SE446004B - Forfarande for framstellning av antibiotikum c-15003 p-o (maytansinol) - Google Patents

Description

"sso2s17-1 2 /cH3 _ 1 vilken R betecknar -co-cH;\g , -CO-CH2-CH2-CH3 eller C33 _, cH3 -CO-CH2-C f/I reduktionshydrolys. \\, i CH3 Utgångsföreningen, dvs antibiotikan C-15003 med formeln II erhål- les genom att odla en C-15 003-producerande stam av släktet Nocar- dia,_nämligen IFO 13726, i ett odlingsmedium med kol och kväve och utvinna antibiotikan därur.' I samband med föreliggande uppfinning betecknar termen antibioti- kum C-15003 de föreningar 1, som uppvisar de tre olika substituen- terna R eller en blandning av två eller tre sådana föreningar. Be- träffande föreningarna med formeln 1 benämnes här den förening, i vilken R betecknar l //CH3 antibiotikum C-15003 P-3 -CO-CH \ f CH3 ' . eller kortare C-15003 P-3, föreningen, i vilken R betecknar -co-cnz-cnz-cn3 benämnes här antibiotikum c-15063 P-3' eller korta- re C-15003 P-3', föreningen i vilken R betecknar CH3 ' -co-CH2-CH CH3 benämnes här antibiotikum C-15003 P-4 eller kortare C-15003 P-4 och föreningen, i vilken R betecknar H benämnes här antibiotikum C-15003 P-O eller kortare C-15003 P-0.

Som ett exempel på den antibiotikum C-15003-producerande stammen av mikroorganism må nämnas en aktinomycet stam nr. C-15003, som isolerats ur jordprover och andra prover vid den systematiska ef- terforskningen av antibiotikaproducerande mikroorganismer.

De mikrobiologiska särdragen hos stammen nr. C-15003 undersöktes på analogt sätt som föreslagits av Schirling & Gottlieb (Interna- tional Journal of Systematic Bacteriology lå, 313-340 (1966D. Re- sultaten av iakttagelser vid 28oC under 21 dagar framgår nedan. 1) Morfologiska särdrag Det vegetativa myceliet är väl utvecklat och förgrenat såväl på agar som i vätskemedium. Många hyfer mäter 0,8-1,2 fmxi diameter 8302517-1 och kan i vissa fall vara uppdelade i fragment, som liknar stav- bakterier eller grenade, korta hyfer. Stammen ger_upphov till god tillväxt på olika taxonomiska medier med luftmycelium placerat ovanpå det vegetativa myceliet, även om det ofta bildar koremia- liknande kroppar (50-200 x 200-1000 pm), på vilka ytterligare luft- mycelier kan tillväxa. Många av luftmycelierna är slingrande, raka eller har löst spiralliknande konfiguration, vilka stöter samman på nâgra få ställen. En mikroskopisk undersökning av äldre kulturer har visst att endast-i några få fall förekommer de konidie-liknan- de cellerna i kedjor, medan cellsuspensioner tagna från ytan hos så- dana kulturer vid mikroskopisk undersökning visade sig innehålla många långsträckta ellipsoida.kroppar (0,8-1,2 pm x 4,8-6,8 pm) och ellipsoida kroppar liknande artrosporer (0,8-1,2 x 1,0-2,0 pm).

Undersökning i elektromikroskop visade att dessa kroppar hade slät yta. 2) Cellernas uppbyggnad Stammen odlades i skak-kultur i modifierat medium ISP nr. 1 vid 2800 under 66-90 timmar, efter vilken tid Cellerna uppsamlades och skölj- des. Cellerna undersöktes med avseende på diaminopimelinsyra- och sockersammansättning med användning av metoden beskriven av B. Bec- ker et al. (Applied Microbiology lg, 421 (1964)) och metoden beskri- ven av M.P. Lechevaller (Journal of Laboratory and Clinical Medi- cine Zl, (1968)). Den förra befanns föreligga i meso-form medan fläckar upptäcktes, vilka motsvarade galaktos och arabinos. 3) Särdrag hos taxonomiska medier Stammen uppvisar jämförelsevis god tillväxt på olika medier, var- vid det vegetativa myceliet var färglöst till svagt gulfärgat i inledningsfaserna hos kulturen och svagt gulaktigt ljusbrun till gulaktivt ljusbrun i de senare faserna. Stammen producerade lös- liga pigment till färgen gula till gulaktigt ljusbruna i olika taxonomiska medier. Luftmyceliet var pulverartat och tillväxte vanligen måttligt samt var vitt till gult eller svagt gulaktigt ljusbrunt. Särdrag för stammen i olika taxonomiska medier framgår av efterföljande tabell 1. J _ _,.._ _ .,._.__. _ ..._ _.._.___._.__._.. . . __ ___:.____. .___ ______... . íí.._._,_ï_.________,wà. 3502517-1 Tabell 1 - Särdrag hos odlingskultur av stam nr. C-15003 på taxo- nomiska medier (A) Snkrosnitratagar:_ _ _ Tillväxt (G): måttlig, Brite Melon Yellow_(3 1a)* till Am- ber tan (3 1c)*, koremia-liknande kroppar bildades 'Luftmycelie (AM): sparsamt, vitt _ I Lösligt pigment (SP): Inget eller svagt gulaktigt ljusbrunt (B) Glycerolnitratagar: G: måttlig, Lt Ivory (2ca)*, koremia-liknande kroppar bildades AM: måttligt, vitt ' Sá: Inget (C)' Glukosasparaginagar: G: måttlig, Brite Merigold (3 pa)* till Brite Yellow (2 pa)* AM; sparsamt, vitt 'k SP: Brite Yellow (2 pa) (D) Glycerolasparginagar: _ .

G: måttlig, Lt Ivory (2 ca)*, koremia-liknande kroppar bildades AM; måttligt, vitt ' I HSB: Inget (E) Stärkelseagar: J G: måttlig, Lt Ivory (2 ca)* till Lt Wheat (2 ea)f, koremia- _.liknande kroppar bildades AM: rikligt, Lt Ivory (2 ca)* SP: Inget '(F)7 Näringsagar: G: måttlig, Lt Ivory (2 ca)* till Colonial Yellow (2 ga)*, koremia-liknande kroppar bildades I AM: sparsamt, vitt ' sp: Inget (G) Kalciummaleatagar: G: måttlig Lt Ivory (2 ca)* till Lt Wheat (2 ea)*, koremia- liknande kroppar bildades AM: måttligt, vitt till Lt Ivory (2 ca)* SP: Inget l(H) (I) (J) (K) ssø2s17-1 Jästextrakt-maltextraktagar: G: måttlig, Amber (3 1a)* till Brite yellow (3 liknande kroppar bildades AM: måttligt, vitt till Lt Ivory (2 ca)* SP: Inget ' I * 1a) , koremia- Havremjölsagar: _ * * G: måttlig, Lt Ivory (2 ca) till Colonial Yellow (2 ga) , koremia-liknande kroppar bildades AM: sparsamt, vitt till ljusgult SÉ:-Inget Peptonjästexteaktjärnagar: G: måttlig, Colonial Yellow (2 ga)* AM: I SP: Inget k Colonial Yellow (2 ga) Tyrosinagar: G: måttlig, Lt Ivory (2 ca)* till Lt Melon Yellow (3 ea)*, koremia-liknande kroppar bildades AM: måttligt, vitt till Lt Ivory (2 ca)* SP: Camel (3 1e)* 7 * Uppgifterna om färgen hänför sig till Color Harmony Manual, fjärde upplagan (Container Corporation of America, 1958) 4) Fysiologiska särdrag - _ De fysiologiska särdragen hos stammen återges i nedanstående ta- bell 2. Temperaturområdet för tillväxt var 12-38°C. Temperaturområ- det, inom vilket god lufttillvåxt förekom på agar (ISP nr. 2), var zo-3s°c.

Tabell 2 -Fysiologiska särdrag hos stam nr. C-15003 Temperaturområde för tillväxt; 12-38°C Temperaturområde för lufttillväxt: 20-3500 Förvätskning av geletin: positiv Hydrolys av stärkelse: positiv Reduktion av nitrater: -positiv Peptonisering av mjölk: positiv Koagulering av mjölk: negativ Sönderdelning av kasein: positiv_ _Anm.: 8302517-1 Produktion av melanoida pigment: negativ (peptonjästextraktjärnagar) positiv (tyrosinagar) Sönderdelning av tyrosin:" ppositiv Sönderdelning av xantin: negativ Sönderdelning av hypoxantin: negativ Tolerans för lysozym: _ positiv Tolerans för natriumklorid: I 2% 5) Utnyttjande av olika kolkällor Utnyttjandet av olika kolkällor undersöktes med användning av ett medium beskrivet i Pridham och Gottlieb (Journal of Bacterio- logy åá, 107 (1948)) och ett basmedium med samma sammansättning plus 0,1% jästextrakt. Resultatet framgår av nedanstående tabell 3.

Tabell 3 - Ütnyttjandet av kolkällor hos stam nr. C-15003 Kolkälla Q-xylos Q-arabinos Q-glukos Q-galaktos Q-fruktos Q-rhamnos Q-mannos sukros laktos maltos trehalos * Basmedium med 0,1% +++ ++ + I n mo Tillväxt_ Kolkällor + ++* raffinos + '+ melibios ++ ++ l-inositol + + Q-sorbitol +++ ++ Q-mannitol + Ä glycerol +++ ++ I löslig stärkelse ++ +: kontroll 7 1 + + ++ jästextrakt tillsatt ymnig tillväxt gèd tillväxt I " tillväxt dålig tillväxt ingen tillväxt Tillväxt ______ï_ + + + + ++ ++ l+ _ e, .V-.....f ...__- .... ...w ..«_...-..~ 8302517-1 6) Övriga egenskaper cellerna skördades på det sätt som tidigare beskrivits under 2) och DNA framställdes på ett sätt analogt med det som beskrivits av J, Marmur et al. (Journal of Molecular Biology, Q, 208, 1961).

Halten G-C (guanin-cytosin) i DNA befanns vara ca 71 mol-%.

Gram-färgningen hos det vegetativa myceliet hos denna stam var po- sitiv. Ovan framtagna särdrag hos stam nr. C-15003 jämfördes med beskrivningarna i S.A. Waksmanš "The Actinomycetes Vol. 2" (The Williams and Wilkins Co., 1961), R;E. Buchanan och N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, åttonde upplagan, 1974" och annan litteratur.

Eftersom denna stam ansågs tillhöra grupp III av släktet Nocardia och försök att finna några arter med dessa särdrag beskrivna bland kända stammar, måste slutsatsen dras att denna stam representerade en ny art av mikroorganism. _ Stammen nr C-15003 har deponerats vid Fermantation Research Insti- tute, Agency of Industrial Science and Technology (FERM) under nr 3992, vid The Insitute for Mermentation, Osaka (IFO) under nr IFO 1372 och vid The American Type Culture Collection (ATCC), Maryland, USA under nr 31281. Även om stammen C-15003 som ovan nämnts är en ny art av släktet Norcardia, är det, vilket allmänt gäller för mikroorganismer, troligt att den undergår variationer och mutationer, antingen spontant eller under inverkan av en mutagen. De många varianterna av stammen, som kan erhållas genom bestrålning med röntgenstrål- ning, gammastrâlning, ultraviolett ljus, med monocellisolering, genom odling på medier innehållande olika kemikalier eller genom annan mutagen behandling liksom de mutanter, som spontant kan erhållas från stammen, skall ej anses representera någon anna speciell art utan varje sådan variant och mutant med förmåga att utveckla C-15003 P-3, P-3' och/eller P-4 kan användas för upp- finningens ändamål. Exempelvis kan man genom att utsätta stam C-15003 för olika mutagena behandlingar få mutanter som i huvud- sak saknar förmågan att producera lösliga pigment, mutanter med substratmyceller som är färglösa, gulgröna, rödaktigt ljusbruna ___-. , - , ..._._.._-_v-_-.....w~_.-~__....»-_.-__..,,._ i _ 8302517-1 eller orangeröda, mutanter vars hyfer kan delas upp i bacillära element eller grenade kottar hyferfragment och mutanter med om- fattande vita luftmycelier eller i huvudsak utan luftmycelier.

Det medium, som användes för odlingen av en sådan antibiotika C-15003-producerande stam, kan vara vilken som helst vätska eller fast medium som innehåller näringsämnen, som stammen kan utnyttja, även om ett_vätskemedium föredrages före snabbare produktion. Mediet kan innehålla kol- och kvävekällor, som stammen nr C-15003 kan assimilera och uppsluta, oorganiskt material, spårämnen, m.m. Som exempel på kolkällor må nämnas glukos, laktos, sukros, maltos, dextrin, stärkelse, glycerol, mannitol, sorbitol m.m., fetter och oljor (t.ex. sojabönolja, isterflott, kycklingolja etc.) m.m.

Kvävekällan kan t.ex. vara köttextrakt, jästextrakt, torkad jäst, sojabönmjöl, majssirap, pepton, bomullsfrömjöl, melass, karbamid, amoniumsalter. (t.ex; ammoniumsulfat, ammoniumklorid, ammonium- nitrat och ammoniumacetat) m.m. Mediet kan vidare innehålla salter av natrium, kalium, kalcium, magnesium etc., salter av järn, mangan, ,zink, kobolt, nickel etc., salter av fosforsyra, borsyra etc., samt organiska syrasalter såsom acetater och propionater. Vidare kan mediet som tillsats innehålla olika aminosyror (t.ex. glutaminsyra, asparaginsyra, alanin, glycin, lysin, metionin och prolin), pepti- der (t.ex, dipeptider och tripeptider), vitaminer (t.ex. Bl,B2, nikotinsyra, B12, C och E), nukleinsyror (t.ex. purin, pyrimidin och derivat därav) m.m. För inställning av mediets pH-värde kan man tillsätta någon oorganisk eller organisk syra, alkali, buffert eller liknande. Lämpliga mängder oljor, fetter, ytaktiva medel etc. kan också tillsättas i sknmdämpande syfte. Ödlingen kan utföras under stationära betingelser, under skakning, under aeroba betingelser under vatten och andra odlingsbetingelser.

För en snabb produktion föredras aeroba betingelser under vatten. fÄven om odlingsbetingelserna naturligtvis beror av mediets samman- sättning, stammen, odlingsmetoden och övriga faktorer föredrar man normalt att utföra inkubationen vid 20-35°C med ett begynnelse-pH av ca 7,0 eller däromkring. Särskilt önskvärd är en temperatur av 23-30°C i ett mellanstadium av odlingen med ett begynnelse-pH av _6,5-7,5. Inkubationstiden varierar naturligtvis också med samma faktorer som nämnts ovan men det är tillrådligt att fortsätta in- kubationen tills titern på den önskade antibiotiska produkten blir 8502517-1 9 maximal. Vid tillämpning av odling under skakning eller odling under vatten under aeroba betingelser ligger den erforderliga tiden vid ca 48-144 timmar.

Styrkan hos antibiotikan analyserades med Tetrahymena pyriformis W som analysorganism. Ovan angivna mikroorganism fick sålunda tillväxa på ett försöksmedium [_20 g proteos-pepton (bifco), l 9 jästextrakt (Difco), 2 g glukos, 100 ml destillerat vatten och :Lo mi: n-fosfatbuffert (pH 7,o)__7 'vid 28°C under 44-48 timmar °°h styrkan hos antibiotikan bestämdes genom serieutspädning med övervakning av tillväxtens grumlighet, effekten på askitestumör- celler och genom tunnskiktskromatografi (förkortat TLC) på nedan närmare beskrivet sätt.

Den nya antibiotikan C-15003 P-3, P-3' och/eller P-4 alstrades och ackumulerades i den resulterande fermanteringsmassan såväl extra- cellulärt som intracellulärt¿ Dessa substanser detekterades också medelst tunnskiktskromatografi.

Fermenteringsmassan separerades i celler och filtrat genom filt- rering eller centrifugering och filtratet extraherades med samma volym etylacetat. Till cellerna sattes samma mängd 70-procentig lösning av aceton och vatten som filtratet och efter l timmas omröring vid 20°C filtrerades suspensionen. Acetonen avlägsnades från filtratet och det resulterande filtratet extraherades med etylacetat. Var och ett av extrakten koncentrerades till l/100 av sin volym och underkastades tunnskiktskromatografi på en silika- gel-glasplatta (Merck, Västtyskland,_Kieselgel 60 F254, 0,25 mm, 20 x 20) (lösningsmedelsystem : kloroform-metanol = 9:1). Styrkan bestämdes'pâ basis av intensiteten hos fläckar detekterade genom bestrâlning med ultraviolett ljus vid 2537 Å.

.Eftersom C-15003 P-3, P-3' och/eller P-4, som sålunda alstras i fermenteringsmassan, är lipofila neutrala substanser, kan de ut- vinnas medelst separations- och reningsmetoder, som normalt tillämpas vid skörd av sådana mikrobiologiska metaboliter.

Exempelvis kan man använda en metod, där man utnyttjar skill- naden i löslighet mellan antibiotikan och föroreningen, metoder där man utnyttjar den adsorptiva affiniteten hos olika adsorbent, såsom aktivt kol, makroporösa nonjonhartser, silikagel, alu- 8302517-1 10 miniumoxid etc., metoder där man avlägsnar föroreningar med hjälp av jonbytarhartser med flera, tillämpade var för sig eller i lämplig kombination och även använda upprepade gånger.

Eftersom C-15003 P-3, P-3' och P-4 som ovan nämnts förekommer i såväl filtratet som cellerna separeras och renas antibiotikan med hjälp av ett sådant adsorbent antingen direkt eller efter en lösningsmedelsextraktion i fallet med filtratet, eller efter en lösningsmedelsextraktion i fallet med mikrobiologiska celler.

Lösningsmedelsextraktionen kan utföras med hjälp av vilken som helst av följande metoder, t.ex. (1) lösningsmedelsextraktion ur odlingskulturen före separation av cellerna och (2) lösnings- medelsextraktion av cellerna och_filtratet erhålles genom filt- rering, centrifugering eller andra metoder. För extraktion av filtratet och cellerna-oberoende av varandra kan nedan angivna metod med fördel användas.

Lösningsmedlen lämpade för extraktion av filtratet är med vatten icke blandbara, organiska lösningsmedel, såsom fettsyraestrar, t.ex. etylacetat och amylacetat, alkoholer, t.ex. butanol, halo- generade kolväten, t.ex. kloroform, och ketoner, t.ex. metyliso- __butylketon. Extraktionen utföres vid nästan neutralt pH och den på pH 7 i förväg inställda odlingskulturen extraheras med etyl- - acetat. Egtraktet tvättas med vatten och koncentreras under redu- cerat tryck. Därefter sättes ett icke polärt lösningsmedel, såsom petroleumeter eller hexan, till koncentratet och råprodukten 1 innehållande den aktiva föreningen utvinnes. Eftersom vid tunn- skiktskromatografi ett flertal fläckar detekteras förutom anti- biotikan C-15003 underkastas produkten l följande reningsproce- dur. Rutinmässigt användes adsorptionskromatografi och för detta ändamål kan man använda något konventionellt adsorptionsmedel, såsom silikagel, aluminiumoxid, eller ett makroporöst, nonjoniskt adsorbentharts. För rening av râprodukten l användes helst silika- .gel. Framkallningen kan exempelvis ske genom att starta med petroleumeter och hexan och elueringen av antibiotikan C-15003 utföres genom tillsats av ett polärt lösningsmedel, såsom etyl- acetat, aceton, etanol eller metanol. Vid en representativ ,process med användning av silikagel (Merck, Västtyskland, 0,05 - 0,2 mm) som bärare, utföres kolonnkromatografi med en successiv -830.2'517-1 11 ökning av förhållandet hexan till etylacetat. Eluatet tas upp i f fraktioner och undersökes medelst tunnskiktskromatografi och fraktionerna innehållande C-15003 sammanföres och koncentreras under reducerat tryck. Därefter sättes petroleumeter eller hexan till koncentratet, varigenom råprodukten ll erhålles. Eftersom denna produkt fortfarande innehåller föroreningar måste den renas ytterligare. Produkten ll kan t.ex. renas med användning av en andra_silikagelkolonn med användning av ett annat lösningsmedels- svstem. Framkallningssystemet kan då exempelvis bestå av ett halogenerat kolväte, såsom diklormetan eller kloroform, under tillsats av ett polärt lösningsmedel såsom en alkohol, t.ex. metanol eller etanol, en keton, t.ex. aceton eller metyletyl- ' keton, eller liknande. På detta sätt kan man isolera antibiotika Cf15003. Ordningsföljden för lösningsmedelssystemen för den första och andra silikagelkolonnen kan omkastas och dessutom kan man vid behov använda vanliga organiska lösningsmedel tillsammans med ovan angivna system.

När ett makroporöst adsorbentharts användes för rening av râproduk- ten ll_utföres elueringen av antibiotikan C-15003 med en blandning av vatten och en lägre alkohol, en lägre keton eller en ester. Den lägre alkoholen kan t.ex. vara metanol, etanol, propanol eller butanol och den lägre ketonen exempelvis aceton eller metyletyl- keton. Estern kan t.ex. vara etylacetat. Man kan lämpligen gå I tillväga så att råprodukten ll löses i 60 % metanol-vatten och adsorberas på en kolonn av "Diaion HP~10" (Mitsubishi Kasel K.K., Japan). Kolonnen tvättades med 70 % metanol-vatten och euleringen utfördes med 90 % metanol-vatten. På detta sätt eluerade man ut antibiotikan C-15003 ur kolonnen.

Oavsett vilken av ovannämnda metoder som användes, sammföres frak- tionerna innehållande antibiotikan C-15003 och koncentreras under reducerat tryck. Till den torra produkten sättes 5-8 volymer etylacetat och blandningen får stå en tid, varpå kristallerna av antibiotikan C-15003 separerarf Dessa kristaller innehålla C-15003 P-3, P-3' och P-4. Dessa föreningar separeras därefter från varandra med hjälp av ett adsorbent, såsom något av de ovan angivna. Sålunda kan man med användning av silikagel eller ett makroporöst, nonjoniskt adosrbentharts och ovan angivna lösnings- s3o2517f1 '12 medel företa fraktionerad eluering av de önskade föreningarna.

När exempelvis silikagel användes utföres elueringen med hexan, etylacetat eller kloroform-metanol, varvid C-15003 P-4, P-3' och P-3 framträder i nämnda ordning. Efter detektering genom tunn- skiktskromatografi koncentreras fraktionerna innehållande C-15003 P-4, P-3' resp. P-3 under reducerat tryck och etylacetat sättes till koncentraten. På detta sätt kan resp. föreningar erhållas i kristallform. När ett makroporöst, nonjoniskt adsorbentharts användes kan man företa gradienteluering med ett varierande för- hållande alkohol, keton eller ester till vatten. Exempelvis kan man med gradientelueringsmetoden med användning av 60 % metanol- vatten och 95 % metanol-vatten och 5 % tillsatt natriumklorid få C-15003 P-3. P-3' och P-4 att uppträda i nämnda ordning. Efter provtagning och detektering medelst tunnskiktskromatografi koncent- reras varje grupp av aktiva fraktioner under reducerat tryck och kristalliseras ur etylacetat. De isolerade kristallerna inne- håller etylacetat som lösningsmedel från kristallisationen och efter torkning över fosforpentoxid vid 7000 under 8 timmar kunde de i efterföljande tabell 4 angivna fysikaliska och kemiska egen- .skaperna noteras. 8502517-1 13 æm.m @«.m wm_m Hu ~m.« ~«_«_ f«.« z Awv ßwcxwuwm mm.@ ~w.w ~w.w m, mo~P@ fm_o@ Fm.o@ u m>fimcm ~m»:wswHm m~.m mm.m ¶>m.m Hu m~.« «m.« mm.« z _w. pmnaøm mo.> ~o_> «o.» . m _ ¶[email protected] mo.ow wo.o@ u wæflmcm umusmswfim Amflumu -m_onu. .mfiumu ~fi.0nu. Amflumu m>m_O"oV o~w\w\ wmmsnmw QOF H owwvl oo? M o«mF| o@P H o@m_| |wmnflnwfl~> xflwfioømm oow~|>>P omw.|~wP oNm~|omf Auov .mam @mF.m«@nmo~zHum«mmmu « 1 Q m N mv Nm mm~.mm@u o zfiu m U .MIN mwf. moomwlü E5MH¥OHQfiufl4 Q flflwnmu mmwuaowzflumwmwmu m¶| m 8502517-1 4 1 omw .oßw .mww .ßmm omw _o>« .www .mßm omw .oßw .www .nßm Aw\EV mauxwmwummmå Amw. ~ø,mo_P ^mmv Auv©o.~ amV^sw~; Ammv ^ø.>N_~ mfluou fi Nmz oøf Añmmv mHuxmmw|mEZ wmør _owQf _o°FP .omPF .°wfF _ .mm~f..o«m_ .mmm_ .mwwr _owm, .@~@_ ~om>F .owßf mmof _o@°« _°°PF _om~_ .°wf_ .mm~F _o«mP _mwm~_.m««F .owmr .oßmf .omßF..°«>~ wmov .owof .OQFP .omrf _owFf .mm~_ .owmr .mwmf ~m««F ~oæmP _@>wr .omßf .owßf Hmm APIEUV muuxmmm. |wd0flumnomQm|mH .oæmmvmww ^~_>mvoæ~ ^ø@m>~.~m~ Aowmww m@>HV Qww Aoommwvmmw mONZflUmvmmmU v I N mm~.mvmn ^@o>mv@w~ .Qm>m.°@~ Aoo@>~.Nm~ Aommwm mwæuvoqw .mmfomvmmw ¶m@P_mm@“mo~zHum«m-u , .mlm , m°°mP|u snxfluoflnfluqm ^°o>m.ww~ .omßm.Qæ~ .o«@>~.~m~ Aømwwm mm>»vo«~ ^°m~omvmmN .äímmwum oßfiuwémmmu _ M 1 m Rfloømumš flv _AWv En mnvxmmm |wnoflumHomnw|>D ^.mvH0u. w Hawnmß 8302517-1 5 ,1. _ Bnfimom :nmflwflwm Éfifimoü u mmuoflhmmmun _ ñfimom ”fiflmïwm Éflflmom u wmuowcwmßwü ncflwumafiwm _ Éflfimom u wwuownwmmna fiufimom nwfiøfluxmwumumm uflxowfiådñflvå :oo ääflounšfifiwp .fiwfififi Äoflmumâ Ãoflmum .cøuwuw .amp |wvwdnuw .Éowonoflx fl E33 , . H30 zoo awmøwn fl mfiwwfiwâ 53% :oo Qmxmš .Hmumdflwm mmämflào å P _ mänmomzflumqmmmu q | m wdflowfiawfiwuänw :oo cmäw. -ougfifiß .qäfläm åoâ |pm= .Honßw .nßwum 5.8. nwomfifim .Euowouøax J." mfifimwfi . . H30 . än ämân fl wwflmwfiää .QÜUÄÜ> S8 flmxw: .Hmumdflumm .H mflflmßflo möímmwflmowzfiumwmmmu . .m I N moompln. Eflxflubflnflvâ ñflxümdflmfiæuä 300 flmHflm |0Hwæ8mfimu .fiæåuæm Ãonm law: .Hofimum .åoumom Ja» lwumflmßm .Euououoflx fl mflflwßfi _ _ uwum nußcmmän fl mflwwüflä äHÉ, :oo nmxwn föfiïflwm fl mflwmflo mwimmïm owzflumvmümu m | m uwsmflfimnq Twfiflom. ív Sømna . '83Q2517-1 16 Med utgångspunkt från ovan visade molekylformel och den antimik- robiella aktiviteten och antitumöraktiviteten meddelad nedan, jäm- gfördes föreliggande antibiotikum med kända grupper av antibioti- ka. Litteraturundersökningar ledde ej till att man fann någon grupp samma som antibiotika C-15003. Vid efterforskning av substan- ser, som gkulle kunna ge likartad ultraviolett adsorption bland olika förekommande organiska substanser ledde fram till maytanacin- grup eb och med ledning av molekylformler antogs att antibiotikan til örde maytanacingrupper av föreningar innehållande två kväve- atomer. Maytanacin erhölls som en växtkomponènt och rapporterades i Journal of American Chemical Society 21, 5294 (1975). Myatanacin uppvisar följande karakteristiska masspektrum: nF-(a) Mïufib) < 4ss-cn3 4ss-c1 _ 545 485 410 ' 450 (a)=H2o.+ HNco o t (bpn-c-on Närvaron av m/e 485, 470 och 450 för C-15003 P-3, P-3' och P-4 är ett bevis för att dessa föreningar har en molekylskelettstruktur identisk med maytanacinets och att skillnaden ligger i typen av acylgrupp i 3-position. Det är sålunda uppenbart att antibiotikum C-15003 är en ny förening; När C-15003 P-3, P-3' och P-4 var för sig behandlades med alkali och analyserades medelst gaskromatogra- fi med avseende på frigjorda karboxylsyror visade det sig att iso- smörsyra, smörsyra och isovaleriansyra erhölls ur C-15003 P-3, - C-15003 P-3' resp. C-15003 P-4. Med ledning härav anges nedan struk- 'turerna för C-15003 P-3, P-3' och P-4. a cu P-3 ~co-cu< 3f ens 9-3' -co-cflz-cuz-cn; i cH r-h -co-cnz-cuí 3 ca 3 8302517-1 17 Biologisk aktivitet: A) antimikrobiell aktivitet: Med trypticas-sojaagar (BBL) som provningsmedium undersöktes de inhiberande koncentrationerna mot nedan angivna mikroorganismer med hjälp av pappersskrivemetoden. Därvid impregnerades filter- pappersskivor (Toyo Selsakusho, tunn typ, 8 mm diameter) vardera med 0,02 ml av en 300 mikrogram/ml lösning av C-15003 P-3, P-3' och P-4 och placerades på plattor smittade med nedan angivna mikroorganismer för undersökning av minsta inhiberande koncentra- tioner. Av resultaten framgick att antibiotikasubstanserna ej hade någon verkan mot följande mikroorganismer: Escherichia coll, Proteus vulgaris, Proteuslmirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtills, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia'marpescens, Mycobacterium avium.

Med agarplattor innehållande provmediet (3,5 g dinatriumvätefosfat, 0,5 g monokaliumdivätefosfat, Sig jästextrakt (Difco), 10 g glukos, 15 g agar, 1000 ml destillerat vatten, pH 7,0), undersöktes till- växtinhiberingen mot Talaromyces aveilaneus. I denna undersökning låg den minsta inhiberade koncentrationen vid 3 mikrogram/ml för C-15003 P-3 och P-3' och vid 1,5 mikrogram/ml för C-15003 P-4.

Vidare odlades den vilda stammen av Tetrahymena pyriformis W som testorganism på ett medium sammansatt av 20 g proteos-pepton (Difco), 1 g jästextrakt, 2 g glukos, 1000 ml destillerat vatten och l0 ml l M-fosfatbuffert med pH 7,0 vid 28°C under 44-48 timmar och den tillväxtinhiberande effekten hos de antibiotiska substanserna mot denna mikroorganism bestämdes med hjälp av 1serieutspädningsmetoden. Tillväxtinhibering skedde vid i mikro- gram/ml för C-15003 P-3 och P-3f och vid 0,5 mikrogram/ml för C-15003 P-4.

Aktiviteten mot svampar framgår av efterföljande tabell 5. Såsom framgår därav uppvisar C-15003 en tillväxtinhiberande effekt mot mikroorganismer, som förorsakar växtsjukdomar. Filterpappers- skivorna impregnerade med 0,02 ml av en 1000 mikrogram/ml lös- ning av C-15003 placerades på plattor smittade med mikroorga- nismerna angivna i tabell 5. a3o2517s1 is Tabell 5 - Anti-mikrobiellt spektra 1* p§A; potatis-sukrosagarmedium ** GB: glukosnärings-agarmedium ' diameter Alternaria kikuchiana 7515 PSA* 48 38 Fflsiclaaium levieri 6477 PSA* 90 68 Helminthosporium sigmoideum var. irregulare 5273 PSA* 48 55 Éyricularia cryzae D . - PSA* 48 53 Elsifloe faficetti -8417 I PSA* 90 55 Fusarium oxysporum I f. cucumerinum ' - PSA* 48 20 Gulgnardia laricina _7888 PSA* 48 12 Cochilioburus miyabeanüs 5277 PSA* 48 60 Diaporthe citri 9170 PSA* 48 55 Gïbbereala åeaë ssso PSA* 46 37 Scierotinia sclerotiorum _ 9395 PSA* 90 65 ,\]:=||| Iqln pil-Inn r-HW '|'f;'.'-.* flíi Éfl Pelliéulapia sasakii 9253 PsA* 48 50 Pythium aphaniaermatume 7030 PSA* 48 ss Botrytis cinerea I - PSA* 48 48 Aspergillus niger 4066 4' PSA* 48 0 Penicillium chrysogenum 4626 PSA* 48 35 -Rhizopüs nigricanš 6188 PSA* 48 25 Saccäfomyces cerevisiae 0209 PSA* 48 0 Rnoaótorula rubra o9o7 psà* 48 28 Tricnophyton rubrum' 'S467 _ GB** 48 38 Trichophyton mantagrophytes 7522 GB** ' 48 38 Candida albicans _ ' 0583 GB** -_ 48 canaina utilis _0619- GB** 46 Cryptócoccus neqformans 0410 GB** 48 43 ss02s17-1 19 B) Tumörbekämpningseffekt.

De terapeutiska effekterna hos C-15003 P-3, P-3' och P-4 (vid intraperitoneal dosering under 9 på varandra följande dagar) på P388 leukemi hos möss (1 x 106 celler/djur, möss, intraperi- tonealt transplanterade) undersöktes. Resultaten visade att dessa föreningar uppvisade en tumörbekämpande effekt av 200 %, beräknat som livsförlängande effekt, vid en dos av 0,00625 mg/kg/dag. 7 C) Toxicitet.

Vid försök för bedömning av den akuta toxiciteten på möss som försöksdjur, varvid företogs intraperitoneala injiceringar av C-15003 P-3, P-3' och P-4, uppvisade samtliga dessa antibiotika ett LD50-värde högre än 0,313 mg/kg.

Antibiotikan C-15003 har starkt inhiberande effekt på svampar och protozoer och är därför av stor betydelse som medel mot sådana organismer. Eftersom vidare antibiotikan C-15003 uppvisar en livsförlängande inverkan pâ_tumörbärande däggdjur (t.ex. möss) kan man också anta att föreningen kan användas som medel mot tumörer.

Antibiotikan C-15003 kan med fördel användas för att undertrycka bakteriefloran i jord, aktivt slam, djurkroppsvätska eller lik- nande. När värdefulla bakterier skall isoleras-ur jordprover eller när bakteriers inverkan skall utvärderas oberoende av svampars och protozoers inverkan i samband med drift och analys av ett aktivt slamsystem använt vid behandling av avloppsvatten kan antibiotikan enligt uppfinningen användas för att åstadkomma en selektiv tillväxt av bakteriefloran utan att det sker en tillväxt av förorenande svampar och protozoer i materialet.

I ett representativt fall_sättes provet till en vätska eller ett fast medium och 0,1 ml av en 10 - 100 mikrogram/ml lösning av'antibiotikan i 1 % metanol-vatten tillsättes per ml medium, som därefter inkuberas. ' Antibiotikan CÅ15003 kan också användas som antimikrobiellt ___.. __. ,... ,. _-. _., _ . ______.-_.....:_____.... ._.._.._......- 8502517-1 K 20 medel för behandling av växtsjukdomar förorsakade av de i ovan- stående tabell 5 omnämnda mikroorganismerna.

Antibiotikan C-15003 användes då vanligen i form av en 1-procen- tig lösning av metanol i vatten innehållande 0,5 f 5 mikrogram/ /ml av antibiotikan. Exempelvis kan antibiotikan C-15003 an- vändas för att bekämpa olika angrepp på risplantor.

Föreningarna C-15003 P-3, P-3' och P-4 är sålunda nya föreningar med samma skelettstruktur och kan användas som mellanprodukter för framställning av andra farmaceutiskt användbara föreningar.

Genom deacylering kan sålunda P-15003 P-0 (maytansinol) med en hydroxylgrupP i 3-position framställas utgående från antibio- tikan enligt uppfinningen. Härvid kan, på grund utav att acyl- gruppen befinner sig i beta-position till karbonylgruppen, konventionell reduktiv hydrolys tillämpas med fördel. Man kan sålunda med användning av en komplex metallhydrid (t.ex. litium- elfiminimnhyaria Lizunkii via låg temperatur (Lex. mellan -zo och OQC) underkasta 0-esterbindningen i 3-position hydrolytisk klyvning utan att påverka andra funktionella grupper, t.ex. karbonyl,'epoxi, kol-koldubbelbindningar etc; för erhållande av maytansinol. De fysikaliska-och kemiska värdena för sålunda erhållen_maytansino1 överensstämmer väl med de värden, som återfinns i Kupchan et-al The Journal of American Chemical Society gl, 5294 - 5295 (1975).

Efterföljande exempel avser att belysa men på intet sätt att begränsa uppfinningen och angivna del(ar) hänför sig till vikten om ej annat anges och relationen mellan de1(ar) och volymdel(ar) motsvarar det mellan gram och ml och "%" är baserad på_vikt/volym om ej annat anges. ' Referensexempel 1 Nocardia No. C-15003 (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281), som fått tillväxa på ett medium av jästextrakt-maltextraktagar användes för ympning i ett fermenteringskärl rymmande 200 volymdelar och innehållande 40 volymdelar av ett odlingsmedium (2 % glykos, 3 % löslig stärkelse, 1 % rått sojabönmjöl, 1 % 3302517-1 21 majssirap, 0,5 % polypepton, 0,3 % Na Cl, 0,5 % CaC03, pH 7,0). Det ympade mediet fick utvecklas vid 28°C under 48 tim- mar för erhâllande av ett inokulum. 0,5 volymdel av detta erhållna inokulum överfördes till fermenteringskärlet inne- hâllande_40 volymdelar av ett fermenteringsmedium bestående av 5 % dextrin, 3 % magssaft,_0,1 % polypepton och 0,5 % CaCO3 (pH 7,0) och odlades vid 28°C under 90 timmar för erhål- lande av ett inokulum (ympkultur). - * Vid bestämning medelst serieutspädningsmetoden och användning av Tetrahy mena pyriformis W som testorganism och antibiotika C-15003 P-3 som standardprov befanns ovan erhållna kultur hålla en titer av 25 mikrogram/ml.

Referensexemgel 2 10 volymdelar av i referensexemplet 1 erhållet inokulum över- fördes till ett fermenteringskärl rymmande 2000 volymdelar och innehållande 500 volymdelar av en utsädeskultur (samma som ovan) och fick utvecklas vid 28°C under 48 timmar. 500 volymdelar av den resulterande kulturen överfördes till en behållare av rost- fritt stål rymmande 50000 volymdelar och innehållande 30000 volymdelar utsädeskultur och fick tillväxa vid 28°C under luft- tillträde (30000 volymdelar/minut), omröring (280 varv/minut/ '/1/2:DT/) och ett inre tryck av 1 kg/cm2 för erhållande av en utsädeskultur. Denna kultur användes för ympning i en behållare fav rostfritt stål rymmande 200000 volymdelar och innehållande 100000 volymdelar av ett fermenteringsmedium samma som det, som användes i referensexempel 1 vid ett ympningsvärde av 10 %.

Det ympade mediet fick utvecklas vid 28°C under lufttillträde (100000”volymdelar/minut), omröring (200 varv/minut/1/2 DT/) och ett inre tryck av 1 kg/cmz under 90 timmar. Ovan erhâllen kultur befanns hålla en titer av 25 mikrogram/ml bestämd på samma sätt som beskrivits i referensexempel 1._ Referensexemgel 3 fill 95000 volymdelar av kulturen erhållen i referensexempel 2 sattes 2000 delar "Hyflo-supercel ®" (Johnes and Manville 8302517-1 22 Products, U.S.A.) och efter noggrann omröring filtrerades blandningen genom ett tryckfilter för erhållande av 85000 'volymdelar filtrat och 32000 delar fuktiga celler. Filtratet omrördes och extraherades med 30000 volymdelar etylacetat.

Denna provedur upprepades en gång. Etylacetatskikten samman- fördes, tvättades två gånger med 30000 volymdelar vatten, torkades genom tillsats av 500 delar vattenfritt natriumsulfat och koncentrerades under reducerat tryck till 200 volymdelar.

Petroleumeter sattes till koncentratet och den resulterande fällningen utvanns genom filtrering (53 delar). Denna råpro- dukt omrördes med 100 volymdelar etylacetat och olösliga produkter frånfiltrerades. Filtratet omrördes med 10 delar silikagel (Merck, Västtyskland, 0,05 - 0,2 mm) och etylace- tatet avlägsnades under reducerat tryck. Återstoden tillfördes i toppen av en kolonn med silikagel (400 volymdelar). Eluering utfördes med 500 volymdelar heàan,'500 volymdelar hexan-etyl~ acetat (3:1), 500 volymdelar hexan-etylacetat (1:1), 500 vo- lymdelar hexan-etylacetat (1:3), 500 volymdelar etylacetat och 1000 volymdelar etylacetat-metanol (50:1), varvid eluatet upp- samlades i fraktioner om 100 volymdelar.

En volymdel av varje fraktion koncentrerades till torrhet och 0,1 volymdel etylacetat sattes till koncentratet. En droppe av denna blandning placerades 2,5 cm från nedre kanten av en glasplatta med ett överdrag av silikagel (Merck, Västtyskland, 60 F254, 0,25 mm, 20 x 20) och fläcken vandrade cirka 17 cm med ett lösningsmedelssystem av etylacetat-metanol (19:1).

Därefter utfördes detektering med ultraviolett ljus (2537 A).

De aktiva fraktionerna~23 - 28 med Rf 0,6 - 0,65 uppsamlades och koncentrerades under reducerat tryck till cirka 20 volym- delar. Till detta koncentrat sattes 150 volymdelar petroleum- eter för erhållande av 15 delar av en rå produkt 11.

Referensexempel 4 Under omröring extraherades 32000 delar av de fuktiga cellerna erhållna i referensexempel 3 med 50000 volymdelar 70 % aceton- -vatten och efterföljande filtrering upprepades en gång. 8302517-1 23 Filtraten sammanfördes och acetonen avlägsnades genom koncen- trering under reducerat tryck. Det resulterande vattenhaltiga systemet matades genom en kolonn med 5000 volymdelar "Diaion HP-10" (Mitsubishi Kasel K.K.), Japan. Kolonnen tvättades med -20000 vol;mdelar vatten och_50-procentig metanol i vatten, varefter företogs eluering med 15000 volymdelar 90 % metanol- -vatten. Eluatet koncentrerades under reducerat tryck till -3000 volymdelar och skakades med 3000 volymdelar etylacetat.

Denna procedur upprepades en gång. Etylacetatskikten samman- fördes, tvättades med vatten, torkades genom tillsats av vat- tenfritt natriumsulfat och koncentrerades under reducerat tryck till 200 volymdelar. Efter tillsats av petroleumeter utvanns fällningen genom filtrering (28 delar). Produkten renades ge- nom en kolonn med silikagel och man utvann 8,0 delar råprodukt 11. ' Referensexemgel 5 I 10 volymdelar etylacetat löstes 1,5 delar av râprodukten 11 erhâllen i referensexempel 3 och lösningen omrdrdes väl med 4 delar silikagel (Merck, Västtyskland, 0,05 - 0,2 mm). Etyl- acetatet avlägsnades-under reducerat tryck. Aterstoden till- I fördes upptill i en kolonn med 300 volymdelar silikagel och -kolonnen tvättades först med 500 volymdelar kloroform och elu- erades sedan med 500 volymdelar kloroform-metanol (50:1), 500 volymdelar klordform-metanol (20:1) och 500 volymdelar kloro- form-metanol (1Ö:1). Eluatet uppsamlades i fraktioner om 25 volymdelar. 0,5 volymdel av varje fraktion koncentrades under reducerat tryck. Till koncentratet sattes 0,05 volymdel etylacetat och blandningen underkastades tunnskiktskromatografí på silikagel med kloroform-metanol 9:1 som framkallningssystem.

Fraktionerna 39 och 40 med adsorbtion vid 2537 Å i zonen med Rf 0,50 - 0,60 uppsamlades och koncentrerades till torrhet under reducerat tryck. Till återstoden sattes 2 volymdelar etylacetat och blandningen fick stå en tid, varpå 0,150 delar kristaller av antibiotikan C-15003 erhölls. 8502517-1 24 De erhållna kristallerna av antibiotikan C-15003 (0,150 delar) löstes i 15 volymdelar metanol, varefter tillsattes 0,300 de- lar natriumklorid och 15 volymdelar vatten. En kolonn packades med 200 volymdelar “Diaion HP-10" (Mitsubishi Kasei K.K., Japan) och kalibrerades med 600 volymdelar 50-procentig metanol i vatten innehållande 5 % NaCl. Ovan beredda provlösning matades genom kolonnen och gradienteluering utfördes med användning av 1500 volymdelar_60-% 'metanol-vatten innehållande 5 % NaCl och 1500 volymdelar 95 % metanol-vatten. Eluatet uppsamlades i frak- tioner om 15 viktdelar och varje fraktion underkastades tunn- skiktskromatografi på silikagel. Fraktionerna 145 - 153 innehöll C-15003 P-3, fraktionerna 167 - 180 innehöll C-15003 P-3' och P-4 och fraktionerna 185 - 190 innehöll C-15003 P-4.

Varje grupp av fraktioner koncentrerades och löstes genom till- sats av 50 volymdelar vatten och 100 volymdelar etylacetat.

Lösningen skakades i en separationstratt och vattenskiktet -sèparerades och efter tvättning med två omgångar av 50 volym- delar torkades etylacetatskiktet över vattenfritt natriumsulfat koncentrerades och fick stå en tid. På detta sätt erhölls kris- taller ur varje grupp av fraktioner. Kristallerna uppsamlades genom filtrering och torkades och av de olika antibiotikaty- perna erhölls följande mängder: I C-15003 P-3 _ 0,070 delar c-15oo3 P-sn P-4 0,018 aeiar c-15003 P-4 ' o,o1s aelar De blandade kristallerna av C-15003 P-3' och P-4 (0,018 delar) löstes i 0,3 volymdelar etylacetat och placerades ut fläckvis på linje på ett avstånd av 2,5 cm från nedre kanten av en glas- platta överdragen med silikagel (Merck, Västtyskland, Kiesel- gel 60 F254 med etylacetat-metanol (19:1). Efter vandring cirka 18 cm skrapades absorptionsbandet vid Rf 0,68 (P-4) och Rf 0,65 (P-3') av och extraherades var för sig tvâ gånger med etyl- o,25 mm, 20 x 20), varefter framkallning företags acetat innehållande en liten mängd vatten. De resulterande etylacetatextrakten tvättades med vatten, torkades över vatten- fritt natriumsulfat, koncentrerades under reducerat tryck och isso2s17-1 25 fick stå en tid. Man erhöll 0,010 delar kristaller av C-150032 P-4 och 0,003 delar kristaller av C-15003 P-3' från fraktio- nerna med Rf 0,68 respektive Rf 0,65.

Referensexemgel 6 1000 volymdelar av kulturen från referensexempel 2 ympades i en behållare av rostfritt stål rymmande 200 000 volymdelar och innehållande 100 000 volymdelar av en odlingskultur och det ympade mediet fick tillväxa vid 28°C under lufttillträde (100 000 volymdelar/minut) och omröring (200 varv/minut) under '48 timmar för framställning av en utsädeskultur. Denna utsädes- kultur överfördes till en behållare av rostfritt stål rymmande 2 000 000 volymdelar och innehållande 1 000 000 volymdelar av ett fermenteringsmedium av samma slag som användes i referens- exempel 1 vid ett transplanteringsvärde av 10 %. Odlingen ut- fördes vid 28°C under lufttillträde (1 000 000 volymdelar/minut),, omröring (120 varv/minut /1/3/ DT/) och ett inre tryck av 1 _ kg/cmz under 90 timmar. Den resulterande kulturen befanns hålla en-titer av 20 mikrogram/ml bestämd på samma sätt som beskrivits i referensexempel 1. 0 Till 900 000 volymdelar av ovan erhâllen kultur sattes 900 000 volymdelar aceton och gfter en timmes omröring tillsattes 20 000 delar "Myflo-Supercel ", (Johnes & Manville, U.S.A.). Bland- ningen omrördes därefter_och filtrerades genom ett tryckfilter. 1 700 000 volymdelar av det resulterande filtratet försattes med 500 000 volymdelar vatten och i en Podbielniak-extraktor (Pol- bielniak, Incorporated) extraherades blandningen med 1 000 000 volymdelar etylacetat. Etylacetatskiktet tvättades med vatten, torkades genom tillsats av vattenfritt natriumsulfat och kon- centrerades under reducerat tryck. Till koncentratet sattes petroleumeter och den resulterande fällningen utvanns genom filtrering och torkades. Pâ detta sätt erhölls 68 delar råpro- dukt 1. Denna råprodukt renades därefter som i referensexempel 3, 4 och 5 för erhållande av 9,5 delar C-15003 P-3, 0,300 delar C-15003 P-3' och 2,5 delar C-15003 P-4. 8502517-1 26 Exemgel 1 I 1 volymdel tetrahydrofuran löstes 0,015 delar av de i refe- rensexempel 5 erhållna kristallerna av antibiotikan C-15003 och lösningen kyldes till -5°C och försattes därefter med 0,012 delar litiumaluminiumhydrid. Blandningen fick stå under 2 timmar. Efter tillsats av 0,5 volymdelar av en 1-procentig vattenlösning av HZSO4 extraherades reaktionsblandningen med 2 volymdelar etylacetat. Etylacetatskiktet tvättades med vat- ten, torkades genom tillsats av vattenfritt natriumsulfat och 'koncentrerades under reducerat tryck. Preparativ tunnskikts- kromatografi med silikagel som bärare utfördes på koncentratet och zonen med Rf 0,25 - 0,3 skrapades av och extraherades med etylacetat innehållande en liten mängd vatten. Extraktet tvät- tades med vatten, torkades över vattenfritt natriumsulfat och koneentrerades under reducerat tryck, varpå kristaller separe- rade. Kristallerna utvanns genom filtrering och torkades. Pâ detta sätt erhölls 0,01 delar P-15003 P-0 med smältpunkten 174°C.

Elementaranalys: Funnet C 59,65, H 6,58, N 5,02, Cl 6,51 Beräknat för C H ClN O C 59,52, H 6,60 N 4,96, Cl 6,27 . za 37, zs_1 IR: 1715, 1670, 1580 (cm ') _ - UV (nmï: 232(32750), 244(rygg, 30850), 252(31650), 282(5750), 288(5700).

Denna produkt var vad beträffande egenskaperna identisk med maytansinol.

Claims (3)

gszo2s17-1 27 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av en förening med formeln Cl §H3 S on k ä n n e t e c k n a t av att man underkastar antibiotikan C-15003 med den allmänna fbrmeln CH i vilken R betecknar -CO-CH:: 3, -CO-CH2-CH2-CH3 eller CH3 CH3 -CO-CH2-Cfiíl , reduktiv hydrolys. CH 3

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den reduktiva hydrolysen utföres med användning av en komplex metallhydrid. 83025174 28

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t _e"c k n a t av att den komplexa metallhydridep är- litiumaluminiumhydrid.