DE2614393C3 - Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents
Aminozucker-Derivate und diese Verbindungen enthaltende ArzneimittelInfo
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Description
ΗΟΗ,Γ
in der n\ und n? für eine Ziffer von 1 bis 7 stehen
können, die Summe von m und ßj jedoch imn.
einen Wert von 2 bis 8 besitzt.
einen Wert von 2 bis 8 besitzt.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin n\ 2 und /72 I
ist. zn
3. Verbindung nach Anspruch ! worin n-, 2 und n-£ 2
ist.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin /Ji 2 und n2 3
ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Aminozukker-Derivate und, die diese Aminozucker-Derivate als
Wirkstoffe enthalten.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales Inhibitoren für Glycosidhydrolasen
bilden, wobei man je nach den Züchtungsbe-
CH,Oll
O -^ ^-O
HO HO
HO HO
IK) OH
HOH2C
in der
Πι und Π2 für eine Ziffer von 1 bis 7 stehen können, die
Summe von n% und nj jedoch stets einen Wert von 2 bis 8
besitzt.
Je nach dem Wert der Summe von iu +112 besitzen
diese Aminozucker-Derivate überwiegend amylase- bzw. saccharasehemmende Wirkung. So sind Aminozukker-Derivate,
die gezielt zur Hemmung der Amylase eingesetzt werden können, solche mit n, + m = 4 bis 8.
insbesondere mit n, + n2 = 4 und 5. Aminozucker-Derivate,
die gezielt /ur Hemmung der Saccharase eingesetzt werden können, sind solche mit n>
und n? = 2 bis 3, insbesondere bevorzugt mil n<
= 2.
Es wurde weiterhin gefunden, daß überraschenderweise
Aminozucker-Derivaie mit H\ + ni = 2 bis 3,
insbesondere mit ii\ = 2 in vivo eine starke Hemmung
des SlarkeabbäUS zeigen.
Die Herstellung der erfindungsgemüßen Afflinozukker-Derivale
erfolgt durch Züchtung von Stämmen der Ordnung Actinomycetales, insbesondere der Familie
Actirioplanaceae in an sich bekannter Weise und durch anschließende Auftrennung und Isolierung der einzel·
N
H
H
H1C
HO
-O
OH
HO
5. Verbindung nach Anspruch 1, worin n\ 2 und 02 4
ist
6. Arzneimittel enthaltend Verbindungen gemäß Anspruch 1.
7. Arzneimittel enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 2.
8. Arzneimittel enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 3.
dingungen Inhibitoren mit überwiegender Amylase- oder Saccharase-Hemmwirkung erhält (s. hierzu die
USA-Patentschriften 38 76 766. 38 55 066 und 38 79 546).
Gefunden wurden nun die neuen Aminozucker-Derivate der allgemeinen Formel I
Il | ,C | - O | O ■ | HO | ( | H2OH | |
I | |||||||
N | OH | ^,() | |||||
H | \ | ||||||
I | IO | HO O |
|||||
nen Verbindungen in ebenfalls an sich bekannter Weise.
Aminozucker-Derivate mit Werten der Summe von
Πι + Hi von 2 bis 4 können weiterhin durch chemische
-,n oder enzymatische Hydrolyse höhermolckularcr Aminozuckerderivate
erhalten werden
Als zur Herstellung der erfindungsgemäßen Amino zucker-Dcrivate τη Frage kommende Stämme der
Ordnung Actinomycetales seien beispielsweise genannt
v, SE 50 (CBS %l 70). SO 18 (CBS 957.70) und SE 82 (CBS
615.71), sowie Mutanten oder Varianten dieser Stämme.
Besonders gut geeignet erwiesen sich dabei im Hinblick auf die Ausbeute an erhaltenen Anunozucker-Dcrivaten
die Stämme SE 50/13 (CBS 614 71) und SE 50/110(CBS
Mi 674.73). Beide Slämme entsprechen in ihrer Beschrei
bung weitgehend dem ElicrnslaiHm SE 50 (CUS 971.70),
aus dem diese Slämmd durch natürliche Selektion ohne
Anwendung von Miitügenen gewonnen werden.
Zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet man
Zur Züchtung der Mikroorganismen verwendet man
61; feste oder flüssige, insbesondere flüssige, wäßrige
Nährboden, die die an srt'h bekannten Ausgangsstoffe für Kohlenstoff und Stickstoff. Salze und Anlischaum
millcl in den üblichen Konzenirationcn enthalten.
Als Ausgangsstoffe für Kohlenstoff dienen vorwiegend
Kohlenhydrate, insbesondere Stärke, Maltose, Glucose sowie komplexe Stoffgemische wie beispielsweise
handelsüblicher Malzextrakt
Als Ausgangsstoffe für Stickstoff kommen die an sich bekannten komplexen Stoffgemische wie beispielsweise
Kaseinhydrolysat, Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt sowie Mischungen
dieser Ausgangsstoffe in Frage, ebenso wie einzelne Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze als Stickstoff- to
quellen verwenden werden können.
Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt aerob in belüfteten Schüttelkulturen oder in den üblichen
Behälterkulturen.
Art und Konzentration der für Kohlenstoff eingesetzten
Ausgangsstoffe beeinflußt in Verbindung mit dem jeweiligen zur Fermentation verwendeten Stamm die
Art des überwiegend gebildeten Endproduktes.
So werden beispielsweise in Nährlösungen, die Stärke über 2 Gew.-0A enthalten, vor allem Verbindungen mit
Π ι η. Λ Kir Q nnk-Mnt Cm. Α',η Un^>-,JI>i»ff A\r*r-nv
I T UJ — -r UU \J 51.UIIUV.I. I Ul UtV. 1 11V.I StUtIUlIg lil\.3l.l
Aminozucker-Derivate mit Π\ + n2 = 4 bis 8 ist der
Stamm SE 50/13 (CBS 614.71) besonders gut geeignet.
Enthält die Nährlösung hinreichend Glucose (ca. 3.5 Gew.-%) so reichen jedoch bereits 0,1 bis 3 Gew.-%
Stärke, um überwiegend Gemische von Aminozucker-Denvaten
mit Πι + nj = 4 bis 8 zu erhalten. Sämtliche
dieser so erhaltenen Aminozucker-Derivate können als Ausgangsverbindungen für die Herstellung der niederen
Homologen auf dem Wege der chemischen oder jo enzymatischen H 'dcolyse verwendet werden.
Aminozucker-Derivate mit n, + n2 = 2 bis 4 werden
in überwiegendem Maße erhalten, wenn man in stärkefreien Nährlösungen arbeitet. Besonders günstig
wirkt sich hierbei die Zugabe .on Maltose zur j-,
Nährlösung aus. So erhält man beispielsweise bei Zugabe von Mallose und unter Verwendung des
Stammes SE 50(CBS 961.70) Gemische von Aminozukker-Derivaten,
mit überwiegend n, + /7? = 2 bis 3. Die
Bildung eines Aminozucker mil n\ = 1 wird insbeson- w
derc dadurch erreicht, daß man als Ausgangsmaterial für Kohlenstoff nur Glucose verwendet. Zu beachten ist
hier jedoch, daß bei einem Überschuß an Glucose bei längerer Fcrmentalionsdauer auch die höhermolekularen
Aminozuckerderivatc gebildet werden. 4-,
Verwendet man Nährlösungen, die keine Glucose enthalten und gibt als alleinigen Ausgangsstoff für
Kohlenstoff Maltose hinzu, so erhält man überwiegend den Aminozucker mit n\ + η; = 2. In einer technisch
vorteilhaften Ausführiingsform kann man dabei die ;o
reine Maltose durch ein billigeres Produkt ersetzen, wie
τ. B. Malt/in, einen natürlichen handelsüblichen Malzextrakt.
Als besonders geeignet fur die Herstellung von Amino/ucker-Derivalen. die überwiegend solche Deri -,·,
vale mn π. t rij - 2 bis 3 enthalten, erwies sich der
Stamm Sf 50/110(CBS 674.7 3).
Dieser Stamm ergibt Ausbeulen an niedermolekularen Aminozucker Derivaten, die eiwa zweimal so groß
sind wie die mn dem Stamm SI 50/13 (C BS 614.71) ho
erhaltenen.
Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt im
allgemeinen bei Bebrülungstempcraturert zwischen 15
bis 45°C. vorzugsweise zwischen 24 bis 32OC. So erhält
man bei Verwendung der Stämme SE 50 (CBS 961.70)
oder SE 50/13 (CDS 614.71) Aminozucker-Derivate mit
/»ι + lh = 4 bis 8 bei einer höheren Temperatur, z. B. 28°C, während bei niedrigen Temperaturen z. B. 24°C,
beispielsweise die die Stämme SE 50 (CBS 961.70) und SE 50/110 (CBS 674.73) in überwiegendem Maße
Aminozuckerderivate mit Πι + n2 = 2 bis 3 bilden.
Die Kulturdauer beträgt im allgemeinen 1 bis 8 Tage, vorzugsweise 2 bis 6 Tage. Eine längere Kulturdauer,
insbesondere in Verbindung mit Kohlenhydratüberschuß im Nährmedium, begünstigt die Bildung von
Aminozucker-Derivaten mit höheren Werten von πι + n2.
Der pH-Wert des Kulturmediums variiert im allgemeinen zwischen 5,0 bis 8,5, wobei pH-Werte von
6,0 bis 7,0 bevorzugt werden.
Der Endpunkt der Fermentation erfolgt im allgemeinen
durch Bestimmung des Gehaltes an Hemmaktivität i-.Ti enzymatischen Hemmtest sowie durch dünnschichtchromatografische
Bestimmung der Zusammensetzung des Fermentationsmediums.
Im Falle der chemischen Hydrolyse höhermolekularer Aminozucker-Derivate zur Herstellung von niedermolekularen
wie bereits vorstehend erwähnt, geht man im allgemeinen in der Weise vor, daß man die
höhermolekularen Aminozucker-Derivate mit 1 bis 5 normalen wäßrigen ivlineralsäuren bei Temperaturen
von 50 bis 100° C. insbesondere von 90 bis 1000C 10 bis
180 Minuten behandelt. Die ebenfalls mögliche enzymatische Hydrolyse erfolgt im allgemeinen durch Inkubation
mit Ezymen {Hydrolasen), insbesondere mit /?-Amylasen oder nicht hemmbaren <x-Amylasen oder
Amyloglucosidasen mikrowellen Ursprungs, wie beispielsweise
vAmylasen aus B. subtilis. oder durch Inkubation mit Mikroorganismen, die in Nährlösungen,
welche die höhermolekularen Aminozucker-Derivate in Gehalten von 1 bis 10%. vorzugsweise 2 bis 5% als
vorzugsweise alleinige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen vermögen, beispielsweise Aspergillus niger
(ATCC 11J94).
Die Auftrennung und Isolierung der einzelnen erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate geht aus
entweder von den mikrobiologischen Kulturbrühcn oder von den Hydrolysaten bzw. Inkubationsgemischen,
in denen der enzymatische und/odfc»· mikrobiologische
Abbau der höhermolekularen Aminozucker-Denvaie durchgeführt wurde.
)e nach den Werten für Πι + n2 erfolgt die
Aufarbeitung in urierschiedlicher Weise. So geht man
zur Reindarstellung der Aminozucker Derivate von Π\ + r>i = 2 bis 4 im allgemeinen in der Weise vor. daß
man. gegebenenfalls nach vorheriger Abtrennung des Myccls. die betreffende Kulturbrühe oder das Hydroly
sat mit Aktivkohle bei neutralem pH behandelt,
anschließend die so an die Aktivkohle gebundenen Aminozucker-Derivate durch Behandlung der Aktiv
kohle mn wäßrigen Alkoholen oder Aceton. Vorzugs weise 50 bis 80%igem Aceion, desorbiert. Besonders
vollständig gelingt dabei die Desorbtion bei sauren pH-Werten im Bereich von pH 1.5 bis 4. vorzugsweise
von pH 2 bis 3
Falls die aufzutrennenden Kulturbrühcn bzw. Hydro
lysate sehr dunkel gefärbl sind, hai es sich als vorteilhaft
erwiesen, sie vor der vorstehend beschriebenen Behandlung mit Aktivkohle bei saurem pH zunächst mit
Aktivkohle oder Absorbtionsharzen wie dem handelsüblichen Lewapol® Ca 9221 (0,35 mm Körnung bei
pH-Werten von pH 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 3 zu behandeln und so eine Entfärbung zu erreichen. Die
Aktivkohle bindet dabei im sauren Bereich bevorzugt nur die Farbstoffe, nicht jedoch die Aminozucker-Dcrivale.
Die Abtrennung der einzelnen erfindungsgemäßen
Aminozucker-Derivate aus dem wie vorstehend be
schrieben erhaltenen Aktivkohle-Desorbat erfolgt dann im allgemeinen in der Weise, daß man dieses Desorbat
über an sich bekannte stark saure Kationenaustauscher wie z. B. Dowex® 50 W leitet (pH 1 bis 8, vorzugsweise
pH 2 bis 4; bei niedriger Ionenstärke, entsprechend einer Leitfähigkeit
< 10 mS - cm"1, vorzugsweise
< 2mS-cm-'). Die einzelnen Aminozucker-Derivate
werden dabei an den Kationenaustauscher gebunden. Besonders vorteilhaft lassen sich dabei die Aminozukker-Derivate
aus acetonischer Lösung (50 bis 80% Aceton, pH 1 bis 5, vorzugsweise pH 2 bis 4) an solche
Kationenaustauscher binden.
Die selektive Desorption der erfindungsgemäßen Aminozucker-Derivate von diesen Kationenaustauschern
erfolgt dann im allgemeinen unter Verwendung von wäßrigen Säuren oder Basen als Elusionsmittel,
wobei man vorzugsweise Ammoniak oder Salzsäure in Konzenirationen von 0,0i bis 1 Vai/Liier verwendet.
Aus den einzelnen Desorbaten r/ird dann das
fcetreffende Aminozucke --Derivat nach Neutralisierung lies Desorbats mit einem schwach sauren bzw. basischen
Austauscher oder nach Entfernen der Base bzw. Säure durch Abziehen im Vakuum im Falle von flüchtigen
Basen oder Säuren nach Einengen der Lösung durch Lyophilisation oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln,
vorzugsweise mit Aceton erhalten.
Weiterhin ist es möglich, niedermolekulare Aminofcucker-Derivate
von inerten Sacchariden durch Chromatographie an Austauschern auf Cellulosebasis,
vorzugsweise Phosphor-Cellulose, abzutrennen. Als Laufmittel werden dabei Puffer, vorzugsweise Phosphatpuffer,
von geringer lonenstärke, vorzugsweise 2 bis 100 mM. insbesondere 5 bis 10 mM, im pH-Bereich a
von 2,5 bis 8, vorzugsweise 5 bis 6. verwendet. Voraussetzung für eine effektive Fraktionierung sind
dabei möglichst geringe Salzgehalte in den zu fraktionierenden Praparationen, deren FarbstotTe weniger
stören.
Zur Reindarstellung der einzelnen Aminozucker-Derivate Chromatographien man dann die vorgereinigten
Präparate, über ein geeignetes Molekularsieb, τ. Β.
Bio-Gel® P-2 und untersucht die Fraktionen des F.luaiei.
dünnschichtchromatographisch. Fraktionen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen rein enthalten, werden
vereinigt, rechromatographiert und schließlich nach Einengen lyophilisiert oder mittels organischer Lösungsmittel,
wie oben beschrieben, gefällt.
Alle Aminozucker-Derivate sind dadurch gekennzeichnet,
daß bei saurer Totalhydrolyse 'Komponente Γ /C13H19O7N7 sowie Glucose gebildet werden. Für
'Komponente Γ wurde nachstehende Strukturformel hergeleitet.
OH
HO
(Komponente I)
OH
H C OH
C'H.,
C'H.,
Die Substanz mit nx + n2 = 3 erhält man in zwei
isomeren Formen, wobei eine der beiden isomeren Formen überwiegend gebildes wird.
Das in größeren Mengen vorhandene isomere Produkt ist die Verbindung O-(4,6-Bisdesoxy-4-[IS-
(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-4-O-a-D-gIucopyranosyl-(
1 — 4)-cyc!ohex-2-en-1 -ylamino]-a- D-glycopyranosyl}-(l
— 4)-0-a-D-glucopyrar<osyl-(l ->4)-D-glucopyranose
der konformativen Formel:
HO
HO
HO
TS
CH2OH
OH
HO
CH, CH2OH
(H)
Dieses Isomerr neigt auf Kieselgelfertigplatten unter Verwendung von n->Bu(anol, Äthanol und Wässer im
Verhältnis Von 50;30:20 Rciuco^Werte von 0,41 bis
0,46. Die Struktur der Formel II läßt sich nachweisen, indem man die Produkte aus dem hydrierenden Abbau
(PalladiumAAktivköhle) analysiert. Es gehören zu diesen
Abbauprodukten: copyranosyI)-(l-»4)-O-»\-D-gIucopyranosyl-(l-*4)-D-
3-Hydroxymethyl-4.5.6 liihydroxy-4-O-i\-D-glucopy- glucopyranose und Glucose.
ranosyl-(1)-hexan. O-(4 amino-4.6-bisdesoxy<vÜ-glu
(H2OII (IKOIl CM,
CUjOM
CH2OM
O ! · O O O
HO O jN ()'.·()· -OH
HO OH !HO OH HO OH HO OH HO OH
(H2OH CIUOII CII., CH2OH ClI2OIl
- O > \θ /-0 ν>
O
PdCH2 HO -O - ν · H2N (
> -0- < / -O \ ,>
OH
HO OH HO OH HO OH HO OH HO OH
ClUOH
^O
HO · > OH
HO OH /
In weiteren Untersuchungen wurde die Verbindung II mit πι + Π2 — 3 nach bekannten Methoden methyliert.
hydrolysiert, mit Natriuiiiborhydrid reduziert, acetyliert Ji
und gaschromatographisch analysiert. Die Verbindung der Formel II liefert l^j-Tri-O-acetyl^.e-tri-O-methyl-D-glucito!
und U-Di-O-acetyl-ZJ^.ö-tetra-O-niethyl-D-glucitol
im Molverhältnis von 2:1.
Die Verbindung der Formel II läßt sich von den Isomeren chromatort«phisch an einem sauren Austaubennar/
mil 0,025 π rvai/saure ais Eiuiionsmiuei
trennen.
Die höheren Glieder der Reihe, die 4 bis 8 Glucoseeinheilen mit Molgewichten von 969 bis 1617 4->
enthalten, vermögen Saccharase weniger zu hemmen.
Bei der sauren Hydrolyse dieser höheren Glieder lassen sich die jeweils niederen Komponenten als
Zwischenprodukte zusammen mit Glucose und Maltose nachweisen.
Dünnschiehtchromatographie unter Verwendung von n-ButanoI. Äthanol. Wasser im Verhältnis 50 : 30 : 20 auf
F 1500 Kieseigelplatten ergib! Rr,iw,w- Aerte von
ν · "hci'en)-μ·L-.ihei'en):
und
0.30-0.34 | 4f; |
021-02! | if, |
0.14-0 lh | h(, |
0.09 -0.1 ' |
Wie bc den niederen <
·
totale Sd!.re Hydrolyse Ki
diskreten Mißverhältnisse-
und i : 8. (wobei die GIuOi-83J<Vr,.8f).5°>. bzw,. 89.1 >o s
totale Sd!.re Hydrolyse Ki
diskreten Mißverhältnisse-
und i : 8. (wobei die GIuOi-83J<Vr,.8f).5°>. bzw,. 89.1 >o s
Bei der Dünnschicht, hr.
dung mn F 1500 K ic s
Äthanol. Wasser im V-Lösungsmittel werden
dreifachen Fntv.itklung b
dung mn F 1500 K ic s
Äthanol. Wasser im V-Lösungsmittel werden
dreifachen Fntv.itklung b
ede i dieser Reihe ergibt die
.Tipo'ie Me I und Glucose in
-. nar-.iich 1 4. 1 5. 1 : 6. 1 : 7
epr'j/.entsät/e 74 4% "9.7%
nd)
malographie unter Verwen
cigeiplatten mit n-Butanol.
hähnis von 45 : 35 : 20 als
•igende Ri-Werte bei der
Verhältnis
Glucose .'Komponente I
Standard
Rr-Wert
Glucose | 0,77 |
Maltose | 0,65 |
Maltotriose | 0,51 |
Maltotetraose | 0,39 |
Maltopentäose | 0,27 |
0,25 | |
Maltohexaose | 0,21 |
0,18 | |
Maltoheptaose | 0,15 |
0,13 | |
Maltooctaose | 0,11 |
0,09 | |
0,07 |
f.benfalls zeigt die oben beschriebene katalytische Hydrierung, daß einige aber nicht alle Glucoseeinheiten
diener höheren Glieder in 4-Stellung der Cyclohexengruppe
gebunden sind.
Da diese Verbindungen lineare Oligoglucosidketten mn 1 — 4 Bindungen enthalten, können sie als Substrate
für gewisse Kohlenhydrat-abbauende Enzyme Verwendung finden. Der Bereich der Enzyme ist offenbar auf
solche beschränkt, die nicht wesentlich durch die Verbindungen gehemmt werden.
Bakterielle und püzaruge -v-Amylasen können zum
Abbau jeder Oligoglucosidkette verwendet werden, die 3 oder mehr Glucoseeinheiten enthalten und niedermolekulare
Verbindungen und inerte Saccharidfragmente
wie / B. Maltose und Mallotriose ergeben Dieses
Abbaiiverfahrcn ist auf die Verbindungen mit
Πι + n> >
i anwendbar und stellt einen weik-ien
Beweis ftir die \. l-»4 Bindung dar F.rfindiingsgeinhfie
Verbindungen mit 4 bis 7-Glticoseeinhc-iten sind .nah
teilweise durch /J-Amylase abbaubar. Da /f-Am\liise
Maltoseeinheiten von dem nichtreduzierenden \'.\\>\e
einer Glticosekellc mit x. I-»4 Bindungen abspültet,
liefert sorgfältige Analyse der ,i-Amylaseabbauprnduk
tie wertvolle Information übur jeden an der 4-Stelliing
#es Cyclohexenrings gebundenen Oligoglucosidsubsti-
!0
luenten. insbesondere über seine Ketienlänge. und die
Zahl der Glucosen in der an der Bisdcsoxyglucnse
gebundenen Kette, d. h. in dem rcdu/ierenden Finde der
Verbindung Die 4Λή.7 iuler 8 Glucosueinheiiert
enthaltenden Verbindungen sind jedoch nicht völlig abbaubar durch /J-Amylsise. Der Resistenz eines Teils
der Verbindungen isi offensichtlich unzureichenden Struktiirbedinj'iingen fur den ,i Amylaseangnff zuzuschreiben.
Die Ergebnisse des β Ainjlaseabbaus können folgendermaßen
zusammengefaßt werden.
Zahl der Glucose- cinheiten im Aus* gangsmaterial |
Zahl der Glucose einheiten in Ab- bau|)foduktion |
Entfernte Maltoseeinheilen |
4 | 4 2 |
C 1 |
5 | 5 3 |
0 1 |
6 | 6 4 2 |
SJ-O |
8 | 8 6 4 2 |
O I 2 3 |
7 | 7 5 3 |
O 1 2 |
Gegebenenfalls wird ein Teil des Ausgangsmaterials •riedergewonnen.
Bezüglich des /J'-amylolytischen Abbaus soll nochmals
ietont werden, daß /?-Amylase nur Maltoseeinheiten zu 4»
fntfernen vermag und diese auch nur von dem •icht-reduzierenden Ende eines Ologosaccharids. Es soll
termieden werden, daß irgendeine Theorie zu einer
tinschränkung führt. Obwohl die genaue Struktur dieser iöheren Verbindungen nicht völlig geklärt ist, ist nach αγ>
•feigen Befunden zu folgern, daß zu den Verbindungen •lit 4, 5, 6, 7 und 8 Glucoseeinheiten Derivate der
•federen Verbindung mit der Formel HI A gehören, •reiche Ketten mit 2, 3, 4, 5 und 6 Glucoseeinheiten
fnthalten, die cc, 1-»4 miteinander verbunden sind,
•robei die Oligosaccharidkette in Ä-Konformation mit
4er4-StelIung des Cyclohexenringes verbunden ist.
Methylierung der Verbindungen mit Methyljodid/Natriumhydrid
in Dimethylsulfoxid. totale Hydrolyse. Derivatisierung und anschließende gaschromatographi- v,
sehe Analyse ergibt das 2,3,6-TrimethyIglucoscdcrivat,
so daß die Glucoseeinheiten notwendigerweise I—4 in einer ausschließlich linearen Struktur verbunden sind.
Ein zweites Methylierungsprodukt, welches in Abhängigkeit von der methylierten Verbindung in verschiedenem
Maße oder unter Umständen gar nicht vorhanden ist, ist das 2,3,4,6-TetramethyIderivat. Das Vorkommen
dieses Derivats und sein Molverhältnis zu dem Trimethylderivat ist abhängig von dem an dem
Gyclohexenring gebundenen Substituenten.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln
und Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst. Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten,
die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glykosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen,
Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema
Amylase Multasc
Stärke bzw. Glykogen ♦ Mallose · Glucose
Sacchara.se
Saccharose - Glucose +■ F-ruklosc.
Saccharose - Glucose +■ F-ruklosc.
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt.
Bei Adipösen bewirkt die aiimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das
seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige
Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig
eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender
Speisebrei die Produktion von Magenwft fördern, der
seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines tllcus
ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.
Fs wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäßen
Amino/uckerderivate die aliiiientäre Hyperglykilmie.
Hyperinsulinämie und Hypoglykämie erheblich vermin
dem.
Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhy
drate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespülten werden und dadurch die Kariesbildting
gefördert wird.
Die erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate kön nen /ur Verhinderung bzw. Verminderung einer solchen
Karicsbildung eingesetzt werden.
In vitro ■ Amylasetest
weitere Saccharosespallung durch die Saccharase nicht
mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer au! 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung
') mit 0—20 (ig Inhibitor oder 0 — 20 μI der ^u testenden
Lösung versetzt und mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer
pH 6.0 auf 0.1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35"C
iiquilibrierl und dann mit 0,1 ml einer auf 35 C vorgewärmten 0.05 m Saccharoselösung in 0,1 m Nntriummaleinatpuffer
pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35"C und stoppt die Saecharasereaktion
durch Zugabe von I ml Glucoseoxidasereagcns !) ab
und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35"C. Danach wird
I ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen
entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzter1
Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SI E/g bzw.
..MIW ,WI1MIL1W IIIIIILMCWI L. 11 ■ I IW I 1 V
als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu
30% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten
angegebenen Teslbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μνβΙ
gespaltenen Bindungen werden als μνβΙ gebildeter
reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorime-Irisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve
als μ VaI Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20—22
AE/ml) mit 0— 10 μg Inhibitor oder 0—20 μΙ der zu
lcstenden Lösung in 0,4 ml 0.02 m Natriumglycerophos- jo
phatpuffer/O.OOI m CaCb pH 6,9 versetzt und etwa 10 — 20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C
äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35"C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich,
der Firma Merck. Darmstadt. Nr. 1252) bei 35°C inkubiert und anschließend mit I ml Dinitrosalicylsäure-Reagens
(nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwickking
wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml
destilliertem Wasser versalzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert
ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die
nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der
eingesetzten Amylase errechnet Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten
Λ 1 Π\ ΐρ( rlnf»»tinr.i QIF/I itPT iimcfprpr*hn*>t
;ig Inhibitor*) AE**)
*) Bezogen auf Trockensubstanz.
**) AE im nicht inhibierlen Ansalz der gleichen Serie.
**) AE im nicht inhibierlen Ansalz der gleichen Serie.
aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AI E/mg Inhibitor umgerechnet.
In vitro — Saccharasetest
Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu
50% inhibiert Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten
angegebenen Testbedingungen I μΜοΙ Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die μΜοΙ gebildete
Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine
Maltasetest
Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als
die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an
Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen I μΜοΙ Maltose in 2 μΜοΙ
Glucose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose werden
mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere
Maltosespaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer
auf 0.060—0.070 ME eingestellten Maltaselösung ') mit 0—20 μg Inhibitor oder 0— 20 μΙ der zu testenden
Lösung versetzt und mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf 0.1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C
äquilibriert und dann mit 0.1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0.05 m Maltoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer
pH 6.0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Maltasereaktion durch
Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens 2) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird
1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.
Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50%
Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MI E/Liter umgerechnet.
Die Ergebnisse der in vitro Enzymhemmtests für einzelne der erfindungsgemäßen Aminozuckerderivate
sind in nachstehender Tabelle I zusammengefaßt:
60
') Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa
nach B. Borgström. A. Dahiquist, Acta Chem. Scand. 12,
(1958). Seite 1997. Mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
2) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg
Glucoseoxidase (Fa. Boehringer Nr. 15423) in 100 ml 0.565 m
Tris-HCl-Puffer pH 7.0 und anschließenden Zusatz von 1 ml
Detergenslösung(2g Triton X 100 + 8 g 95% Äthanol p. a.),
1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin · 2 HCI in 20 ml H2O) und 0,5 ml 0.1 %iger wäßriger Peroxidaselösung
(Fa. Boehringer Nr. 15302) hergestellt
·) Solubilisierte Maltase aus Schweinedünndarmmucosa nach
B. Borgström. A. DahlquisL Acta Chem. Scand. 12. (1958).
Seite 1997. Mit 0.1 m Natriummaleinatpuffer pH 6.0 auf
entsprechenden ME-Gehalt verdünnt.
-) Bereitung des Glucoseoxidasereagens: wie beim Sacchara seiest. S. 30. Fußnote 2), beschrieben.
-) Bereitung des Glucoseoxidasereagens: wie beim Sacchara seiest. S. 30. Fußnote 2), beschrieben.
13 | 26 14 393 | Saccharase- Inhibition |
14 | Mallase- Inhibition |
|
Tabelle 1 | SIF./g | MlF./g | |||
Formel | Zahl der Olueose- einheiten |
ίτ-Amylase Inhibition |
21000 | 5000 | |
AIF/g | 8 500 | - | |||
II | 3 | 1 400 000 | 2 500 | _ | |
4-6 | 17 500 000 | ||||
5-7 | 30 000 000 | ||||
Wie dus der Tabelle ersichtlich, steigt die spcz. in vitro
Hemmaktivität gegenüber Pankreas-a-Amylase mit
iunehniendem Molekulargewicht der Reihe stark an: so isigen die Verbindungen mit 5—7 Glucoseeinheiten
•ine 20fach stärkere Enzymhemmung in vitro als die Verbindung II.
In v'vo läuft die Wirksamkeit in der Saccharasehem-Hiung
der in vitro gefundenen spez. Hemmaktivität in etwa parallel. Dagegen wurde überraschenderweise
beim Stärkebelastungstest in vivo für die Verbindungen mit 2 oder 3 Glucoseeinheiten eine im Vergleich zur
Amylasehemmung in vitro 10—40fach gesteigerte Wirksamkeit gefunden.
Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie erhielten Gruppen mit jeweils 6
nüchternen Ratten
a) 2,5 Saccharose,
b) 2,5 g Maltose oder
c) 1 g gekochte Stärke
j>. os in wäßriger Lösung oder als Suspension appliziert.
• andere Ratten erhalten die genannten Kohlenhydrate in der gleichen Menge und zusätzlich einen Glucosidhytf
roseinhibitor in der angegebenen Dosierung.
Weiterhin erhalten 6 andere Ratten eine entsprechende Menge Salzlösung.
Blutglucose und Seruminsulin wurden in kurzen teitlichen Abständen im Blut aus dem retroorbitalen
Venenplexus gemessen. Die Blutglucosebestimmungen werden im Auto-Analyzer (Technicon ® nach 1 loffman:
J. biol. Chem. 120, 51 (1937) oder enzymatisch mit
Glucoseoxydase und o-Dianisidinhydrochlorid), die
Seruminsulinbestimmungen nach der Methode von
Haies und Rändle: Biochem. J. 88,137 (1963)) ausgeführt.
Die Ergebnisse der in vivo Saccharaseinhibition
(Saccharoseverabreichung) in der nüchternen Ratte gibt die folgende Tabelle III:
Formel
Dosis (SIEl
Blutalucose in mc % (Mittelwert + Abw.)
Min. 30 Min. 45 Min.
Λ0 Min.
II 3 Salzlösung 66 ± 4,6 73 ± 4,3 76 ± 3,9
Saccharose (Kontrolle) 122 ± 6,6 125 ± 16,0 128 ± 14,8
Saccharose + 25 SIE 88 + 11,4**) 101 ± 12,0*) 104 ± 7,4**)
Saccharose - 50 SIE 91 ± 9,4**) 106 ± 7,0*) 94 ± 9,0***)
Saccharose + 100 SIE 81 ±7,2**) 90 ± 8,0***) 97 ± 1,6***)
4-6 Salzlösung 58 ± 2.9 49 ± 3,3 54 ± 4,8 63 ± 5,0
Saccharose (Kontrolle) 107 ± 11 121 ± 6,0 132 ± 16 132 ± 6,7
Saccharose + 25 SIE 109 ± 6,4 105 ± 10**) 112 ± 9,1*) 108 ± 8,1***)
Saccharose + 50 SIE 103 ± 4,1 107 ± 15**) 102 ± 7,7**) 101 ± 9,2***)
Saccharose + 100 SIE 85 ±8,1**) 94 ± 9,9***) 95 + 8.5***) 85+6,4***)
5-7 Salzlösung 58 ± 2,9 49 ± 3,3 54 ± 4,8 63+5,0
Saccharose (Kontrolle) 107 ± 11 121 ± 6,0 132 ± 16 132 ±6.7
Saccharose + 75 SIE 102 + 11 108 ± 9,6*) 109 ± 7,5**) 101 ± 7,9**)
Saccharose + 150 SIE 92 + 7,0*) 100 ± 8.3***) 109 ± 3,7**) 102 ± 6,3***)
Saccharose + 300 SIE 95 ±8,1*) 84 ± 8,7***) 93 ± 9,0***) 91 ±4,5***)
*) = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = 0,05 **) = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = 0,01
***) = Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Saccharose = 0,001
16
Wie aus obigen Daten ersichtlich läuft die in vivo Aktivität in der Saccharase-Inhibition der in vitro
gefundenen Hemraaktivität parallel. So steigt die ED»,
wahrend die Saccharaseinhibitionsejnhejten pro mg
abnehmen- Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefaßt:
Tabelle | IV | Glucose- einheiten |
Saccharaseinhibition in vitro in vivo SIE/mg (ED30 mg/kg) |
2,65 ~ 15,30 -52,00 |
Formel | (3) (4-6) (5-7) |
21 8.5 2,5 |
||
II | ||||
Überraschenderweise ist die in-vivo-Inhibition des nicht dem erwarteten Muster. Die folgende Tabelle V
Stärkeabbaus durch die Verbindung der Formel II viel gibt die wie oben ermittelten in vivo Daten für die
höher, als anhand der in \ um gefundenen Daten tür die nüchterne Ratte nach Verabreichung der Stärke wieder:
Amylasehemmung erv nrtet hätte und entspricht also ;..
Formel Glucose- Dc s s (AlF) Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Abw.)
einhciten
einhciten
5 Min.
IO Min.
15 Min.
20 Mm.
30 Min.
45 Min.
82 ± 6.5
70 ± 6,9
93 ±7,3 133 ±12 127 ±9.3 152 ± 15 156 ±15 124 ± 7,7
86 ± 8,5 107 ±5.0***) 117 ±8.7*) 121 ± 12**) 126 ± II***) 114 ± 3.6**)
86 ± 8,5 107 ±5.0***) 117 ±8.7*) 121 ± 12**) 126 ± II***) 114 ± 3.6**)
Salzlösung 52 ± 2,3 75 ± 7.9 57 ± 3.7 78 ± 9.1
Stärke
(Kontrolle)
Starke + 750 AIE
Stärke+ 77 ± 14*) 92 ± 9,6***) 94 ± 9.5***) 113 ± 9.7***) 112 ± 8.8***) 111 ± 4.2**)
1500 AIE
Stärke + 65 ± 5.6***) 101 ± 3.3***) 82 ± II***) 112 ± 4.5***) 109 ± 6.4***) 104 ± 2.5**)
3000 All·.
4-6
S-7
Salzlösung
Stärke
Kontrolle
Starke + 6(XK) All
Starke + 12(H)O All-Starke + 24(K)O All
Salzlösung
Starke
(Kontrolle)
Starke + 6(H)O All
Starke ♦ 12000 All
Starke ♦ 241)00 ΛII
55 ± 4.8 63 ± 5.9 67 ± 5.8 72 ± 4,7 66 ± 5.0 103 ±11 117 ± X.(, 118 ± 8.5 128 ± 8.9 109 ± 11
99 ± 4.5 118 ± 5.8 104 ±8.1*) 123 ±11 107 ± 7.3
90 ±5.2*) 98 ± 8.2**) 99 ±4.1***) 117 ± 6.7*) 104 + 8.2
74 ± 5.5***) 82 ± 2.9***) 83 ± 3.7***) 96 ± 6.6***) 85 ± 6.4*)
55 ± 4.8 63 ± 5.9 67 ± 5.8 72 ± 4.7 66 ± 5.0 103+11 117 ±8.6 118 ±8.5 128 + 8.9 109+11
95 ± 4.3 107 ± 3.3*) 102 ± 5.5**) Il I ± 3.0**) 102 ± 6.7
87 ± 8.6*) 94 + 8.8**) 89 + 8.5***) 98 ± 8.3***) 91+4
74 ± 8.9***) 84 + 7.2***) 84 ± 6.U***) 8* +■ 6.5***) 85 t 4
*> ' Wahfschcinliclikeil gegen Kontrolle mit Stärke =
<0.05. **) ' Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stärke =
<0.0I ***) - Wahrscheinlichkeit gegen Kontrolle mit Stiirkc =
<0.00l
Aus obigen Daten ist ersichtlich, daß. während sich ,,·, abhängig vom Molekulargewicht ist. während in vivo
der Gnul der Saccharaseiiihibition sowohl in vitro als die Inhibition des Slärkealibaiis mit dem fallenden
auch in vivo als einr deutliche Funktion des Molekular- Molekulargewicht nicht annimmt, sondern überrn
gewichtes erweist, die Amylflseinhibiiion nur in vitro si hendeiwcise konstant bleibt
Ο3Ο2Μ/27Π
Obwohl also die in vivo Amylasehemmaktivität mit dem Molgewicht abnimmt, sind die EDso-Werte der
Stärkeverdauungshemmung für alle erfindungsgemäßen Verbindungen im wesentlichen gleich. Dies ist in der
folgenden Tabelle VI zusammengefaßt:
Tabelle | VI | Glucose- einheiten |
e-Amylase- inhibition in vitro Al E/mg |
Stärke verdauungs inhibition in vivo (ED50 mg/kg) |
Formel | (3) (4-6) (5-7) |
1400 17 500 30000 |
1,61 1,42 1,00 |
|
II |
Zahl der Glucose- a-Amylasc-lnhibitmn
cinhcitcn
AIt-Vg
Saccharase-Inhibilinn
SIFVg
6 "OOOO(X)
57000 000
42 000 000
24 000 000
SOOOOOO
57000 000
42 000 000
24 000 000
SOOOOOO
7 000
1500
1200
60
10
10
?n
Es ist also überraschenderweise möglich mit der Verbindung II eine Hemmung der Saccharose- und
Starkeverdauung gleichzeitig zu erreichen, und zwar bei einer präzisen, vorhersehbaren und cnarakteristischen
Dosis.
Reinigung des Gemisches der höheren Glieder dieser Reihe und Anwendung in reiner Form führt unerwarteterweise
zu noch höherer Aktivität und Spezifität. Dies IaBt sich durch einen Vergleich der in Tabelle I jo
angegebenen α-Amylase- und Saccharase-in vitro-Hemmdatep
mit den in folgender Tabelle VII angegebenen .')aten tür die reinen Verbindungen belegen:
Tabelle VII r.
Die vorhergehenden Ergebnisse /eigen die hohe Aktivität der Verbindung mit 4 Glucosceinhcitcn in der
Rolle eines vAmylaseinhibiiors. Auch die Verbindun
gen mit 5 und 6 Einheilen /eigen wesentlich höhere
spc/iliSLhe Inhibitoraklivitäl als bei bisher bekannten
Präparaten gefunden wurde. Eine Abn&hme der
Inhibitoraktivität tritt mit zunehmendem Molekulargc
wicht auf. wie bei den Verbindungen mit 7 und 8 Glucosceinhcilen /u sehen ist. obgleich diese noch
erhebliche Hemmaklivität /eigen In vitro Sacchara
seinhibition scheint in umgekehrter Abhängigkeit von
dem Molekulargewicht zu stehen. Die Verbindung mit 4 Glucosccinheilefi weist etwa '/to der spezifischen
Aktivität auf, die die Verbindung mit 2 Glucosceinhcilen
aufweist, wohingegen die llemmaküvität der Verbindung
mit 8 Glucoseeinheitcn nur geringfügig ist.
Die Verbindungen können ohne Verdünnung, /.. ti. als Pulver oder in einer Gelatinehüllc oder in Kombination
mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appli/iert werden.
Arzneimittel können eine größere oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z. B. 0,1% bis 99,5%, in
Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nichtloxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff
eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches,
inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche Arzneimittel
liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten vor. d. h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge
des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen der Dosis entsprechen,
die zur Herbeiführung der gewünschten Henimwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten können 1, 2, 3, 4
oder mehr Einzeldosen oder '/>, '/j oder '/··. einer
Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer
Applikation gemäß eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Dosierungseinheiten
die gewünschfe Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine
ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Viertel der
Tagesdosis gewöhnlich einmal, zweimal, dreimal oder viermal am Tage verabreicht wird. Obgleich die
Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte, unter Anwendung
gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts und des /ustands des
Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich
zwischen etwa 30 bis etwa 3 χ 10"· AI E/kg und zwischen
etwa I bis etwa 1 < I04 SIF./kg des Körpergewichtes
pro Tag liegen. In manchen I allen wird man dabei eine
ausreichende therapeutic he Wirkung nut einer gerin
gcrefi Dosis erreichen, wahrend in anderen Fällen cmc
größere Dosis erforderlich sein wird.
Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssiger Dosierungseiiiheitcn durchgeführt werden, wie
z. B. Pulver. Tabletten. Dragees. Kapseln. Granulate. Suspensionen. Losungen und dergleichen.
Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in
einer geeigneten Große und Vermischen mn einem ebenfalls /erkleinerien pharmazeutischen Iraj»erstoff
hergestellt Obgleich 'in eßbares Kohlenhydrat, wie
z. B. Stärke. Lactose, -»accharosc oder Glucose nor
malerwcise /u diesem /wecke Verwendung findet und
auch hier benui/i werden kann, ist es wünschenswert cm
nicht mctabnlisierbares Kohlcnhydral. wie / B. ein
Cellulosederivat /u benutzen
SüUmittcl. Gesi hmacks/iisai/e Konscrvierungssinl
fe. Dispergiermittel und färbemittel können .weh
milvcrwcndet werden
Die Kapseln können durch /Übereilung der oben
beschriebenen Piilvcrmisihung und durch I tillung
bereits gebildeter Gelaliiiehiitlcn hergestellt werden
Die PulvermischiiM>r kann man vordem I üllvorgang mit
Glcilnvlieln. wie / B Kicsclgel Talkum. Magnesium
stearat. (jlciiimslear.il oder festem Polyäthylenglykol
versetzen Die Mischung kann man ebenfalls mit einem
Desintegrator oder !.cisiingsvcrmitilcr. wie / B Agar
Agar, Calciumcarbomit oder Natriumcarbonat versetzen,
um bei Einnahme der Kapsel die Ziigiihglichkcit des
Inhibitors zu verbessern.
Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch Herstellung einer Pulvermischung, grob oder
feinkörnig, und Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser Mischung formt man
Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Weise
zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel oder eine anderen Trägersubstanz wie oben beschrieben.
Gegebenenfalls fügt man eine Bindemittel hinzu: z. B. Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine oder
Polyvinylpyrrolidone, einen Lösungsverzögerer, wie z. B. Paraffin, einen Resorptionsbeschleuniger, wie z. B.
ein quarternäres Salz und/oder ein Adsorptionsmittel, wie z. B. Bentonit, Kaolin oder Dicalciumphosphat. Die
Pulvermischung kann granuliert werden zusammen mit einem Bindemittel, wie ζ B. Syrup, Stärkepaste,
Akazienschleim, oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymerenmaterialien. Danach preßt man das Produkt
durch ein grobes Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung durch eine Tablettenmaschine
laufen lassen und die sich ergebenden ungleichmäßig geformten Stücke bis auf Korngröße zerkleinern. Damit
die entstandenen Körner nicht in den tablettbildenden Düsen stecken bleiben, kann man sie mit einem
Gleitmittel versetze,, wiez. B.Stearinsäure,Stearatsalz.
Talkum oder Mineralöl. Diese g!eitfäh?g gemachte Mischung wird dann in Tablettenform gepreßt. Die
Wirkstoffe können auch mit freifließenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und direkt in Tablettenform
gebracht werden unter Auslassung der Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt mit
einer klaren oder opaken Schut/hülie versehen. /. B.
einem Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker oder Polymersiibsianzen unJ einer polierten
Hülle aus Wachs. Farbstoffe können diesen Überzügen beigefügt werden, d.-.mit zwischen den verschiedenen
Dosierungseinheiten unterschieden werden kann.
Die oral zu verabreichenden Zubvreitungsformcn.
wie /. B. Lösungen. Syrup und Elixiere, lassen sich in
DosiLTiingseinheiten herstellen, so daß t-ne bes'immte
Menge Präparat eine bestimmte Menge Wirkstoff enthalt. Syrup kann so hergestellt werden, daß der
Wirkstoff in einer wäßrigen Lösung, welche geeignete Cieschmacksstoffe enthält, gelost wird; Elixire werden
unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer Tragerstoffe erhalten. Suspensionen kann man durch
Dispergieren der Verbindung in einem nicht toxischen Tragcrsioff darstellen. Lösungsvcrmittler und Mmiilgier
muteI. wie ζ B. äthoxyliertc Isostearylalkoholc und
Polyoxyälhvlensorbilesler. Konservierungsmittel, gc
sdimacksvrrbessernde Zusätze wie /. B. Pfeffcrniinzol
oder Saccharin und dergl können auch zugegeben
werden.
Dosierurgsvorschriften können auf der Kapsel
angegeben werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, daß der Wirkstoff verzögert abgege
bcn wird. ζ B. durch Hinhalten des Wirkstoffes in
PolymcrenMibstaiizen. Wachse oder dergl
Die loxizität dieser Verbindungen ist sehr gering
Auih ohne Endreinigung wird beispielsweise (las
Rohprodukt aus dem Beispiel h mit einer Aktivität von
8.500 SI[7g ohne Auftreten von Nebenwirkungen vertragen Dies trifft bei den hierin beschriebenen
Verbindungen der vorliegenden Erfindung ni. die in
einer Dosierung von 540000 SIE/kg Maus und Ratte p. os ohne Nebenwirkungen vertragen worden sind.
Auch1 bei intravenöser Injektion tolerieren Mäuse 10.000
SlE/kgohne Nebenwirkungen.
Zusätzlich zu den oben erwähnten Arzneimitteln lassen sich auch diese Wirkstoffe enthaltende Lebensmittel
herstellen; beispielsweise Zucker, Brot, Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere
Konfeklartikel. und Konserven, wie ι. B. Marmelade,
wobei zu diesen Produkten eine therapeutisch-wirksa
me Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen
Inhibitoren gegeben wurde.
Erläuterung einiger verwendeter Reagentien und Hilfsmittel:
Als Ionenaustauscher können z. B. die im Handel
befindlichen Produkte Amberlite® IRA 410 CI (Anionenaustauscher); Amberlite® IRC '20
(H+-Form) (stark saurer Kationenaustauscher): Amberlite® (HCOj'-Form) (Anionenaustauscher);
Amberlite® IRA 410 OH" (stark basischer Anionenaustauscher); Amberlite® IRC 5OH* (schwach
saurer Kationenaustausdier) [Warenzeichen der
Firma Rohm and Haas Company] sowie Dowex·3 50 WX 4H+ (stark saurer Kationenaustauscher)
[Warenzeichen der Firma Dow Chemical Co. Midland, Michigan, USA] verwendet werden.
Als Anionenaustauscher auf Cellulosebasis kann z. B. DEAE-Zellulose der Schleicher Schlecher und Schüll verwendet werden.
Als Anionenaustauscher auf Cellulosebasis kann z. B. DEAE-Zellulose der Schleicher Schlecher und Schüll verwendet werden.
Als Polyacrylamid-Gel kann z.B. Bio-GeI"-P-2
[Warenzeichen der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond.California, USA] verwendet werden.
Maltzin® ist ein natürliches Malzextrakt der Firma Diamalt AG. München (BRD).
Lewapol® ist ein unspezifisches Adsorpiionsharz der Firma Bayer AG. Leverkusen (BRD).
ClarceP ist ein Filterhilfsmittel der Firma CECA. Velizy Villacoublay, Frankreich.
SE 30 ist ein Silico.i Elastomer der F"irma Hewlett Packard.
Maltzin® ist ein natürliches Malzextrakt der Firma Diamalt AG. München (BRD).
Lewapol® ist ein unspezifisches Adsorpiionsharz der Firma Bayer AG. Leverkusen (BRD).
ClarceP ist ein Filterhilfsmittel der Firma CECA. Velizy Villacoublay, Frankreich.
SE 30 ist ein Silico.i Elastomer der F"irma Hewlett Packard.
Die im folgenden verwendeten Mikroorganismen sind bei American Type Culture Collection unter den
folgenden Nummern hinterlegt worden:
Slamm
SE 50(CBS961.70)
SE 18 (CBS 957.70)
SE 82 (CBSbI 5.71)
SE 50/1i(CBS614.71)
SE 50/110(CBS 67473)
SE 18 (CBS 957.70)
SE 82 (CBSbI 5.71)
SE 50/1i(CBS614.71)
SE 50/110(CBS 67473)
ATCC-Nr.
310 Al
31041
31045
31043
31044
31041
31045
31043
31044
Man beimpft einen Glasfermentcr mn 8 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 5,0% Stärke. 1,0%
Hefeextrakt. 0.2% K>HPO4 nut einem 3 Tage alten
Schültelkolben des Stammes SE 50/13 (CBS 614.71) und
bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28"C und erhält eine Kulturbrühc mit 105.000
AI E/ml.
6 Liter dieser Fcrmcnlationsbrühe werden nach dem
Abkühlen auf 20"C mit halbkonzentrierier HNOi auf
pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Aktivkohle versetzt und 10
Minuten gerührt. Anschließend wird 15 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe
Überstand nach Neutralisation mit NIU auf 500ml eingeengt. Die 500 ml Konzentrat wurden 45 Minuten
mit 200 g Amberlite® IRA 410 Cl gerührt, abgenutschl
und mit 4/5 Vol. = 400 ml Methanol versetzt, um die
Hauptmenge der höhermofekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aklivkolileresien)
auszufällen. Es wird 5 Minuten bei 5.000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml Überstand werden unter
intensivem Rühren in 4 Lir. Trockensprit eingetropft. Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3mal mit
Trockensprit nd 2mal mit Äther gewaschen und im
Vakuum bei 500C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines
weißen Pulvers mit 10 χ 106 AFE/G. In einigen der folgenden Beispiele wird diese Zubereitung verwendet.
Enzymhemmung auf Dünnschichtplatten
Zur Beurteilung des Endproduktes von Fermentationen und der Zusammensetzung von Präparaten mittels
Dünnschichtchromatographie trägt man 1 μ! der Fermeniationsbrühen
oder 1 μg der Präparate auf Kieselgelfertigfolien
auf und entwickelt 2mal in n-Butanol/ÄthanoI/Wasser = 50/30/20.
Zur Saccharaseinhibitionsfärbung besprüht man die
entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20 χ 20 cm Platte) und läßt das Gel erstarren.
Dann wird für 5' in einer feuchten Kammer bei R'dumtemperatur vorinkubiert und anschließend satt
mit Substratgel besprüht. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte
Kammer ein und inkubiert bei 40cC. Die Inhibitionsfärbung
(helle Flecken, rotbrauner Hinter£ -und) entwickelt M
sich in 60—90'. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den
darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.
Bereitung der Gele
finzymgel: 1,5 g Agarose (!.'Industrie Biologique
Francais) wird in 100 ml 0.2 m Na-Maleinatpuffer pH 6.0 suspendiert und anschließend durch Aufkochen gelöst.
Die klare Agaroselösung wird auf 50rC abgekühlt und in
mti 250 μΙ Triton X-100 Lösung (2 g Triton®
X-100 + 8g Äthanol p.a.) und 0.5m! Dianisidinlösung
(20 mg Dianisidin/I ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden I ml
GOD/POD-Reagens (12.5 mg Glucoseoxidase. Rein- η
heitsgrad I. Fa. Boehringer. Best. Nr. 15423 und 2 5 mg
Peroxidase. Reinheitsgrad 11. Fa. Boehringer. Best. Nr
15302 gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4 — 5 Einheiten
Saecharase aus Schweinedünndarm zugesetzt. Das Gel muß bis /um Versprühen auf 50r C gehalten werden. da 4n
es sonst beim Sprühvorgar.g in den Düsen erstarrt.
Substratgel: 0.5 g Agarose wird in IOD ml Na-Maleinat
puffer pH 6.0 suspendiert und unter Kochen gelöst Man
kühl' anschl-eOend auf 50"( ab. vcrsct/t mit 100 μΙ
Triton (2 g Triton® X 100 + 8g Äthanol pa.) und gibt t~,
] f/ Saccharose /u. Nach dem Lösen der Saccharose ist
das Cicl gebrauchsfertig.
Zur AmylaseiriHibitionsfärbung besprüht man die
entwickelte und getrocknete fX'-Platte mil einem
Amvlasegel (2OmI' 20 χ 20cm Platte) und läßt '>"
erstarren. Nach 5' Vorinkubation bei Raumtemperatur bringt man die Platte mit der Gclschicht in eine 0.5°/iigc
StärkelöMinj (1 g Stärke in 200 ml 0.2 m Glycerophos
phatpuffer OOImC'aC'b pH 0.9 unter Kochen gelöst) ein
lind belaßt sie dort für 2' bei 40 C unter Umschwenken ·">
lier Losung. Danach wird die Platte mit deM Wasser gut
«bgespült und /ur Anfärbung d„-r nicht abgebauten
Stärke in eine verdünnte |,· Losung (4 ml );-Stamnlr>
Sung auf 500 ml HjO, Jj-Summlösung: 2.2 g Jj + 4.4 g
KJ in 100 ml H2O gelöst) eingefaucht. Nach ca, 1 Minute
ist die Färbung optimal. Man photographiert sofort, da die blauen Flecken schnell verblassen.
Bereitung des Amylascgcls
1 g Agarose wird in 100 ml 0.2 m NaCriumglycero- h'-<
phosphat/0,01 m ft ι CaCJi- Puffer pH 6.9 bet 1000C
gelöst, nach dem Abkühlen auf 500C werden ΙΟΟμΙ
Triton» XlOO (2 ι Triton X-100 + 8g Äthanol p.a.) zugesetzt. Direkt vor dem Besprühen setzt man 100 μΐ
einer Amylasekristallsulspension (10 mg Schweinepakreasamylase/ml
ges.NHt-Sulfatlösung, Fa. Boehringer. Nr. 15017) zu.
Beimpft man I-Ltr-Erlenmeyerkolben mit 120 ml
einer Nährlösung bestehend aus 4% Stärke, 2.4% Glucose, 0,9% Kaseinhydrolysat und 0,9% Hefeextrakt,
pH mit NaOH auf 7,6 eingestellt, mit 0,4% CaCO3
versetzt und 30 min bei 1210C sterilisiert, mit 3 ml einer
Vorkultur des Stammes SE 82 (CBS 615.71), angewachsen in einer Nährlösung bestehend aus 2% Stärke, 1%
Glucose, 0,5% Kaseinhydrolysat und 1% Hefeextrakt, pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt, mit 0,4% CaCO3
versetzt und 30 min bei 1210C sterilisiert, und bebrütet 5
Tage bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so erhält man eine Kulturlösung m** 122.000 AIE/ml. Zu,-Aufarbeitung
trennt man das Myce! von den vereinigten
Kulturlösungen durch Zentrifugation bei 12.000 Upm ab. bringt 300 ml des Kulturfiltrates mit halbconc. HNO)
auf pH 2.5 und rührt fur 10 min mit 2,5 g Α-Kohle p.A.
Nach Abtrennung der Kohle bei 12.000 Upm wird die mittels 10 N KOH auf pH 6 neutralisierte Lösung mit
300 ml Methanol versetzt, kurz stehen gelassen und bei 12.000 Upm vom Niederschlag befreit. Tropft man nun
den Überstand in 3 Ltr Äthanol, isoliert die Fällung nach
kurzem Stehenlassen durch Zentrifugation bei 12.000 Upm, wäscht den Niederschlag zweimal mit abs.
Äthanol und einmal mit Äther und trocknet im Vakuum, so erhält man 2.23g eines Produktes mit 7.45 χ \0b
AIF/g. das zu über 95% Verbindungen mit Πι + η; = 4
und mehr Glucoseeinheiten enthält.
Beimpft man 1-L-F.rlenmeyerkolben mit 120 ml einer
Nährlosung der Zusammensetzung 3.5% Glucose. 2% Stärke. 0.5% Kaseinhydrolysat. 1.3% Hefeextrakt. 0.3%
Ca(O, und 0.3% K2HPO1 vor Sterilisation auf 7.K
eingestellt. Sterilisation 307121C. mit 6 ml einer
Vorkultur des Stammes SF. 50/110 in t.ner Nährlösung
bestehend aus 3% So|„mchl. J1V. Glycer.n und 0.2"/n
CaCOi und bebrütet 3 — 4 lage auf einer Rundschüttelmaschine
bei 24 C. so erhält man eine Kuliurlnsting. die
153 00OAIIVmI und 12 200 SIL. I.(r enthält.
I Ltr. Kuhiirlosung wurde mit HNOi auf pH 2.5
eingestellt, mit 5 g Aktivkohle 10' gerührt und
anschließend 30 bei 5000 Upm zentrifugiert. Anschließend
wurde durch /usat/ von 25 g Amberlilc* iRA 410
(OH Form) neutralisiert. Der neutrale Überstand wurde auf 100 ml cinrotiert. mit K)OmI Methanol
versetzt und filtriert. Das Filtrat wurde in 2 Ltr. Tro« kcnsprit eingerührt, der ausfalleni/e Niederschlag
abgenutschl und nach 3 χ Waschen mit Aceton und Äthrr im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 14 g eines weißen Pulvers mit Γ>
χ 10f AIF./g. das überwiegend Verbindungen mit mindestens
/j, + D2 =, 4 ülucöseeinheiten enthalt
Beimpft nii-n 1 L F.rlenmeyerkolben mit je 120 ml
einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke. 1% Hefeextrakt. 0.2% K2HPO4 mit je 2 ml einer
Vorkultur nach Beispiel 3, so erhält man nach 3tägigcr Bebrülung bei 28"C Kulturlösungen mit folgender
Ausbeute an Amvlase Inhibitor:
Stamm
AI E/ml
SE 50(CBS 861.70) 37 000
SE 50/13 (CBS 614.71) 109 000
SE 50/110(CBS 674.73) 53 500
die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder mehr Glucoseeinheiten.
Beimpft man 1-L-ErlenmeyerkoIben mit je 120 ml
Nährlösung der Zusammensetzung 1.3% Maltose, 3.5% Glucose. 0.5% Kaseinhydrolysat, 1.3% Hefeextrakt.
0.3% CaCO3, 0.3% K2HPO4 mit je 2 ml einer Vorkultur
nach Beispiel 3. so erhält man nach 4tägiger Bebrütung
i bei 24'
Stämmen folgende Ausbeuten:
Stämmen folgende Ausbeuten:
10
15
SIE/ml AlE/ml
SE50(CBS961.70) 25 580
SE50/13(CBS6r4.71) 14.8 1460
SE 50/110(CBS 674.73) 57.9 755
20
25
die vorwiegend aus einer Mischung der Verbindungen mit 4 oder weniger Glucoseeinheiten.
Beimpft man einen Fermenter mit 100 L Nährlösung der Zusammensetzung 33% Glucose, 23% Maltzin®.
03% Kaseinhydrolysat. 13% Hefeextrakt, 03% CaCO3. 03% K2HPO4 und 0.1% Antischaummittel mit 5 Leiner
Vorkultur nach Beispiel 3 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 24°C. so erhält man eine
Kulturlösung mit 73 000 SIE/L die vorwiegend die erfindungsgemäße Verbindung mit /7| + n2 = 2 enthält.
90 Ltr. Fermentationsansatz wurden mit Mycel am
pH-Meter mit konz. HNO3 auf pH 23 eingestellt und
unter Rühren mit 900 g (= 1%) Aktivkohle zur Adsorption der Hauptmenge der gebildeten Farbstoffe
versetzt. Man rührte für 15 Min„ trennte über eine Zentrifuge bei 3000 Upm vom Mycel und der
Hauptmenge der Kohle ab und filtriert den Überstand schließlich unter Zusatz von 3 kg Clarcel über eine
Drucknutsche. Man erhielt 61 Ltr. gelbbraunen, klaren Filtrats mit einem SIF.-Gehalt von 60 000 SIE/Ltr.
Das Filtrat wurde mit konz. NH3 auf pH 7 eingestellt
und zur Adsorption des Wirkstoffs mit 1300 g (2%) Aktivkohle für 30' gerührt Man filtriert über eine
Drucknutsche und wusch das Aktivkohlesediment 3 χ mit 10 Ltr. destilliertem Wasser. Anschließend wurde
die Kohle gut trocken gedrückt und in 3 χ 4 Litern 50% Aceton bei pH 23 für jeweils 15' gerührt, um den
Wirkstoff von der Kohle zu desorbieren. Die acetonischen Desorbate wurden — nach Abtrennen von der
Kohle durch Filtration — vereinigt. Man engte das vereinigte Desorbat am Rotationsverdampfer auf
250 ml ein. versetzte mit einem gleichen Volumen (250 ml) Methanol und filtrierte durch ein Faltenfilter.
Das Filtrat (480 ml) wurde in 5 Ltr. Aceton unter kräftigem Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag
wurde abgenutscht und 3 χ mit Aceton und Äther gewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei
35" C getrocknet. Ausbeute 230 g mit 8500 SIE/g.
25 g des obigen rohen Produkts wurden in 1 Ltr. H2O
gelöst und mit 300 g Dowex ® 50 WX 4 H+ (200-400
mesh) 30' gerührt. Man filtrierte das Harz ab und wusch 3 χ mit 2 Llr. 0.001 η HCI nach. Das gewaschene
Dowex wurde anschließend in 500 ml H2O suspendiert und die Suspension am pH-Meter durch Zugabe von
25% NHj auf pH 9.0 eingestellt. Anschließend wurde noch 2 χ mit je 500 ml 0.6% NH3 desorbiert, die
Desorbate vereinigt und am Rotationsverdampfer auf 100 ml eingeengt. Zur Entfärbung dieses Konzentrats
wurde es mit 2 g DEAE-Zellulose. 0.6 mVal/g) für 5 min.
gerührt, dann zentrifugiert. Der hellgelbe Überstand wurde mit einem gleichen Volumen (100 ml) Methanol
versetzt und dann in 2 Ltr. Aceton unter intensivem Rühren eingetropft. Der Niederschlag wurde abgenutscht.
mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum bei 35"C getrocknet.
Zur weiteren Fcmicmiguug wuiucn die 4.0 g ίπίϊίυίίΐίί"
in 0.5 g Portionen über Biogel ® P-2 gplfiltriert. Dazu
wurden jeweils 0.5 g des Präparats in 10 ml H2O gelöst und auf eine Biogel ® P-2-Säule (200-400 mesh) vom
Durchmesser 5 cm und der Länge 95 cm aufgetragen. Man entwickelte in Wasser bei einer Fließrate von
80 ml/h. Es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurde der Gesamtkohlenhydratgehalt
(in Form des Anthrontest als Extinktion bei E62o) sowie
der Gehalt: aSaccharase-Inhibitorund Amylase-Inhibitor
ermittelt. Außerdem wurden die Fraktionen dünnschichtchromatographisch (Enzym-Inhibitionsfärbung
nach Beispiel 1) geprüft.
Die Fraktionen, die die Verbinungen mit 4 — 6
Glucoseeinheiten enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum auf 10 ml eingeengt und durch Eintropfen in
200 ml Trockenspritz gefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert. mit Aceton und Äther gewaschen und
im Vakuum getrocknet: Ausbeute aus 4.0 g Rohinhibitor:0,2 g der Verbindungen mit 4—6 Glucoseeinheiten
mit 173 χ 106 AIE/g und 8.500 SIE/g. Die die
Verbindung mit 3 Einheiten enthaltenden Fraktionen wurden in gleicher Weise aufgearbeitet, wobei die
Fällung mit 200 ml Aceton erfolgte: Ausbeute aus 4.0 g Rohinhibitor: 0.2 g der Verbindung mit Πι + n2 = 3 mit
1.4 χ 106 AIE/g und 21.000 SIE/g. Aus den die Verbindung mit n\ + n2 = 2 enthaltenden Fraktionen
(Fällung mit Aceton) wurden 0,9 g der Verbindung mit πι + n2 = 2 Einheiten mit 0.3 χ 106 AIE/g und 68.000
SIE/g isoliert.
Beimpft man 3 Kleinfermenter mit je 8 L d. r Nährlösung 7.5% Maltzin®. 0,3% Kaseinhydrolysat.
0.7% Hefeextrakt. 0.3% CaCO3. 03% K2HPO4 mit 5%
einer Vorkultur des Stammes SE 50/110 (CBS 674.73) (gewonnen nach Beispiel 3), so erhält man nach 5tägiger
Bebrütung bei 24°C eine Kulturbrühe mit 73 SIE/ml. die vorwiegend die Verbindung mit r>\ + n2 = 2 enthalten.
Nach Zentrifugation (30', 3000 Upm) zur Abtrennung des Mycels erhielt man 203 Ltr. einer tiefbraunen
Kulturlösung mit 67 000 SIE/L Man stellte mit HNO5
auf pH 33 ein und setzte zur Entfärbung 60 g Lewapol (035 mm Körnung)/L = 1.23 kg Lewapol® zu. Nach 20'
Rühren wurde über ein Seitz K 3-Filter abgenutscht. Die
entfärbte Kulturlösung wurde mit NH3 neutralisiert (183 L, 67 000 SIE/L). Man rührte anschließend zur
Adsorption des Wirkstoffs 20 g Aktiv-Kohie/L = 370 g
ein und ließ 30' rühren. Anschließend wurde über ein Seitz K 3-Filter, das mit einer Schicht aus dem
Filterhilfsmittel Clarcel® beschickt war, abfiltriert. Das Filtrat (173 I, 3600 SIE/L) wurde verworfen. Der
26
Kohleriicksland wurde 3 χ mil 2 I dest. MjO gewaschen.
Zur Desorption des Wirkstoffs von der Kohle wurde diese > χ nacheinander mit jeweils I L 80°/oig.
Aceton für 15' gerührt, wobei das pH mit konz. HCI auf
pH 2.5 eingestellt wurde. Die Desorbate wurden vereinigt (2,4 L. 371.000 SIE/L). In dieses Desorbal
«ν-den 20 g Dowex® H <7L (Dowex® 50W X 4.
H+ -Form, = 46 g Dowex eingetragen und 20' gerührt. Anschließend wurde das Harz abfiltriert (Dowex®-fraktion
I) und mit etwas 75%igem Acetor. 'lachgewaschen, in
Das Filtrat und Waschflüssigkeit (3L = 215 000 SIE/L)
wurden mit 60g Amberlite® IRA 410 (OII-Form)/L
gerührt, bis pH 7 erreicht war. Anschließend wurde •bfiltriert und das Filtrat (2,8 L, 219 000 SIE/L) mit 72 g
Dowex® H+ versetzt und 20' gerührt. Das pH wurde dabei durch Einhängen eines mit Amberlite® IRA 410
OH - gefüllten porösen Nylonbeutels auf 3-.0 gehalten.
AnsrhlipRpnd wurde vom Dnwex ahfiltrierl (Dnwexfraktion
II), das Filtrat (2,6 L, 27 000 SIE/L) wurde verworfen.
Dowex®-Fraktion I und Il wurden jede für sich 3 χ
mit 75% Aceton bei pH 3,5 gewaschen und anschließend je 3 χ mit je 100 ml (Dowex®-Fraktion I) bzw. 150 ml
(Dowex®-Fraktion II) 0.6% NHj desorbiert. Bei der 1.
Desorption, bei der die Amnioniakmenge zur Neutralisation
des Dowex®-Harzes nicht ausreichte, wurde durch Zugabe von konz. NHj am pH-Meter auf pH 9
eingestellt. Die 3 Desorbate von Dowex®-Fraktion I und Il wurden für sieh vereinigt, am Rotationsverdampfer
fast zur Trockne eingeengt, in 50 ml H2O aufgenommen,
am pH-Meter mit HCI auf pH 3-4 eingestellt und mit 50 ml Methanol versetzt. Die Lösungen wurden in 1.5 L
absolutes Aceton unter Rühren eingetropft, der fallende Niederschlag abgenutscht und 3 χ mit Aceton sowie 1 χ
mit Äther gewaschen. Man trocknete im Vakuum.
Ausbeute: Fraktion I 6.5 g 25 000SIE/g
Fraktion Il 12.3 g 36O0OSIE/g
Fraktion Il 12.3 g 36O0OSIE/g
Fraktion I und Il enthalten als hemmaktive Restiinrlleile hauptsächlich die erfindungsgemäße Verbindung
mi'. n\ + 02 = 2 neben geringen Anteilen der
Verbindung mit fli + /J2 = 3.
Die folgende Tabelle gibt die Sacchärase-Hemmaktivitälen
des Präparats in aufeinanderfolgenden Stufen wieder:
Ausbeute
Volumen (L) | SIE/L | SIE gesamt | SIE Ausbeute % |
|
1) Kulturlösung | 20,5 | 67 000 | 1 373 500 | 100 |
2) Nach Lewapol® Entfärbung | 19,5 | 67 000 | i 306 500 | 95 |
3) Nach Aktivkohleadsorption | 18,5 | 3 600 | 66 600 | (4,8 Verworfen) |
4) 1. Desorbat | 0,7 | 742 000 | 519400 | 37,8 I |
5) 2. Desorbat | 0,9 | 329 000 | 296 100 | 883 500 21,6 1 64,4 |
6) 3. Desorbat | 0,8 | 85 000 | 68000 | 5,0J |
7) Mischdesorbat (4-6) | 2,4 | 371000 | 890400 | 64,8 |
2λ Nach ! Dc.vsx® sdscnticr: | 1 η | T[5 nnn | 645 000 | |
9) Nach Neutralisat mit IRA CH" | 2,8 | 219 000 | 613 200 | |
10) Nach 2. Dowex®-adsorption | 2,5 | 27 000 | 67 500 | (4,9 verworfen) |
11) Vereinigte NH3 Desorbate von Dowexa-Fraktion I |
0,29 | 682 000 | 197 780 | 14,4 I Lo,9 |
12) Vereinigte NH3 Desorbate von Dowex®-Fraktion II |
0,45 | 1419000 | 638 550 | 46,5 j |
13) Fällung Fraktion I | 6,5 g | 25 000/g | 162 500 | "'8Wo |
Fällung Fraktion II | 12,3 g | 36000/g | 442 800 | 32,2 I44'0 |
Beispiel 8 | mil 7 I 7flOAiiTAm | t*t Qi-^m lii Rl ir*h elf irrt ti |
200 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1 beschrieben wurden in 940 ml destillierem Wasser und 60 ml konz.
H^SO4 gelöst und 1M Stunde unter Rückfluß erwärmt
(Innentemperatur: 98-1000C; Ölbadtemperatur: !40cC). Die abgekühlte, schwarzbraune Lösung wurde
mit 10 g Aktivkohle versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach wurde die Aktivkohle abgesaugt, mit Wasser
gewaschen und das Filtrat mit ca. 250 ml 10 η KOH auf pH = 7 bis 8 eingestellt. Die Lösung wurde 1 Stunde mit
50 g Aktivkohle ausgerührt. Die Kohle wurde abgesaugt, mit 21 Wasser gewaschen und das Filtrat
verworfen. Zur Desorption wurde die Kohle über Nacht man die Kohle ab und engte die alkoholische Lösung am
Rotationsdampfer ein. Rückstand: 8,0 g.
Der Rückstand wurde in 15 ml H2O aufgenommen
und auf eine mit 50 g Amberlite® IR 120 (H+-Form) gefüllte Säule (Höhe: 20 cm, 0 2,4 cm) aufgetragen.
Man ließ mit 3 Tropfen/Minute einziehen und wusch mit Wasser nach (12 Tropfen/Mrnute), bis alle nicht
basischen Bestandteile entfernt waren. Dann wurden die basischen Produkte mit 0,5%igem NH3 von der Säule
eluiert (12 Tropfen/Minute) und die wäßrige Lösung am
Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Rückstand: 4,1g.
tn
2 g dieses Rückstandes wurden in wenig Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex® G-15 gefüllte Säule
(Höhe: 200 cm; 0: 3,0 cm) aufgetragen. Es wurde mit Wasser eluiert. Bei einer Fließgeschwindigkeit von
8 ml/Stunde wurden Fraktionen von jeweils 2 ml
abgenommen. Die einzelnen Fraktionen wurden dünnschichlchromatographisch
geprüft. Die Fraktionen 85-94 lieferten 280 mg der Verbindung mit «ι + /I2 = 2 mit einer spcz. Aktivität von 50 000SIE/g.
Inkubiert man 2 g einer Zubereitung wie in Beispiel 1
beschrieben in 30 ml 20 mM Acetatpuffer vom pH 4,8 mit 1,25 mg /?-Amylase aus sweet potato (BOEHRIN- \-,
GER 15471) unter stetigem Rühren für 120 std bei 37°C,
erhitzt schließlich für 5 min auf 100°C und zentrifugiert !•ei 4000 Unni vom IJrmplÖs'pn ab. ?O prhält man nnrh
Lyophilisation der Lösung 1,5 g eines Produktes mit l800SIE/g und 3,8 χ 105AIE/g. Prüft man dieses
Produkt mittels Dünnschichtchromatographie und Saccharase-Inhibitionsfärbung
wie in Beispie! 1 beschrieben, so zeigt sich, daß an hemmaktiven Verbindungen
im wesentlichen die erfindungsgemäßen Verbindungen mit πι +./J2 = 2 und 3.
Beispiel 10
Beimpft man einen 200-ml-Erlenmeyerkolben, der
25 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 0.1% jn
K2HPO, 0.2% (NH4)2SO4, 0.5% MgSO4, 0.05% KCl.
0.01% FeSO4, 2% einer Zubereitung wie in Beispiel 1
beschrieben mit einer Sporensuspension des Stammes Aspergillusniger ATCC 11394 und bebrütet bei 28°C auf
einer Rundschüttelmaschine, so sinkt nach 6 Tagen der jj
AIE-Titer von 210000 AIE/ml auf 53 000AIE/ml und
nach 10 Tagen auf 21 300 AIE/ml. Gleichzeitig nimmt der SIE/ml Gehalt von 7.0 auf 72 SlE/ml zu.
20 ml einer 10 Tage mit der Sporensuspension inkubierten Lösung wurden zur Abtrennung des Mycels
30' bei 3000 Upm zentrifugiert. Die 15 ml Überstand
(72 000S1H/L) wurden durch 30minütiges Rühren mit
2 g Amberlite® IRC 50 H + und 1 g Amberlite® IRA 410 OH- entsalzt (Leitfähigkeit kleiner als 2 m S · cm-').
Man filtrierte ab und ließ das Filtrat mit 5 ml/h durch eine mit Dowex®H+ in 0.001 η HCI äquilibrierte Säule
(0 1 cm χ 10 cm) laufen. Anschließend wurde mit 200 ml 0.001 η HCI nachgewaschen. Zur Desorption
wurde 0,6% NHj-Lösung durch die Säule gepumpt (10 ml/h) und 5 ml Fraktionen aufgefangen. Die die
saccharaseinhibitorische Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 2 ml am Rotationsverdampfer
einrotiert und mit 2 ml Methanol versetzt. Man stellte diese Lösung auf pH 3—4 ein und brachte sie
durch Eintropfen in 100 ml Aceton zur Fällung. Der Niederschlag wurde abgenutscht, mit Aceton und Äther
gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute:
26 mg mit 28 000SIE/g, bestehend aus Verbindungen
mit πι + Π2 = 2 und 3. Die Gewinnung der reinen
Verbindung mit Πι + /J2 = 2 aus diesem Produkt erfolgt
wie in Beispiel 8 beschrieben durch Gelfiltration über eine Säule mit Bio-Gel® P-Z Man erhält 7 mg der
Verbindung mit Πι + H2 = 2 von 60.000 SI E/g.
Beispiel 11
Zur Gewinnung der Aminozuckerderivate mit 5 — 7
Glucoseeinheiten geht man z. B. von einer Zubereitung, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, aus.
Dazu wurden 30 g der Zubereitung nach Beispiel 1 in
250 ml H2O gelöst. Die Leitfähigkeit dieser Lösung beträgt 10 mS · cm-',das pH 5.5. Zur Entsalzung wurde
die Lösung mit 60 g Amberlite® IRC 5OH* (schwach saurer Kationenaustauscher, der die Aminozuckerderivüle
aus wäßriger Lösung nur spurenweise bindet) und 20 g Amberlite® IRA 410 OH" versetzt und 20'gerührt.
Das Filtrat (Leitfähigkeit 0.5 mS · cm-', pH 3.5) wurde mit 1 η HCI auf pH 3.0 eingestellt (Leitfähigkeit 0.6
mS · cm '). Diese Lösung wurde mit 42 ml/h durch eine mit Dowex® 50 W (H ♦) gefüllte Säule (0 2.5 cm, Höhe
40 cm, äquilibriert in 0.001 η HCI) gepumpt und anschließend nut 2 L 0.001 η HCI nachgewaschen. Nach
dem Waschen der Säule eluierte man mit 1.2% wäßrigem Ammoniak und sammelte 10 ml Fraktionen.
Die inhibitorisch aktiven Fraktionen wurden vereinigt, d2S Ammoniak im Vakuum ahcrp7nupn und Hip !.ösunp
anschließend im Vakuum auf 30 ml eingeengt. Man fällte durch Eintropfen in 600 ml Trockensprit, nutschte den
Niederschlag ab und trocknete im Vakuum nach Waschen mit Alkohol und Äther. Ausbeute 4.4 g mit
26,5 χ 106AI E/g.
Jeweils 0,5 g wurden zur Feinreinigung auf eine präparative Biogel® P-2 Säule, wie in Beispiel 6
beschrieben, aufgetragen und entwickelt. Die Fraktionen, die nach DC (Amylaseinhibitionsfärbung) Verbindungen
mit /Ji + n2 = 5-7 enthalten, wurden vereinigt,
im Vakuum eingeengt und wie oben beschrieben mit Trockensprit gefällt. Ausbeute aus 0,5 g Rohprodukt:
0.2 g Aminozuckerderivate mit rt\ + n2 = 5 —7 mit
30 χ IO6 AIE/g und 2.500 SlE/g.
Beispiel 12
Dieses Beispiel zeigt, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen aus dem Kationenaustauscher unter
sauren Bedingungen eluiert werden können.
Man füllt eine Säule vom Durchmesser 1,5 cm mit 30 g (Feuchtgewicht) Dowex® 50 W χ 4, (H + )
200-400 mesh in 0.001 η HCI.
Anschließend pumpt man 500 ml Mischdesorbat (400 000 SIE/L, pH 2,5, 60% Aceton), erhalten nach
Beispiel 9 (Tabelle, laufende Nr. 7) in ca. 1 Stunde durch die Säule und wäscht anschließend mit 500 ml 0.001 η
HCl nach. Unter diesen Bedingungen wird nur spurenweise Aktivität eluiert. Daran anschließend
wurde mit 0.0125 η HCI desorbiert, wobei die Leitfähigkeit oder das Brechungsindex des Säuleneluats registriert
wurde. Außerdem wurde der SIE-Gehalt des Eluats getestet. Die aktiven Fraktionen 74—100 werden
vereinigt und durch Zugabe von Amberlite® IRA 410 OH" neutralisiert, dann eingeengt auf 5 ml, mit 5 ml
Methanol reagiert und durch Eintropfen in 200 ml Aceton gefällt. Nach Waschen mit Aceton und Äther
wurde im Vakuum getrocknet.
Ausbeute 1 g der Verbindung mit m + 112 = 2 mit
65 000SIEZg.
Aus den aktiven Vorfraktionen können die Verbindungen mit πι + /72 = 3 und 4 Glucoseeinheiten
gewonnen werden.
Dieses Verfahren der sauren Desorption ermöglicht also im Gegensatz zur alkalischen Desorption eine
Fraktionierung der einzelnen Aminozuckerderivate dieser Reihe.
Wenn man dem wie oben beschriebenen zubereiteten Stoff mit 4 bis 8 Glucoseeinheiten diesem Verfahren
unterwirft, wobei die neutralisierten Eluate lediglich
/Jl+/72 =
Πι + /72 =
lyophilisiert werden, erhält man die folgenden einzelnen höheren Fraktionen:
4 = 67.000 AI E/mg
5 = 57.000 AI E/mg
6 = 42.000 AI E/mg
7 = 24.000 AI E/mg
8 = 5.000 AI E/mg
Beispiel 13
Das oben beschriebene j3-Amylase-Abbauverfahren
wird folgendermaßen durchgeführt.
100 mg Verbindung wurden in 1,9 ml 20 mM Nalriumacetatpuffer
(pH 4,75) gelöst und mit 0,1 ml jS-Amylase
»us sweet potato (BOEHRiNGER Nr. 15471; 5 mg/ml;
500 E/mg) Vcrscizi. Die Mischung würde 48 Siunden bei
37°C gehalten Und für 5 Minuten auf 100°C erhitzt und
anschließend bei 4500 Upm zentrifugiert, um ausgefälltes
Eiweiß und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die ganze Mischung wurde dann auf eine Säule mit
Bio^Gel P 2 (Durchmesser 22 mm; 100 cm lang; bei 65°C thermostatisiert) aufgetragen und mit Wasser bei
einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Std. eluiert. D'as
Eluat wird durch ein Konduktometer und ein hochempfindliches
Refraktometer mit Durchflußküvetten geleitet. Fraktionen von jeweils 2,5 ml wurden aufgefangen.
Die Fraktionen können auf Am.ylase- oder Saccharasehemmaktivität oder mittels des Anthrontests auf
Kohlenhydratgehalt geprüft werden. Die aus dem Puffer stammenden Elektrotypen und das Enzympräparat
werden mit dem Leervolumen um1 die Abbauprodukte
nach abnehmendem Molekulargewicht eluiert.
Vollständige Abtrennung der Verbindungen, deren Molekulargewichte sich wenig unterscheiden, wird
durch recycling chromatography unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Fraktionen,
die zu isolierende Produkte enthalten, werden vereinigt
ίο und lyophilisiert.
Beispiel 14
Zur Trennung der isomeren Verbindungen mit drei Glucoseeinheiten wurden IO g einer in Wasser gelösten
Isomerenmischung auf eine mit Dowex®50 W χ 4(H+) gefüllte Säule mit Wasser gewaschen, bis das Elual
neuira! war, und dann niii 0,025 Π Salzsäure eiuieri.
Fraktionen von jeweils 3 ml würden aufgefangen und dünnsäiichtchromatographisch geprüft. Dünn-Schichtchromatographie
wurde auf silanisierten Kieselgelplatten mit 100:60:40:2 Äthylacetat + Methanol
+ Wasser 4- 25% Ammoniak mit dreifacher Entwicklung durchgeführt. Die 6 g Isomeres mit der Formel Il
enthaltenden Fraktionen 215 bis 272 wurden vereinigt, mit Amberlite® IRA-410 (OH-) neutralisiert und
eingeengt.
Die in vitro Saccharase-Hemmaktivität des durch dieses Verfahren isolierten Isomeren der Formel IV ist
19.000 SI U/g.
Claims (1)
- Patentansprüche: 1. Arninozuckerderivaie der allgemeinen FormelH-HOHOOH
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