DE2944143C2 - Antibiotikum SF-2052, Verfahren zu dessen Herstellung und das Antibiotikum SF-2052 enthaltende antibakterielle Mittel - Google Patents

Antibiotikum SF-2052, Verfahren zu dessen Herstellung und das Antibiotikum SF-2052 enthaltende antibakterielle Mittel

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DE2944143C2
DE2944143C2 DE2944143A DE2944143A DE2944143C2 DE 2944143 C2 DE2944143 C2 DE 2944143C2 DE 2944143 A DE2944143 A DE 2944143A DE 2944143 A DE2944143 A DE 2944143A DE 2944143 C2 DE2944143 C2 DE 2944143C2
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Description

NH2
und seine pharmazeutisch annehmbaren Säureaddi- . b) tionssalze.
2. Hyu.'ochlorid und Sulfat des Antibiotikums SF-2Q52 gemäß Anspruch 1.
3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums SF-2052 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man hi einem wäßrigen Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen entweder
COCH2NHCH
Micromonospora sp. SF-2098 (FERM-P 5073 bzw. ATCC 31580) bei 25-40" C züchtet und
das Antibiotikum SF-2052 aus dem Kulturmedium, vorzugsweise in Form seines Hydrochlorides, isoliert
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 2 bis 10 Tage bzw. Micromonospora sp. SF-2098 3 bis lOTage züchtet
5. Antibakterielle Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einem pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalz des Antibiotikums SF-2052 und einem üblichen Trägermaterial.
Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, welches die Bezeichnung SF-2052 trägt Die Erfindung betrifft weiterhin das in Anspruch 3 angegebene Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums durch Züchtung eines Stammes der Gattung Dactylosporangium oder der Gattung Micromonospora in einem geeigneten Kulturmedium. Schließlich betrifft die Erfindung auch antibakterielle Mittel, welche das Antibiotikum SF-2052 als Wirkstoff enthalten.
Aus der Kulturbrühe verschiedener Stämme von Mikroorganismen ist bereits eine große Zahl unterschiedlicher Antibiotika isoliert worden. Bei dem Versuch, neue und wertvolle Antibiotika zu finden, die nicht nur sowohl gegen gram-negative als auch gegen gram-positive Bakterien, sondern auch gegen verschiedene gegenüber den bekannten Antibiotika resistente Bakterienstämme wirksam sind, ist jetzt die Gärbrühe eines neuen Mikroorganismus untersucht worden, der die Bezeichnung Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 trägt Dabei konnte festgestellt werden, daß ein neues Antibiotika erzeugt wird, wenn man diesen Mikroorganismus in einer Gärbrühe, die assimilierbare Nährstoffe enthält, unter aeroben Bedingungen züchtet Das neue Antibiotikum konnte aus der Gärbrühe isoliert werden und wurde als Substanz SF-2052 bzw. einfach als SF-2052 bezeichnet Die chemischen, physikalischen und biochemischen Eigenschaften von SF-2052 konnten festgestellt werden. Es konnte außerdem festgestellt werden, daß sich das neue Antibiotikum auch gewinnen 65 läßt, wenn man den Stamm eines weiteren neuen Mikroorganismus mit der Zeichnung Micromonospora sp. SF-2098 züchtet.
Es ist infolgedessen die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Antibiotikum, nämlich SF-2052, welches als antibakterielles Niittel brauchbar ist, bereitzustellen und ein Verfahren vorzuschlagen, mit welchem dieses neue Antibiotikum gewinnbar ist
Gegenstand der Erfindung ist zum ersten das Antibiotikum SF-2052 einschließlich seines Hydrochloride und seines Sulfates der in den Ansprüchen 1 und 2 gekennzeichneten und beanspruchten Art
SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung kann in Form von Säureanlagerungssalzen mit pharmazeutisch akzeptablen anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure oder Apfelsäure vorliegen.
Die Eigenschaften von SF-2052-Hydrochlorid können wie folgt zusammengefaßt werden:
Aussehen:
farblos, amorphes Pulver.
Schmelzpunkt:
kein definierter Schmelzpunkt, langsame Verfärbung nach braun beim Erwärmen bei oder nahe bei 1700C; anschließend Zersetzung bei 209 bis 2100C unter Aufschäumen.
Gewichtsanalyse:
C35,69%; H7,04%; N 1130%.
Ultraviolett-Absorptionsspektrum:
kein charakteristischer Absorptions-Peak bei Wellenlängen zwischen 220 nm und 370 nm.
Infrarot-Absorptionsspektrum:
SF-2052-Hydrochlorid in Kalhimbromidtablette 10, zeigte das in Fig. 1 dargestellte Spektrum. Hauptabsorptions-Peaks bei 2900-3500, 1720, 1640,1510,1120 und 1050 cm-'.
6. Molekulargewicht; da SF-2052 unter alkalischen pH-Bedingungen instabil ist, konnte die freie Base nicht in beständiger Form gewonnen werden. Infolgedessen war eine direkte Bestimmung des Molekulargewichtes nach der Massenspektrometrie sehr to schwierig. Aus dem Kohlenstoff-NMR-Spektrum sowie anderen vorliegenden Daten konnte abgeleitet werden, daß SF-2052 in Form der freien Base ein Molekulargewicht von etwa 400 bis 450 aufweist
7. Löslichkeit:
leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol und praktisch unlöslich in organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Äthylacetat, Hexan, Benzol, Äthyläther etc.
8. Beständigkeit:
relativ beständig unter sauren bis neutralen pH-Bedingungen, jedoch instabil unter alkalischen pH-Bedingungen.
9. Rf-Werte bei der Dünnschicht-Chromatographie an Cellulose:
(a) Rf «0,46 bei Entwicklung mit n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 15:10:3:12),
(b) Rf·» 0,10 bei Entwicklung mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 2 :1:1).
Rf-Werte bei der Papier-Chromatographie (aufsteigende Methode):
(a) Rf «0,40 bei Entwicklung mit p-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 15:10:3:12),
(b) Rf - 0,09 bei Entwicklung mit n-Butanol-Essigsäure-Wasser (Volumenverhältnis 2 A A).
Farbreaktion:
positiv bei Verwendung von Ninhydrin, Greig-Leiback- und Lemieux-Reagenz,
negativ bei Verwendung von Sakaguchi-Reagenz und Silbernitrat
Kernmagnetische Resonanzspektren:
das Wasserstoff-NMR-Spektrum von SF-2052-HCI in Deuterowasser (100 MHz, TMS, extern, Standard) ist in Fig.2 der Zeichnungen dargestellt Hauptsignale wurden beobachtet bei 1,34 ppm (d), 2,00 ppm (m), 3,16 ppm (s), 3,51 ppm (s), 533 ppm (d) und 739 ppm (s).
Koh!enstoff-NMR-Spektrum von SF-2052-HC1 in Deuterowasser (Dioxan, intr-i<, Standard) ist in F ig. 3 dargestellt
Spezifische optische Drehung:
(«)?- +87° (c= 1,H2O).
Unter Berücksichtigung der vorstehend angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften von SF-2052-Hydrochlorid kann davon ausgegangen werden, daß SF-2052 in Form der freien Base der folgenden chemischen Strukturformel entsprich*:
NH2
NH2
OCH3
Il
COCH2NHCH
Erläuterung der Zeichnungen:
F i g. 1 zeigt eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums einer Probe von SF-2052-Hydrochlorid in Kaliumbromid tablette;
Fig.2 zeigt eine Kurve des Wasserstoff-NMR-Absorptionsspektrums einer Probe von SF-2052-Hydrochlorid in Deuterowasser bei 100 MHz;
Fig.3 zeigt eine Kurve des Kohlenstoff-NMR Absorptionsspektrums einer Probe von SF-2052-Hydrochlorid in Deuterowasser bei 25 MHz.
Die antibakterielle Wirkung von SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung (in Form des Sulfates) bei der Inhibierung des Wachstums verschiedener Bakterien wurde nach der seriellen Standard-Verdünnungsmethode unter Verwendung eines Herz-Infusionsagar als Bebrütungsmedium bestimmt Die Bebrütung wurde bei einer Temperatur von 37° C in 16 Stunden durchgeführt. Die Mindestheminkonzentrationen (meg/m!) von SF-2052-Sulfat sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt
Tabelle 1
Antibakterielles Spektrum von SF-2052-Sulfat
55
eo
Test-Mikroorganismen MHK(mcg/ml)
Bacillus subtilis PCI-219 1,56
Staphylococcus a*.reus 209P 3,12
Sarctna lutea 0,78
Escherichia coii 12,5
Escberichia coü B 6,25
Escherichia coli K-12-R 3,12
KlebsieUu pneumonia 3,12
Proteus vulgaris 1,56
Pseudofflonas aeruginosa 100
Mycobacterium smegmatis 607 Km-R 100
Mycobacterium smegmatis 607 Sm-R 1,56
Aus den in der vorstehenden Tabelle enthaltenen Werten geht deutlich hervor, daß SF-2052 gemäß
vorliegender Erfindung eine hohe antibakterielle Wirkung sowohl gegen gram-positive als auch gegen gram-negative Bakterien aufweist
SF-2052 mit den vorstehend beschriebenen chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften stimmt offensichtlich mit keiner aus der Literatur bekannten Substanz überein und muß infolgedessen als eine neue Substanz bezeichnet werden.
Der SF-2052 erzeugende Mikroorganismus, Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052, der für die vorliegende Erfindung verwendet wird, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Inagami-shrine in Matsuzaki-cho, Kamo-gun, Shizuoka-Prefecture, Japan im Februar 1977 eingesammelt wurde. Die Isolierung des Stammes SF-2052 wurde erreicht, indem man eine wäßrige Suspension der Bodenprobe auf einem Isolations-Kulturmedium aus 0,2% löslicher Stärke, 0,04*b Ammoniums'.'!??·; 0.02% Dikaliiimnhosphat. 0,02% Magnesiumsulfat, 0,04% Calciumcarbonat und 1,5% Agar (pH-Wert nicht eingestellt) bei 28°C 30 Tage bebrütete. Der Stamm SF-2052 wurde bei der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute« in Chiba-City, Japan (jetzt verzogen nach Yatabe-cho, Tsukuba-gun, Ibaragi- Prefecture, Japan) unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P 4670 sowie außerdem bei der American Type Culture Collection, Washington, D.C., USA unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 31570 am 26. September 1979 hinterlegt.
Der Stamm SF-2052 weist die im folgenden angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften auf. Die Beobachtungen wurden nach der Methode von E. B. Shirling und D. Gottlieb gemacht, die in dem »International Journal of Systematic Bacteriology« 16, 313-340(1966) festgehalten ist
I. Morphologische Beobachtung
Die Substratmycelien wachsen wellig mit reichlichen Verzweigungen und haben einen Durchmesser von
s 0,5—0,6 Mikron. Sowohl auf Agar-Medium als auch auf flüssigen Medien konnte im Regelfall eine Fragmentierung der Substratmycelien nicht beobachtet werden.
Luftmycelien wurden in praktisch allen Fällen nicht beobachtet, woraus geschlossen wird, daß sie tatsachlich
to nicht gebildet werden. Das Substratmycelium des Stammes SF-2052 trägt Sporangien einzeln oder in Büscheln an der Oberfläche von Agarmedium. Das Sporangium bildet sich verhältnismäßig reichlich auf Stärke-Agar-Medium, jedoch nur schwach auf Glycerin-Asparagin-Agar, Tyrosin-Agar und Hafermehl-Agar. Das Sporangium hat eine ringerähnliche Gestalt und eine Größe von 0,9—1,4x4,0—6,0 Mikron. Jedes Sporangium enthält üblicherweise eine einzelne Reihe mit drei Sporen. Fast alle Sporen haben eine
Μ zylindrische oder ovale Form und die Oberflächenstruktur der Sporen ist glatt. Jede Spore weist eine Größe von 0,8 bis 13x1,1 bis 1,6 Mikron auf. Werden die Sporen beispielsweise in einem wäßrigen Bodenextrakt suspendiert und 15 bis 30 Minuten abgestellt, so zeigen sie eine freie Beweglichkeit.
II. Kultureigenschaften auf verschiedenen
Kulturmedien
Die Kultureigenschaften des Stammes SF-2052 sind
in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt. In der
Tabelle beziehen sich die Beschreibungen der Farben in Klammern auf das Standardwerk »Color Harmony Manual« der Container Corporation of America. Die Bebrütung wurde bei 28° C durchgeführt und die Beobachtungen erfolgten jeweils nach einer Bebrü-
tungsdauer von 21 Tagen.
Tabelle 2 Kulturmedium Wachstum und Farbe
Luftmycel
lösliches
Pigment
Sucrose-Nitrat-Agar
gewöhnliches Wachstum, bernsteinfarbig bis schwach-orange (3 Ic)
keins
keins
Glucose-Asparagüi-Agar gewöhnliches Wachstum,
rötlich-orange (4 pe)		 keins keins
Glycerin-Asparagin-Agar schwaches dünnes Wachstum,
schwach Mellon-gelb (3 ea)		 keins keins
Stärke-Agar gewöhnliches bis gutes
Wachstum, rötlich-orange
(4 pe)		 keins keins
Hafermehl-Agar gewöhnliches Wachstum,
orange (4 lc-5 nc)		 keins keins
Hefeextrakt-Malzextrakt-
Agar		 gewöhnliches Wachstuni,
schrumplig, bemsteinfarbig
bis hellbraun (3 lc-4 ng)		 keins keins
Tyrosin-Agar gutes Wachstum,
schwachgrau-orange bis
hellbraun (4 lc-4 ng)		 keins bräunlich-
rosa
Nähr-Agar sehr schwaches Wachstum,
schwach-orange		 keins keins
Fortsetzung Kulturmedium Wachstum und Farbe
Luftmycel
lösliches
Pigment
Bennet-Agar Calciummalat-Agar
gewöhnliches bis gutes keins
Wachstum, rötlich-orange (4 pc-5 pe)
schwaches bis gewöhnliches keins
Wachstum, hell-orange
(3 ga-4 ga)
keins
keins
III. Physiologische Eigenschaften
(1) Wachstums-Temperaturbereich: der Stamm SF-2052 wächst in einem Temperaturbereich von
15 An°£ onf Stärke-A^sr-Medium. Die ontirnä!e
Wachstumstemperatur liegt zwischen 25 und 370C.
(2) Verflüssigung von Gelatine: bei 21tägigem Bebrüten bei 20°C erfolgte keine Verflüssigung von Gelatine.
(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei 21tägigem Bebrüten bei 280C).
(4) Reduktion von Nitrat: negativ (bei 21tägigem Bebrüten bei 28° C).
(5) Gerinnung von Magermilch: negativ (bei 21 tägigem Bebrüten bei 28° C).
(6) Peptonisierung von Magermilch: negativ (bei 21tägigem Bebrüten bei 28° C).
(7) Bildung von Melanoid- Pigment: negativ.
IV. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
Die Feststellung erfolgte beim Bebrüten bei 28°C an einem Inkubationsmedium folgender Zusammensetzung:
ts
Kohlenstoffquelle
Wachstum
D-Fructose
I -Arahinncp
Hefeextrakt (Difco)
Calciumcarbonat
Agar (Difco)
destilliertes Wasser
5g Ig 15g 1000 ml
Die Ergebnisse der Feststellung sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt
Tabelle 3 Kohlenstoffquelle
Wachsaim
D-Glucose
D-Xylose
Tabelle 4
D-Mannitol
I-Inositol
Rhamnose
Saccharose
Raffinose +
kein Zusatz +
V. Chemische Zusammensetzung der Zellwand
Die chemische Zusammensetzung der Zellwand und der gesamten Zelle des Stammes SF-2052 wurde nach
der Methode von T. Yamaguchi analysiert, die in »J. Bact.« 89, 444—453 (1965) beschrieben ist; weiterhin erfolgte die Untersuchung nach der Methode von B. Becker et al, beschrieben in »Appl. Microbiol.« 12, 421—423 (1964) sowie nach der Methode von M. P.
Lechevalier, beschrieben in »J. Lab. Clin. Med.« 74, 934-944(1968).
Aus den gewonnenen Analysenergebnissen konnte geschlossen werden, daß der Stamm SF-2052 zum Zellwandtyp II gehört weil die Zellwand Hydroxydi-
amino-pimelinsäure und Glycin enthält Das gesamte Zellzuckerschema gehört zum A- oder D-Typ, weil sich gezeigt hat, daß das Hydrolysat der Gesamtzelle Xylose und Galactose zusammen mit einer Spur Arabinose enthält.
Im Hinblick auf die vorstehend erwähnten Eigenschaften des Stammes SF-2052 ist geschlossen worden, daß derselbe zur Gattung Dactylosporangium in der Ordnung Actinomycetales gehört. Von der Gattung Dactylosporangium sind zwei Arten, nämlich Dactylo-
sporangium aurantiacum und Dactylosporangium thailandense bereits bekannt (J. E Thiemann et al- »Arch. Viikrobiol.« 58, 42-52 (1967) und »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« 8th ED, 1974). Ein Vergleich des Stammes SF-2052 mit diesen bekannten
Arten ist in der folgenden Tabelle 4 enthalten. Eigenschaften
Stamm SF-2052
D. aurantiacum D. thailandense
Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar-Medium
Bildung von Sporangium auf
Calcrjnunaiat-AgaT-Msdiurn
Wachstum auf Nähr-Agar-Medium
gewöhnliches Wachstum, rötlich-orange
keins
gewöhnliches Wachstum, gewöhnliches Wachstum,
weiß schwach-orange
reichlich
reichlich
sehr schwaches Wachstum, sehr gutes Wachstum, hell-orange weiß
gutes Wachstum,
orange
Fortsetzung
10
Eigenschaften
SUmm SF-2052
D. aurantiacum D. thailandense
Bildung von löslichem Pigment keins
auf Hickey- und Tresner-Agar-Medium
Wachstum auf Kartoffelstü ck kein Wachstum
keins
rötlich-braun
Verflüssigung von Gelatine
Reduktion von Nitrat
Peptonisierung von
Magermilch
Ausnutzung von Raffmose
Bemerkunaen
negativ
negativ
negativ sehr schwaches Wachstum, sehr schwaches Wachstum, hell-orange rötlich-braun
negativ
positiv
positiv
positiv
negativ positiv
keine Ausnutzung*3
Ausnutzung*' gute Ausnutzung*2
*': auf einem Inkubationsmedium, beschrieben von J. E. Thiemann in „Arch. Mikrobiol." 58, 42-52 (!967) *2: auf einem Inkubationsmedium wie verstehend bei *' angegeben, welches jedoch zusätzlich eine gewisse Menge
Vitamine enthielt
*3: auf einem Hefeextrakt-Calciumcarbonat-Agar-Medium. Der Stamm SF-2052 wuchs nichtaufden Medien ·' und 'J.
Der Stamm SF-2052 stimmt mit keiner der bekannten Arten der Gattung Dactylosporangium überein, so daß geschlossen wurde, daß es sich um eine neue Art handelt, die als Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 bezeichnet wurde.
Darüber hinaus ist es möglich gewesen, einen weiteren neuen Mikroorganismus aus einer Bodenprobe zu isolieren, die in Choshi-City, Chiba-Prefecture, Japan eingesammelt worden ist Dieser neue Mikroorganismus erhielt die Bezeichnung SF-2098. Es wurde gefunden, daß der Stamm SF-2098 zur Ordnung Actinomycetales und zur Gattung Micromonospora gehört Der Stamm SF-2098 wurde bei der öffentlichen japanischen Hinterlegungsstelle »Fermentation Research Institute« unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P 5073 und bei der An.irican Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC 31580 am 16. Oktober 1979 hinterlegt. Es konnte festgestellt werden, daß der Stamm Micromonospora sp. SF-2098 die Substanz SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung erzeugt.
Zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehört infolgedessen auch das Verfahren zur Erzeugung der Substanz SF-2052, welches in den Ansprüchen 3 und 4 gekennzeichnet und beansprucht ist
Der Stamm SF-2098 weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf:
I. Morphologische Beobachtung
Der Stamm SF-2098 bildet kein Luftmycel auf verschiedenen Agar-Kulturmedien, die üblicherweise für die BebrOtung von Actinomycetes-Stämmen verwendet werden. Die mikroskopische Untersuchung des Stammes SF-2098, der in einem flüssigen Kulturmedium w> bebrütet worden war, zeigt, daß das Substratmycelium mit Verzweigungen wächst und daß jeweils eine Spore an verschiedenen Stellen des Substratmycels gebildet wird. Bei der Beobachtung unter dem Elektronenmikroskop zeigt sich, daß die Spore annähernd kugelförmige .-5 Gestalt hat; ihre Abmessung ist 1,0 bis 1,3 Mikron im Durchmesser. Die Sporenoberfläche zeigt stumpfe Stachnln.
II. Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien
Die Bedingungen der Züchtung des Stammes SF-2098, der auf verschiedenen Kulturmedien bei 28°C bis 20 Tage bebrütet wurde, wurde beobachtet und in der folgenden Tabelle 5 zusammengestellt. Die Beschreibung der Farben in Klammern bezieht sich wieder auf das Standardwerk »Color Harmony Manual« der Container Corporation of America.
Tabelle 5
Kulturmedium Wachstum und
Farbe		 lösliches
Pigment
Saccharose-Nitrat-Agar gewöhnliches
bis gutes Wachs
tum, erhöht,
orange,
(4 la-4 na)		 keins
Glucose-Asparagin-Agar sehr schwaches
Wachstum,
farblos		 keins
Glycerin-Asparagin-Agar schwaches
Wachstum, gelb
lich-braun (3 ie),
später wechselnd
inoliv-grau
01/2 ge)		 keins
Stärke-Agar gewöhnliches
Wachstum, bern
steinfarbig (3 Ic),
später wechselnd
in dunkel-oüv
01/2 pn)		 keins
Hefeextrakt-Malzextrakt-
Agar		 gewöhnliches
bis gutes Wachs
tum, hellotiv-grau,
01/2 Ii-11/2 ig)		 keins
11
Fortsetzung
Kohlenstoflquelle
Wachstum
Kulturmedium
Wachstum und
Farbe
lösliches Pigment
Hafermehl-Agar
Tyrosin-Agar
Nähr-Agar
Bennet-Agar
Calciummalat-Agar
gewöhnliches
Wachstum, bernsteinfarbig, (3 Ic),
später wechselnd
in oliv-grau
(11/2 ig)
schwaches
Wachstum, bemsteinfarbig bis
gelblich-braun
(3 lc-3 ie)
schwaches
Wachstum,
schwach gelblich-braun (3 gc)
gewöhnliches
Wachstum,
feucht, bernsteinfarbig (3 Ic)
schwaches
Wachstum,
hei.oliv-grau
(1/1/2 ge)
keins
keins
keins
keins
keins
kein Zusatz
D-Glucose
D-Fructose
D-Xykwe
Glycerin
L·Arabinose
D-Mannitol
1-Inositol
Saccharose
ar-Melibiose
Raffinose
Rhamnose
III. Physiologische Eigenschaf ten
(1) Wachstumstemperaturbereich: der Stamm SF-2098 wächst in einem Temperaturbereich von 15 — 45° C.
(2) Verflüssigung von Gelatine: positiv (bei 21tägiger Bebrütung bei 200C).
(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei Htägiger Bebrütung bei 28° C).
(4) Beeinflussung von Magermilch: Peptonisierung und Gerinnung von Magermilch positiv (bei 21tägiger Bebrütung bei 28° C).
(5) Bildung von Melanoid-Pigment: negativ.
(6) Reduktion von Nitrat: negativ (bei Htägiger Bebrütung bei 28° C).
(7) NaCI-Verträglichkeit (festgestellt nach der Methode in »Intern. J. Syst Bacteriol.« 21,240(1971): gutes Wachstum bei 0 bis 1,5%, schwaches Wachstum bei 3 bis 4%, kein Wachstum bei mehr als 5%.
IV. Ausnutzung von Kohlenstoffquellen
Die Feststellung erfolgte bei Bebrütung bei 28° C in einem Inkubationsmedium mit folgender Zusammensetzung:
Hefeextrakt (Difco)
Calciumcarbonat
Bacto-Agar (Difco)
destilliertes Wasser
0^% 0,1%
ad 100
Das Ergebnis der Feststellungen ist in der folgenden Tabelle 6 enthalten.
V. Chemische Zusammensetzung der Zellwand
Die chemische Zusammensetzung der Zellwand des Stammes SF-2098 wurde nach der Methode von B. Becker et al., beschrieben in »Appl. Microbiol.« 13, 236 (1965), analysiert. Aus den Analysenergebnissen konnte geschlossen werden, daß die Zellwand Hydroxydiamino-pimelinsäure enthält.
Im Hinblick auf die vorstehend erwähnten Eigenschaften des Stammes SF-2098 und insbesondere bei Berücksichtigung der Tatsachen, daß der Stamm SF-2098 kein Luftmycel auf Agar-Medien bildet, den mesophilen Actinomycetes, die eine Einzelspore an ihrem Substratmycel aufweisen, zuzurechnen ist, und die Zellwand von SF-2098 Hydroxydiamino-pimelinsäure enthält, wurde der Stamm SF-2098 der Gattung Micromonospora zugerechnet. Folglich wurde für den Stamm SF-2098 die Bezeichnung Micromonospora sp SF-2098 gewählt.
Bei der fermentativen Herstellung von SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung, und zwar entweder mit dem Stamm Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 oder dem Stamm Micromonospora sp. SF-2098, wird der die Substanz SF-2052 erzeugende Stamm in an sich bekannter Weise in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Nährstoffquellen enthält, die für gewöhnliche Microorganismen assimilierbar sind. Für den genannten Zweck können alle bekannten liahrstoffe verwendet werden, die auch üblicherweise bei der Züchtung bekannter Actinomycetes-Stämme verwendet werden. Beispiele für geeignete Nährstoff quellen sind Glucose, Glycerin, Saccharose, Stärke, Dextrin, Maltosesirup, Melasse und Sojabohnenöl als Kohienstoffquellen, Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisweichwasser, Baumwollsamenmehi, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Erforderlichenfalls können auch anorganische Salze wie Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kobaltchlorid, Phosphate zugesetzt werden. Darüber hinaus kann auch nützlich sein, solche organischen oder anorganischen Materialien zuzusetzen, die das Wachstum der Stämme SF-2052 oder SF-2098 unterstützen und die Bildung der Substanz SF-2052 fördern.
Die Züchtung kann in der flüssigen Phase, insbesondere unter submersen Bedingungen durchgeführt werden, wie dies auch bei der Herstellung bekannter Antibiotika geschieht Im vorliegenden Fall erfolgt die Züchtung unter aeroben Bedingungen. Der Stamm SF-2052 wird bei einer Temperatur von 25 —37° C, in der Mehrzahl der Fälle bei einer Temperatur von 28 -32° C bebrütet In diesem Fall erreicht die Bildung
der Substanz SF-2052 in der KulturbrQhe am Ende einer 2- bis lOtägigen Bebrfitungszeit sowohl bei Schüttelkultur als auch bei der ruhenden Tankkultur ein Maximum. Der Stamm SF-2098 wird bei einer Temperatur von 25-4O0C, im Normalfall etwa bei 300C bebrütet Das Bebrütungsmediutn wird vorzugsweise neutral oder schwach alkalisch eingestellt Wird der Stamm SF-2098 in flüssiger Phase bebrütet, so erreicht die Ansammlung der Substanz SF-2052 in der Kulturbrühe im allgemeinen nach 3- bis lOtägiger Bebrütung ein Maximum. ic
Die Prüfung der erfindungsgemäß gebildeten Substanz SF-2052 erfolgte nach folgender Methode: es wurde ein Prüf-Kulturmedium verwendet welches 0,5% Polypepton, 03% Fleischextrakt und 1,5% Agar (pH 7,0) enthielt; Bacillus subtilis PCI-219 wurde als Test-Mikroorganismus verwendet Bei dieser Prüfmethode wird bei einer Konzentration von 50 mcg/ml bis lOmcg/ml der Substanz SF-2052 das Verhältnis zwischen dem Logarithmus der Konzentration und dem Durchmesser der Inhibiemngszone linear aufgetragen, v/obei sich die !nhibierungszone mit 21,2 bis 123 mm ergibt bestimmt nach der üblichen Papierscheibenmethode.
Die Substanz SF-2052 gemäß vorliegender Erfindung ist ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches bei der Züchtung der Stämme SF-2052 oder SF-2098 hauptsächlich in der flüssigen Phase der Kulturbrühe anfällt und aus dieser unter Ausnutzung der physikochemischen Eigenschaften der Substanz SF-2052 gewonnen werden kann. Die Abtrennung und Reinigung der Substanz SF-2052 kann auf chromatographischem Wege unter Verwendung geeigneter Hilfsmittel erfolgen. Solche Hilfsmittel für die Chromatographie sind synthetische Adsorberharze auf der Basis mikroporöser Copolymere von Styrol und Divinylbenzol (beispieisweise Amberlite XAD-2* oder Diaion HP-20·), Gelfiltrationsmittel auf der Basis von mit Epichlorhydrin vernetzten! Dextran (Sephadex G-10*) oder auf der Basis von Dextransulfatderivaten (Sephadex LH-20·) oder auf der Basis von carboxymethylsubstituiertem vernetzten! Dextrangel (CM-Sephadex·) und Kationen' austauscherharze von der Art der schwach sauren Copolymere aus Methacrylsäure und Divinylbenzol (IRC-50· oder Amberlite CG-50·). Die vorstehend aufgeführten Handelsprodukte werden von den Firmen Rohm"Haas Co, USA, Mitsubishi Kasei Co, Japan, Pharmacia Co, Schweden, hergestellt und vertrieben.
Die folgende Arbeitsweise eignet sich zur Abtrennung der Substanz SF-2052 aus der Kulturbrflhe. Die die Substanz SF-2052 enthaltende Kulturbrühe wird durch so Filtrieren oder Zentrifugieren von den festen Bestandteilen befreit Das so gewonnene Filtrat wird mit dem. vorstehend erwähnten Adsorberharz Diaion HP-20* behandelt, um die aktive Substanz zu adsorbieren. Anschließend wird die aktive Substanz durch Eluieren aus dem Harz gewonnen, indem man 50%iges wäßriges Aceton (Wasser-Aceton-Mischung im Volumenverhältnis 1:1; pH-Wert nicht eingestellt) und 50%iges wäßriges Aceton, dessen pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure auf 2,0 eingestellt worden ist als Laufmittel verwendet. Das gewonnene Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man SF-2052-Hydrochlorid als pulverförmiges Rohprodukt erhält
Dieses Rohprodukt wird anschließend durch Säulenchromatographie gereinigt wobei man CM-Sepha- es dex* in der H+-Form und in der Na+-Form und/oder Aktivkohle in geeignetem Mischungsverhältnis verwendet, so daß das SF-2052-Hydrochlorid in hochgereinigter Form anfällt Die Substanz SF-2052 in Form der freien Base ist unter alkalischen Bedingungen sehr instabil and kann infolgedessen in dieser Form rein nur schwierig gewonnen werden. Es ist wichtig, daß die Abtrennung und Reinigung der Substanz SF-2052 immer unter neutralen oder sauren Bedingungen erfolgt; das Arbeiten in schwach saurer wäßriger Lösung ist zu empfehlen. Im Endstadium der Abtrennung wird die Substanz SF-2052 der Gefriertrocknung unterworfen, wobei das Hydrochlorid oder das Sulfat von SF-2052 in Form eines farblosen amorphen Pulvers anfällt
Soll die Substanz SF-2052 aus der Kulturbrühe des Stammes SF-2098 gewonnen werden, so ist es ratsam, die Kulturbrühe zunächst durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 einzustellen. Anschließend wird die Kulturbrühe unter Verwendung eines Filtrationshilfsmittels wie Diatomeenerde filtriert, um so den Mycelkucfaen und andere feste Bestandteile abzutrennen. Weiterhin wird das Brühenfiltrat durch eine Kolonne mit Amberlite IRC-50* (Na+-Form) geleitet, um die aktive Substanz zu adsorbieren. Anschließend wird die Harzkolonne mit 0,4 η Chlorwasserstoffsäure eluiert Das gewonnene Eluat wird mit wäßrigem Natriumhydroxid neutralisiert und anschließend mit Aktivkohle entsalzt
Die so gewonnene entsalzte Lösung wird weiter durch Säulenchromatographie unter Verwendung von CM-Sephadex* Aktivkohle und/oder Sephadex LH-20· gereinigt so daß schließlich SF-2052-Hydrochlorid in hochreiner Form anfällt
Zur Bestimmung der akuten Toxizität von SF-2052-Sulfat wurde letzteres intravenös in wäßriger isotonischer Natriumchloridlösung verschiedenen Gruppen von Mäusen injiziert Es wurde festgestellt daß SF-2052-Sulfat einen LD59-Wert von 350 mg/kg bei intravenöser Injektion bei Mäusen zeigt und damit als im wesentlichen nichttoxisch anzusehen ist
Zum Gegensund der Erfindung gehört daher schließlich auch ein antibakterielles Mittel, welches als aktiven Bestandteil eine ausreichende Menge wenigstens eines pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalzes der Substanz SF-2052 in Verbindung mit einer pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit oder einem solchen festen Trägermaterial enthält Der Gehalt an aktivem Bestandteil in diesem antibakteriellen Mittel kann zwischen 5 und 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht liegen.
Das antibakterielle Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann als wäßrige Lösung vorliegen, welche den aktiven Bestandteil in Form eines Säureanlagerungssalzes der Substanz SF-2052 in einer Menge von 0,01 bis 0,1 Gew.-% enthält. Diese Lösung eignet sich zum Sterilisieren chirurgischen Materials und chirurgischer Instrumente sowie von anderen Geräten und Orten, die steril gehalten werden sollen. Das antibakterielle Mittel gemäß der Erfindung kann auch in eine oral verabreichbare Form wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Lösungen und Suspensionen gebracht werden, indem man eine ausreichende Menge eines pharmazeutisch akzeptablen Säureanlagerungssalzes der Substanz SF-2052 in üblicher Weise mit einem pharmazeutisch akzeptablen festen Trägermaterial wie Stärke, Saccharose, Talcum oder Calciumcarbonat vermischt oder die Substanz in einem pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägermaterial wie Äthanol und Wasser löst oder suspendiert Das Verhältnis von aktiver Substanz zu festem oder flüssigem Trägermaterial soll dabei
entsprechend der oralen Verabreichungsform ausgewählt werden; es soll üblicherweise zwischen 1 :1 und 1 :100 (Gewichtsverhältnis) liegen.
Das antibakterielle Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann auch in Form von injizierbaren s Lösungen oder Suspensionen vorliegen. Letztere gewinnt man, indem man die aktive Substanz in einer ausreichenden Menge von 0,1 bis 10 Gewichtsprozent in einer physiologischen Salzlösung oder einem anderen flbüchen pharmazeutisch akzeptablen flüssigen Trägermaterial, z.B. Ringer's Lösung, mit oder ohne Zuhilfenahme geeigneter Dispersionshilfsmittel löst oder suspendiert Die injizierbare Lösung oder Suspension, die so hergestellt worden ist, kann beispielsweise intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal injiziert is werden.
Die Dosierung der aktiven Substanz gemäß vorliegender Erfindung hängt, wie dem Fachmann selbstverständlich klar ist, im Einzelfall von der Art der Verabreichungsform, der Verabreichungsweise und der zu behandelnden Krankheit ab. Viele Faktoren, wie Alter, Körpergewicht, Geschlecht, mögliche Diäten, Verabreichungszeit, Verabreichungsart, Ausmaß der Ausscheidung, evtL Medikamentenkombinationen sowie Reaktionen des Patienten und Schwere des Krankheitsfalles müssen bei der Verabreichung ebenfalls berücksichtigt werden. Im allgemeinen kann jedoch gesagt werden, daß die aktive Verbindung erwachsenen Personen in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht täglich verabreicht werden kam Die jeweils optimale Dosis muß, wie gesagt, vom Fachmann anhand der vorstehend aufgeführten Faktoren festgestellt werden. Auch die Dosierungsweise betagter antibakterieller Mittel kann als Richtschnur mit herangezogen werden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
(1) Bebrütung des Stammes SF-2052
40
Es wurde eine Stammkultur von Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 (FERM-P 4670 bzw. ATCC 31570) verwendet und in einem sterilisierten Impfkulturmedium mit 2,0% Glucose, 0,5% Pepton, 0,2% 4S Fleischextrakt, 03% Hefeextrakt, 0,2% Sojabohnenmehl und 0,1% Calciumcarbonat (pH-Wert 7,0 vor dem Sterilisieren) bebrütet
5 bis 6 Schlingen voll der vorstehend erwähnten Stammkultur wurden in 20 ml des vorstehend genann- so ten Impfkulturmediums in einem lOO-ml-Erlenmeyer-Kolben eingeimpft Anschließend wurde 6 Tage bei 289C bebrütet, wodurch man eine erste Impfkultur erhielt Die Herstellung dieser ersten Impfkultur wurde in 10 Kolben durchgeführt Insgesamt 200 ml der ersten Impfkultur wurden in 20-ml-Anteilen in 10-Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingeimpft, von denen jeder 80 ml des eingangs erwähnten Impfkulturmediums enthielt Die Bebrütung erfolgte in 72 Stunden bei 28" C.
Auf diese Weise erhielt man eine zweite Impfkultur, die in 5-ml-Anteilen in 150 Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von jeweils 500 ml eingeimpft wurden; die Kolben enthielten jeweils 80 ml eines Produktionskulturmediums. Das Produktionskulturmedium hatte folgende Zusammensetzung: 4,0% Glucose, 1,0% Pepton, 0,4% Fleischextrakt, 0,6% Hefeextrakt 0,4% Sojabohnenmehl und 0,2% Calciumcarbonat Die angegebenen Mengen der Nährstoffkomponenten sind jeweils das Zweifache, bezogen auf die Menge im Impfkulturmedium, Die Bebröwng erfolgte in 6 Tagen bei 28° C nach der üblichen Schüttelkultunnethode.
Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe einer kontinuierlichen Zentrifugation in einer Gefrierzentrifuge (einem von der Firma Tommy Company, Japan, hergestelltem Gerät) unterworfen, wobei man 101 Brflhenfiltrat in etwa 2stündiger Zentrifugationsoperation erhielt
(2) Abtrennung der Substanz SF-2052
Das Brühenfiltrat (101), welches wie oben angegeben erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 750 ml entsprechende Menge eines synthetischen Adsorberharzes, und zwar das Handelsprodukt Dtaion HP-20* enthielt, damit die aktive Substanz adsorbiert werden konnte. Die Harzkolonne wurde zunächst mit 31 Wasser gewaschen und dann mit 1,81 50%igem wäßrigem Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) und dann mit 13150%igem wäßrigem Aceton (pH-Wert mit HCl auf 2,0 eingestellt) eluiert Auf diese Weise konnte die Substanz SF-2052 aus der Harzkolonne eluiert werden. Das Eluat wurde in 1,8-l-Fraktionen aufgefangen.
Die aktiven Fraktionen (insgesamt 3,61), die die Substanz SF-2052 enthielten, wurden unter vermindertem Druck auf ein kleineres Volumen eingeengt, indem man das Aceton abdestillierte. Das auf diese Weise gewonnene Konzentrat wurde abgestellt und nach dem Absetzen eines Niederschlages filtriert Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 300 ml entsprechende Menge CM-Sephadex C-25· (H+-Form) als Gelfiltrationsmittel enthielt, an welchem aktive Substanz adsorbiert werden kann.
Die Kolonne mit dem Gelfiltrationsmittel wurde mit 1,01 0,1m wäßrigem Natriumchlorid, 1,01 0,2 m wäßrigem Natriumchlorid und schließlich mit 31 0,4 m wäßrigem Natriumchlorid gewaschen und anschließend mit 0,6 m wäßrigem Natriumchlorid eluiert Das Eluat wurde in 18-ml-Fraktionen aufgefangen; die aktive Substanz fand sich in den Fraktionen 26 bis 92.
Die aktiven Fraktionen wurden durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge chromatographischer Aktivkohle enthielt Die Kolonne mit der adsorbierten aktiven Substanz wurde mit 900 ml Wasser gewaschen und danach mit 1,21 50%igem wäßrigem Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) sowie 600 ml 50%ipm wäßrigem Aceton (pH-Wert mit HCl auf 2,0 eingestellt) eluiert Das *?luat wurde in 1800-mUFraktionen aufgefangen. Die aktive Fraktion (1800 ml) mit der Substanz SF-2052 wurde unter vermindertem Druck eingeengt Die eingeengte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Auf diese Weise erhielt man 170 mg eines rohen weißen pulvrigen Produktes (Reinheit etwa 20%), welches SF-2052-Hydrochlorid darstellte.
(3) Reinigung
Da> pulverförmige Rohprodukt (170 mg), welches das Hydrochlorid der Substanz SF-2052 darstellte und gemäß vorliegender Verfahrensstufe (2) erhalten worden war, wurde in 5 ml Wasser aufgenommen. Die entstandene wäßrige Lösung in 5 ml Wasser durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 180 ml entsprechende Menge an CM-Sephadex C-25· (Na+-
Form) enthielt, welche zuvor mit 0,1m wißrigem Natriumchlorid imprägniert worden war. Diese Kolonne wurde mit 210,5 m wäßrigem Natriumchlorid eluiert und anschließend mit 1,0 m wißrigem Natriumchlorid entwickelt Du Eluat wurde in 18-ml-Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen 8-20 mit der Substanz SF-2052 wurden vereinigt
Die aktiven Fraktionen (insgesamt 220 ml) wurden durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 40 ml entsprechende Menge an chromatographischer Aktivkohle enthielt Die Kohlenstoffkolonne wurde mit 250 ml Wasser gewaschen und anschließend mit 200 ml 50%igem wißrigem Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) und danach mit 200 ml 50%igem wißrigem Aceton (pH-Wert 2,0) eluiert Das Eluat wurde in 400-ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktive Fraktion (400 ml) wurde unter vermindertem Druck eingeengt Die konzentrierte Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wonach 26 mg SF-2052-Hydrochlorid als farbloses Pulve* vorlagen, das rein war.
(4) Bildung von SF-2052-Sulfat
Das farblose Pulver (26 mg), welches reines SF-2052-Hydrochlorid darstellte und gemiß vorstehender Verfahrensstufe (3) erhalten worden war, wurde in 10 ml Wasser aufgenommen. Die gewonnene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 10 ml entsprechende Menge eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRA-400· (Sulfat-Form) enthielt Die die Kolonne verlassende Flüssigkeit wurde eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 30 mg SF-2052-Sulfat als farbbses Pul/er. Dieses Produkt zeigte einen Zersetzungspuukt Ober 220° C
Beispiel 2
101 des Brühenfiltrates, welches bei dem Züchtungsverfahren gemiß Beispiel 1 (1) erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne geleitet, welche eine einem Volumen von 800 ml entsprechende Menge eines synthetischen Adsorberharzes, und zwar Diaion HP-20* enthielt Die Harzkolonne wurde mit 41 Wasser gewaschen und dann mit 50%igem wäßrigen Aceton (pH-4,0) gewaschen. Das Eluat wurde in 500-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 2-6 mit der aktiven Substanz wurden eluiert und vereinigt und unter vermindertem Druck durch Abdestillieren des Acetons eingeengt
Die konzentrierte Lösung wurde zunächst stehengelassen und später Filtriert, nachdem sich ein Niederschlag abgesetzt hatte. Das Filtrat wurde durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 250 ml entsprechende Menge eines Kationenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRC-50* (Na+-Form) enthielt Die Harzkolonne wurde anschließend mit 21 Wasser gewaschen und mit 0,1 η Wasserstoffsäure eluiert Das Eluat wurde in 18-ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktive Substanz fand sich in den Eluat-Fraktionen 240—336. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und zur Neutralisation durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge eines Anionenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IR-45*(OH--Form) enthielt
Die Kolonne verlassende Lösung (pH 5,4) wurde über eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 80 ml entsprechende Menge chromatographischer Aktivkohle enthielt Diese Kohlekolonne wurde dann mit 400 ml Wasser gewaschen und mit 300 m! 50%igem wißrigem Aceton (pH-Wert nicht eingestellt) und 300 ml 50%igem wäßrigem Aceton (pH-Wert mit HCl auf 2,4 eingestellt) eluiert, um die aktive Substanz aus der Kolonne herauszulösen.
■> Die vereinigte aktive Lösung (insgesamt 600 ml), die auf diese Weise gewonnen worden war, wurde unter vermindertem Druck eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 260 mg SF-2052-Hydrochlorid als schwach gelb gefärbtes
in pulverförmiges Rohprodukt (Reinheit 16%).
Beispiel 3
(1) Bebrütung des Stammes SF-2098
ι? Eine Stammkultur von Micromonospora sp. SF-2098 (Hinterlegungsnummern FERM-P 5073 und ATCC 31580) wurde verwendet und in einem sterilisierten Impfkulturmedium, welches 2,0% Glucose, 0,5% Pepton, 0,2% Fleischextrakt 03% Hefeextrakt 0,2%
a> Sojabohnenmehl und 0,1% Calciumcarbonat enthielt und dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren nicht eingestellt wurde, bebrütet
3 bis 4 Schlingen voll der vorstehend erwähnten Stammkultur wurde in 20 ml des ebenfalls erwähnten Impfkulturmediums in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 100 ml eingeimpft Die Bebrütung erfolgte ja 4 Tagen bei 28° C Auf diese Weise erhielt man eine Impfkultur. Die Impfkultur wurde in 20 Kolben hergestellt
in Die so gewonnene Impfkultur (insgesamt 400 ml) wurde in 4-ml-Potlionen in 100 Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von je 500 ml eingeimpft Jeder Kolben enthielt 80 ml eines sterilisierten Produktionskulturmediums. Dieses Produktionskulturmedium enthielt 4% Maltosesirup, 0,3% Sojabohnenöl, 05% lösliches pflanzliches Protein, 1,0% Baumwollsamenmehl, 0,001% Ferrosulfat, 0,0001% Kobaltchlorid und 0,2% Calciumcarbonat; der pH-Wert lag vor dem Sterilisieren bei 7,0. Die Bebrütung erfolgte in 2 Tagen bei 28° nach der üblichen Schüttelkufturmethode.
Nach der Bebrütung wurde die Kulturbrühe durch Zugabe von 6 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und nitriert, und zwar unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrierhilfsmittel.
Die Menge des gewonnenen Brühenfiltrates betrug etwa 7,01.
(2) Abtrennung der Substanz SF-2052
Das in der vorstehend angegebenen Weise gewonne-
ne Brühenfiltrat (7 1) wurde durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 220 ml entsprechende
Menge eines Kationenaustauscherharzes, und zwar Amberlite IRC-5O»(Na+-Form) enthielt Die Harzkolonne wurde mit 11 Wasser gewaschen
und anschließend mit 0,4 η Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das Eluat wurde in 250-ml-Fraktionen aufgefangen; die aktive Substanz befand sich in den Fraktionen 2-5 des Eluates. Diese aktiven Fraktionen wurden vereinigt und durch Zugabe von 0,2 η wäßrigem
bo Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 4 bis 6 eingestellt Die danach vorliegende Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet die eine einem Volumen von 150 ml entsprechende Menge an Aktivkohle enthielt Die Kohlekolonne wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschließend zunächst mit 40OmI 50%igem wäßrigem Aceton, dessen pH-Wert nicht eingestellt war, und danach mit 400 ml 50%igem Aceton, dessen pH-Wert auf 2,2 eingestellt war, eluiert um die aktive
Substanz aus der Kolonne herauszulösen. Die aktiven Fraktionen des Bluates wurden vereinigt (insgesamt 800 ml) und unter vermindertem Druck durch Abdestilliercn des Acetons eingeengt
Die so gewonnene konzentrierte Lösung wurde durch ι eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 200 ml entsprechende Menge CM-Sephadex C-25· enthielt Die Kolonne mit der adsorbierten aktiven Substanz wurde dann zunächst mit 11 03 m wäßrigen Natriumchlorid und danach mit 11 0,5 m wäßrigen ι ο Natriumchlorid gewaschen sowie schließlich mit 0,5 m wäßrigen Natriumchlorid eluiert Das Eluat wurde in 20-ml-Fraktionen aufgefangen; die aktiven Fraktionen 102—172, die die Substanz SF-2052 enthielten, wurden vereinigt Die aktive Lösung wurde durch eine Kolonne ι ~> geleitet, die eine einem Volumen von 50 ml entsprechende Menge an chromatographischer Aktivkohle enthielt. Die Kohlekolonne mit der adsorbierten aktiven Substanz wurde mit 200 ml Wasser gewaschen, anschließend zunächst mit 200 ml 50%igem wäßrigem Aceton, dessen pH-Wert nicht eingestellt war, und dann mit 200 ml 50%igem wäßrigem Aceton, dessen pH-Wert mit HCl auf 2,0 eingestellt worden war, eluiert Die aktive Substanz ließ sich auf diese Weise in guter Ausbeute eluieren. Die vereinigten aktiven Fraktionen (insgesamt 800 ml) wurden unter vermindertem Druck eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 124 mg SF-2052-Hydrochlorid als weißes pulverförmiges Rohprodukt (Reinheit 20%). Dieses pulverförmige Rohprodukt, 120 mg, wurde in 4 ml 50%igem wäßrigem Methanol (Wasser-Methanol-Gemisch im Volumenverhältnis 1 :1) aufgenommen; die entstandene Lösung wurde durch eine Kolonne geleitet, die eine einem Volumen von 380 ml entsprechende Menge Sephadex LH-20a enthielt, welches zuvor gut mit 90%igem wäßrigem Methanol (Wasser-Methanol-Gemisch im Volumenverhältnis 1 :9) gewaschen worden war. Die Kolonne wurde mit 90%igem wäßrigem Methanol entwickelt und das Eluat wurde in 12-ml-Fraktionen aufgefangen. Die aktive Substanz befand sich in den Fraktionen 12-16 des Eluates. Die vereinigten aktiven Fraktionen (insgesamt 60 ml) wurden unter vermindertem Druck eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Mp.'-: erhielt auf-diese Weise 20 mg SF-2052-Hydrochlorid als farbloses pulverförmiges Rohprodukt
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche;
1. Antibiotikum SF-2052 der Formel
OCH3
a) Dactylosporangium matsuzakiense SF-2052 (FERM-P4670 bzw. ATCC31570) bei 25-37°C oder
NH
DE2944143A 1978-11-06 1979-11-02 Antibiotikum SF-2052, Verfahren zu dessen Herstellung und das Antibiotikum SF-2052 enthaltende antibakterielle Mittel Expired DE2944143C2 (de)

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Publications (2)

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DE2944143A1 DE2944143A1 (de) 1980-05-08
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FR2440955B1 (de) 1983-04-22
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