kaninchen gezogen und mittels subkutaner Injektion von Ovalbumin in Freund's unvollständigem Adjuvans erhalten. Vor der Injektion entnommene Blutproben dienten der Kontrolle genauso wie Seren, die gemäß desselben Verfahrens gegen andere Antigene gezogen worden waren. Sämtliche Test-Proben wurden bis zur Verwendung eingefroren aufbewahrt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde ausgeführt durch Zugabe von 10 Mikroliter Blutserum aus einem zuvor mit Ovalbumin immunisierten Kaninchen und eines Streifens Nitrocellulosepapier, auf den ein Mikrogramm Ovalbumin aufgetropft worden war, zu einem Teströhrchen, welches einen Milliliter von mit Protein A beschichtetem kolloidalen Gold als Entwicklungsmittel enthielt, wobei die Reagenzien wie zuvor beschrieben hergestellt wurden. Das Röhrchen wurde mittels Schütteln bei Raumtemperatur gemischt. Nach 15 Minuten tauchte ein roter Spot an der Stelle des gebundenen Ovalbumins auf dem Nitrocellulosestreifen auf und zeigte damit eine positive Reaktion und die Anwesenheit von Antikörpern gegen Ovalbumin in der untersuchten Blutserumprobe an.

BEISPIEL 2

Zehn Mikroliter des Blutes aus dem Kaninchen gemäß Beispiel 1 vor der Zugabe des Ovalbumins sowie 10 Mikroliter Blut aus einem anderen Kaninchen, welches gemäß dem Immunisierungsprotokoll des Beispiels 1 mit einem unterschiedlichen Antigen erhalten wurde, wurden gemäß dem Vorgehen des Beispiels 1 behandelt mit einer weiteren Probe positiven Ovalbuminserums parallel dazu. Es trat kein roter Spot als positive Anzeige mit der prä-immunisierten Probe oder der Probe aus dem anderen Kaninchen und dem anderen Antigen auf, während bei dem parallelen positiven Test ein roter Spot auftauchte. Die Inkubation wurde über Nacht fortgeführt und die negativen Kontrollen blieben negativ, während die positive Anzeige sich zu einem dunkleren Rot verändert hatte.

BEISPIEL 3

Dem Vorgehen gemäß Beispiel 1 folgend, wurde die Sensitivität des Testverfahrens bewertet durch die Zugabe kleinerer Mengen an Testseren zu einer Reihe von vier Teströhrchen, die einen Milliliter des kolloidalen Gold-Protein A-Indikators und einen Teststreifen mit Ovalbumin betropften Nitrocellulosepapier enthielten. Die Ergebnisse zeigen bei Serumverdünnungen von 1:100, 1:500, 1:1200 und 1:2500, daß die Farbintensität des Indikatorspots proportional zu der Konzentration anwesender spezifischer Antikörper war und liefert daher eine quantitative Indikation der in der Test-Probe anwesenden Antikörper.

BEISPIEL 4

Das Potential der nicht-spezifischen Antikörper, das erfindungsgemäße Verfahren auf dem Wege der Kompetition um die Bindungsstellen des Protein A auf dem kolloidalen Goldindikator kompetitiv zu hemmen, wurde bewertet durch Zugabe von einem Mikroliter positiven Kaninchenserums zu steigenden Kontrollmengen, d.h. für Ovalbumin-Antikörper negatives Kaninchenserum, und durch anschließende Zugabe der gesamten Serenmischung zu einem Milliliter Entwicklungsreagens für das kolloidale Gold in Gegenwart des mit Ovalbumin betropften Nitrocellulosepapierstreifens. Obgleich schwach, war eine positive Anzeige selbst in Gegenwart von 200 Mikroliter Blockingserums pro Mikroliter positiven Serums nachweisbar. Da die Mengen unverdünnter Seren oder anderer biologischer Flüssigkeiten, die eine hohe Konzentration an Antikörpern aufweisen, die pro Milliliter kolloidalen Goldindikators und Festphasen-Antigen zugegeben werden, sich im allgemeinen im Bereich von weniger als 1 Mikroliter bis zu 50 Mikrolitern bewegen, ist die kompetitive Hemmung durch anwesende Antikörper einer zum bekannten Testantigen nicht in Beziehung stehenden Spezifität nicht signifikant. Die Reaktionsgeschwindigkeit und -intensität fiel mit sinkender Konzentration an positiven Serum ab.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwendung des beschriebenen einstufigen Immunoassays zum Nachweis Virus-spezifischer Antikörper.
Das Equine Infectious Anemia (EIA)-Virus wurde als Quelle für das Zielantigen ausgewählt. Das EIA-Virus wurde in kultivierten equine fetal kidney cells propagiert. Die in den Überstand der Kulturflüssigkeit freigesetzten Viren wurden durch Ultrafiltration, gefolgt durch Zentrifugation, um ein kleines Viruspellet zu bilden, konzentriert. Phosphatpuffer, 0,05 M, pH 7,4, wurde in Mengen zugegeben, die gerade ausreichend sind, das Pellet zu resuspendieren, und das suspendierte Virusmaterial wurde bis zur Verwendung eingefroren aufbewahrt. Das Festphasen-Testantigen wurde hergestellt durch Zugabe von 10 Mikroliter aufgetauten Virusmaterials zu 90 Mikrolitern 4 M KSCN. Dieser Schritt dient dazu, die Viren aufzubrechen, um die inneren als auch die Oberflächenantigene zu exponieren. Das aufgeschlossene Virus wurde mit 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,2, auf 1:8 verdünnt. Um das Festphasen-Substrat herzustellen, wurden Mengen von jeweils 1 Mikroliter des verdünnten aufgeschlossenen Virus einzeln auf Nitrocellulosepapier aufgetropft. Die Spots wurden auf der Nitrocellulose 1 Stunde lang bei 70ºC im Ofen getrocknet. Im Falle der beschriebenen Herstellungsweise würde ein Milliliter Viruskonzentrat ausreichend sein, um 80 000 Antigenspots zu erhalten. Die Festphasen-Träger mit den Flecken angelagerter Virusantigene wurden vor der Verwendung nicht blockiert.
Das verwendete Reagens zur Signalentwicklung entsprach dem in Beispiel 1 beschriebenen mit der Abweichung, daß 2,5 % (Gew./Vol.) fettfreie Trockenmilch direkt dem Entwicklungsreagens als ein Blocker nicht-spezifischer Reaktionen zugegeben wurde. Einzelne Tests wurden durchgeführt durch Einbringen von 1 Milliliter mit Protein A beschichteten Signalentwicklungsreagens aus kolloidalem Gold gemeinsam mit einem Streifen Nitrocellulose mit einem angelagerten Antigenfleck in ein Teströhrchen. Um die Tests durchzuführen, wurde einem der Assayröhrchen 2,5 Mikroliter Serum eines mit EIA infizierten, gemäß dem EIA-Test von Coggins als seropositiv bekannten Pferdes zugegeben, während einem zweiten Assayröhrchen, welches als Kontrolle in derselben Weise wie das erste Röhrchen behandelt worden war, dieselbe Menge Serum aus einem als EIA-negativ bekannten Pferd zugegeben wurde. Nach einer Inkubation von 15 Minuten bei Raumtemperatur tauchte ein roter Spot an der Antigenstelle des positiven Serums auf und zeigte eine positive Reaktion an, während in derselben Zeitspanne keine Färbung an der Antigenstelle der Negativkontrolle auftauchte. Nach einer fortgeführten Inkubation über Nacht war der Antigenspot des bekannten positiven Serums dunkelrot, während der mit dem Negativserum inkubierte Antigenspot immer noch negativ, d.h. nicht gefärbt war, und denselben weißen Hintergrund des Nitrocellulosepapiers beibehielt.

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung des Serumtiters durch limitierte Verdünnung.
Die beiden Seren sowie das Verfahren gemäß Beispiel 5 wurden in einem standardisierten Reihenverdünnungstest eingesetzt, um für die Untersuchungen positiver Seren eine Endpunktreaktion zu etablieren. Serielle 1:5 Verdünnungen der Seren erfolgten direkt in das Reagens zur Signalentwicklung, welches 2,5 % (Gew./Vol.) fettfreie Trockenmilch enthielt. Verdünnungen, die sich im Bereich von 1:500 bis 1:312 500 bewegten, wurden durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart des Festphasen-gebundenen EIA-Antigens untersucht. Die Antigenflecken, die mit Verdünnungen der als negativ bekannten Kontrollseren inkubiert worden waren, waren alle negativ und nicht gefärbt. Bei einer Serumverdünnung von 1:62 500 erreichte das positive Serum einen leicht rötlichen Antigenspot, was eine schwache positive Reaktion anzeigte. Die Verdünnung von 1:62 000 wurde daher als Endpunkt für diese Serumprobe genommen. Bei weiteren Verdünnungsebenen entwickelte sich kein Farbspot an der Antigenstelle, was darauf hinweist, daß die Antikörper der Reaktion über die Sensitivitätsgrenze dieses Tests hinweg verdünnt worden waren.

BEISPIEL 7

Die Auswirkung kleiner Volumina Entwicklungsreagens auf das Assay wird in diesem Beispiel veranschaulicht. Um zu untersuchen, ob dieses einstufige Assay unter Verwendung der kleinen Flüssigkeitsvolumina, die für einige Testanordnungen wie die weit verbreitet verwendeten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt werden könnte, wurde das Nitrocellulosepapier kreisförmig geschnitten, so daß der Antigenf leck sich im Zentrum befand, und die kreisförmigen Ausschnitte wurden, mit dem Antigenfleck nach oben, auf den Grund verschiedener Vertiefungen zweier Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plaziert. Die Vertiefungen der verwendeten Mikrotiterplatten faßten jeweils ein Maximum von 0,5 Milliliter. Das gemäß Beispiel 5 verwendete Reagens zur Entwicklung des Signals wurde den Vertiefungen in Mengen von 0,25 und 0,1 Milliliter zugegeben. Dasselbe positive und negative Pferdeserum wurde getrennten Vertiefungen unter Verwendung von Mengen von jeweils 1 Mikroliter zugegeben. Die Ergebnisse wurden nach einer Inkubation von 4 Stunden aufgezeichnet. Alle Vertiefungen mit positivem Serum wiesen einen roten Farbspot an der Antigenstelle auf, während alle Vertiefungen mit dem negativen Kontrollserum an der Antigenstelle einen weißen Hintergrund zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, dieses Assay unter Verwendung von lediglich kleinen Mengen Reagens in Tests durchzuführen, die für eine Automatisierung entwickelt sind.

BEISPIEL 8

Die Verwendung von Vollblut als Antikörperquelle wird in dem folgenden Beispiel veranschaulicht.
Vollblut wurde sowohl einem als EIA-seropositiv bekannten Pferd als auch einem als EIA-seronegativ bekannten Pferd in Gegenwart eines der verschiedenen gerinnungshemmenden Mittel abgezogen.
Die drei gerinnungshemmenden Mittel Heparin, Citrat und EDIA wurden getrennt verwendet, wie sie im Handel erhältlich sind. Nachdem das Vollblut erhalten worden war, wurden 1, 2,5, 5, 10 bzw. 20 Mikroliter von dem für jedes Pferd in Gegenwart eines jeden gerinnungshemmenden Mittels gesammelten Blutes entfernt und jeweils getrennt einem Teströhrchen direkt zugegeben, welches 1 Milliliter des Signalentwicklungsmittels gemäß dem in Beispiel 5 verwendeten sowie einen mit EIA-Antigen betropften Nitrocellulosestreifen enthielt. Der Einfachheit halber wurden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Sämtliche Proben des als EIA-positiv bekannten Pferdes zeigten einen roten Spot an der Antigenstelle als Zeichen einer positiven Reaktion, während sämtliche Proben, die mit Blut aus dem als EIA-negativ bekannten Pferd inkubiert worden waren, an der Antigenstelle als Zeichen einer negativen Reaktion weiß blieben. Daher muß das Serum vor der Analyse mit diesem Antikörpertest nicht vom Vollblut abgetrennt werden. Diese Beobachtung steigert den Wert des Tests insbesondere unter Feldbedingungen.

BEISPIEL 9

Dieses Beispiel veranschaulicht ein alternatives Reagens zur Signalentwicklung, d.h. die Verwendung von Mikrokügelchen als ein Bestandteil des Signalentwicklungsmittels. Um die Vielseitigkeit dieses einstufigen Assays zu zeigen, wurden Mikrokügelchen als ein Beispiel nicht-metallischer Partikel als wirksamer Teil des Signalentwicklungsmittels eingesetzt.
Gelb-grüne Fluoresbrite Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,21 Mikrometer wurden von Polyscience, Inc., of Warrington, Pennsylvania, bezogen und mit Protein A beschichtet durch Adsorption in carbonisiertem Puffer bei einem pH-Wert von 9,6 über Nacht. Die mit Protein A markierten Kügelchen wurden von ungebundenem Protein A getrennt, indem die markierten Kügelchen 30 Minuten lang bei 10 000 UpM in einer Sorval S-600 zentrifugentrommel pelletiert und in 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,2, gespült wurden. Vor der Verwendung wurde 2,5 % (Gew./Vol.) fettfreie Trockenmilch als Blockierungsmittel zugegeben. Dieses gefärbte und fluoreszierende Indikatormittel in Form von Mikrokügelchen wurde anstelle der mit Protein A markierten Goldpartikel gemäß Beispiel 5 unter Verwendung gleichermaßen hergestellter positiver und negativer Serumproben und unter Anwendung des gleichen Protokolls verwendet. Nach der Inkubation von 2,5 Mikroliter positiven Serums in Gegenwart von 1 Milliliter des Mikrokügelchen enthaltenden Signalentwicklungsmittels und der mit EIA- Antigen betropften Nitrocellulose entwickelte sich an der Antigenstelle eine leicht gelb-grüne Farbe, wohingegen an der Antigenstelle des parallel mit 1 Milliliter desselben Mikrokügelchen enthaltenden Signalentwicklungsmittels inkubierten negativen Kontrollserums keine gelb-grüne Färbung nachgewiesen wurde. Die reagierten Teststreifen wurden anschließend analysiert unter Verwendung von ultraviolettem Licht aus einem UVP, Inc., UV Transluminator. Ein sehr helles Fluoreszenzsignal wurde aus der EIA-Antigenstelle emittiert, welche mit dem positiven Serum inkubiert, nicht jedoch aus derjenigen, die mit dem negativen Serum inkubiert worden war. Die entsprechenden Antigenspots wurden anschließend fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Der Antigenspot, welcher mit dem positiven Serum inkubiert worden war, emittierte ein sehr helles Licht, wobei die Abgrenzung des Antigenspots scharf abgegrenzt war. Bei der Fluoreszenzmikroskopie wurde im Hintergrund etwas über die Nitrocellulose verlaufende Streufluoreszenz beobachtet. Eine mikroskopische Untersuchung des mit dem negativen Serum inkubierten Antigenspots zeigte als Zeichen einer negativen Reaktion lediglich gestreute nicht-spezifische Reaktionen auf der Oberfläche der Nitrocellulose. Fluoreszenz kann eingesetzt werden, um eine Reaktion zu amplifizieren.
Mikrokügelchen, auch als monodispergierte Mikropartikel bezeichnet, können in einer Vielzahl von Größen, Farben, organischchemischer Zusammensetzung und fluoreszierenden Farbstoffen mit Protein A vormarkiert erhalten werden und sollten in diesem Assay in Signalentwicklungsmitteln geeignet sein.

BEISPIEL 10

In diesem Beispiel wird die Anwendung des erfindungsgemäßen einstufigen Assays zum Nachweis von Antikörpern veranschaulicht, die für komplexe Mikroorganismen spezifisch sind.
Brucella abortus, ein wichtiges bakterielles Pathogen für Rinder, infiziert einen weiten Bereich von Säugerwirten einschließlich Rinder, Büffel, Elche, Ziegen und den Menschen. Dieser Mikroorganismus wurde als Beispiel für ein komplexes Antigenziel ausgewählt. Das Antigen, ein Rohextrakt aus B. abortus, welcher gemäß den von dem United States Department of Agriculture (USDA) veröffentlichten Verfahren hergestellt wurde und als "buffered brucella card Testantigen" bekannt ist, wurde 1:80 mit 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,4, verdünnt und Mengen von jeweils 1 Mikroliter wurden auf das Nitrocellulosepapier aufgebracht, um das Festphasen-Testantigen zu bilden. Das Antigen wurde 1 Stunde lang bei 70ºC getrocknet. Zur Durchführung eines jeden Tests wurde ein Streifen Nitrocellulosepapier, der den Antigenfleck enthielt, gemeinsam mit 1 Milliliter mit Protein A beschichtetem Kolloidgold-Signalentwicklungsmittel und 2,5 % (Gew./Vol.) fettfreier Trockenmilch, wie in Beispiel 5 beschrieben, in ein Teströhrchen überführt. Um das Assay durchzuführen, wurde einem der präparierten Teströhrchen 2,5 Milliliter Serum einer als seropositiv bekannten Kuh zugegeben, und 2,5 Milliliter Serum einer als sero-negativ bekannten Kuh wurde als Kontrolle einem zweiten präparierten Teströhrchen zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubationszeit bei Raumtemperatur erschien ein roter Spot an der mit dem als positiv bekannten Serum inkubierten Antigenstelle als Zeichen eines positiven Testergebnisses, während die mit dem als negativ bekannten Serum inkubierte Antigenstelle als Zeichen eines negativen Testergebnisses ungefärbt blieb. Dieses Assay wurde dreimal mit denselben Testergebnissen wiederholt.
Aus dem obigen Beispiel ist ersichtlich, daß rohe Antigenaufbereitungen aus komplexen Mikroorganismen in diesem einstufigen Assay als Antigene funktionieren können. Dieselben Reagenzien können bei Seren von unterschiedlichen Spezies erfolgreich angewendet werden. Aus den obigen Beispielen kann geschlossen werden, daß das beschriebene Assay bei gereinigten Antigenen, Viren als Antigene und sehr komplexen Quellen für Antigene wie Mikroorganismen funktioniert.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird an ein Assay-Verfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines Bindungsmittels gedacht, welches mit einer Akzeptorsubstanz spezifisch reagiert, wobei die Akzeptorsubstanz an eine feste Phase geknüpft ist, indem eine Test-Probe, die das Bindungsmittel enthalten kann oder auch nicht, mit der lokalisierten Akzeptorsubstanz in Gegenwart einer Markersubstanz, die mit dem Bindungsmittel verknüpft ist, in Kontakt gebracht wird. Dieses Vorgehen liefert eine markierte Indikation an der lokalisierten Stelle auf der festen Phase, wenn das spezifische Bindungsmittel in der Test-Probe vorhanden ist, zeigt aber keine markierte Indikation, wenn das spezifische Bindungsmittel nicht in der Test-Probe vorhanden ist. Obgleich unter Bezugnahme auf den Antigen-Antikörper-Immunoassay-Test bereits ausgeführt, wird davon ausgegangen, daß der Erfindungsbereich sich unter diesem Aspekt der Erfindung auf andere Systeme ausweitet. Typischerweise haben eine Vielzahl von Polypeptiden, einschließlich Proteinen, Enzymen, Hormonen und dergleichen eine spezifische Tertiärstruktur, durch die eine definierte Erkennungs- oder aktive Bindungsstelle geschaffen wird. In einigen Fällen beeinflussen eine Vielzahl anderer Einflüsse wie Substrathemmung und kompetitive Hemmung die Bindung vielfältiger Substanzen an die Polypeptide, aber in anderen Fällen sind die Substanzen für ein anderes Polypeptid oder eine andere Substanz für die Bindung an die aktive Stelle spezifisch. Typisch für derartige Fälle sind ein Protein eines Peptids, welches für einen Virus oder einen anderen Mikroorganismus spezifisch ist, und ein Kohlenhydrat, das für einen Mikroorganismus oder bestimmte Bestandteile gewisser biologischer Gewebe charakteristisch ist. Demgemäß bilden all diese Antigene oder weisen die Fähigkeit auf, spezifische Antikörper zu erzeugen, welche dann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen oder quantifiziert werden können. Damit stellt es ein einfaches und zuverlässiges Testverfahren für Viren bereit, die menschliche Pathogene sind, wie Rubella-Virus, Herpes-Virus einschließlich Herpes simplex, Herpes zoster, Cytomegalo-Virus oder Epstein Barr-Virus, das AIDS-Virus einschließlich den HIV-, LAV- oder HTLV-III-Viren. Ferner sind Tests für Viren eingeschlossen, die tierische Pathogene sind wie das feline Leukemia-Virus oder das Equine Infectious Anemia Virus, sowie für Mikroorganismen, die entweder für Menschen oder Tiere pathogen sind wie Brucella abortus, Toxoplasma gondii und dergleichen. Das Antigen kann ferner ein normaler oder aberranter Bestandteil des Blutserums oder anderer Gewebe sein. Als solches ist das Antigen aus normalen Quellen, die von infizierten Zellen gebildet sind, oder synthetisch erhältlich durch chemische Synthese oder rekombinanter DNA-Techniken, um synthetische Antigene wie Polypeptide oder Kohlenhydrate zu bilden.
Für ein diagnostisches Kit ist es lediglich notwendig, in geeigneter Weise betropfte Nitrocellulosestreifen mit in geeigneter Weise identifizierten Antigenspots sowie ein Behältnis mit einem markierten suspendierten partikelförmigen Signalentwicklungsreagens und ein Hilfsmittel zum Erhalt einer geeigneten Test-Probe an klinischer Flüssigkeit herzustellen. Saubere Teströhrchen oder andere geeignete Behältnisse werden wie gefordert zur Verfügung gestellt. Damit wird in angenehmer Weise ein immuncytochemisches Assaykit zur Felddiagnose hergestellt sowie ein erfindungsgemäßes Verfahren für menschliche oder tierische Rassen bereitgestellt. Gleichfalls wird ferner ein diagnostisches Kit für ein professionelles Laboratorium bereitgestellt. Der einzige Schritt für den Praktiker besteht in der Zugabe einer vorher bestimmten Menge Assay-Flüssigkeit wie Blutserum und anschließend Ablesen des visuell erscheinenden Ergebnisses nach einer angemessenen Inkubationsdauer, wie sie für jeden Testtyp vorher festgelegt wird.

Claims

1. Ein Immunoassay-Verfahren zum Analysieren einer Test-Probe zum Nachweis von Test-Antigen-spezifischen Antikörpern in Gegenwart von nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern, welches umfaßt:

- Binden einer detektierenden Menge von wenigstens einem bekannten Test-Antigen an eine lokalisierte Stelle auf einem Festphasen-Substrat;

- Eintauchen des genannten Festphasen-Substrates, an welches das genannte Antigen gebunden ist, in ein Signal-entwickelndes Reagens, das sowohl gegenüber den genannten Test-Antigen-spezifischen Antikörpern als auch gegenüber den genannten nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern ausreichend reaktiv ist, um sowohl die Test-Antigen-spezifischen Antikörper als auch die nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörper zu markieren:

- Zugeben der Test-Probe, welche sowohl Test-Antigen- spezifische Antikörper als auch nicht-Test-Antigen- spezifische Antikörper enthält, zu dem genannten Signal-entwickelnden Reagens und dem genannten eingetauchten Festphasen-Substrat, an welches das genannte Test-Antigen gebunden ist, Inkubieren in einem einzigen Schritt, um eine einzige Reaktionsmischung zu bilden, Inkubieren der genannten Mischung, und Nachweisen eines Signals, das durch das genannte Signal-entwickelnden Reagens produziert wird, in der genannten Reaktionsmischung, wobei ein positives Ergebnis für Test-Antigen-spezifische Antikörper in der genannten Test-Probe durch Lokalisierung des genannten Signals in der genannten Reaktionsmischung an der genannten Substrat-gebundenen Test-Antigen-Stelle angezeigt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das bekannte Antigen als ein Blot oder eine Vielzahl verschiedener Antigen-Blots, die einer vom anderen getrennt auf einem geeigneten Festphasen- Substrat aufgetragen ist.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem das genannte Substrat ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus Nitrocellulose, Nylon, ZETA-PROBE , APT(2-Aminophenylthioether)polystyrol, GENE SCREEN , diazotierte Membran, Blot- Adsorbens-Membran, Kügelchen, Röhrchen und Objektträgern ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das genannte Substrat Nitrocellulose ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Signal-entwickelnde Reagens ein Komplex aus einer Detektorsubstanz und einem Liganden ist, welcher die genannte Detektorsubstanz sowohl an die genannten Test-Antigen-spezifischen Antikörper als auch die genannten nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörper bindet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der genannte Ligand aus Protein-Liganden und Anti-Antikörpern ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der genannte Ligand ein aus Staphylokokken-Protein A und -Protein G ausgewählter Protein-Ligand ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der genannte Ligand Staphylokokken-Protein A ist.

9. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die genannte Detektorsubstanz aus kolloidalen Metallsolen, radioaktiv markierten Substanzen, fluoreszierendem Material, Enzymen und Kombinationen von einem oder mehreren solcher Detektorsubstanzen ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die genannte Detektorsubstanz ein kolloidales Metallsol ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Metall des genannten kolloidalen Metallsols aus Metallpartikeln und Metallverbindungen, die aus Platin, Gold, Silber, Kupfer, Silberiodid, Silberbromid, Kupferoxidhydrat, Eisenoxid und Eisenhydroxid ausgewählt werden, ausgewählt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das genannte kolloidale Metallsol ein kolloidales Goldsol ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Partikel des genannten kolloidalen Goldsols eine Partikelgröße im Bereich von etwa 5 bis etwa 150 nm Durchmesser aufweisen.

14. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die genannte Detektorsubstanz ein fluoreszierendes Material ist, welches ein Polymer-Mikrokügelchen mit einem fluoreszierenden Färbemittel ist.

15. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das genannte Signal-entwickelnde Reagens in einer Konzentration vorliegt, die ausreicht, um im wesentlichen alle sowohl der genannten Test- Antigen-spezifischen Antikörper als auch der genanten nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörper zu binden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Detektorsubstanz des genannten Signal-entwickelnden Reagens ein kolloidales Metallsol ist, welches in einer Konzentration für die Gesamtoberfläche des genannten Metalls vorliegt, um etwa 0,5 bis etwa 50 ug des genannten Liganden pro Milliliter des genannten kolloidalen Metallsols zu binden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das genannte kolloidale Metall in einer Konzentration vorliegt, um etwa 1,0 bis etwa 50 ug des genannten Liganden pro Milliliter kolloidalen Metallsols zu binden.

18. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Menge der genannten Test-Probe, die in der genannten Immunoassay-Methode verwendet wird, im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 ul liegt.

19. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Inkubieren für eine Dauer von etwa 0,25 bis etwa 24 Stunden und bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 40ºC durchgeführt wird.

20. Verwendung eines diagnostischen Kits, welches umfaßt:

(a) ein festes Substrat, an welches eine detektierende Menge wenigstens eines bekannten Test-Antigens an einer lokalisierten Stelle gebunden ist,

(b) eine darin enthaltene Menge eines Signal-entwickelnden Reagens, das sowohl gegenüber den genannten Test-Antigen-spezifischen Antikörpern als auch gegenüber den genannten nicht-Test-Antigen-spezifischen Antikörpern reaktiv ist,

wobei die Inkubation des genannten Substrates mit der genannten Test-Probe in der Gegenwart des genannten Signalentwickelnden Reagens die Bildung eines Signals an der genannten Stelle als ein positives Ergebnis für die genannten Test-Antigen-spezifischen Antikörper verursacht, wenn das Antigen, das an der lokalisierten Stelle des genannten festen Substrates gebunden ist, ein Test-Antikörper-spezifisches Antigen ist, und die genannte Stelle als ein negatives Ergebnis für die genannten Test-Antigen-spezifischen Antikörper frei von einem Signal ist, wenn das Antigen, das an der lokalisierten Stelle des Substrates gebunden ist, ein nicht-Test-Antikörper-spezifisches Antigen ist,

zur Durchführung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 1 bis 19.