DE2904186C2 - Anthracyclin-Glykoside, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen - Google Patents
Anthracyclin-Glykoside, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische ZusammensetzungenInfo
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Description
11-Desoxy-adriamycin -CO-CH2OH
11 -Desoxy- 13-dihydrodaunomycin — CHOH-CH j
11-Desoxy-daunomycin —CO—CHj
11-Desoxy-13-desoxodaunomycin -CH2-CHi
und deren Salze.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den
bei »Deutsche Sammlung von Mikroorganismen« mit der Aufnahme-Nr. DSM 1190 hinterlegten Mutantenstamm
Micromonospora peucetica sp. nova unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Kulturmedium,
das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei
einer Temperatur von 25 bis 37"C und bei einem pH-Wert von zunächst 6,5 bis 7,0, am Ende der Fermentation
von 6,5 bis 8,0 kultiviert, die genannten Anthracyclin-Glykoside gewinnt und gegebenenfalls in deren
Salze überführt.
3. Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine oder mehrere Verbindungen gemäß Anspruch 1
in Mischung mit üblichen Trägerstoffen.
Die Erfindung betrifft Anthracyclin-Glykoside, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen
enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Die neuen Anthracyclin-Glykoside zeigen Antitumor- und antibakterielle Wirksamkeit. Insbesondere sind die
neuen Anthracyclin-Glykoside als Antitumormittel bei Versuchstieren verwendbar.
Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wird durch mutagene Behandlung von Streptomyces
peucetius var. caesius mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten (Arcamone et al., Biotechnol. Bioengen,
1969, Xl, 1101 — 1110). Dem neuen Stamm wurde die Code-Nummer B 211 F. I. der Farmitalia Collection of
Microorganismen gegeben, und er wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer
1190 DSM, bei der American Type Culture Collection unter der Nummer 31 366 ATCC und beim Fermentation
Research Institute (Japan) unter der Nummer 4363 FRI hinterlegt. Wie bei vielen Antibiotika produzierenden
Kulturen führt die Fermentation des Stammes B 211 F. I. zur Bildung einer Mischung oder eines Komplexes
aus Antibiotika. Vier bioaktive Anthracyclin-Glykosid-Verbindungen wurden vom Komplex abgetrennt.
Es wurde festgestellt, daß diese Anthracyclin-Glykoside die folgende Formel aufweisen:
OH
H3CO 0 OH O
OH
t>
mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R:
11-Desoxy-adriamycin -CO-CH2OH (Glykosid 1)
11-Desoxy-13-dihydrodaunomycin -CHOH-CHs (Giykosid II)
11-Desoxy-daunomycin —CO-CHj (Glykosid III)
il-Desoxy-13-desoxodaunomycin -CH2-CH1 (Glykosid IV)
Die Bezeichnungen Daunomycin und Adriamycin werden hier für Daunorubicin bzw. Doxorubicin verwendet
Die obigen Anthracyclin-Glykoside enthalten alle Daunosamin (3-Amino-23.6-tridesoxy-L-lyxo-hexose), die
Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin (F. Arcamone, G. Cassinelli, P. Orezzi, G. Franceschi
und R. Mondelli, J. Am. Chem. Soc. 86, 5335. 1964, und eigene US-PS 35 90 028). Die Strukturen wurden
durch Analyse ihrer IR-, UV-, sichtbaren, Masse- und NMR-Spektren bestimmt und stimmen mit den im
nachstehenden angegebenen chemischen und physikalischen Daten überein.
Die neuen Anthracyclin-Glykoside bilden sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze, und pharmazeutisch
verwendbare Salze sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Beispiele derartiger pharmazeutisch verwendbarer
Salze sind Salze mit Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Stickstoff- und Phosphorsäure, und mit Metallkationen, z. B.
Alkalimetall- oder Erdalkalimetallkatbnen, wie Na'rium. Kalium, Kalzium und Magnesium, und auch mit anderen
Kationen, wie dreiwertigen Eisenkationen.
Mikroskopische Eigenschaften des Stammes B 211 F.!.
Die Sporen weisen folgende Größe auf: 0,9—1,1 · 1,1 —1.6 μπι. Sie werden einzeln oder sehr häufig als Paare
gebildet, selten als Büscheln, endständig auf kurzen Sporophoren, die monopodial als Äste an langen, willkürlich
gebildeten Hyphen mit einer Dicke von 0,5 bis 0,9 μιη entstehen. Selten werden sessile Sporen beobachtet Es
werden keine polymorphen Formen gebildet. Luftmycel ist nicht vorhanden.
Makroskopische Eigenschaften des Stammes B 211 F. I.
Die Kultureigenschaften des Stammes B 211 F. I. sind in Tabelle I angegeben. Das Wachstum ist im allgemeinen
auf organischen Medien gut und auf synthetischen Medien weniger gut; auf ersteren ist es im allgemeinen
erhaben und gefurcht und im Aussehen feucht, aber nicht schleimig.
Die Sporulationsschichi ändert das orange-terrakotta farbene vegetative Mycel beim Altern auf braun bis fast
schwarz. Im allgemeinen wird kein lösliches Pigment gebildet. Bei Temperaturen über 400C wird kein Wachstum
festgestellt Die physiologischen und biochemischen Eigenschaften des Stammes B 211 F. I sind in Tabelle Il
angegeben.
t-1
I-; Identifizierung und Klassifizierung des Stammes B 211 F. I,
35
Der Stamm B 211 F. I. ist klar auf den Genus Micromonospora Orskov (0rskov J. »Investigations into the
\',( Morphology of the Ray Fungi«, Levin und Maunksgaard, Kopenhagen, 1923, S. 171) der Reihe Actinomycetales
Iv: zurückzuführen, und zwar auf Grund seiner morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften. Jedoch
[' ermöglichte eine sorgfältige vergleichende Prüfung der von Waksman S. A. (»The Actinomycetes« Bd. 2, 1961. to
I\ Williams und Wilkins Co., Baltimore, und »The Actinomycetes a Summary of Current Knowledge« 1967, Ronald
N Press Co.), Luedemann und Brodsky (1963) und Luedemann G. (»Micromonospora Taxonomy« Advances in
ji Applied Microbiology«, 1970, 11, 101 — 133) für bekannte Arten, die diesem Genus angehören, beschriebenen
Ii und angegebenen Eigenschaften mit jenen, die der Stamm B 211 F. I. zeigt, keine Identifizierung dieses Stammes
mit irgendeiner der genannten Species, die für den obengenannten Genus angeführt sind. Wegen seiner speziellen
Kohlenwasserstoffverwertung und im Hinblick auf die Tatsache, daß er neue Anthracycline produziert, kann
geschlossen werden, daß der Stamm B 211 F. I. sich von allen bisher beschriebenen Species dieses Genus
unterscheidet und eine neue Species ist. Der Name Micromonospora pcucetica sp. nova wurde diesem Stamm
gegeben.
50
Kultureigenschaften des Stammes B 211 F.l. auf verschiedenen Medien gemäß Waksman, 1961, supra,
wenn nicht anders angegeben
wenn nicht anders angegeben
Medium Reaktion
Bennett's -Agar Wachstum gut, erhöht und gefurcht; orange bis terrakotta
oder korallenrot, wird bei Altern schwarz bo
Emerson's-Agar Wachstum schön, erhöht und gefurcht; durchgehend
hell-tcrrakotta, wird beim Altern braun
Glucosc-Asparagin-Agar Wachstum gut. flach; durchgehend hell-tcrrakotia
1 % NZ-Amin Typ Λ, 1 % Glucose + Agar Wachstum gut. erhöht und gefurcht; orange-terrakotta bis
(Luedemann G. M. et al. Antimicrobial hellrot, wird beim Altern braun bis schwär/
Aecnts. 1963. S. 116-124)
Medium
Reaktion
GIucose-Hefeextrakt-Agar
5
Stärke-Casein-Agar
Gelatine-Agar
Tyrosin-Agar (Gordon R. D. und Smith M. L,
J. Bacteriol.69,1955,S. 147-150)
Pepton-Eisen-Agar (Tresner H. D. und
Danga F, J. Bacteriol. 76.1958,
S. 239-244)
Czapeck's-Agar
Glycerin-Glycin-Agar
Anorganische Salze-Stärke-Agar
(Pridham T. C. et al. Antibiotics
Annual 1956/1957, S. 947 -953)
S A-Agar (bezüglich Zusammensetzung
siehe Aufrechterhaltungsmedium in
Beispiel 1)
Wachstum schlecht, erhöht und gefurcht; durchgehend hell-tcrrakotta
Wachstum gut. erhöht und gefurcht: zuerst hell-terrakotta,
dunkel-rötlich, wird beim Altern kupferbraun bis fast schwarz. Ein dunkelbraunes lösliches Pigment wird gebildet
Wachstum ziemlich flach; braun; ein dunkelrötliches bis kaffcbraunes lösliches Pigment wird gebildet
Wachstum gut, erhöht und gefurcht; durchgehend hell-tcrrakotla
Wachstum mäßig, erhöht und gefurcht; terrakotta bis braun, wird bei Altern fast schwarz
Wachstum gering, flach; hell-terrakotta, wird bei Altern schwarz
Wachstum mäßig, flach; zuerst farblos, wird bei Altern olivgrün bis dunkelgrün
Wachstum schön, flach; rosa bis terrakotta, wird bei Altern orangebraun
Wachstum gering, flach; hell-terrakotta, wird bei Altern fast schwarz
Wachstum gut, erhöht und gefurcht; zuerst cremefarben bis honigfarben, wird später terrakotta und bei Altern leicht
bräunlich. Manchmal wird ein gelbes lösliches Pigment festgestellt, das bei Altern hellbraun wird
Tabelle II
40 Physiologische und biochemische Eigenschaften des Stammes B 211 F. I.*)
Glucose +
D-Xylose +
M-Mannit +
M-Inosit +
L-Arabinose -ΙΟ-Fructose + Adonit +
Lactose +■
d( + )-Mannose +
Maltose +
Raffinose +
L-Rhamnose +
Λ-Λ-Trehalose +
Äsculin +
Glycerin +
Na-Citrat +
Na-Acetat +
NH^-Tartrat +
Glycogen —
Paraffin —
Tabelle II (Fortsetzung)
Negative Kontrolle:
Verflüssigung von Gelatine +
Tyrosinzersetzung +
Malaninbildung +
Stärkehydrolyse +
H2S-Bildung -
Nitratreduktion +
Milch (Pepton und Koag.) gebildete Antibiotika: neue Anthracycline
+ = positive Reaktion. — ■= negative Reaktion.
*) das Medium für den Kohicnwasserstoffverwertungstesl wurde von R. D. Gordon und M. L Smith, supra, beschrieben;
die für die anderen physiologischen Reaktionen verwendeten Medien sind von S. A. Waksman, !96!, supra, angegeben.
Fermentierungsverfahren
Die Produktion wird durch übliche, wohlbekannte Methoden durchgeführt und besteht im Kultivieren des
Mikroorganismus in einem vorher sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer
Temperatur von 25 bis 37°C (vorzugsweise bei 28"C) während 5 bis 30 Tagen (vorzugsweise 15 Tagen) und bei
einem pH-Wert von zunächst 6,5 bis 7,0 und am Ende der Fermentation von 6,5 bis 8,0.
Das Kulturmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle sowie aus Mineralsalzen. Die
Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Mannit, Maltose, Getreideweiche,
Trebern. Sojabohnenöl oder Sojabohnenmehl sein. Die Stickstoffquelle kann außer den obererwähnten komplexen
Substanzen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Trockenhefe, Fleischpepton oder Casein sein. Gute
Ergebnisse werden sogar durch Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfaten,
Diammoniumphosphaten, erhalten. Die Mineralsalze variieren entsprechend dem verwendeten Medium. In
einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentationsrückstände, enthält, hat
sich der Zusatz von Calciumcarbonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten als zweckmäßig erwiesen. In
Medien, die Glucose oder Ammoniumsalze enthalten, sind wesentlich höhere Mengen an Mineralsalzen, wie
Kalium-, Natrium- oder Calciumsalzen, und Zusätze von Spurenelementen, wie Eisen, Zink, Kupfer, Magnesium
und Mangan, notwendig. Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Laboratoriums- oder Industriefermentern
mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden.
35 Analytische Methoden
Proben der Fermentationsbrühen und der rohen Zubereitungen werden unter Verwendung von Whatman Nr.
1 -Papier, gepuffert mit M/15 Phosphatpuffer auf pH 5,4, einer Papierchromatographie unterworfen, wobei als
Eluierungsmitte! eine Mischung von n-Propanol : Ethylacetat: Wasser (7:1 :2) verwendet wird. Die Papierstreifen
werden einer Bioautographie gegen Bacillus subtilis unterworfen, und es wurde gefunden, daß vier
antibiotische Substanzen auftreten. Diese werden als Glykosid I (Rf 0.30), Glykosid II (Rf 0,50), Giykosid III (Rf
0.55) und Glykosid IV (Rf 0,65) bezeichnet.
Rohe Zubereitungen werden unter Verwendung von vorher überzogenen Dünnschicht-Chromatografie-Platten
aus Silikagel 60-F-254 (Merck) einer Dünnschichtchromatographie (TLC) unterworfen, wobei als Eluierungsmittel
eine Mischung aus Chloroform : Methanol : Essigsäure : Wasser (80 : 20 : 14 :6) verwendet wird. Es treten
vier gelbe Verbindungen auf,die Glycosid I (Rf 0,50), II (Rf 0,55), III (Rf 0,65) bzw. IV(Rf 0,70) entsprechen.
Eine quantitative Bestimmung der gesamten, in den Fermeniationsbrühen vorhandenen gelben Bestandteile
kann wie folgt durchgeführt werden. Einer Probe der Brühe, auf pH 8,5 eingestellt, werden zwei Volumina
Chloroform : Methanol (9 : 1) zugesetzt Die erhaltene Mischung wird 1 min bei R. T. beschallt. An einer Probe
der organischen Phase, die mit saurem Methanol verdünnt ist, kann der Gesamtgehait der gelben Anthracyciine
und deren Aglycone spektrophotometrisch bei 418 nm bestimmt werden. An einer Probe der organischen Phase,
die unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann die quantitative Bestimmung der einzelnen Glycoside
durch präparative TLC unter Verwendung des oben abgegebenen Systems erhalten werden. Die verschiedenen
gelben Zonen werden abgekratzt und mit Methanol eluiert. Jeder Bestandteil wird spektrophotometrisch bei
418 nm bestimmt-11-Desoxy-adriamycin ist in den Fermentationsbrühen gewöhnlich der Hauptanteil.
Isolierungsverfahren
Nach der Fermentation sind die aktiven Verbindungen in den Mycelen und in der Fermentationsflüssigkeit ta
enthalten. Der antibiotische Anthracyclinkomplcx kann bei pH 8,5 bis 9,0 in Form freier Basen aus der Kukurbrühe
»insgesamt« mit einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobutylketon.
Chloroform, Methylendichiorid oder Ethylacetat, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die
Mycelc und die Fermentationsflüssigkeit durch Filtrieren bei pH 4 mit Hilfe von Diatomeenerde getrennt und
dann getrennt extrahiert.
Der Filtrationskuchen wird mit einer Mischung eines in Wasser löslichen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol
oder einem anderen nied. Alkohol, und einer wässerigen 0,1 N Lösung einer anorganischen oder organischen
Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, extrahiert. Im allgemeinen wird eine Mischung aus Ace-
ton :0,l N Salzsäure im Verhältnis 4:1, bezogen auf das Volumen, verwendet. Die Mycclcxtrakte werden
gesammelt, auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Das wässerige
Konzentrat wird mit der filtrierten Hrühe vereinigt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann mit
einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder n-Butanol,
■> extrahiert. Die Extrakte werden unter vermindertem Druck eingeengt, und der Anthracyclinkomplex wird durch
Zusetzen von 5 Volumina n-Hexan ausgefällt. Die Bestandteile des rohen Komplexes werden dann fraktioniert
und durch Säulcnchromatographie gereinigt.
Reinigungsverfahren
ίο Die weitere Reinigung des antibiotischcn Komplexes und dessen Trennung in die vier Bestandteile kann durch
Säulenchromatographie mit Silikagel bewirkt werden. Das rohe orangebraune Pulver wird in Chloroform gelöst
und die Lösung, gemischt mit 1 Äquivalent methanolischem Chlorwasserstoff, auf Silikagel mit Mischungen aus
Chloroform, Methanol und Wasser chromatografiert. 11 -Desoxy-13-desoxodaunomycin und 11 -Desoxy-daunomycin
werden zuerst mit einer 94,8 :5,0 :0.2-Mischung eluicrt. li-Desoxy-13-dihydro-daunomycin und U-Desoxyadriamycin
folgen mit einer 89,5 :10 :0,5-Mischung. Die Komponenten werden gewöhnlich getrennt, wie
durch Papier- und Dünnschichtchromatografie gezeigt, und die vier Bestandteile werden als Hydrochloride in
kristalliner Form erhalten.
Chemische und physikalische Eigenschaften
Die neuen Antibiotika der vorliegenden Erfindung besitzen einige gemeinsame Eigenschaften, doch können
sie auf Grund ihrer chemischen und physikalischen Merkmale unterschieden werden. Alle neuen Anthracycline
besitzen eine vergleichbare Löslichkeit; als freie Basen sind sie in Chloroform. Methylendichlorid, Aceton,
Methanol, Ethanol, wässerigen Alkoholen, sauren Wasser, Dioxan und Pyridin löslich, aber wenig löslich oder
unlöslich in Diethylether, η-Hexan, Cyclohexen und Petrolether; als Hydrochloride sind sie in Wasser, Methanol,
Ethanol und wässerigen Alkoholen löslich, aber unlöslich in Aceton, Benzol, Chloroform, Diethylether und
Petrolether. Sie können als Indikatoren, die in neutralen und sauren Lösungen organge-gelb sind und in welchen
sie auch unter UV-Licht orange-rote Fluoreszenz zeigen, verwendet werden. Ihre alkalischen Lösungen sind
rotbraun und, wenn sie mit alkoholischem Magnesiumacetat behandelt werden, ergeben sie rote Lösungen.
All diese Eigenschaften und die Absorptionsspektra in den UV- und sichtbaren Zonen zeigen, daß diese neuen
Verbindungen zu der Gruppe der Anthracyclinantibiotika gehören. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften
der Glykoside gemäß der Erfindung als Hydrochloride isoliert, sind in Tabelle I ί Ι angegeben.
35 Eigenschaft
Glykosid I · UCI Fp. 171 —173"C
(Zers.)
Glykosid Il ■ HCl
Fp. I63-164°C
(Zcrs.)
Glykosid III · HCI
Fp. 175-176°C
(Zers.)
Glykosid IV · HCI Fp. 140-150"C
(Zcrs.)
[x]» (c=0,2 in Methanol)
UV- und sichtbare
Spektren
j MlOH
pn
S..
£jr
IR-Spektrum
(KBr): cm-'
+ 11Γ
228,260,418 nm 645.420.193
235,262.426 nm 600,406,161 510nm 120
3700-2400 1725 1670 1625 1585 1490 1470 1450 1420
1385 1330 1300 1290 1240 1200 1180 1115 1085 1055 101";
985
+ 107°
228,260,418 nm
640,410,179
235,262.246 η m
605,400,160
510 nm
118
3700-2400
1665
1625
1585
+ 485
1470
1445
1420
1385
1325
1290
1235
1195
1180
1115
1050
1010
985
940
840
820
+ 139°
228,260,418 nm
713,450,199
235,262.426 nm
617,424,166
510nm
3700-2300
1710
1670
1625
1585
1490
1470
1445
1420
1385
1325
1295
1235
1195
1115
1085
1010
985
835
815
795
+ 122°
228.260,418 nm
610,395,171
235,262,426 η m
580,400.160
510nm
110
3700-2400
1665
1625 .
1585
1 AOC
ItOJ
1465 1445 1420 1385
1325 1295 1255 1235
1190 1180 1110 1040 1010
980
830
750
Fortsetzung
Eigenschaft
Glykosid I · HCI
Fp.171-173"C
(Zcrs.)
Glykosid Il ■ HCI Ip. 163-IWC
(Zcrs.)
Glykosid III ■ HCl
Fp. 175-176°C
(Zers.)
Fp. 175-176°C
(Zers.)
Glykosid IV ■ HCl
Fp. 140-!500C
(Zers.)
Fp. 140-!500C
(Zers.)
IR-Spektrum
(KBr):cm'
(KBr):cm'
940
875 840 820 795 755 440
750
435
430
empirische Formel
Molgewicht
Molgewicht
564
HCl C27Hj1NO, · HCI
550
C27HnNO9 · HCl
548
548
C27Hj1NO8 · HCI
534
534
Diese neuen Anthracyclinantibiotika /eigen auch charakteristische NMR-Spektren. Das Spektrum von Glykosid
I, als Hydrochlorid in DMSO-d„, zeigte charakteristische Signale bei 1,14 <J(d,CH,-C-5'), 3,39 rf(s, CH3O),
4,60 rf(breites s,C-H-H2),4,89 rf(breitcs s,C-7-H), 5.27 rf(breitcs s,C-l'-H). 7,23 rf(s,C-Il-H), 7,4-7,9 rf(m,C-I-H,
C-2-N und C-3-H) und 13,61 rf(s, C-6-OH). Das Glykosid, als Hydrochlorid in DMSO-db, zeigte Signale bei 1,15 rf
(d, CHrC-5'), 2,26 rf(s, CHiCO), 3,92 rf(s, CH1O), 4,90 rf (breites s, C-7-H), 5,26 rf (breites s, C-l'-H), 7,31 rf(s,
C-11-H), 7,4-7,9 rf(m,C-1-H.C-2-H und C-3-H) und 13,65 rf(s,C-6-OH).
Felddesorptionsmassespektroskopie der freien Basen der erfindungsgemäßen Glykoside bestätigten die zugeschriebenen
Molekularformeln, wie in Tabelle IV gezeigt.
%:- | Tabelle IV | Molekularformel | Molgewicht bcr. |
gef. m/e |
lift | Verbindung | C27HnNOk, C27H11NO, C27HnNO, C27Hj1NOh |
527 513 511 497 |
527(M+) 514(MH+) 512(MH+) 498(MH + ) |
I | Glykosid I Glykosid II Glykosid III Glykosid IV |
|||
Biologische aktive Daten a) Antibakterielle Wirksamkeit
Die »in vitro« minimalen Hemmungskonzentrationen (MlC) der erfindungsgemäßen Glykoside wurden für
bestimmte Mikroorganismen unter Anwendung des Standardrohrverdünnungsverfahrens bestimmt und sind in
Tabelle Vl angegeben.
Testorganismus
Staphylococcus aureus 209 P Staphylococcus aureus 153
Sarcina lutea ATCC 9341 Bacillus subtilis ATCC 6633
Escherichia coli B
M IC in ng/ml | (H) |
Glykosid (I) | 1000 |
125 | 1000 |
500 | 100 |
100 | 100 |
100 | 100 |
50 | |
(III)
(IV)
62
250
12,5
50
25
250
12,5
50
25
250
1000 50 25
100
50
100
50
b) Antitumorwirksamkeil
Die neuen Verbindungen wurden gegen HeLa-Zellen in vitro (Zeit der Einwirkung der Heilmittel 24 h) und
auf L 1210- und P 388-Leukämie an Mäusen im Vergleich mit Daunorubicin getestet. Die Ergebnisse der in
vitro-Versuche gehen aus Tabelle VlI hervor. Es kann festgestellt werden, daß alle Verbindungen die Zellenentwicklungsfähigkeit
von HeLa-Zellen in vitro hemmten, wobei die ID5O für Glykosid IH 0,05 μg/ml, für Glykosid I
0,1 ug/ml. Glykosid IV 0,22 ^g/ml und für Glykosid II 0,44 ug/ml beträgt.
Die in vivo-Daten, die bei Mäusen erhalten wurden, sind in Tabelle VIII angegeben. Glykosid I war gegen
P 388-Leukämie in einer Dosis von 66 mg/kg wirksam und bei der Dosis von 100 mg/kg toxisch; bei der
tolerierten Dosis war die Antitumorwirksamkeit höher als jene von Daunorubicin.
Duunorubicin (Daunomycin)
Glykosid(l) Glykosid(lll)
25 Glykosid(ll)
*) HeLa-Zellen wurden den Heilmitteln 24 h lang ausgesetzt und dann plattiert. Die Kolonienanzahl
wurde 5 Tage später festgestellt.
30 **) % gegenüber unbehandclten Kontrollen.
30 **) % gegenüber unbehandclten Kontrollen.
Wirkung gegen P 388- und L 1210-Leukämie bei Mäusen
Doms*) | Anzahl von | ID^ |
(ng/ml) | Kolonien·*). % | (ng/ml) |
12,6 | 35-15 | b-7 |
6,25 | 48-66 | |
3,12 | 71-80 | |
200 | I | |
100 | 63 | 105 |
50 | 73 | |
25 | 74 | |
200 | 3 | |
100 | 44 | 54 |
50 | 54 | |
400 | 0 | |
200 | 53 | 220 |
100 | 109 | |
1600 | 0 | |
800 | 20 | 440 |
400 | 66 |
Verbindung
Dosis*) | T/C. % | P 388 | toxische |
(mg/kg) | 1.1210 | 199 | Todesfälle*·) |
2,9 | 133-133 | 200 | |
4.4 | 140-133 | 223 | |
6,b | 111-133 | 14/26 | |
2,9 | 111 | ||
6,6 | 128 | ||
10 | 122 | 245 | |
66 | 254 | ||
100 | 1/10 | ||
2,9 | 100 | ||
6,6 | 117 | ||
15 | 122 | iöi | |
i00 | 45 | 3/8 | |
150 | 3/19 | ||
2.9 | 100 | ||
6,6 | 100 | ||
15 | 111 | 18 | |
125 | 9 | 5/5 | |
250 | 0 | 5/5 | |
2,9 | 100 | ||
6,6 | 122 | ||
15 | 122 | ||
Daunorubicin
Glykosid(I)
Glykosid(IIi)
55 Glykosid(IV)
Glykosid(II)
500 9 2/2
·) Mäuse wurden intraperitoncal einen Tag nach der Tumor/cllenanimpfung behandelt.
**) Die Bewertung erfolgte auf Grundlage der makroskopischen Autopsieuntersuchungen.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne daß diese jedoch hierauf
beschränkt sein soll.
Eine Kultur von Micromonospora peucetica. Siamm B 211 F. 1, wurde 25 Tage lang bei 28°C auf Schrägagar
mit dem Aufrechterhaltungsmedium SA gezüchtet. Das Medium SA hatte die folgende Zusammensetzung:
Glucose | 3% |
Brauerei-Trockenhefe | U% |
Natriumchlorid | 0,1% |
Kaliumdihydrogenorthophosphat | 0,05% |
Calciumcarbonät | 0,1% |
Magnesiumsulfat | 0.005% |
Ferrosulfatheptahydrat | 0,0005% |
Zinksulf a theptahydra t | 0,0005% |
Cuprisulfatpentahydrat | 0,0005% |
Agar | 2% |
Leitungswasser bis zu | 100% |
Die Sterilisierung wurde durch Erhitzen in einem Autoklaven bei 120°C während 20 min bewirkt
Die Mycelmatte der so erhaltenen Kultur wurde abgekratzt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt von 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums angeimpft:
Die Mycelmatte der so erhaltenen Kultur wurde abgekratzt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt von 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums angeimpft:
Brauerei-Trockenhefe
Pepton
Pepton
Calciumnitrattetrahydrat
Leitungswasser bis zu
Leitungswasser bis zu
0,3% 0.5% 0,05% 100%
Die Sterilisierung wurde durch Erhitzen in einem Autoklaven bei 120° C während 20 min bewirkt. Der
pH-Wert des Mediums betrug nach der Sterilisierung 6,8 bis 7.0.
Die angeimpften Kolben wurden 8 Tage lang bei einer Temperatur von 28°C auf einem Drehschüttler bei
250 UpM. der einen Kreis mit einem Durchmesser von 7 cm umschrieb, geschüttelt. 5 ml der wie oben gezüchteten
Kultur wurden in einen 300-ml-Erlenmayerkolben mit einem Gehalt an 50 ml des folgenden Produktionsmediums
eingeimpft:
Glucose 6%
Brauerei-Trockenhefe 3%
Natriumchlorid 0,2%
Kaliumdihydrogenorihophosphat 0,1 %
Calciumcarbonat 0,2%
Magnesiumsulfat 0,01%
Ferrosulfatheptahydrat 0,001%
Zinksulfatheptahydrat 0,001%
Cuprisulfatpentahydrat 0,001%
Leitungswasser bis zu 100%
Das Sterilisieren wurde durch Erhitzen im Autoklaven oci 115"C während 20 min bewirkt.
Die Kolben wurden 25 Tage lang bei 28°C unter Bedingungen bebrütet, die mit jenen für die Animpfphase
identisch sind. Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 18. und 22. Tag der
Fermentation mit einer Produktion von 90 mcg/ml erzielt.
Eine Kultur des Stammes B 211 F. I. wurde 14 Tage lang, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, und die
Mycelmatte, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt wurde, wurde in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem
Gehalt an 50 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums eingeimpft:
lösliche Stärke 4%
Sojabohnenmehl 1,5%
Brauerei-Trockenhefe 0,5%
Getreideweiche 0,8%
Calciumcarbonai 0,3% Kaliummonohydrogenorthosphosphat 0.05%
Magnesiumsulfat 0,025%
Kaliumchlorid 0,025%
Leitungswasser bis zu 100%
10
20
25
30
35
40
45
50
55
6(
Der pH-Wert von 5,7 wurde vor der Slerilisierung mit Natriumhydroxyd auf 7,5 erhöht. Die Sterilisierung
wurde bei 1200C während 20 min bewirkt.
Nach 4 Tagen Bebrütung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurden 5 ml der so gezüchteten
Kultur in 300-ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt an 50 ml des oben beschriebenen Mediums eingeimpft.
Dann wurden die Ko.aen unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, 10 Tage lang bebrütet. Die
maximalen Konzentrationen der aktiven Verbindungen wurden zwischen dem 8. und 9. Tag der Fermentation
mit einer Produktion von 15 mcg/ml erzielt.
Das gesamte Bier (201) aus einer gemäS Beispiel 1 erhaltenen Fermentation wurde mit Salzsäure auf einen
pH-Wert von etwa 4 eingestellt und unter Verwendung von 3% Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, wobei ein
Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert wurden. Der nasse Filterkuchen wurde mit etwa
4 1 einer Mischung aus Aceton und 0.1 N wässeriger Salzsäure (80 :20) behandelt Nach Filtration gewährleistete
eine zweite Behandlung mit weiteren 3 1 angesäuertem wässerigen Aceton die vollständige Extraktion der
aktiven Verbindungen. Die kombinierten wässerigen Acetonextrakte wurden mit Ammoniumhydroxyd auf
einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 eingeengt und mit der filtrierten
Brühe vereinigt. Die erhaltene Mischung wurde auf einen pH-Wen von etwa 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann
zweimal mit einem halben Volumen einer Chloroform-Methanol^:1)-Mischung extrahiert. Die vereinigten
organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter
vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Durch Zusetzen 1 I n-Hcxans fiel der rohe
Komplex als gelbbraunes Pulver (7 g) aus.
B c i s ρ i c I 4
Eine Chloroformlösung des rohen Komplexes als freie Base (6 g in 200 ml) wurde nach Behandlung mit 10 ml
1 N methanolischen Chlorwasserstoffs auf eine Kieselsäuresäule (hergestellt in Chloroform) aufgebracht. Die
Säule wurde mit Chloroform gewaschen, worauf mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol, Wasser
(94,8 :5 :0,2) eluiert wurde. Die erste gelbe Fraktion enthielt einige Aglycone, die nächsten zwei gelben Banden
enthielten das Glykosid IV bzw. III. Die Eluierung wurde mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol, Wasser
(893 :10 :0,5) fortgesetzt, bis zwei andere gelbe Banden, entsprechend den Glykosiden Il und 1, eluiert wurden.
Die Fraktionen, die diese vier Banden enthielten, wurden getrennt unter vermindertem Druck konzentriert,
wobei die praktisch reinen Hydrochloride von Glykosid IV (0,2 g). Glykosid 111 (0,4 g), Glykosid Il (0,2 g) und
Glykosid I (0,6 g) als mikrokristalline Pulver erhalten wurden. Durch Umkristallisieren der Glykoside I und III
aus Methanol: n-Butanol wurden die entsprechenden reinen Hydrochloride als gelborangefarbene Kristalle
erhalten, Fp. 171-1730C mit Zersetzung für Glykosid I, Fp. 163-i64°C mit Zersetzung für Glykosid II,
Fp. 175-176°C mit Zersetzung für Glykosid III und Fp. 150- 15O11C mit Zersetzung für Glykosid IV.
Claims (1)
1. Anthracyclin-Glykoside der allgemeinen Formel
O
O
HjCO O OH O
OH
mit folgenden Bezeichnungen und Zuordnungen von R:
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