CS214749B2

CS214749B2 - Means for treating the diseased plants and method of preparation of active substance

Info

Publication number: CS214749B2
Application number: CS776678A
Authority: CS
Inventors: Eiji Higashide; Mitsuko Asai; Seiichi Tanida
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-03-31
Filing date: 1977-10-13
Publication date: 1982-05-28
Also published as: SE8302517D0; PH15985A; PH13381A; CA1107212A; PT67854B; NL188102C; SE8302517L; SE7711542L; DE2746209C2; SE446004B; PL122289B1; NL188102B; PT67854A; YU245377A; DK458877A; DE2746209A1; IE46064B1; GB1586688A; PL201541A1; ES472230A1

Description

Vynález se týká prostředku s antimikrobiální, antiprotozoální a antifungální účinností, vhodného pro ošetřování nemocných rostlin a způsobu přípravy účinné složky tohoto prostředku.

Podle uvedeného vynálezu bylo shromážděno mnoho vzorků půd i jiných vzorků, přičemž byly zkoumány a vytříděny mikroorganizmy izolované ze zmíněných vzorků. Při těchto pokusech bylo zjištěno, že některé ze zkoumaných mikroorganismů jsou schopné produkovat nové antibiotikum, přičemž uvedené mikroorganismy patří k rodu Nocardia, a dále, že .při kultivaci těchto mikroorganismů ve vhodných živných prostředích je možné shromáždit uvedené antibiotikum v kultivačním prostředí. Podle vynálezu bylo rovněž zjištěno, že lze připravit různé deriváty uvedeného .antibiotika.

Podstata prostředku pro ošetřování nemocných rostlin podle uvedeného vynálezu spočívá v tom, že jako účinnou složku obsahuje antibiotikum. C-15003 obecného vzorce:

ve kterém znamená substituent R skupinu

CHs /

—CO—CH \

CH3 —-CO—CHz— CHž— CHs,

CH3 / —CO—CH2—CH \

CH3 nebo atom' vodíku.

Podstata způsobu přípravy účinné složky prostředku podle vynálezu výše uvedeného, obecného vzorce spočívá v tom, že se pěstuje mikroorganismus kmene Nocardia číslo C-15003 IFO 13726 v kultivačním prostředí, které obsahuje asimilovatelné zdroje uhlíku a stravitelné zdroje dusíku, při teplotě v rozmezí od 20 °C do 35 °C s počátečním pH okolo hodnoty 7 za aerobních podmínek tak dlouho, dokud se zmíněné antibiotikum· C-15003 nenahromadí v uvedeném živném prostředí, a potom se případně takto získané antibiotikum C-15003 podrobí redukční hydrolýze za vzniku sloučeniny .obecného vzorce:

Ve výhodném . provedení postupu .podle uvedeného. vynálezu se výše uvedená redukční hydrolýza provádí za pomoci komplexního· kovového hydridu. Jako komplexního kovového hydridů je výhodné použití lithiumaluminiumhydridu.

K výhodám. prostředku podle uvedeného vynálezu náleží výborné antimikrobiální, antiprotozoální a. antifungální vlastnosti, použitelné při léčení rostlin.

V popisu tohoto vynálezu značí výraz „antibiotikum C-15003“ obecně bud skupinu všech tří sloučenin majících shora uvedený obecný vzorec I, nebo .směs dvou nebo tří zmíněných sloučenin, nebo jednotlivě kteroukoliv z uvedených . sloučenin. Sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R značí skupinu vzorce

CH3 /

—CO—CH .....

\

CHs

-15003 P-3“; sloučenina obecného vzorce I, ve kterém . R značí skupinu vzorce —CO—CH2—CH2—CH3, jest označována, jako „antibiotikum C-15003 P-3‘ “, nebo zkráceně „C-15003 P-3‘ “; sloučenina .obecného vzorce I, ve kterém R značí skupinu . vzorce

CH3 /

—CO—CH2— CH \

CHs jest označována jako „antibiotikum C-15003 P-4“, nebo zráceně „C-15003 P-4“; a sloučenina obecného vzorce I, ve kterém R značí atom . vodíku ( tj. sloučenina vzorce II) jest označována jako „antibiotikum. C-15003 P-O“, nebo' zráceně „C-15003 P-O“.

Jako příklad kmene mikroorganismů produkujícího .antibiotikum C-15003 lze uvést kmen antinomycet číslo. C-15003, který autoři vynálezu vyisolovali z půdy . i z jiných vzorků při. studiu a třídění mikroorganismů produkujících antibiotika.

Mikrobiologické znaky kmene číslo C-15003 byly stanoveny analogickými způsoby, jak jsou popsány Schirlingem & Gottliebem (International Journal of Systematic Bacteriology 16, 313-340 /1966/). Výsledky pozorování provedených během 21 dnů při 28 °C jsou uvedeny níže.

1. Morfologické znaky

Vegetativní mycelium roste dobře .a vyvíjí se ve formě rozvětvených vláken, a to jak na .agaru, tak v tekutém živném prostředí. Četné hyfy mají průměr 0,8-1,2 ,tm. a v některých případech se mohou rozpadat na částečky podobající se tyčinkovitým bakteriím nebo· krátkým rozvětveným hyfám. Kmen roste dobře na různých taxonomických. živných . půdách, přičemž ... na povrchu vegetativního mycelia se tvoří vzdušné mycelium, . které často tvoří útvary podobné kcromiu . (svazky konidioforů o rozměrech 50,-200. X 200—1000 μΐη), na. kterých . je umístěno. budoucí vzdušné mycelium. Četná vzdušná mycelia jsou zprohýbaná, přímá nebo. volně spirálovitá, jak byl tvar určen při různých příležitostech. Mikroskopické hodnocení zralých kultur ukazuje, že jen v řídkých případech se na vláknech, objevují buňky podobné konidiím, zatím co buněčné .suspense získané z povrchů zmíněných kultur obsahují,. jak bylo zjištěno mikroskopicky, četné protáhlé elipsoidní (0,8-1,2 ^m X X 4,8-6,8 ..μϊίι) a elipsoidní (0,8-1,2 μ X X 1,0—2,0 μΐη) tělíska .podobající se arthrosporám.

Při pozorování pomocí elektronového mikroskopu bylo. . zjištěno, že tato tělíska mají hladký povrch.

jest v popisu vynálezu označována jako „antibiotikum C-15003 P-3“, nebo. kratčeji „C2. Složky buněk

Kmen byl kultivován za. třepání na módi214749 fikované ISP živné půdě číslo 1 při 28 °C po dobu 66—90 ' hodin a po uvedené době byly buňky odděleny a propláchnuty. Veškeré získané buňky byly poté hodnoceny metodou popsanou B. Bockerem a spolupracovníky (Applied Microbiology 12, 421 /1964/) a metodou popsanou Μ. P. Lechevalierem (Journal of Laboratory and Cttnical Medicíno 71» 934 /1968/) na obsah kyseliny -diamtoopimelové a na složení cukrů. Bylo nalezeno, že prvá látka je přítomna v meso-formě, a byly detegovány stopy látek, které odpovídaly galaktose a a.rabinose,

3.. Charakteristice znaky na různých taxonomických živných, půdách

Kmen. vykazuje poměrně dobrý růst ®a různých živných půdách, přičemž v- počátečních fázích kultivace je vegetativní mycelium bezbarvé až bledě žluté a v pozdějších fázích světle žlutohnědé až žlutohnědé. V různých taxonomických prostředích produkuje kmen rozpustná barviva, žlutá až' žlutohnědá. Vzdušné, mycelium je prachové, ob vykle středního vzrůstu, bílé až- žluté nebo světle žlutohnědé. Charakteristické znaky kmene na různých taxonomických půdách jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Charakteristické kultivační znaky- kmene číslo C-15003 na různých taxonomických půdách

A. Nitrátový agar se sacharosou:

Růst (G):

bujný, barva melounově- žlutá (3 iaj* - -až' jantarově žlutá (3 1c)*, tvorba útvarů podobných koremiu

Vzdušné, mycelium (AM):

sporé, bílé

Rozpustná barviva (SP): žádné nebo- světle- žlutohnědé

B. - Nitrátový agar s glyc.erol.em:

G: středn,,. barva -světlé, -slonové kosti (2 ca)*, tvorba útvarů podobných koremiu AM: střední, bílé

SP: žádné

C. - Asparaginový agar s glukosou:

G; střední, barva aksamitníkově žlutá - (3 pa)* až- jasně- žlutá (2 pa.)*

AM.:, sporé, bílé

SP: žluté (2 *a)*

D. Asparaginový agar s glycerolem:

G: střední, barva světle -slonové kosti - (2 car,, tvorba útvarů podobných koremiu AM: -sporé, bílé

SP: žádné.

E. Škrobový agar:

G: střední, barva světlé slonové kosti (2 ca)’ až barva světlé kukuřice (2. &a)* tvorba útvarů podobných koremiu AM: hojné, barva světlé slonové kosti (2 ca)*

SP: žádné

F. Živný agar:

G: střední, barva světlé -slonové kosti (2 ca)* až starobylé žluti (2. ga)*, tvorba útvarů podobných koremiu

AM: sporé, bílé

SP: žádné

G. Kalciummalátový agar:

G: střední, barva -světlé slonové kosti (2 -ca)* až barva světlé kukuřice (2 ea)*, tvorba útvarů podobných koremiu

AM: střední, barvy bílé až barvy světlé slonové kosti (2 ca) *

SP:žádné

H. Agar -s kvasničným extraktem a sladovým extraktem:

G: střední, barva jantarově žlutá (3 1c)* až jasně žlutá (3 lap, tvorba útvarů podobných koremiu

AM: střední, barvy bílé až barvy světlé, slonové' kosti (2 ' ca.)* .

SP: žádné

I. Agar -s ovesnou moukou:

G: - střední, barva světlé slonové kosti (2 -ca.)* -až starobylé žluti (2 *a)* - tvorba útvarů podobných koremiu

AM: -sporý, barvy bílé až světle žluté

SP: žádné .....

J. Peptonový agar s kvasničným extraktem a železem:

G: -střední, barva starobylé žluti (2 ga)*

AM: žádné

SP: starobylá žluť (2 -ga)*

K. Tyrosinový agar:

G: střední, barva světlé slonové - kosti (2 ca)* až -světle melounově žlutá (3 ea)*, tvorba útvarů podobných -koremiu.

AM: střední, barvy bílé až barvy světlé slonové- kosti (2 -ca.)*

SP; hnědorůžově zbarvené (3 ie)*

i)- Označení barev podle příručky Color Hormony Manual, 4, vydání (vydavatel Container Corporatlon -of America, 1958).

4. Fysiologické vlastnosti

Fysiologické. vlastnosti kmene jsou uvedeny v tabulce 2. Kmen roste v rozmezí teplot

12—38. °C. Rozsah teploty, ve kterém, dochází -k dobrému vzdušnému růstu na agaru (ISP -číslo- 2) je 20—35 °C.

Tabulka 2

Fysiologické vlastnosti kmene číslo C—15003

Rozmezí teplot vhodné pro růst: 12 až 38 °C

Rozmezí teplot vhodné pro vzdušný růst: 20 až 35 °C

Ztekucování želatiny: positivní

Hydrolysa škrobu: positivní

Redukce dusičnanů: positivní

Peptonisace mléka: positivní

Koagulace mléka: negativní

Rozklad kaseinu: positivní

Tvorba melaninových barviv: negativní (peptonový agar s kvasničným extraktem a železem) positivní (tyrosinový agar) Rozklad tyrosinu: positivní

Rozklad xanthinu: negativní

Rozklad hypoxanthinu: negativní Tolerance vůči lysozymu: positivní

Tolerance vůči chloridu sodnému: 2 %

5. Využívání různých zdrojů uhlíku

Využívání různých zdrojů uhlíku kmenem C-15003 bylo sledováno za použití prostředí popsaného Pridhamem a Gottllebem (Journal of Bacteriology 56, 107 /1948/) a za použití základního živného prostředí o stejném složení, ke kterému bylo přidáno 0,1 % kvasničného extraktu. Získané spektrum je uvedeno v následující tabulce 3

Tabulka 3

Využívání různých zdrojů uhlíku kmenem číslo 015003

Zdroj uhlíku	Růst
D-xylosa	+	4-4-*
L-arabinosa	+	+
D-glukosa	++	—1_
D-galaktosa	4-	+
D-fruktósa	4-4*4-	4-4-
L-rhamnosa	4-	+
D-mannosa	4—1—H	++
sáčharosa	4-4-	4-4-
laktosa	—	—
maltosa	4-	4-
trehalosa	X	4-4-

Zdroj uhlíku	Růst
rafinosa	+	4-*
melibiosa	4-	4-
i-inositol	—
D-sorbitol	—.
D-mannitol	4-4-		-4-
glycerol	—
rozpustný škrob	+
kontrola	—

*) Základní živné prostředí s přídavkem

Paznámka:

4—F+ bujný růst

-|—j- dobrý růst + růst + slabý růst — žádný růst

6. Další charakteristické znaky

Buňky byly vypěstovány způsobem popsaným výše ad 2. a DNA byla připravena způsobem popsaným J. Marmurem a spolupracovníky (Journal of Molecular Biology, 3, 208 /1961/). Obsah G—C (guanin-cytosinu) v DNA byl nalezen asi 71 mol °/o.

Gramovo barvení vegetativního mycelia tohoto kmene bylo positivní.

Shora uvedené charakteristické znaky kmene číslo C-15003 byly srovnány s popisy uvedenými v S. A. Waksmanově monografii „The Actinomycetes“, svazek 2 (vydavatel Williams and Wilkins Co., 1961), s popisy v příručce R. E. Buchaná a N. E. Gibbonse „Bergey* s Manual of Determinative Bacteriology“, 8. vydání, 1974, a s popisy uvede

1,1 % kvasničného extraktu.

nými v další literatuře.

Ačkoliv se autoři vynálezu domnívali, že tento kmen patří do skupiny III rodu Nocardia, nepodařilo se jim najít mezi známými kmeny žádný druh mající shora popsané charakteristické znaky a proto usuzují, že tento kmen představuje nový druh mikroorganismů.

Předmětný kmen číslo C-15003 je uložen ve Výzkumném ústavu pro fermentaci (Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology /FERM/) pod přijímacím číslem 3992, a v Ústavu pro fermentaci v Osace (Institute for Fermentation, Osaka /IFO/J pod přijímacím číslem IFO 13726, a v Americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA) pod přijímacím číslem 31281.

Ačkoliv je kmen číslo C-15003, jak již bylo uvedeno, novým druhem rodu Nocardia, je schopný, jako všechny mikroorganismy, podléhat různým variacím a mutacím, buď spontánně nebo působením mutagenů. Například lze získat četné varianty kmene oza214749 řováním X-paprsky, gama-paprsky, ultrafialovým světlem -atd., isolací jednobuněčných buněk, kultivací ' kmene na živných půdách obsahujících různé chemické látky, anebo jakýmkoliv jiným mutagenním působením, a rovněž mutanty vzniklé spontánně z původního kmene nelze v podstatě pokládat za jiný odlišný druh, ale spíše lze kteréhokoliv takového varianta nebo- mutanta původního kmene, schopného produkovat antibiotikum C-15003 P-3, P-3‘ a/nebo P-4, používat beze změny pro účely tohoto vynálezu stejně jako kmene číslo- C-15003. Když se kmen číslo C-15003 podrobí působení různých mutangenů, získají se například mutanty, kterým v podstatě chybí schopnost produkovat rozpustná ' barviva, nebo mutanty, jejichž základní myoelia jsou bezbarvá, žlutavě zelená, červenohnědá nebo oranžově červená, nebo mutanty, jejichž hyfy jsou schopné se rozpadat na tyčinkovité částečky nebo krátké rozvětvené fragmenty hyf, nebo mutanty s hojným bílým vzdušným -myceliem anebo téměř vůbec bez vzdušného mycelia.

Jako prostředí pro kultivaci kmene -schopného produkovat antibiotikum C-15003 lze použít jakéhokoliv tekutého nebo pevného živného prostředí, jen pokud obsahuje živiny, které může kmen využít; tekuté prostředí je výhodné při výrobě ve velkých násadách. Živné prostředí musí obsahovat zdroje uhlíku a dusíku, které je kmen číslo C-15003 schopen asimilovat a strávit, anorganické látky, stopové živiny a další látky. Jako příklad zmíněných zdrojů uhlíku lze uvést glukosu, laktosu, sacharosu, maltosu, dextrin, škrob, glycerol, mannitol, sorbitol a podobné látky, tuky a oleje (například -sójový olej, olej vylisovaný ze sádla, kuřecí olej a podobné) -atd. Jako zdroje dusíku mohou -sloužit například masový výluh, kvasničný výluh, sušené kvasnice, sójová moučka, kukuřičný výluh, pepton, bavlníková moučka, prokvašená melasa, močovina, amonné -soli (například síran amonný, chlorid amonný, -dusičnan amonný, octan -amonný atd.) a podobné suroviny. Živná půda může dále obsahovat soli sodíku, draslíku, vápníku, hořčíku atd., soli železa, manganu, zinku, kobaltu, niklu atd., soli kyseliny fosforečné, kyseliny borité -atd., a soli organických kyselin, jako octany a propionany. Živné prostředí může dále obsahovat, j-ako· přídavek, různé aminokyseliny (například kyselinu glutamovou, kyselinu asparagovou, alanin, glycin, lysin, methionin, prolin atd.), peptidy (například dipepťidy, tripeptidy atd.), vitaminy (například -vitamin Bi a Bž, kyselinu nikotinovou, vitaminy B12, C, E a další), nukleové kyseliny (například purin, pyrimidin a jejich deriváty) a další látky. Za účelem úpravy pH -živného prostředí lze -přidat anorganickou nebo organickou kyselinu, alkálii, pufr a -podobné látky. Dále lze k prostředí přidat vhodné množství -odpěňovacích prostředků, například olejů, tuků, povr10 chově aktivních látek a podobných prostředků.

Kultivaci kmene lze provádět za stacionárních podmínek, za třepání, za submersních aerobních podmínek i za jiných -kultivačních podmínek. Pro velkoprodukční násady jest samozřejmě, výhodná submersní aerobní kultivace. Podmínky kultivace závisí samozřejmě na formě a složení živného prostředí, na druhu kmene, na způsobu kultivace -a na dalších faktorech; normálně se dává přednost provádění inkubace při 20 až 35 °C, při počátečním· -pH asi 7,0 nebo podobném. Obzvláště výhodná teplota ve středním stadiu kultivace- je 23 až 30 °C, při počátečním pH 6,5 až, 7,5. Doba kultivace je rovněž proměnlivá a je závislá na -stejných faktorech jaké byly uvedeny výše; je -vhodné pokračovat v kultivaci tak dlouho, -dokud titr vznikajícího antibiotika nedosáhne maxima. V případě provádění kultivace za třepání nebo· v případě aerobní submersní kultivace v tekutém živném prostředí -se -potřebná doba kultivace pohybuje -normálně v rozmezí 48 až 144 hodin.

Množství vzniklého antibiotika se stanovuje za použití mikroorganismu Tetrahymena -pyriformis W jako testovacího organismu. Uvedený mikroorganismus -se pěstuje na testovací živné půdě (20- g - proteázopeptonu (Difco), 1 g -kvasničného extraktu (značky Difco), 2 g glukosy, 1000 ml - destilované vody a 10·' -ml ΙΜ-fosfátového pufru /pH 7,0/) při 28 °C po dobu 44 až 48 hodin a -množství antibiotika se -stanoví -sériovou zřeďovací metodou, při které se sleduje zákal způsobený buňkami -mikroorganismů; současně se množství antibiotika stanoví na -základě jeho inhibičního účinku na -ascitické nádorové buňky, a tenkovrstevnou chromatografií (TLC), která je popsána níže.

Nová antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ -a/nebo P-4 jsou mikroorganismem produkovány -a hromaděny v kultivační živné -půdě jednak extracelulárně -a jednak intracelulárně.

Uvedená antibiotika -se rovněž detegují pomocí -tenkovrstevné -chromatografie. Fer- mentační kapalina se filtrací nebo odstředěním rozdělí na podíl obsahující buňky a -na filtrát, -a filtrát se vytřepe -stejným objemem -ethylacetátu. K buňkám se -přidá stejné množství 70^o/ornti-o vodného acetonu jako -k filtrátu, suspense se -míchá jednu hodinu při 20 °C a -pak se zfiltruje. Z filtrátu se -odstraní aceton za -sníženého tlaku -a zbývající vodný podíl se vytřepe ethylacetátem. Každý jednotlivý ethylacetátový -extrakt se zahustí na 1/100 původního -objemu a koncentát se podrobí tenkovrstevné chromatografli na vrstvě silikagelu nanesené na skleněné desce (Merek, Německá spolková republika, Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, -20 X X 20 cm) za použití rozpouštědlové soustavy -chloroform-methanol 9 : 1. Množství látek se stanoví na základě intensity fluorescence skvrn po detekci -ozářením ultrafialovým světlem při 2537 A.

Antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ a/nebo P-4, která jsou - - uvedeným způsobem produkována -do kultivační živné půdy, jsou lipofilní a neutrální látky, které lze isolovat a čistit běžnými -separačníml a čisticími postupy, kterých se normálně používá při isolaci podobných mikrobiálních metaholitů. Tak například lze - použít -postupů, které využívají rozdílů v rozpustnosti mezi antibiotikem a nečistotou, nebo· způsobů, které využívají frakční -adsorpční afinity různých adsorbentů, jako aktivního uhlí, -makroporézních neionogenních pryskyřic, silikagelu, kysličníku hlinitého· · a podobných, nebo postupů - využívajících k odstranění nečistot iontoměničových pryskyřic, nebo podobných postupů; uvedené postupy lze aplikovat jednotlivě nebo ve vhodných kombinacích nebo opakovaně.

Vzhledem k tomu, že se, jak již bylo· uvedeno výše, antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ a P-4 vyskytují jak ve filtrátu živného prostředí, -tak v buňkách, -dají se zmíněná antibiotika. isolovat -a čistit pomocí uvedených adsorbentů buď přímo, nebo po extrakci filtrátu - rozpouštědlem, nebo po extrakci mikrobiálních buněk rozpouštědlem. Extrakci antibiotik rozpouštědlem lze provádět jedním z níže uvedených způsobů, nebo jinými způsoby, například:

1. - extrakcí rozpouštědlem z kultivační živné - půdy bez oddělení buněk, - a 2. extrakcí rozpouštědlem z buněk a z filtrátu po jejich vzájemném oddělení filtrací, -odstředěním nebo jinými způsoby. K extrakci filtrátu a buněk, každého- uvedeného podílu samostatně, lze s výhodou použít následujícího postupu.

Jako vhodných rozpouštědel lze k extrakci filtrátu použít -organických rozpouštědel ne•míaitelných s vodou, jako -esterů mastných kyselin, například ethylacetátu nebo amylacetátu; -alkoholů, například butanolu; halogenovaných uhlovodíků, například chloroformu; a ketonů, například methylisobutylketonů. Extrakce -se provádí při pH blízkém neutrální hodnotě, a výhodně -se kultivační kapalina, upravená předem na pH 7, extrahuje -ethylacetátem. Extrakt se -promyje vodou a zahustí za -sníženého tlaku. Ke koncentrátu se -pak -přidá nepolární rozpouštědlo, jako petrolether nebo hexan, a získá se -surový produkt I - -obsahující účinnou látku. Vzhledem k tomu, že při hodnocení pomocí TLC obsahuje produkt I řadu skvrn jiných než antibiotikum C-15003, podrobí se surový produkt dalším čisticím operacím. Jako rutinní čisticí postup je vhodná zvláště adsorpční chromatografie, ke které lze použít jednoho z následujících běžných adsorbentů: -silikagelu, kysličníku hlinitého, makroporésní neionogenní -adsorpční pryskyřice a podobných. K čištění -surového produktu I jest nejvýhodnější silikagel. Eluce- se -může provádět například nejdříve -petroletherem a hexanem, a poté jejich směsemi s polárními rozpouštědly, například s ethylacetátem, acetonem, ethanolem nebo methanolem. Při typickém -postupu se používá sloupcové chromatografie na silikagelu (Merck, Německá spolková republika, 0,05—0,2 mm] jako nosiči a eluce látek -se provádí nejprve hexanem, pak -směsí - hexanu, se stoupajícím množstvím ethylacetátu -a nakonec ethylacetátem. Eluát se jímá po frakcích, které se hodnotí pomocí TLC, a frakce obsahující -antibiotikum C-15003 se spojí a zkoncentrují za sníženého tlaku. Ke koncentrátu -se přidá petrolether nebo hexan a získá se surový produkt II. Jelikož -tento produkt obsahuje ještě nečistoty, čistí -se dále následujícím způsobem. Například se surový- produkt II opakovaně chromatografuje na sloupci -silikagelu v odlišném rozpouštědlovém systému. K - tomuto účelu je vhodný například eluční -systém skládající -se z halogenovaného uhlovodíku, jako dichlormethanu nebo- chloroformu, s - přídavkem -polárního rozpouštědla, jako alkoholu, například methanolu nebo· ethanolu, ketonu, například acetonu nebo methylethylketonu, nebo podobných rozpouštědel. Tímto způsobem se získá čisté antibiotikum C-15003. Pořadí rozpouštědlových -systémů použitých -pro -první a druhou sloupcovou chromatografii na silikagelu -může být -obrácené, a dále se -může použít v kombinaci s výše uvedenými systémy, popřípadě i dalších běžných organických rozpouštědel.

Použije-li -se k čištění surového -produktu II makroporésní adsorpční pryskyřice, provádí se eluce antibiotika - C-15003 směsí vody -s - nižším alkoholem, nižším ketonem -nebo esterem. Jako- nižšího alkoholu -se může použít na- příklad methanolu, ethanolu, propanolu nebo butanolu, jako nižšího ketonu například acetonu nebo methylketonu a jako- esteru například ethylacetátu. Při typickém -postupu se surový produkt II rozpustí v 60^!%ním vodném methanolu, roztok se naadsorbuje na sloupec pryskyřice značky Dianion HP-10 (výrobek firmy Mitsubishi Kasei K. K.-sloupec se promyje 70%ním vodným methanolem a pak -se -provede- eluce 90'%ním vodným methanolem, který -se ze sloupce vyeluuje antibiotikum C-15003.

Při kterémkoliv ze -shora· popsaných způsobů čištění se frakce obsahující antibiotikum C-15003 spojí a rozpouštědla -se oddestilují za sníženého tlaku. K -suchému odparku se -přidá 5 až 8 objemových dílů ethylacetátu a -směs -se ponechá -stát, - přičemž se vyloučí -krystaly -antibiotika C-15003; tyto krystaly obsahují antibiotikum C-15003 P-3, P-3‘ a P-4. Uvedené sloučeniny se oddělí jedna -od druhé pomocí chromatografie -na vhodném adsorbentu, například na jednom ze shora uvedených adsorbentů. Například za použití -silikagelu nebo makroporézní neionogenní adsorpční pryskyřice a shora uvedených rozpouštědlových -systémů lze frakč214749 ně eluovat žádané sloučeniny. Použijedi se například k dělení zmíněné směsi silikagelu, provádí se eluce hexanem, ethylacetátem nebo směsí chloroformu s methanolem; ze sloupce vytékají ' nejprve frakce obsahující antibiotikum C-15003 P-4, pak frakce obsahující C-15003 P-3‘ a nakonec frakce obsahující C-15003 P-3. Po zhodnocení pomocí TLC se frakce obsahující jednotné látky C-15003 P-4, P-3‘ a P-3 spojí, rozpouštědla se oddestilují za sníženého tlaku a k odparku se přidá ethylacetát. Tímto způsobem se dají získat čisté sloučeniny v krystalické formě. Použije-li se k dělení makroporézní neionogenní adsorpční pryskyřice, aplikuje se při ehromatografii gradientová· eluce za užití stoupajícího množství alkoholu, ketonu nebo esteru ve vodě. Například při gradien tově eluci za použití 60%ního vodného methanolu až 95%ního vodného methanolu, s přídavkem· 5 °/o chloridu · sodného, vytékají ze sloupce nejprve· frakce obsahující antibiotikum C-15003 P-3, pak ' frakce ' obsahující C-15003 P-3‘ a nakonec frakce obsahující C-15003 P-4. Frakce se jímají, zhodnotí pomocí TLC, z každé skupiny frakcí obsahujících stejnou účinnou látku se oddestilují rozpouštědla za sníženého tlaku a odparky se překrystalizují z ethylacetátu.

Získané krystalické látky obsahují ethylacetát jako krystalové rozpouštědlo; po vysušení nad · kysličníkem fosforečným při 70 · °C (po dobu 8· hodin) vykazují antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ a P-4 následující fysikální a chemické · vlastnosti (viz tabulku 4).

Tabulka · 4

Fysikální a chemické vlastnosti antibiotika C-15003

Antibiotikum C-15003 P—3 P—3‘ P—4

C32H43CIN2O9 = 635,169 C32H43CIN2O9 = 635,169 C33H45CIN2O9 = 649,196

Bod tání

Specifická rotace

14²²

Elementární analysa

Nalezeno (%)

Elementární analysa

Vypočteno (%)

Ultrafialové absorpční spektrum nm (ε) (v methanolu) Infračervená ápsorpční spektra (cm'¹) KBr

Nukleární magnetické resonanční spektrum (PPm)

100 MHz v CDCls

Hmotové spektrum (m/e)

Rozpustnost

190 až 192 °C —136° + 10° (c = 0,375, CHCI3)

C60,06

H7,04

N4,33

Cl5,37

C60,51

H6,82

N4,41

Cl5,58

233 (30250) 240 (sh 28450) 252(27640) 280-(5750) 288(5700)

1740, 1730, 1670,

1580, 1445, 1385,

1340, 1255, 1180,

1150, 1100, 1080, 1038 l,27(d) (3H) l,28(d) (3H)

573, 485, 470, 450 nerozp. v petroletheru, nerozp. v petroletheru, hexanu a vodě ’ ‘ málo rozpustný v benzenu a etheru rozpustný v chloroformu, ethylaceátu, acetonu, ethanolu, methanolu, pyridinu, tetra-thanolu, pyridinu, tetra-thanolu, pyridinu, tetrahydrofuranu, dimethyl- hydrofuranu, dimethyl- hydrofuranu, dimethylsulfoxidu sulfoxidu . sulfoxidu

182 až 185 '°C —134° + 10° (c = 0,11, CHCl3)

60,09

7,02

4,34

5,99

60,51

6,82

4,41

5,58

233(30155) 240 (sh 28250) 252(27600)

280(5750) 288(5700)

1740, 1730, 1670,

1580, 1445, 1385,

1340, 1255, 1180,

1150, 1100, 1080, 1038 l,06(t) (3H)

573, 485, 470, 450 hexanu a vodě málo rozpustný v benzenu a etheru rozpustný v chloroformu, ethylacetátu, acetonu, ethanolu, me177 až 180 °C —142° + 10° (c = ·0,522, CHCI3)

60,65

7,05

4,25

5,23

61,05

6,99

4,32

5,46

233(29900) 240 (sh 28240)· 252 (27590) 280(5712) 288(5680)

1740, 1730, 1670, 1580, 1445, 1385, 1340, 1255, 1180, 1150, 1100, 1080, 1038 l,03(d) (6H)

587, 485, 470, 450 nerozp. v petroletheru, hexanu a vodě málo rozpustný v benzenu a etheru rozpustný v chloroformu, ethylaceátu, acetonu, ethanolu, meBarevné reakce

Dragendorff: positivní Dragendorff: positivní Dragendorff: positivní Beilstein: positivní Beilstein: positivní Beilstein: positivní

1S

Shora popsané antibiotikum C-15003 bylo srovnáváno na základě molekulových vah a níže uvedené antimikrobiální a antineoplastické účinnosti se známými skupinami antibiotik. Při literární rešerši se nepoidařilo najít žádnou zřejmou skupinu antibiotik podobnou antibiotiku C-15003. Když však byly hledány mezi známými složkami rostlin a mezi dalšími organickými sloučeninami vyskytujícími se v přírodě látky s podobným ultrafialovým absorpčním spektrem jako mají antibiotika připravená způsobem podle tohoto vynálezu, bylo zjištěno, že podobná spektra antibiotika maytanacinové skupiny, a ze srovnání příslušných molekulových vah a sumárních vzorců bylo usouzeno, že antibiotikum C-15003 patří do skupiny maytacinových antibiotik se dvěma atomy dusíku. Maytanacin byl již dříve isolován z kůry některých rostlin a popsán v časopisu Journal of Američan Chemical Society 97, 5294 (1975).

Maytanacin má níže uvedené hmotové spektrum.

M⁺ - (а) M+ — 485—СНз 485—Cl (a-|-b)

545 485 470 450 (a) = HžO + HNCO (b) = R—C—OH

O

Přítomnost fragmentů m/e 485, 470 a 450 u antibiotik C-15003 P-3, P-3* a P-4 přesvědčilo autory vynálezu, že tyto sloučeniny mají skelet struktury identický s maytanacinem, a že se liší od maytanacinu povahou acylové skupiny v poloze 3. Je tedy zřejmé, že antibiotikum C-15003 je novou sloučeninou. Když byla jednotlivá antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ a P-4 alkalicky odbourána a uvolněné karboxylové kyseliny analysovány plynovou chromatografií, bylo zjištěno, že se z antibiotika C-15003 P-3 získá kyselina isomáselná, z C-15003 P-3‘ kyselina máselná a z C-15003 P-4 kyselina isovalerová. Z výše uvedených údajů vyplývá struktura antibiotik C-15003 P-3, P-3‘ a P-4 znázorněná na obrázku 1.

Obrázek 1

P—3, R = —CO—CH \

СНз

P-3‘, R = — CO-CH2-CH2-CH3

СНз

P—4, R = —СО—CH2—CH \

СНз

Biologická účinnost:

A. Antimikrobiální účinnost

Inhibiční koncentrace antibiotika C-15003 byla testována metodou papírových disků za použití tryptokáso-sójového agaru (BBL) jako testovací živné půdy. Kotoučky z filtračního papíru (výrobce Toyo Seisakusho, tenký typ, průměr 8 mm), impregnované 0,02 mililitru roztoku antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ nebo P-4 v koncentraci 300 ^g/ml byly umístěny na agarových deskách naočkovaných níže uvedenými mikroorganismy a byly sledovány minimální inhibiční koncentrace antibiotik. Z testů vyplynulo, že předmětná antibiotika nemají účinnost vůči následujícím mikroorganismům: Escherichia coli, Próteus vulgaris, Próteus mirabelis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Mycobacterium avium.

Na druhé straně byla zjišťována inhibiční účinnost vůči růstu mikroorganismus Talaromyces avellaneus, pěstovanému na agarových deskách (složení živné půdy: 3,5 g hydrogenfosforečnanu sodného, 0,5 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 5 g kvasničného výluhu (Difcoj, 10 g glukosy, 15 g agaru, 1000 ml destilované vody, pH 7,0). V těchto testech byly nalezeny u antibiotik C-15003 P-3 a P-3‘ minimální inhibiční koncentrace 3 ,ug/ml, a u C-15003 P-4 1,5 jzg/ml. Dále byl kultivován divoký kmen Tetrahymena pyriformis W jakožto testovací organismus v ' živném prostředí (složení: 20 g proteázopeptonu (Difco), 1 g kukuřičného extraktu, 2 g glukosy, 1000 ml destilované vody a 10 ml 1 M fosfátového pufru pH 7,0) při 28 °C po dobu 44—48 hodin a sériovou zřeďovací metodou byla zjišťována inhibiční účinnost antibiotika C-15O0.3 vůči růstu tohoto specifického mikroorganismu. K inhibici růstu docházelo· při koncentraci 1 ,ug/ml u antibiotik C-15003 P-3 a P-3‘ a při koncentraci 0,5 ,ug/ /ml u antibiotika C-15003 P-4.

Antifungální účinnost antibiotika C-15003 je uvedena v tabulce 5. Jak je z této tabulky zřejmé, antibiotikum C-1-5003 má inhibiční účinnost vůči růstu •mikroorganismů, které způsobují různá onemocnění rostlin. Inhibiční účinnost byla zjišťována diskovou metodou, při které byly kotoučky filtračního papíru, napuštěné 0,02 ml roztoku antibiotika C-15003 o koncentraci 1000 /íg/ml, umístěny na agarové desky naočkované níže uvedenými mikroorganismy (viz tabulku 5).

Tabulka 5

Antimikrobiální spektrum antibiotika C-15003

Testovaný mikroorganismus	Číslo IFO	Prostředí	Doba (hod.)	Inhibiční průměr
Alternaria kikuchiana	7515	PSA*	48	38
Fusicladium levieri	6477	PSA*	90	68
Helminthosporium sigmo-
ideum var. irregulare	5273	PSA*	48	55
Pyricularia oryzae	—	PSA*	48	53
Elsinoe fawcetti	8417	PSA*	90	55
Fusarium -oxysporum
f. cucumerinum	—	PSA*	48	20
Guignardia laricina	7888	PSA*	48	12
Cochlioborus miyabeanus	5277	PSA*	48	60
Di-aporthe citri	9170	PSA*	48	55
Gibberella zeae	8850	PSA*	48	37
Sclerotinia
sclerotiorum	9395	PSA*	90	65
Venturia pirina	6189	PSA*	48	50
Pellicul-aria sasakii	9253	PSA*	48	50
Pythium aphanidermatum	7030	PSA*	48	58
Botrytis cinerea	—	PSA*	48	48
Aspergillus niger	4066	PSA*	48	0
Pe^;nicillium chrysogenum	4626	PSA*	48	35
Rhizopus nigricans	6188	PSA*	48	25
Saccharomyces cerevisiae	0209	PSA*	48	0
Rhodotorula rubra	0907	PSA*	48	28
Trichophyton rubrum	5467	GB**	48	38
Trichophyton mantagrophytes	7522	GB**	48	38
Candida albicans	0583	GB**	48	0
Candida utllis	0619	GB**	48	0
Cryptococcus neoformans	0410	GB**	48	43

) PSA: bramborový agar se sacharosou *) GB: živný agar s glukosou

B. Pro-tinádorová účinnost

Antibiotika - C-15003 P-3, P-3‘ a P-4 byla aplikována intraperitoneálně v devíti pr sobě následujících -dnech myším s leukémií P 388 (1 X 10® buněk na zvíře, transplantováno tntraperitoneálně) a byl sledován therapeutlcký účinek podaných látek. Uvedené sloučeniny vykázaly -protlnádorovu účinnost, projevující se v prodloužení doby života pokusných zvířat o více než 200· % při dávce 0,00625 mg/kg/den.

C. Toxicita

Akutní toxicita antibiotik C-15003 P-3, P-3‘ a P-4 byla stanovena u myší po intraperitoneálním injekčním podání látek. U všech podaných antibiotik byla nalezena hodnota vyšší než LDso 0,313 mg/kg.

Jak bylo uvedeno výše, antibiotikum C-15003 připravené způsobem podle vynálezu má vysokou inhibiční účinnost vůči houbáim a -protozoám, a proto je cenným antlfungálním a antiprotrzrál·ním prostředkem. Dále · lze očekávat vzhledem k tomu, že antibiotikum C-15003 prodlužuje dobu přežití experimentálních zvířat . (například -myší) s některými nádory, že tato ' sloučenina najde použití při léčení rakoviny.

Antibiotikum C-15003 lze jako látku s antifungální a antiprotozoáiní účinností používat s výhodou .při hodnocení bakteriální ekologie · v půdě, -v -aktivních kalech, v živočišných tělesných kapalinách a podobně. Tak například mají-li se isolovat cenné bakterie ze vzorků půd, nebo má-li -se hodnotit činnost -samotných bakterií, nezávisle .na činnosti různých druhů hub a protozoí, -například v souvislosti s úkony a analysami aktivního kalového systému používaného při úpravě -odpadních vod, -dá -se použít antibiotika C-15003, aby se umožnil -selektivní růst bakteriální flory -a nepřipustil -se. růst průvodních hub -a protozoí ve vzorku. V typickém příkladu - tohoto použití se testovaný vzorek přidá k tekutému nebo pevnému živnému -prostředí, pak -se na každý ml živné půdy přidá 0,1 ml roztoku - antibiotika C-15003 v l⁰/oním vodném, methanolu -o- koncentraci 10—100 ug/ml, a -směs -se inkubuje.

Antibiotika C-15003 se dá rovněž používat jako antimikrobiálního prostředku -k ošetřování onemocnění rostlin způsobených mikroorganismy uvedenými výše v tabulce 5.

Při typické aplikaci -se antibiotika C-15003 používá ve formě l%ního vodně-methanolického roztoku -obsahujícího- 0,5 až 5 ug/ml účinné látky. Uvedeného roztoku se dá použít například k ochraně -proti červenohnědé hnilobě listových pochev, proti sněti, proti helmiinthosporové pruhovitosti listů a proti sněti listových -pochev rýžových rostlin.

Z výše uvedeného popisu je zřejmé, že antibiotika C-15003 P-3, P-3‘ -a P-4 jsou nové sloučeniny, které mají stejný strukturní -skelet, -a lze- jich rovněž použít jako- mezipro duktů k výrobě dalších farmaceuticky významných -sloučenin. Tak například deacylační reakcí se z uvedených antibiotik dá získat antibiotikum c-15003 P-0 (maytansinol) -s volnou hydroxylovou -skupinou v -poloze 3 molekuly. Vzhledem k tomu, že acylová skupina se nachází v /-poloze ke karbonylu, lze k deacylaci s -výhodou -použít běžné redukční hydrolysy. Například působením komplexního hydridu kovu (například hydridu lithno-hlinitého, LiAlHá) při nízkých teplotách (například při —20 °C až 0 °C] se dá O-ester v poloze 3 hydrolyticky rozštěpit za vzniku maytansinolu, aniž by -se ovlivnily ostatní funkční skupiny, například karbonylová -skupina, epoxyskupina, dvojné vazby C = C atd. Fysikální a chemické vlastnosti vzorku takto získaného maytansinolu jsou v dobré shodě s údaji popsanými Kupchanem a spolupracovníky v časopisu Journal of Američan Chemical Society 97, 5294-5295 (1975).

Způsob podle vynálezu je dále objasněn v následujících -příkladech provedení, které však rozsah vynálezu nijak neomezují. Pokud není jinak uvedeno, znamenají „díly“ hmotnostní -díly, a vztah mezi „díly“ a „objemovými díly“ odpovídá vztahu mezi „gramy“ a „mililitry“; a „%“ -se vztahují, -pokud není udáno jinak, na poměr „váha/objem“.

Příklady provedení

Příklad 1

Kmen -č. C-15003 (IFO 13726; FERM 3992; ATCC 31281) druhu Nocardia - vypěstovaný na živné půdě (agar s kvasničným a sladovýmvýluhem) se použije k naočkování - 40 -objemových -dílů násadního kultivačního média. (2 % glukosy, 3 °/o rozpustného škrobu, 1 °/o surové sójové moučky, 1 % kukuřičného výluhu, 0,5 % polypeptonu, 0,3 % chloridu sodného, 0,5 % uhličitanu vápenatého, pH 7,0] nacházejícího se ve fermentoru o obsahu 200. objemových -dílů. Naočkované médium se inkubuje 48 hodin -při 28 °C, čímž -se získá inokulum. 0,5 objemových dílů takto· připraveného inokula se přenese do fermentoru o -obsahu 200 objemových dílů, ve kterém je 40 - objemových dílů fermentační půdy -složené z 5 % dextrinu, 3 % kukuřičného výluhu, 0,1 % -polypeptonu a 0,5 % uhličitanu vápenatého [pH 7,0], a kultivuje -se 90 hodin při 28 °C, čímž se získá inokulum (násadní kultura).

Sériovou zřeďovací metodou, za použití mikroorganismu Tetrahymena pyriformis W jako testovacího -organismu a antibiotika C-15003 P-3 Jako -standardu, bylo nalezeno, že shora uvedená kultura má titr 25 jg/ml.

Příklad 2

Dávka 10 objemových dílů inokula (násady) získaného postupem popsaným v -příkla214749 du 1 se přenese do fermentoru o obsahu. 2000 objemových dílů, který obsahuje 500 objemových dílů násadního kultivačního média (stejného složení jak uvedeno výše v příkladu 1) a kultura se inkubuje 48 hodin při 28 °C. Dávka 500 objemo-vých dílů takto získané kultury se přenese do fermentačního tanku z nerezové oceli o obsahu 50 000 objemových dílů, který obsahuje 30 000 objemových dílů násadního kultivačního média a mikroorganismus se kultivuje při 28 °C za provzdušňování (30 000 objemových dílů za minutu], za míchání [280 otáček za minutu (1/2DT) ] a za vnitřního tlaku 1 kg/cm²; získá se násadní kultura. Takto získaná násadní kultura se použije к naočkování fermentačního tanku z nerezové oceli o obsahu 200 000 objemových dílů, ve kterém se nachází 10 000 objemových dílů fermentační živné půdy podobného složení jako půda použitá v příkladu 1, v inokulačním poměru 10 %. Naočkovaná půda se inkubuje při 28 °C, za provzdušňování (100 000 objemových dílů za minutu), za míchání [200 otáček za minutu (1/2 DT)] a za vnitřního tlaku 0,1 MPa po do-bu 90 hodin. Za použití testovací metody popsané v příkladu 1 bylo nalezeno, že shora uvedeným způsobem získaná kultura má titr 25 ^g/ml.

Příklad 3

К 90 000 objemovým dílům kultivační kapaliny získané způsobem popsaným v příkladu 2 se přidá 2000 dílů křemeliny Hyflo-supercel (g) (výrobek firmy Johnes and Manville Products, USA) a po důkladném promíchání se směs zfiltruje tlakovým filtrem; získá se 85 000 objemových dílů filtrátu a 32 000 dílů vlhkých buněk. Filtrát (85 000 objemových dílů) se za míchání extrahuje 30 090 objemovými díly ethylacetátu a uvedená operace se ještě jednou opakuje. Ethylacetátové podíly se spojí, promyjí dvakrát 30 000 objemovými díly vody, vysuší přidáním 500 dílů bezvodého síranu sodného a zahustí za sníženého· tlaku na 200 objemových dílů. Ke zkoncentrovanému roztoku se přidá petrolether a vyloučená sraženina se odfiltruje (výtěžek 53 dílů). Získaný surový produkt I se míchá se 100 objemovými díly ethylacetátu a nerozpuštěný podíl se odfiltruje. Filtrát se rozmíchá s 10 díly silikagelu (Merck, Německá spolková republika, 0,05—0,2 mm) a ethylacetát se odstraní za sníženého tlaku. Zbylý silikagel s naad- _ sorbovaným produktem se nanese na horní 2 konec silikagelového· sloupce (400 objemo-. .... vých dílů silikagelu) a produkty se eluují postupně 500 objemovými díly hexanu, 500 \ objemovými díly směsi hexanu s ethylacetá-.^. tem (3:1), 500 objemovými díly směsi hexanu s ethylacetátem (1:1), 500 objemovými _ díly směsi hexanu s ethylacetátem (1: 3),4^ 500 objemovými díly ethylacetátu, 1000 ob-.' jemovými díly směsi ethylacetátu s metha-^r nolem (50: 1), a eluát se jímá po frakcích o 100 objemových dílech.

Z každé frakce se odebere 1 objemový díl roztoku, rozpouštědlo se oddestiluje к suchu а к odparku se přidá 0,1 objemového dílu ethylacetátu. Směs se nanese ve vzdálenosti 2,5 cm od spodního okraje na skleněnou desku s vrstvou silikagelu (Merck, Německá spolková republika, 60 Fž54, 0,25 mm, 20 X 20 cm) a vyvolá do vzdálenosti asi 17 cm v rozpouštědlovém systému ethylacetáto-methanol (19 : 1). Po vyvolání se provede detekce pomocí ultrafialového světla (2537 A).

Frakce číslo 23-28 obsahující účinnou látku o R_f 0,60 až 0,65 se spojí a zahustí za sníženého tlaku asi na 20 objemových dílů. Ke zkoncentrovanému roztoku se přidá 150 objemových dílů petroletheru a získá se 15 dílů surového produktu II.

Příklad 4

000 dílů odfiltrovaných vlhkých buněk získaných způsobem popsaným v příkladu 3 se extrahuje za míchání 50 000 objemovými díly 70^,0/o»ního vodného acetonu po dobu 3 hodin. Směs se zfiltruje pomocí tlakového filtru a extrakce 50 000 objemovými díly 70°/oního vodného acetonu následovaná filtrací se opakuje ještě jednou. Filtráty se spojí, aceton se oddestiluje za sníženého tlaku a zbylý vodný podíl se adsorbuje na sloupci z 5000 objemových dílů iontoměničové pryskyřice značky Diaion HP-10 (výrobek firmy Mitsubishi Kasei К, K.). Sloupec se promyje 20 000 objemovými díly vody a 50°/oního vodného methanolu a látky se eluují 15 000 objemovými díly 90%ního vodného methanolu. Eluát se zahustí za sníženého tlaku na 3000 objemových dílů, přidá se 3000 objemových dílů vody a směs se vytřepe 3000 objemovými díly ethylacetátu. Uvedená operace se opakuje ještě jednou, ethylacetátové podíly se spojí, promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí za sníženého tlaku na 200 objemových dílů. Ke zkoncentrovanému roztoku se přidá petrolether a vyloučená sraženina se odfiltruje. Získá se 28 dílů surového produktu, který po přečištění sloupcovou chromatografií na silikagelu poskytne 8,0 dílů surového produktu II.

Příklad 5

V 10 objemových dílech ethylacetátu se rozpustí 1,5 dílů surového· produktu II získaného způsobem popsaným v příkladu 3 a roztok se dobře promíchá se 4 díly silikagelu (Merck, Německá spolková republika, 0,05—0,2 mm). Ethylacetát se odpaří za sníženého tlaku a silikagel s naadsorbovaným produktem se nanese na horní konec sloupce připraveného z 300 objemových dílů silikagelu; sloupec se promyje nejdříve

214743

500 objemovými díly chloroformu a pak se látky eluují postupně 500 objemovými díly směsi chloroformu s methanolem (50:1), 500 objemovými díly směsi chloroformu s methanolem (20:1) a 500 objemovými díly směsi chloroformu s methanolem (10 :1); eluát se jímá po frakcích o 25 objemových dílech.

Z každé frakce se odebere 0,5 objemových dílů roztoku, rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku, к odparku se přidá 0,05 objemových dílů ethylacetátu a směs se podrobí tenkovrstevné chromatografii na silikagelu (rozpouštědlová soustava: chloroform-methanol 9:1).

Frakce číslo 39 a 40, absorbující při 2537 A v zóně o R_f 0,50 až 0,60, se spojí a rozpouštědla se oddestilují za sníženého tlaku. К odparku se přidají 2 objemové díly ethylacetátu a směs se ponechá stát; vyloučí se 0,150 dílů krystalického antibiotika C-15003.

Shora uvedeným způsobem získané krystaly antibiotika C-15003 (0,150 dílů) se rozpustí v 15 objemových dílech methanolu, к roztoku se přidá 0,300 dílů chloridu sodného a 15 objemových dílů vody. Chromatografická trubice se naplní 200 objemovými díly iontoměničové pryskyřice značky Diaion HP-10 (výrobce Mitsubishi Kasei К. К.) a sloupec se promyje 600 objemovými díly 50%ního vodného methanolu obsahujícího 5 % chloridu sodného. Shora uvedeným způsobem připravený roztok antibiotika se naadsorbuje na sloupec iontoměniče a látky se vymývají gradientovou elucí za použití 1500 objemových dílů 60%ního vodného methanolu obsahujícího 5 % chloridu sodného a 1500 objemových dílů 95%ního vodného methanolu. Eluát se jímá po frakcích o 15 objemových dílech, a každá frakce se hodnotí tenkovrstevnou chromatografií na silikagelu. Frakce číslo 145 až 153 obsahují antibiotikum C-15003 P-3, frakce číslo 167—180 obsahují antibiotika C-15003 P-3‘ a P-4, a frakce číslo 185 až 190 obsahují antibiotikum C-15003 P-4.

Každá shora uvedená skupina frakcí se spojí, rozpouštědla se oddestilují a odparek se rozpustí přidáním 50 ml vody a 100 ml ethylacetátu. Směs se protřepe v dělicí nálevce, vodná vrstva se oddělí, ethylacetátový podíl se promyje dvakrát po 50 ml vody, vysuší bezvodým síranem sodným, zahustí na malý objem a zkoncentrovaný roztok se odstaví ke krystalisaci. Uvedeným způsobem se získá z každé výše uvedené skupiny frakcí krystalická látka; vyloučené krystaly se odfiltrují a vysuší. Získá se

0,070 dílů antibiotika C-15003 P-3,

0,018 dílů směsi antibiotik C-15003 P-3‘ a P-4, a

0,015 dílů antibiotika C-15003 P-4.

Směsné krystaly antibiotik C-15003 P-3‘ a P-4 (0,018 dílů) se rozpustí v 0,3 objemových dílech ethylacetátu, roztok se nanese v úzkém pruhu ve vzdálenosti 2,5 cm od spod24 ního okraje na skleněnou desku s vrstvou silikagelu (Merck, Německá spolková republika, Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, 20 x X 20 cm) a látky se vyvolají v rozpouštědlovém systému ethylacetát — methanol (19:1) do vzdálenosti asi 18 cm. Zóny látek o R_f 0,68 (antibiotikum P-4) a R_F 0,65 (antibiotikum P-3‘) se seškrábou a každá se samostatně extrahuje dvakrát ethylacetátem obsahujícím malé množství vody. Získané ethylacetátové extrakty se promyjí vodou, vysuší bezvodým síranem sodným, zahustí za sníženého tlaku a zkoncentrované roztoky se odstaví ke krystalisaci. Z frakce o R_F 0,68 se získá 0,010 dílů krystalického antibiotika C-15003 P-4, a z frakce o R_F 0,65 0,003 dílů krystalického antibiotika C-15003 P-3‘.

Příklad 6

100 000 objemových dílů násadního kultivačního prostředí, nacházejících se ve fermentačním tanku z nerezové oceli o obsahu 200 000 objemových dílů, se ínokuluje 1000 objemovými díly kultury získané způsobem popsaným v příkladu 2, a naočkovaná půda se inkubuje při teplotě 28 °C, za provzdušňování (100 000 objemových dílů za minutu) a za míchání (200 otáček za minutu) po dobu 48 hodin. Získaná násadní kultura se přenese do fermentačního tanku z nerezové oceli o obsahu 2 000000 objemových dílů, obsahujícího 1000 000 objemových dílů fermentační živné půdy stejného složení jak bylo popsáno výše v příkladu 1, v transplantačním poměru 10 %. Kultivace se provádí při teplotě 26 °C, za provzdušňování (1000 000 objemových dílů za minutu), za míchání [120 otáček za minutu (1/3 DT)] a za vnitřního tlaku 1 kg/cm², po dobu 90 hodin. Získaná kultura má titr 20 ,ug/ml, jak bylo zjištěno testovací metodou popsanou v příkladu 1.

К 900 000 objemovým dílům kultivační kapaliny získané shora uvedeným způsobem se přidá 900 000 objemových dílů acetonu, směs se jednu hodinu míchá a pak se přidá 20 000 dílů křemeliny Hyflo-supercel (výrobce Johnes & Manville, USA). Směs se dále míchá a pak se zfiltruje pomocí tlakového filtračního přístroje. К 1 700 000 objemovým dílům získaného filtrátu se přidá 500 000 objemových dílů vody a směs se extrahuje na Podbielniakově koloně (výrobce Podbielniak, lne.) 1000 000 objemových dílů ethylacetátu. Ethylacetátový extrakt se promyje vodou, vysuší přidáním bezvodého síranu sodného a zahustí za sníženého tlaku. К zahuštěnému roztoku se přidá petrolether a vyloučená sraženina se odfiltruje a vysuší. Uvedeným způsobem se získá 68 dílů surového produktu I, který se poté čistí způsoby popsanými v příkladech 3, 4 a 5. Získá se 9,5 dílů antibiotika C-15003 P-3, 0,300 dílů antibiotika C-15003 P-3‘ a 2,5 dílů antibiotika C-15003 P-4.

Příklad 7

V 1 objemovém dílu tetrahydrofuranu se rozpustí 0,015 dílu krystalického antibiotika C-15003 získaného· způsobem popsaným v příkladu 5, roztok se ochladí na —5 °C a pak se k němu přidá 0,012 dílů hydridu lithno-hlinitého. Reakční směs se ponechá stát 2 hodiny při teplotě místnosti, pak se přebytek redukčního činidla rozloží opatrným- přidáním 0,5 objemových dílů l°/oního vodného roztoku kyseliny sírové a směs se vytřepe 2 objemovými díly ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty se promyjí vodou, vysuší bezvodým síranem sodným a zahustí za sníženého tlaku. Zk-once-ntrovaný roztok se zpracuje preparativní tenkovrstevnou chromatografií na silikagelu; zóna o R_F 0,25 až 0,3 se seškrabe a produkt se vyextrahuje· ethylacetátem obsahujícím malé množství vody. Ethylacetátový extrakt se promyje vodou, vysuší bezvodým síranem sodným a zahustí za sníženého· tlaku na malý objem. Vyloučené krystaly se odfiltrují a vysuší; zís26 ká se 0,010 dílů antibiotika C-15003 P-0 o bodu tání 174 °C.

Elementární analysa:

Pro C28H37CIN2O8

vypočteno:
59,52 %	C,	6,60% H,	4,96% N,
6,27%	Cl;
nalezeno:
59,65 %	C,	6,58 % H,	5,02 % N,
6,!^1%	Cl.

Infračervené spektrum: 1715, 1670, 1580 cm-1

Ultrafialové · spektrum (nm): 232 (32750),

244 (sh, 30850), 252 ( 31650), 281 (5750), 288 (5700).

Získaná látka odpovídá svými fysikálními a chemickými vlastnostmi maytansinolu.

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

1. Prostředek pro ošetřování nemocných rostlin vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje antibiotikum C-15003 obecného vzorce
2. Způsob přípravy účinné složky prostředku podle bodu 1 obecného vzorce:

ve kterém· substituent R představuje skupinu ve kterém· znamená substituent R skupinu

CH3 /

—CO—CH \

CH3 —CO—CH2—CH2—CH3,

CH3 z —CO—CH2—CH

CH3 nebo atom vodíku.

CH3 /

—CO—CH \

CH3 —CO—CH2—CH2—CH3,

CHs /

—CO—CH2—CH \

CH3 nebo atom vodíku, vyznačující se tím, že se pěstuje mikroorga214749 nismus kmene -Nocardia -č. C-15003 IFO 13726 v kultivačním prostředí, které obsahuje asimilovatelné' zdroje uhlíku a stravitelné zdroje dusíku při teplotě v rozmezí od 20 °C do· 35 °C s počátečním pH okolo hodnoty 7 za aerobních podmínek tak dlouho, dokud se zmíněné antibiotikum C-15003 nenahromadí v uvedeném· živném .prostředí, - a potom se případně takto získané antibiotikum C-15003 podrobí redukční hydrolýze- za vzniku sloučeniny obecného· vzorce:
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že redukční hydrolýza -se· provádí za použití komplexního kovového hydridu.
4. · Způsob podle bodu 3, vyznačující -setím, že komplexním· kovovým hydridem je lithiumaluminiumhydrid.