DE2532568C3

DE2532568C3 - Aclacinomycin A und B, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2532568C3
Application number: DE2532568A
Authority: DE
Inventors: Masa Hoya Tokio Hamada; Toshikazu Kamakura Okio; Akira Yokohama Takamatsu; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1974-07-27
Filing date: 1975-07-21
Publication date: 1979-10-11
Also published as: SE434648B; DK141761C; DE2532568A1; HU172209B; ES439747A1; JPS5115690A; FI54496C; FR2279413A1; NO144064C; BE831726A; CA1055866A; FI54496B; YU188475A; FI752142A; US3988315A; DK141761B; SE7508450L; NL170754C; IE42751L; IE42751B1

Description

—ο

⁷ CH., \j Γ"~

/ N-CH.,

CH,

\ O

H.,C

steht, und deren nicht-toxische Säureadditionssalze. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces galilaeus ATCC 31133 oder einen Mutanten davon unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium bei einer Temperatur zwischen 20 und 35°C und einem pH-Wert zwischen ^ri si'.rl H ."-.1,JiSiC di<. f. 'iiiidci: Aciacinomycin Ge- :ΐ'Γ·ί!). ic·¹-!:! s in an si*.'ί iu¹-.i^;'i'!;-r Weise, aus dem K.ulturmedium gewinnt und in Aciacinomycin A und B auftrennt und letztere gegebenenfalls in ein nicht-toxisches Säureadditionssalz überführt

3. Pharmazeutische Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Aciacinomycin A oder B oder ein nicht-toxisches Säureadditionssalz davon als Wirkstoff enthalten.

Die Erfindung betrifft Anthracydüiglykoside, die als Aciacinomycin A und B bezeichnet werden, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Aclacipomycin enthaltende pharmazeutische Zubereitungen, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen.

Der Stamm, welcher die Antibiotika Aclacinomycine A und B gemäß vorliegender Erfindung erzeugt, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Osaki, Shinagawa-ku, Tokio, Japan gesammelt wurde. Eine Kultur von MA 144-M 1 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockwille, Maryland sowie bei dem Fermentation Research Institute in Japan hinterlegt und deren ständigen Sammlungen von Mikroorganismen als ATCC Nr. 31133 bzw. FERM NR. 2455 angefügt.

Eine Vielzahl von Anthracyclinglykosiden ist in den Kulturbrühen von Streptomyces gefunden worden. Von diesen Verbindungen sind Daunomycin und Adriamycin besonders im Hinblick auf eine Krebschemotherapie zu nennen; sie sind auch schon klinisch zur Bekämpfung von Krebs beim Menschen eingesetzt worden.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Aciiciri.; r^cine A und B weisen eine geringe Kardiotoxizitüi _nd dre wirksame Antitumoraktivität gegenüber verschiedene.ϊ Tiertumoren auf.

In der US-PS 35 90 028 wird Do\orubicin (!4-My 'roxydaunomycin) beschrieben und ü!s Substanz beansprucht. Ferner wird die direkte Gärung durch S. peuceticus var. caesius angegeben. In der JS-PS 38 03 124 wird die chemische Umwandlung von Daunomycin in Doxorubicin beschrieben. Bezüglich d :r direkten Herstellung von Daunomycin (als Antibiotikum FI 1762) durch Gärung von S. peuceticus sei auf ·% GB-PS 10 03 383 hingewiesen.

Das Daunomycin ge.näß der C)B-PS \n·.): -■'■ .-vermutlich das gleiche wie die VerhiriJhng ! ir
von Rh'/'üe-PouletiC (friihsr :ils Ruhkfonr > ·" w— nunmehr als Daunoribicin (vgl. die GB-FS · '-^ς 59S₁ 1188262 und 12 41750 sowie die US-PS 7; ■-., -■·/..) bezeichnet. Wahrscheinlich ist diese Verbindung mit dem Danubomycin von Ciba identisch (vgl. die US-PS 30 92 550 sowie die GB-PS 9 01 830). Ferner ist auf ^l: .■ US-PS 36 86 163 hinzuweisen, in der Dihydrodaunun , ein beschrieben wird.

Cinerubin A und Cinerubin B werden ii, der GB-PS 8 46 130 beschrieben. Hinzuweisen ist in diir;em Zusammenhang auch auf die US-PS 38 64 430 sowie auf »Keller-Schierlein et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy«, Seite 68 (1970) sowie »Chemical Abstracts«, 54,1466 i (1960).

Im »Index of Antibiotic form Aeliriornycetes«, Hamao Umezawa. Univrshv I¹^r!' Pi-r-s; , .-tt·- College. PtrnnsyK-a¹.! ■ ' ' ' ·-.. ■.■..'■ ... ^:
clinantibiotika auf den folgenden Sen en .ufL'eff""·'·

Antibiotikum

Seitenzahl

Aklavin	111
Cinerubin A	220
Cinerubin B	221
Danubomycin	242
Daunomycin	243
Pyrromycin	542
RhoQomycin A, B	561
Rubidomycin	574

In »Antibiotics«, Band 1, Mechanism of Action, herausgegeben von David Gottlieb und Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, (1967) findet sich auf den Seiten 190 bis 210 eine Arbeit von A. DiMarco, die mit »Daunomycin und verwandte Antibiotika« betitelt ist

In »Information Bulletin«, Nr. 10, International Center of Information of Antibiotics werden in Zusammenarbeit mit WHO, Dezember 1972. Belgian, Anthracycline sowie ihre Derivate behandelt

In »Arch, für Mikrobiol.«, 31, 356 (1953; sowie »International Journal of Systematic Bacteriology«, 22, 298 (1972) wird Streptomyces galilaeus beschrieben.

Weiter unten wird bezüglich der Galirubine auf K. E c k a r d t et al hingewiesen (vgl. Chemical Abstracts, 64,3896g und 67,90573z.

Durch die Erfindung werden Aclacinomycin A und B zur Verfügung gestellt, die Antitumor- Wirkung aufweisen. Diese Substanzen werden durch Züchten des Stammes Streptomyces galilaeus MAl 14-Ml in einer wäßrigen Kohlenhydratlösung, die organische stickstoffhaltige Nährmittel enthält, unter aeroben Submersbedingungen solange erzeugt, bis eine erhebliche Menge an Aclacinomycin A und B in der Lösung gebildet worden ist Aclacinomycin A und B können aus den auf diese Weise erhaltenen Kulturbrühen extrahiert und nach he-kömmlichen Methoden gereinigt werden, wie sie für die Extraktion und Reinigung von wasserunlöslichen Antibiotika angewendet werden. Die Erfindung betrifft ferner Aclamycin A und ß in Form von rohen Feststoffen, in Form von gereinigten Feststoffen und in Form ihrer Salze.

Durch di? Erfindung wird Aclacin-imycin A geschaffen, welches

a) in wirksamer Weise das Wachstum von Asziten und festen Formen von Fhrlich-Karzinomen, Sarcoma 180, Lymphoma 6C3HED sowie Leukemia L1210 und Ρ^ββ in Mäusen, Hepatomas in Ratten und Vaccina-virus in HeLa-Zellen zu inhibieren vermag,

b) dazu in der Lage ist, das Wachsen von verschiedenen grampositiven Bakterien und Hefen zu verhindern,

c) in Form eines gelben mikrokristallinen Pulvers isoliert werden kann,

d) in organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Chloroform, Äthanol, Äthylacetat, Azeton sowie Benzol löslich, etwas löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Äther, Hexan und Petroläther ist,

e) einen Schmelzpunkt von 129 bis 135⁰C besitzt und optisch aktiv ist [a]-.' + 29⁰C (C: 1,0, CHCl₃).

i) l'V-Maxinia und Maxima im sichtbaren Bereich besitzt, wie sie aus P ι g. 1 hervorgehen.

g) charakteristische Maxima im IR-Absorptionsspektrum gemäß F i g. 2 aufweist,

h) bei einer Säurehydrolyse Rhodosamin,2-Desoxyfucose, Cinerulose A, 1-Desoxypyrromycin und Aklavinon liefert und

i) ein schwach basisches Anthracyclinglykosid der empirischen Formel C42H53NO15 ist

Ferner wird durch die Erfindung Aclacinomycin B geschaffen, das

a) in wirksamer Weise das Wachstum von Leukemia Ll 210 und P388 in Mäusen sowie Vaccinia-Virus in HeLa-Zellen zu hemmen vermag,

b) in wirksamer Weise das Wachstum von grampositiven Bakterien und Hefen hemmt,

c) in Form eines gelben mikrokristallinen Pulvers isoliert werden kann,

d) in Methanol, Äthylacetat, Chloroform, Äthanol, Azeton und Benzol löslich und etwas löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Äther, Cyclohexan, Hexan und Petroläther ist,

e) einen Schmelzpunkt vor 135 bis 145⁰C besitzt und opthch aktiv ist [α] ί' + 3"C (C: 1,0, CHCl₃),

f) UV-Absorptionsmaxima und Maxima im sichtbaren Bereich gemäß F i g. 4 aufweist,

g) charakteristische Maxima im IR-In^frarotspcktrum gemäß F i g. 5 besitzt,

h) Aklavinon, Rhodosamin, 2-Desoxyfucose, 1-Desoxypyrromycin und das gleiche -nethylierte Disaccharid wie Cinerubin B bei einer Säurehydrolyse j. oder bei einer partiellen Hydrolyse in Methanol

liefert und

i) ein schwach basisches Anthracyclingiykosid der empirischen Formel C42H51 NOi5 ist.

Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung der Aciacinomycine A und B geschaffen, weiches darin besteht, den Stamm Streptomyces galilaeus MA 144-M1 (ATCC Nr. 31133) unter aeroben Submersbedingungen in einem Nährmedium zu züchten.

₄·, das Kohlenstoffquellen sowie; stickstoffhaltige Nährmittel enthält, bis eine erheblich<: Menge an Aclacinomycin A und B durch den Mikroorganismus in dem Nährmedium erzeugt worden ist, wobei das Züchten bei einer Temperatur zwischen 20 und 35⁰C oder in noch zweckmäßigerer Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 30⁰C durchgeführt wird und der pH-Wert 5 bis 8 beträgt, worauf die Aciacinomycine aus dem Kulturmedium nach einem Verfahren gewonnen werden, welches beispielsweise aus einer Lösungsmittelextraktion, einer

.-,-, Lösungsmittelausfällung, einer Konzentrierung, είπε Gelfiltration, einer Gegenstromverteilung, einer Chelierung unter Verwendung von Metallionen und/oder einer Adsorption besteht, worauf sich eine Eluierung von einem Anionenaustauscherharz, einem adsorbierend wirkenden kieselsäurehaltigen Material oder einem synthetischen Adsorbens anschließt.

Die Lösung, weiche die Aciacinomycine en'hält, kann auch gefriergetrocknet werden.
Vor der Gefriertrocknung können der Lösung,

_b- welche die Aciacinomycine enthält, anorganische oder organische Säuren zugesetzt werden, um Säureadditionssalze zu gewinnen.

Die Fig. 1 zeigt das (JV-Ahv.irptionsspektruin. von

Aclacinomycin A, wobei A dasjenige in Methanol, Ii dasjenige in 0,1 η HCI/Methanol und Cdasicnigc in 0,1 η NaOH/Methanol wiedergibt;

Fig. 2 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum von Aclacinomycin A als Kaliumbromid-Preßling,

Fig. 3 ist. das NMR-Spektrum von Aclacinomycin A in CDCI)(IOO MHz, innerer Standard: TMS);

F i g. 4 ist ein UV-Absorptionsspektrum von Aclacinomycin B, wobei A dasjenige in Methanol, Hdasjenige in 0,1 η HCI/Methanol und C dasjenige in (),! η m NaOH/Methanol wiedergibt:

Fi g. 5 zeigt das IR-Absorptionsspektrum von Aclacinomycin BaIs Kaliumbromid-Preßling;

F i g. 6 ist das NMR-Spektrum von Aclacinomycin B inCDCIi(100MHz, innerer Standard: TMS).

Aclacinomycin A und B verlängern merklich die Lebensdauer und verbessern den Zustand von Mäusen, die mit Leukemia L12I0- und P388- sowie Lymphoma 6C3HED-Zellen beimpft worden sind. Die letale Dosis (LDyj) im Falle von Ratten, Mäusen und Kaninchen ist ■■> sehr hoch. Im Falle von Hamstern wird eine geringe Kardiotoxizität festgestellt. Insbesondere bewirken die Substanzen eine merkliche inhibierende Wirkung auf das Wachstum von verschiedenen Tumorzellen in einer Kultur, welche von einer spezifischen Inhibicrung auf ·. eine RNA-Synthese resultiert, wobei ferner eine starke antimikrobielle Aktivität gegenüber Bakterien und Hefen festgestellt wird.

Zur Gewinnung der Aclacinomycine aus dem Kulturmedium können Adsorptionen an loncnaustau- ι schern, adsorbierend wirkenden Kieselerdemaierialien sowie synthetischen Adsorbentien, Lösungsmittelextraktionen, Lösungsmittelausfällungen, Gegenstromverteilungen oder Kombinationen derartiger Methoden angewendet werden. :,

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Aclacinomycine unterscheiden sich deutlich von den bekannten Anthracyclinglykosid-Antibiotika bezüglich der Bruttoformel, der Abbauprodukte bei der Säurehydrolyse, der Spektren im UV, im sichtbaren m Bereich sowie der NMR-Absorptionsspektren, wie vorstehend angegeben wuiucn isi. D<uüm.i Immu.; y,T,d ihre hohe Antitumoraktivität sowie ihre merkliche geringe Kardiotoxizität Eigenschaften, welche bei den anderen Anthracyclinglykosid-Antirtumorantibiotika .»-> nicht festgestellt werden.

Der Stamm Nr. MA144-M1 besitzt folgende Eigenschaften:

1) Morphologische Eigenschaften

Unter dem Mikroskop werden offene Spiralen beobachtet, die sich gut aus verzweigten Substratmyzeln entwickeln. Es werden keine Windungen festgestellt. Die reife Sporenkette ist mäßig lang und weist mehr als 10 Sporen auf. Die Sporen sind ellipsoid und messen 0,4 bis 0,8 μ χ 0.8 bis 1,6 μ. Die Oberfläche ist glatt

2) Eigenschaften auf verschiedenen Medien

Die Angaben in den Klammern entsprechen dem »Color Harmony Manual«, veröffentlicht von der Container Corporation of America, USA.

a) Auf Glukose/Asparagin-Agar, inkubiert bei 27° C: leicht gelblich-braunes Wachstum (3 gc, LtTan) keine LuftmyzeL kein lösliches Pigment -⁷

b) Auf Auf einem Rohrzucker/Asparagin-Agar, inkubiert bei 27°C: farbloses oder leicht gelblich-braunes Wachstum (ige. Lt'lan), keine l.uftmy/cl, kein lösliches Pigment.

c) Auf einem Glyzcrin/Aspanigin-Agar (ISP Medium Nr. ^r>). inknhirrt bei 27C: gelblich-oranges (4ic. SUntan) bis braunes (^r>l g. Cocoa Brown) Wachstum, weiße bis hellgraue (2fe. (Overt Gray) Luftmyzcl. braunes lösliches Pigment.

d) Auf einem Starke/anorganische Sal/e-Agar (ISP Medium Nr. 4), inkubiert bei 27⁰C: helloranges (3ca. Lt. Melon Yellow) bis hellgelblich braunes (3it\ Camel) Wachstum, leicht graue (2fe. Cover! Gray) bis graue (e, Gray) Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

c) Auf einem Tyrosin-Agar (ISP-Medium Nr. /). inkubiert bei 27°C: bräunlich-graue (3Ii, Heaver) bis braune (41 g. Toast Tan) Luftmyzel, schwarzes lösliches Pigment.

t) Auf einem Nänr'iiiiieiagat, inkuuic-i i bei 27 C farbloses bis gräulich-braunes Wachstum, keine Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

g> Auf einem Hefeextrakt/MalzextraktAgar (ISP Nr. 2), inkubiert bei 27°C: leicht braunes (4Ie, Maple) bis braunes (4ng, Lt. Brown) Wachstum, leicht graue (3fe, Silver Gray) bis graue (3ih. Beige Gray) l.uftmyzel, braunes lösliches Pigment.

h) Auf eipim Hafermehlagar (ISP-Medium Nr. 2). inkubiert bei 27°C: farbloses bis hell gelblich-braunes (2gc, Bamboo) Wachstum, hellgraue (ife, Silver Gray) Luftmyzel, braunes lösliches Pigment,
i) Auf einem Glyzerin/Nitrat-Agar, inkubiert bei 27"C: farbloses bis hell gelblich-braunes (3gc, Lt. Tan) oder leicht, olivgraues (2db, Parchment) Wachstum, keine Luftmyzel, kein lösliches Pigment.

j) Auf einem Stärkeagar, inkubiert bei 27°C: hell gelblich-braunes (3gc, Lt. Tan) Wachstum, graue (e. Gray) Luftmyzel, leicht braunes lösliches Pigment.

k) Auf einem Kalzium/Malat-Agar. inkubiert bei 2TQ: farbloses Wachstum, gräulich-weiße (b. Oyster-Weiß) bis leicht bräunlich-graue (3dc. MaiuralM nfimv7pl Wpin lösliches Pigment.

I) Auf einem Gelatineansatz, inkubiert bei 20°C: hellbraunes bis hell gelblich-braunes Wachstum, weiße Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

m) Auf einem Glukose/Pepton/Gelatine-Ansatz, inkubiert bei 27°C: hellbraunes bis braunes Wachstum, keine Luftmyzel, braunes lösliches Pigment.

n) Auf Magermilch, inkubiert bei 37⁰C: hellbraunes bis braunes Wachstum, keine Luftmyzel, braur~s lösliches Pigment.

3) Physiologische Eigenschaften

a) Die Wachstumstemperatur wird an einem Maltose/ Hefeextrakt-Agar untersucht (1,0% Maltose, 0,4% Hefeextrakt, 3,5% Agar, pH 6,0), und zwar bei 20, 24, 27, 30, 37 und 50° C. Die optimale Temperatur für das Wachstum beträgt 27 bis 37° C. Bei 50° C erfolgt kein Wachstum.

b) Gelatineverflüssigung auf einem 15%igen Gelatineansatz bei 20° C und einem Glukose/Pepton/Gelatine-Ansatz bei 27° C: Auf dem ersteren Medium wird eine Gelatineverflüssigung nach einer 14tägigen Inkubation kaum festgestellt, während auf dem letzteren Medium eine schwache oder mäßige Verflüssigung nach einer 7tägigen Inkubation zu erkennen ist

c) S:,irkehvdn>|\se auf einem Sliii ke/anorganische Sal/e Agar bei 27 (': l\s wird eine schwache Hvdrolvse nail¹ einer Hagigen Inkubation festgestellt

il) Peptnnisieriing und Gerinnung von Magermilch bei 37 ( : Ijtie mäßige bis starke Peptonisieriirig be ρ· nt ι I Mgi¹ mich der Inkubai >n und ist mich etwa !7 lagen beendet. Keine fieri nung.

e) Melauiinbildiing auf einem I yrosinagar (ISP-MediiMii Nr. 7), auf einer Tyrosin/Hcfeexlrjkl-Hrühe (ISI' Medium Nr I) und einem Pepton/I lefeev trakt I iseuagar (ISP-Medium Nr. 6) bei 27 C : positiv auf allen Medien.

I) Verflüssigung von Kalziummalat auf einem Kal/.i iimmalatagar bei 27 C: stark positiv.

g) Nitralreduktion auf einem l'eptonagar. das 1.0% Natriumnitrat enthüll (ISP-Medium Nr. K) bei 27 C: positiv.

h) Verwendung von Kohlehydraten von Pridham-Gottlieb-Grundmedium (ISP-Medium Nr. 4), inkubiert bei 27 (': Reichliches Wachstum mit l.-Arabinose, I) -Xvlo.se. Glukose. D-Iruktose. Rohr/ucker. Inosit. I.-Rhamnosi· und Raffinose. kein Wachstum mit I) Mannit.

I al.it man die vorstehenden Eigenschaften des Stamms Nr. ΜΛΙ44-ΜΙ /iisarumen, so ist festzustellen, dall der Stamm zu dem Genus Streptomyccs (chromo gener I vp) gehört, wobei braune löshche PigtTicnte auf verschiedenen Agarmediiirn erzeugt werden, l.ufimyzel bilden offene Spiralen, jedoch keine Windungen. Die Sporenoberflache ist glatt. Das Wachstum auf verschiedenen Medien ist im allgemeinen hellgelblich-braiin bis braun, bei einigen Medien oliv. Die l.uftniy/cl sind leicht grau. Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Die proteolytische Wirkung ist schwach bis mäßig, die Stärkchydrolvse ist relativ schwach. Melamin wird auf Tyrosinager. Iy tos in/11 efeex trakt-Brühe sowie Pepton/I lefeextrakt/ !'isen-Agar erzeugt.

Von den bekannten Spezies von Streptomyces ähnelt der Stamm Nr. MA 144 Ml Streptomyces galilaeus (l.iteraturstelle I: Archiv ftir Mikrobiologie. 31, 3%. I^'38, l.iteraturstelle 2: International lournal of Systematic Bacteriology, 22, 248. 1472). Unter besonderer Berücksichtigung der Differenzierung auf der Grundlage der Morphologie, der Rirbe der Luftmyzel sowie anderer physiologischer Eigenschaften lassen sich folgende Unterschiede zwischen dem crfindungsgemä-Ben Stamm und dem Stamm von S. galilaeus ISP 5481 an Hand von parallelen Kulturen feststellen:

SporenoberlKiche
Snorenkelle
iiliimzel

Wachstum

(isiichcs Pigment

Mclaniinbildung:
ISP-Medium Nr. 1
ISP-Medium Nr. 6

ISP-Medium Nr. "

Stärkeh\ drob.se

\ ertlüssieung von Gelatine:
üelatineansat/

Gluknse/Pepton-Gclatineansat/

l'cptisierung w.in Milch
Gerinnung \on Milch
Nitratreüuklion

\'erbrauch von
Kohlehydraten:

L-Arabinose

D-.\ylose

Giukose

D-Fruktose

Rohrzucker

MA 141 -M 1	Siruptonn cc-	l.iteraturstelk· 1	l.iteralursicllc .
	galilaeus
	ISP ^4Sl
glatt	glatt	glatt	glatt
olfene Spiralen	Spiralen	Spiralen	Spiralen
leicht grau	leicht grau	griiulichwciß	grau
		bis grau
hellgelblichbraun	hellgelblichbraun-	hellgelb bis	gräulichgelh-
bis braun, manch	gräulichhraun-	tief rubinrot	gelbheh'
mal leicht oliv	1 eicht olivgrau		hraunoliv
braun	braun	hellbraun	hellgelb
positiv	positiv	positiv	positiv
positiv	wahrscheinlich	positiv	positiv
	positiv
positiv	positiv	positiv	positiv
schwach	sehwach	schwach	* ι
		schwach

schwach

schwach bis
mäßig

maßig bis stark

negativ

positiv

positiv positiv positiv positiv Dositiv

schwach

schwach bis
maßig

negativ

positiv

positiv
positiv
positiv
positiv
Dositiv

negativ
schwach

positivpositiv
positiv
positiv
nositiv

	25 32 568
MA 11 IM 1	Str-plnnm^
	ISI' vlSI
positiv	positiv
positiv	positiv
positiv	positiv
negativ	iK'nativ

i >Πμ.·1/ΙΙΙ)1!

Inosit

l.-Rliamnosc
Rail i nose
I)-Mannit

' ι Keine Werte.

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu ersehen, daß der crfindungsgemüßc Stamm bezüglich Morphologie und Farbe des Wachstums sowie der Myzeln auf verschiedenen Medien sowie der physiologischen Eigenschaften sehr ähnlich S. galilaeus ISP 5481 ist. Ferner existiert eine Ähnlichkeit beider Stämme bezüglich der Gärungsprodukte. Cinerubin, welches von S. galilaeus erzeugt werden kann, ist eines der Nebenprodukte des erfindungsgemäßen Stammes. Daher kann der Stamm Nr. Mal44-Ml als Streptomyces galilaeus identifiziert werden.

Da die Streptomyces leicht mutierbar sind, und zwar natürlich oder künstlich, umfaßt der erfindungsgemäße Stamm S. galilaeus Nr. MA144-M1 erfindungsgemäß den vorstehend beschriebenen typischen Stamm sowie alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten davon. Dies bedeutet, daß S. galilaeus Nr. MA144-M1 gemäß vorliegender Erfindung alle Aclacinomycin-erzeugenden Stämme umfaßt. Wie im Falle der bekannten Antibiotika kann eine größere Produktion des Aclacinomycins durch die Auswahl höherproduktiver Stämme nach einer einzigen Kolonieauswahl durch Behandlung eines Aclacinomycin-erzeugenden Stamms mit verschiedenen Mutagenen oder durch genetische Rekombinations-, Umwandlungs- oder Uberführungsmethoden erzielt werden.

Aclacinomycine werden durch das Züchten von S. galilaeus unter geeigneten Bedingungen erzeugt. Die zum Züchten von anderen Actinomycetes angewendeten allgemeinen iviciiujucii aiiiu aui üda Züciiien νυιι 3.

galilaeus anwendbar. Eine Gärbrühe, welche Aclacinomycin enthält, wird durch Aufimpfen von Sporen oder Myzeln des Aclacinomycin-erzeugenden Organismus auf ein geeignetes Medium und anschließendes Züchten unter aeroben Bedingungen hergestellt. Wenn auch ein Züchten auf einem festen Medium zur Erzeugung von Aclacinomycin möglich ist, so ist dennoch eine aerobe Submerskultur besonders vorteilhaft zur Herstellung von großer, Mengen der Antibiotika. Medien, die aus den bekannten Nährmittelquellen für Actinomycetes bestellen, sind geeignet. Das Medium enthält vorzugsweise im Handel erhältliche Produkte, wie Glyzerin. Glukose. Stärke, Dextrin, Maltose, Melassen, öle, Fette, Lipide oder dergleichen als Kohlenstoffquellen entweder in gereinigter oder in roher Form sowie als Stickstoffqucllen die im Handel erhältlichen Produkte, wie Sojabohnenmehl, Malzextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Distillers Solubles, Fischmehl, Glutenmehl, Maiswasser, Baumwollsamenmehl, Kasein, hydrolysierte Proteinsubstanzen, Nitrate, Ammoniumsalze. Harnstoff od. dgl, ferner anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, KaI-ziumcarbonat sowie Spurenmcngcn an Schwermeta!!- salzen, wie Kupfer-, Zink.-. Mangan-, Eist:.- oder ähnlichen Salzen. In der beiüi'teien Submerskultur wird IO

ι ileiiiturslelle 1 I H₁TaIUiM₁.

positiv
positiv
positi\
negativ

ein Antischaummittel, wie beispielsweise flüssiges Paraffin, Sojabohnenöl, ein Fett oder ein Silikon verwendet. Jede Gärungstemperatur innerhalb eines Bereiches von 20 bis JVC kann eingehalten werden, wobei jedoch der bevorzugteste Temperaturbereich /wischen 25 und 30⁰C liegt. Der pH-Wert des Züchtungsmediums schwankt zwischen 5,u und 8.Ö.

Sofern nichts anderes angegeben ist, werden das Züchten sowie die Untersuchungen wie folgt durchgeführt:

1.Schüttelkultur

100 ml des Nährmediums in einem Sakaguchi-Kolben oder 50 ml des Mediums in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben werden bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Sporen oder Myzeln von Streptomyces galilaeus ATCC 31133 oder eines Mutanten davon werden auf das sterilisierte Medium von einer Agarschrägkultur mittels einer Platinschlaufc aufgeimpft, worauf bei 28°C während eintr Zeitspanne von 4 Tagen auf einem sich hin- und herbewegenden oder sich drehenden Schüttler gezüchtet wird.

2. Tankkultur

100 1 des Mediums werden in einem 200-l-Gärungsgefäß hergestellt und bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit 2 1 einer Kulturbrühe beimpft, die zuvor durch Schütteln während einer Zeitspanne vor. 2 Tagen

.-.-I-.... 1— :„. r>;„ ns.-nr

ι T* L· rf/"ilrr1

unter Belüften mit 50 ml einer sterilen Luft pro Minute i, sowie unter Rühren mit 160 Upm während einer Zeitspanne von 2 Tagen, Silikonöl sowie flüssiges Paraffin werden als Entschäumer eingesetzt.

3. Untersuchung auf Aclacinomycin
"'" Dünnschichtchromatographie- Farbtestmethode

Die aus der Kulturbrühe, den Myzeln oder dem K-uiturfiiirai durch Azeion, Aihyiai.ei.ai oder durch eine Mischung aus Chloroform und Methanol extrahierten

-,-, Aclacinomycine A und B werden auf eine Kieselgelplatte in Form eines Fleckens mit einem Durchmesser von 5 mm aufgebracht. Nach einer Ί5 Minuten dauernden Sättigung in dem Entwicklungsgefäß wird die Dünnschichtchromatographieplatte in Azeton aufsteigend bis

..;, zu einer Höhe von 15 cm bei Zimmertemperatur entwickelt. Flecken, welche Aclacinomycin A und B entsprechen, werden durch die optische Dichte bei 430 nm unter Einsatz eines TLC-Scanner-Gerätes bei 430 nm bis 700 nm, 1.25 χ 1,25 nm-Schlitz, 10 nm/Minute-

r': Abtast- und Kartengeschwindigkeit, bestimm!. Die •itandardkurven von gereinigtem Aclacinomycin A und B werden zuvor erstellt und schwanken von 0.2 bis 15 mcg/Fleck.

Der Avlaeinomycin-erzeugende Stamm wird zuerst in 0,0008% MnCb · 4 H2O und

lern folgenden Medium durch Schütteln gezüchtet. 0,0002% ZnSO₄ ■ 5 H₂O.

Das Grundmedium besteht aus

Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt.

In der Kulturbrühe wird nach dem 4. Tag eine Anreicherung von 45 mcg/ml Aciacinomycin Λ rnd 15 mcg/ml Aclacinomycin B festgestellt.

Aclacinomycine A und B werden in Medien, die verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthali'i ten, unter Schütteln hergestellt. Nachfolgend werden verschiedene Reispiele angegeben:

I. Verschiedene KohlcnstolVqucllcn werden dem Grundmedium zugesetzt, das aus 1.5 ' „ Sojabohnenmehl sowie indcren Salzen, wie angegeben, besteht:

Zu dem angegebenen Zeitpunkt vorliegendes Aclacinomycin A

1%	Glukose,
1%	Kartoffelstärke,
1,5%	Sojabohnenmehl
0,1%	KH₂PO₄,
0,1%	MgSO₄ · 7 H₂O,
0,3%	NaCI,
0,0007%	CuSO₄ ■ 5HA
0,0001%	FeSO₄ · 7 H₂O,

	2 lage	meg/ml	.1 rage	mcc/nil	4 lage	incg/i
	η 11	η η	nl!	38	pi i	41
2% Glukose	7,3	15	~A	2S	8.0
2% Maltose	6,6	32	6.0	39	7.0	4(1
2% Rohrzucker	7,3	35	τ 7	2 S	8.2
2% lösliche Stärke	7,4	36	7.4	3 "\	7.9	42
2 % Kartoffelstärke	7.2	32	⁷.6	34	8.1	43
I % Glukose + 1 % Kartoffelstärke	6.3	26	7,7	28	8.3	30
1 % Glukose + 1% Maltose	7.4	26	<\⁷	30	~ -?	■^ ·)
I % Glukose + 1 % Rohrzucker	7.3	Τ,Ί	7.(i	3"	~.s
I % Glukose + 1 % lösliche Stärke	7.1	36	7.9	3d	8.4	41
1 % Glukose + I % Glyzerin	4.9	6.3	8.1

2. Verschiedene Stickstoffquellen werden dem Grundmedium zugesetzt, das aus 1 Glukose. 1 Kartofiel stärke sowie anderen Salzen besteht:

Zu dem angegebenen Zeitpunkt vorliegendes Aelacinonncm A

	1,5 "',-■	2 Tage	mcg/ml	ei starke	λ Tage	A"!	mcg/ml	B* ι	4 Tage	meg/ml
	2.5%	Pll	.14	B-)	Pll	36	4S	19	pH	4:"
i,3 7o bojaDonnenmeni	1 5 o,_	b.J	37	23	- Λ'	39	54	2 S	;ί.ΰ	48
1.5% Sojabohnenmehl	2.5%	5.8	9	39	7.1	4 S		^l	8.1	13
1,5% Malzextrakt	mcg/ml.	6.2	45	IQ	6.6	43	43	28	6.6	4(1
1.5 % Hefeextrakt	5,4	18	24	7 7		21		8.5
1.5% Kaseinhydrolysai	6.9	9		8.0		T₁ ->	8.3
1.5% Rindfleischextrakt	5.6	38	- ι	28	8.2	. .^
1.5% Polypepton	62	HIICIIMUII- UIIU UCi folgt angereichen:	S.2		8.6
	UCI ΓνΙ B wie	kohienstolTüueiie
		Gluko>
		Karte!":
		A')			B-■
		33	A-i
		31	-	34
			51	-
		17	-	ig
			58
j. vvciueii uie i\oiizeiiuaiioiien dann werden Aclacinomycin A und




Sojabohnenmehl

Sojabohr.er.rneh!

*) Aclacinomvein A oder B:

Die vorstehenden Ergebnisse stellen lediglich Beispiele dar. Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Stärke, Maltose und Rohrzucker, eignen sich für die Herstellung von Aclacinomycin. Stickstoffquellen, wie Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Rindfleischextrakt und Pepton, sind ebenfalls geeignet.

Wird die Gärung bei 28°C unter Schütteln unter Einsatz eines geeigneten Mediums mit einem pH-Wert von 6,9 aus beispielsweise

2%	Glukose	■ 7 H₂O,
2%		5H₂O,
2,5%	Kartoffelstärke,	7H₂O,
0,1%	Sojabohnenmehl,	■ 4 H_:O und
0,1%	KH₂POi	5H;,O
0,0007%	MgSO₄
0,0001%	CuSO₄ ·
0.0008%	FeSO₄ ·
0.0002%	MnSO₄
ZnSO₄ ■

durchgeführt, dann fällt der pH-Wert des Mediumr in 20 Stunden auf 5.25 bis 5.10, wobei das Myzelwachstum 10 Stunden nach der Beimpfung zunimmt.

Nach 3 Tagen steigt der pH-Wert von 7,0 auf 7,5. wobei die Menge an Aclacinomycin A und B in der Brühe ein Maximum erreicht, d. h. 46 mcg/ml A und 23 m g/ml B. LJm das Aclacinomycin zu isolieren, kann das Antibiotikum mit einem geeigneten Lösungsmitte! entweder aus der Kuliurbrühe »in toto« ohne Filtrieren der Myzelmasse oder aus der Myzelmasse sowie der zuvor durch Filtration abgetrennten Kulturflüssigkeit extrahiert werden. Die Hauptmenge der Antibiotika liegt in dem Filtrationskuchen vor, der aus den Myzeln besteht, die mit Diatomeenerde vermischt sind. Anschließend wird der Filtrationskuchen angeteigt und in einem organischen Lösungsmittel zur Extraktion der Antibiotika gerührt. Geeignete Lösungsmittel sind Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Butanol, Ketone, wie Azeton oder Methylethylketon, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder Methylenchlorid, Benzol oder wäßrige Lösungen von organischen oder anorganischen Säuren, wie Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure. Bevorzugt werden Azeton, Äthylacetat, Mischungen aus organischen Lösungsmitteln, wie Alkoholen und mit Wasser nicht mischbaren Ketonen, sowie wäßrige Lösungen von anorganischen oder organischen Säuren.

I'm die Antibiotika in dem Filtrat zu extrahieren, ist es vorteilhaft, dem schwach angesäuerten oder neutralisierten Filtrat ein doppeltes Volumen eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Butanol. Chloroform. Äthylacetat, Butylacetat oder Benzol, zuzusetzen. Von den Abtrennungsmethoden für Aclacinomycin sind die wirksamsten eine Gegenstromverteilung, eine Chromatographie unter Verwendung von Kieselsäure, Aluminiumoxyd, eines vernetzten Dextrangels oder synthetischen Adsorbcntien. cmc Adsorption an Aktivkohle oder eine Kombination aus einer Lösungsmittelextraktion und diesen Methoden.

Die Antibiotika können direkt aus der Kulturbrühe nach den vorstehend genannten Methoden ohne Abtrennung der Myzeln extrahiert werden.

Nach einer Konzentrierung im Vakuum werden die Extrakte auf einen pH-Wert /wischen 5 und 7 eingestellt und erneut mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise n-Butanoi. Amylalkohol. Äthylacetat, Chloroform. Benzol, Mcthylcnchlorid.

Methylpropylketon od. dgl, extrahiert. Aus der mil

Wasser nicht mischbaren organischen Lösung wird die

aktive Rohsubstanz in Form eines gelben Pulvers durcl

Konzentrieren im Vakuum auf ein kleines Volumen unc

-, Ausfällung mit niedrig-polaren Lösungsmitteln, bei spielsweise gesättigten Kohlenwasserstoffen, wie n-He

xan, Cyclohexan oder Petroläther, oder Äthern, wie

Diäthyläther oder Dipropyläther, erhalten. ·» Zur Entfernung von anderen pigmentierten Substan

in zen, wie Cinerubin A und B, aus der aktiver Rohsubstanz sowie zur Gewinnung von reinen Aclacinomycin A und B kann eine weitere Reinigung durch Säulenchromatographie unter Einsatz von ver schiedenen Adsorbentien, wie Kieselsäure, Aluminium

ι -, oxyd, eines vernetzten Dextrangels, Ionenaustauschern wie schwach sauren Harzen sowie Polystyrol-Divinyi benzol-vernetzten Matrixharzen, wie eines makroreti kularen vernetzten Polystyrolpolymeren, durch Chelie rung mit verschiedenen Metallen, wie Kupfer(II)-

j Eisen(Ii)-, Eisen}'!!)-, Kalzium- und Magncsiurnioncn sowie durch Kombinationen aus wenigstens zwei ode mehreren Verfahren, ausgewählt aus einer Chelierunj mit Metallionen, einer Lösungsmittelausfäliung, eine Lösungsmittelextraktion, einer Gegenstromverteilung

;, durchgeführt werden.

Werden beispielsweise rohes Aclacinomycin A und t in einer kleinen Menge Chloroform gelöst, auf eini Kieselsäuresäule aufgegeben und dann mit eine Mischung aus Chloroform und Methanol eluiert, dam

■ wird zuerst eine Aclacinomycin B-Fraktion mit eine Mischung aus Chloroform und Methanol (50 : 1) eluieri worauf das Aclacinomycin A mit der vorstehende! Mischung mit einem Mischungsverhältnis von 30 : 1 bi 20 : I eluiert werden kann. Die Eluate von Aclacinomy ·, ein A und B werden getrennt im Vakuum konzentrier und weiter vollständig von Cinerubin A und B und eine kleinen Menge an pigmentierten Substanzen al Verunreinigungen unter Anwendung einer Säulenchro matographie unter Einsatz eines synthetischen Absor

:.. bens abgetrennt, wobei ais Adsorbens beispielsweise

AI₂Oi ■ MgO ■ 2SiO₂ · 4H₂O

aktiviertes Magnesiumsilikat oder Hydroxylapatit ver wendet werden kann. Ferner kann man I χ 10 ³ bis 1 > IO ^! m CuSO₄, FeCIi, FeSO₄ oder MgSO₄ zur Herstel lung eines Chelatkomplexes von Cinerubin A und I

., zusetzen und anschließend eine Säulenchromatographl· mit einem vernetzten Destrangel durchführen. Dn erhaltenen Lösungen aus reinem Aclacinomycin A um B können im Vakuum zur Trockne konzentriert werdet sie können ferner allein oder nach Zugabe eine organischen oder anorganischen Säure gefriergetrock net werden.

Das durch die Kombination der vorstehend erwähn ten Methoden erhaltene Aclacinomycin A und FJ, wobe diese Methoden in den folgenden Beispielen beschrie

.., ben werden, ist rein und einheitlich und zeigt einci einzigen Flecken bei der Dünnschichtchromatographi unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittel stemen. Ferner wird ein konstanter Schmelzpunkt sowi eine konstante Rechtsdrehung festgestellt. Die Ergeh

. , nisse der Elementaranalysc, charakteristische Peaks ir IJV und im Sichtbaren sowie die NMR- un IR-Absorptionsspektren werden nachfolgend angege ben.

Aclacinomycin A

Schwach basisches und lipophiles gelbes Pulver oder mikrokristallines Pulver.
Gefunden Berechnet für C₄₂H₅₃NO₁₅

C = 62,37%
H = 6,67%
O = 29,38%
N = 1,82%

(Mol-Gew. 813)

C - 62,14% H = 6,58% O = 29,56% N = 1,73%

Die Absorptionsspektren im UV und im sichtbaren Bereich (Fig. 1) zeigen Banden bei den folgenden Wellenlängen:

In Methanol bei

229,5 nm, EiI= 540

258 nm.	Ei
290 nm,	ei:
434 nm,	ε ι:
In 0,1 η HCl/Methanol bei 229,5 nm.	ei:
258 nm,	ei:
290 nm,	ei:
434 nm,	ei:
ΙηΟ,Ι η NaOH/Methanol bei 239,5 nm,	ε i:
288 nm,	ei:
314 nm.	ei:
523 nm.	ei:
.= 301
.= 128
.= 147
.= 578
.= 329
.= 141
.= 164
„ = 678
.= 232
.= 156
.= 170

In Kaliumbromid werden charakteristische Absorptionsb jnden im IR-Spektrum (F i g. 2) bei folgenden Wellenzahlen (in cm-¹) festgestellt: 3300, 3080, 2940, 2860, 2760,1740, 1640, 1620, 1540, 1460, 1450, 1415, 1385, 1295, 1250. 1220, 1195, 1165, 1125, 1105, 1090, 1010,960, 930, 890, 840, 815, 760, 730, 580 und 450. Ein Protonen-NMR-Spektrum wird auf einem Varian XL-lOO-15-Spektrophotometer aufgezeichnet, der bei 100 MHz nach der Fourier-Umwandlungsmethode arbeitet (vgl. F i g. 3).

Das Antibiotikum Aclacinomycin A ist löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat, Azeton, Benzol, Dimethylsulfoxyd und Methylcellosolve, schwach löslich in Wasser und unlöslich in Äthyläther, Hexan, Cyclohexan und Petroläther. Die wäßrige Lösung ist gelb und schlägt in konzentrierter Schwefelsäure in rötlich-braun um. Mit alkoholischem Magnesiumacetat zeigt diese Lösung eine purpurrote Färbung und schlägt bei der Alkalinisierung in purpurrot um.

Aclacinomycin B

Schwach basisches, lipophiles und gelbes Pulver oder mikrokristallines Pulver. Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte:

Gefunden

C - 62.21 %

H -- 6.46%

O - 29.60%

N =■- 1,73%

Berechnet fur C₄₂H^NO, (Mol-Gew. 811)

C - 62,29%

Il - 6.35%

O = 29,63%

N = 1.73%

Die Absorptionsspektren im UV sowie im sichtbaren Bereich (I" ig. 4) zeigen Banden bei folgenden Wellenlängen:

In Methanol bei

229,5 nm, f.:\ = 452

257.5 nm, [■,-. - 261

290 nm, F-I". = 120

<tJ3nm. l·;·- = 120

In 0,1 η Hcl/Methanol bei

In 0,1 η NaOH/Methanol bei

229,5 nm,	EIl =	465	*'Φ.*
257,5 nm,	EIl =	261
290 nm,	EIl =	125
433 nm,	EIl =	134
238 nm,	E =	440
268-			a
289 nm,	EIl =	142	%
315 nm,	EIl =	97	*£■
525 nm,	ei:.=	135

Charakteristische Absorptionsbanden im IR-Spektrum (Fig.5) werden bei folgenden Weilenzahlen (in cm-', KBr) festgestellt: 3300, 3070, 2940, 2850, 2750, 1740,1640,1620,1540,1465,1445,1410,1380,1290,1245, 1215,1160,1120,1095,1050,1010, 960,920,880,840,820, 750,725,700,600,580 und 450.

Das NMR-Spektrum von Aclacinomycin B geht aus F i g. 6 hervor.

Das Antibiotikum ist in Methanol, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat, Azeton und angesäuertem Wasser löslich, schwach löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Hexan, Cyclohexan und in Äthern. Die wäPrige Lösung ist gelb und schlägt in konzentrierter Schwefelsäure in ein tief rötliches Purpur um. Diese Lösung ist in alkoholischem Magnesiumacetat purpurrot und geht bei der Alkalinisierung in ein rotes Purpur über.

Aclacinomycin A und B besitzen folgende Rf-Werte auf Kieselgeldünnschichtchromatogrammen beim Einsatz verschiedener Lösungsmittelsysteme:

	Rf-Wertc	von Aclacino-
	myein
	A	B
Chloroform zu Methanol
20: 1	0,36	0,71
5: 1	0,88	0,90
Aceton	0,43	0,72
Azeton zu Hexan 1 : 1	0.15	0,49
Benzol zu Methanol 1 : 1	0,86	0.93

Bei einer partiellen Hydrolyse oder Methü.iolyse mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder in Methanol, das 5% Chlorwasserstoffsäure enthält, während einer Zeitspanne von I bis 2 Stunden bei Zimmertemperatur ergeben Aclacinomycin A und B methylierte Disaccharide und I-Desoxypyrromycin. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie die IR-Absorptionsspektren, UV-Absorptionsspektren, Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich und NMR-Absorptionsspektren, der Schmelzpunkt sowie die Rechtdrehung des methylierten Disaccharids, das aus Aclacinomycin B erhalten wird, fallen vollständig mit den entsprechenden Eigenschaften des methylierten Disaccharids zusammen, das aus Cinenibin B durch partielle saure Hydrolyse (Helvetica Chimica Acta, 55, 467-480, 1972) erhalten wird. I-Desoxypyrromyciri wurde mit den Werten von Rhodomycin (Chem. Her. 83, 1762, 1955, Naturwiss. 48. 716, 1961), Cinerubin (Chem. Ber. 92. 1868, 1959) und Pyrromycin (Chem. Ber. 92, 190, 1959) auf der Grundlage des NMR Spektrums, des Massenspektrums

des Aglykons sowie des Vorliegens von Rhodosamin in dem sauren Hydrolysat identifiziert.

Aclacinomycin A und B ergeben ein neutrales Aglykon und zwei bzw. drei reduzierende Zucker bei der Hydrolyse mit einer 03 η Schwefelsäure während einer Zeitspanne von 3 Stunden bei 85° C.

Das Aglykon bildet orange-gelbe Kristalle, die bei 171 bis 174⁰C schmelzen, und enthält Sauerstoff, Kohlenstoff und Wasserstoff. Die Elementaranalyse, das Infrarotspektrum, das UV-Spektrum sowie das NMR- io Spektrum, Fragmentionenpeaks im Massenspektrum sowie andere Eigenschaften zeigen, daß das Aglykon von Aclacinomycin A und B aus Aklavinon (Tetrahedron Letters 8, 28, 1960, Naturwiss. 47, 135, 1960, Naturwiss. 42,154,1955, Naturwiss. 50,92,1963) besteht. 15 Eine vergleichende Analyse von Zuckern in den sauren Hydrolysaten von Aclacinomycin A und B sowie Cinerubin A und B durch Dünnschichtchromatographie zeigt, daß Aclacinomycin A das gleiche Rhodosamin, die gleiche 2-DesoxviJcose und die gleiche Cinerulose A 20 wie Cinerubin A* und das Adacinornycin B das gleiche AH;icinnmycin R Rhodosamin und die gleiche 2-Desoxyfucose wie das Cinerubin B hat.

Aus den vorstehenden Ergebnissen gehen die Strukturen von Aclacinomycin A und B gemäß vorliegender Erfindung wie folgt hervor:

Struktur von Adaeinoniveiii:

COOCH

CH₂CH,

OH

τ ϊ τ '

HO O OH

CH,

OH

N -CH.,
CH₁

CH,

Aclacinomycin A und B gehören im Hinblick auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften und Strukturen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, sowie auf Grund eines Vergleiche mit bekannten Antibiotika zu der Gruppe der Anthracyclinglykoside und ähneln Cinerubin A und B, Rutilantin, Aklavin, Requinomycin sowie den Galirubinen.

Cinerubin und Rutilantin unterscheiden sich von den erfindungsgemäßen Antibiotika bezüglich des Aglykons, und zwar ε-Pyrromycinon (Tetrahedron Letters, 16, 17, 1959). Von den Antibiotika mit einem Aklavinonaglykon sind Requinomycin (J. Antibiotics, 25, 393, 272) und Aklavin (J. Bacteriol. 72, 90, 1956) nicht identisch mit den erfindungsgemäßen Antibiotika im Hinblick auf den Zuckeranteil sowie die Molekülformel, die auf der Basis von Elementamalysen basiert. Galirubine, die durch Streptomyces galilaeus erzeugt werden, ähneln den erfindungsgemäßttn Antibiotika am meisten. K. E c k a r d t hat berichtet, daß vier Komponenten von Galirubin (Galirubin D, C₁ B und A) von den Myzeln von S. galilaeus isoliert worden sind, und daß Galirubin A das ε-Pyrromycinonglykosid, B das Aklavinonglykosid, Galirubinon C f-Pyrromycinon und Galirubinon D 7-Desoxyaklavinon ist. Im Zusammenhang mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften von Galirubin B, welches Aklavinon als Aglykon aufweist, gibt der Bericht nicht eine ins Detail gehende Reinigungsmethode an. Ferner fehlen Angaben über das chromatographische Verhalten, den Schmelzpunkt, die Elementaranalyse, die Absorptionsspektren im infraroten, im UV sowie im sichtbaren Bereich sowie über das N M R-Absorptionsspektrum. Es wird nur angegeben, daß zwei Zuckerflecken in dem sauren Hydrolysat von Galirubin B auf dem Papierchromatogramm entdeckt wurden.

Aclacinomycin A und B mit dem Aklavinonaglykon und drei Zuckern unterscheiden sich daher deutlich von Galirubin B bezüglich der vorstehend angegebenen Eigenschaften. Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind neue Substanzen.

Therapeutisch wertvolle nicht-toxische Salze der Antibiotika Aclacinomycin A und B können aus organischen und anorganischen Säuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Propionsäure, ölsäure, Palmitinsäurc, Zitro-

nensäure, Bernsteinsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure hergestellt werden.

Die biologischen Aktivitäten von Aclacinomycin A und B sind wie folgt:

1) Das antimikrobielle Spektrum von Aclacinomycin A und B wird nach der Kulturbrüheverdünnungsmethode wie folgt bestimmt:

Antimikrobielies Spektrum von Aclacinomycin A und B

Testorganismus

Minimale	inhibierende	b
Konzentration, mcg/ml	0,63
A	>100
0,63	>100
>100	>100
>100	10
>100	20
10
20

Testorganismus

Minimale inhibierende Konzentration, mcg/ml

A B

Bacillus subtilis ATCC 6633 <0,2 <0,2

B. cereus ATCC 9634 <0,2 <0,2

B. megaterium <0,63 <0,2

Staph. aureus FDA209P <0,63 <0,2

e*~-,u c-_;*u ^-c\ η ^ c\ τ

juipii. auicua oiihlii -ν,υ,ζ. -^w,^.

Sar.lutea ATCC 9341 <0,2 <C,2

Mic. flavus <0,2 <0.?

Cory, bovis 1810 <0,2 <0,2

Mycobact. smegmatis 2,5 5 ATCC 607

Strept. faecalis 2,5 2,5

St. pyogenes NY 5 1,25 1,25

Diplo. pneumoniae Typ 1 0,63 0,63

Diplo. pneumoniae Typ 3
E. coli K 12

Kl. pneumoniae ATCC 10031
Ps. aeruginosa A 20229
Can. albicans IAM 4905
Can. tropicalis IAM 4924

2) Antitumorwirkungen: Die Antibiotika Aclacinomycin A und B zeigen eine ausgeprägte inhibierende Wirkung auf experimentelle Tiertumore (aszitische und feste Tumore). Diese Antitumorwirkung läßt sich am signifikantesten im Falle von Leukämien von Mäusen und Hepatomen von Ratten zeigen. Werden beispielsweise BDFi-Mäuse, die 18 bis 22 g wiegen, mit 1x10* Zellen von P 388-ZeIlen intraperiton,·.,}, beimpft, und ■werden AclaCinGffiycin A oder B uiträpc/ii'mciii eiiiin<>> täglich während einer Zeitspanne von 10 Tagen aufeinanderfolgend alle 24 Stunden nach der Beimpfung verabreicht, dann wird die Überlebenszeit der Mäuse merklich hei einer Dosierung von 0,5 bis 5 mg/kg Körpergewicht pro Tag in einem Ausmaß von mehr als 150% verlängert, und zwar im Vergleich zu Mäusen, die keine Antibiotika erhalten haben, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

Antibiotikum

Aclacinomycin A

Aclacinomycin B

Isontrollgruppe

CDFi-Mäuse werden intraperitoneal mit einer Suspension von P 388 Leukämiezellen beimpft und mit Lösungen verschiedener Konzentrationen von Aclacinomycin A und B, Daunomycin und Doxorubicin 1 bis

Dosis mg/kg/Tag	Mittlere Überlebenszeit Tage	T/C	Tiere, die 30 Tage überleben
4,0	21,5	215	1/4
2,0	30,0	300	4/4
1,0	28,0	280	3/4
0.5	23,0	230	2/4
4,0	8,5	85	0/4
2,0	17,5	175	0/4
1,0	19,0	190	1/4
0,5	14,7	147	0/4
-	10,0	-	0/8

Tage anschließend an die Tumorimplantation behandelt. Die Verlängerungen der Lebensdauer der einen Tumor aufweisenden Mäuse geht aus der folgenden Tabelle hervor.

Antibiotikum	Dosis mg/kg/Tag	Mialei j Überlebenszeit Tage	T/C %	Tiere, die 30 Tage überleben
Aclacinomycin A	7,5	8,5	50	0/3
	5,0	19,5	208	0/3
	3,3	16,0	170	0/3
	2,2	14,5	154	0/3
Aclacinomycin B	5,0	7,5	80	0/3
	2.5	10,9	132	0/3
	1,25	16,7	178	0/3
	0.6	13.4	143	0/3

22

Antibiotikum

Daunomycin

Dovorubiciii

Kontrollgruppe

4.0 .1.(1 1.0 0.5 4.(1 2.(1 1.0 0.5

Werden BDFi-Mäuse intraperitoneal mit einer Suspension von L 1210-Leukämiezellen (1 χ ΙΟ¹⁵ Zellen/Maus) beimpft und mit Lösungen verschiedener Konzentrationen von Aclacinomycin A und B 1,5 und Tage anschließend an die Tumorimplantation behandelt, dann werden die in der folgenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse erzielt, die zeigen, daß Aclacinomycin A, verabreicht in Dosen von 6 und 3 mg/kg/Tag, beträchtlich die mittlere Überlebenszeit der behandelten Mäuse erhöht.

Antibiotikum

mp/ku/
Tau

Mittlere 1 lere, die

Über- .111 Tage

lehenszeil überleben

lage

Aclacinomycin A 12
6

1.5

Arhirin'imvrin R f\

0.75

Kontroligruppe

16.1 21,7 23,2 12.6 ης

15,9

17,1 14,8 10,4

0/5 2/5 2/5 0/5 n/s

0/5 2/5 1/5 0/10 Mittlere

1 berlebens/eit

laue
9.5

.Antibiotikum

Werden BDFi-Mäuse mit L1210 Leukämiezellen (1 χ 10⁵ Zellen) intraperitoneal beimpft und werden Aclacinomycin A, Doxorubicin oder Daunomycin intraperitoneal einmal täglich während einer Zeitspanne von zehn Tagen aufeinanderfolgend jeweils drei Stunden nach der Beimpfung verabreicht, dann bedingen diese Wirkstoffe eine Inhibierung des Wachstums der Ll2!0 Leukämie, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

101
164
196

172
X 5
22X
218
207
100

hen:, die M) 'laue überleben

0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/14

I)(IMS

Mittlere

I Iberlehens-

/eil

mg/kg/Tag Tage

Vergleich

Adacinomycm Λ 8
4

0,5 Daunormcin 4

0.5 Doxoruhicin 4

I
0.5

9./ S.7 20,8 22,8 17.5 12,1 8.7 15.1 26.2 26,5 1⁽λ7 26.2 27,2 19.4

T/C

100 90 215 235 180 125 90 155 270 273 203 270 280 200

Werden CH3/HE-Mäuse, die 20 bis 23 g wiegen, mit

a IU -i_.jr ιιιμίΐυιιια uv'Ji n-iy/v/vj-z^ciicti mn apci iiuiicüi oder mit 5 χ 10*-Lymphoma 6C3HED/OG-Zellen subkutan beimpft, und wird Aclacinomycin A intraperitoneal einmal täglich während einer Zeitspanne von zehn Tagen aufeinanderfolgend drei Stunden nach der Beimpfung verabreicht, dann zeigt das Aclacinomycin A eine merkliche Hemmung des Wachstums des aszitischen oder festen öCSHED/OG-Turnors, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht. In diesem System ze>~t auch Aclacinomycin B eine ausgeprägte Inhibierung des Wachstums von festem öCSHED/OG-Tumor, und zwar eine 52.3°/oige Inhibierung bei 1 mg/kg/Tag, eine 68.1 %ige Inhibierung bei 03 mg/kg/Tag und eine 37.5°/oige Inhibierung bei 0.25 mg/kgATag.

	Aciacinorm 4	ein A. Dosis:	mg/kg/iag	0.5	Koniroii- gruppe	7/9
Fester Typ:
Tumorgewicht, mg	5023	4633	2501	3695	7045
Tumorgewicht '„, Körpergewicht	19.5	15.1	9.5	12,4	29,6
Inhibierung. %	28.7	34.2	64.5	47,6	-
Tiere, die 21 Tage überleben	0/3	3/3	3/3	3/3

As/ilischer l>p

MSI. I,ige*)

I icrc. die 62 I M'x ii hei Ie heu

0/3

,. I )lM\	ηιμ/Κμ/1.υ	37,5	".5	15.0	kontroll-
		1X3	7}	gruppc
	I	1/3	0/3
3 I.X		20.5
155
0/3	0/3

' ) MiIIk¹I¹L' I Ih'Hl'I'l'iis/l'iI
"I I KtlcKnsieilulliiis (iclcstcte I icic/Vcrulcichsticrc.

Doiiryu-Ratten. die mit as/itischcm llcpatoma Λ1144 beimpft worden sind, werden intraperitoneal während zehn aufeinanderfolgenden Tagen mit 2 mg/kg/Tag Aclacinomycin A behandelt. Während die Vergleichsratten eine durthschnittliche Überlebens/eit von 14,5 lagen nach der Tumorimplantation /eigen, leben alle behandelten Ratten dreißig Tage nach dem Versuch.

3) Akute Toxizität

Die 1.1)·-,!,-Werte nach einer einzigen Injektion von Aclacinomycin A oder B sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

	Wce	cal	LDm₁, mg/kg	H
			Λ	16.4
M	intra\ cnös	cal	33.7	13.7
M	intraperiton	22.6	15,0
R;	intra\ cnös	32.5	10-15
R;	intraperiton	25-50
•j rart

aus
aus
itte
itte

4) Cardiotoxizität in Hamstern

Akute Herzveränderungen in den Elektrokardiogrammen von Hamstern werden wie folgt untersucht: Männliche Goldhamster mit einem Gewicht von 90 bis MOg werden mit 30 bis 45 mg/kg Pentobarbitalnatrium intraperitoneal anästhesiert. Mit in die entsprechenden Gliedmaßen eingeführten Nadelelektroden werden .Standardelektrokardiogramme aufgenommen. Die Wirkstoffe werden intravenös in die Oberschenkelvene in Dosisvolumina von 0,2 ml verabreicht. Vor der Verabreichung des Wirkstoffs läßt man jedes Tier während einer Zeilspanne von 30 Minuten in den Gleichgewichtszustand kommen. Dann werden die Tiere auf Anzeigen einer Cardiotoxizität während einer Zeitspanne von wenigstens 60 Minuten anschließend an die Wirkstoffverabreichung beobachtet. Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht zeigen die elektrokardiographischen Veränderungen ein gutes Ansprechen auf Aclacinomycin A und B sowie Doxorubicin. Aclacinomycin A und B verursachen eine leichte Veränderung des ECG bei 25 bis 50 mg/kg, während in Doxorubicin in einer Dosis von 2 bis 6 mg/kg eine ernsthafte Arrhvthmip hpci'inat Darain jphl hprvnr HaR Dnvnnihicin ECG-Veränderungen in einer Dosis verursacht, die weniger als '/io der Dosis von Aclacinomycin A und B beträgt.

Wirkung \cn Adadnomycin Λ und ti sowie Doxorubiun aut das hlektrokardiogramm von männlichen Goldhamsiern

Antibiotikum

Adacmorn\dn Λ
Adadnomycin B
Doxorubicin - HCl

Dosis, mg/kg

1.5f' 3.13 6.25 12.:"

Abnormal/getestet (durchschnittliche (.'herlehenslagcl

1/8 2/4 4/4

014) 010.3) (3.5)

	l/S	1/5
	Ο14)	Ο8.3)
0/8	0/4	1/3
ΟΙΟ)	(3)	(1)
4/4	2/2
(0)	(0)

2/3
(5)

10(1

O¹ einseeaneen innerhalb 24 Stunden nach der iniektion.

Die Antibiotika hemmen vollständig das Wachstum von gezüchteten Säugetier-Tumorzellen, Vaccinia-Viren in HeLa-Zellen und in spezifischer Weise die RNA-Synthese bei einer extrem geringen Konzentration. Werden L,1210-Zellen auf ein Medium aufgeimpft (Rosewell Memorial Park Institute 1640), das 10% Kalbsscrum cntHlt, und setzt man verschiedene Konzentrationen ai, Aclacinomycin A und B sowie als Vorläufer ^HC-Thymidin, -Leucin oder Uridin zu und inkubiert bei 37°C während einer Zeitspanne von 60 Minuten bei der Durchführung des ¹⁴C-lnkorporierungsversuchs sowie während einer Zeitspanne von 3 Tagen bei der Durchführung des Wachstumsversuchs, dann stellt man fest, daß die Nukleinsäurebiosynthese sowie das Zellenwachstum über 50% unterhalb I mcg/ml Aclacinomycin in dem Medium inhibiert werden, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

	IDsii. mcg/ml	Aclacino-
	Aclacino	niycin Ii
	mycin A
L 1210-Zellen:		0,24
Wachstum	0,12	4
DNA-Synthese	1,1	0,2
RNA-Synthese	0,1	12
Proteinsynthesc	6,3	< 10
Vaccinia-Virus:	< 10

Die vorstehend beschriebenen Eigenschaften von Aclacinomycin A und Aclacinomycin B zeigen, daß diese Substanzen neue Antibiotika sind, die sich von bekannten Antibiotika unterscheiden und infolge ihrer extrem geringen Cardiotoxizitäten therapeutisch wertvolle Substanzen sind, wobei die geringen Cardiotoxizitäten die Tatsache aufwiegen, daß ihre Antitumoraktivitäten etwas geringer sind als die Ap.titumoraktivität von Doxorubicin, dem für diesen Zweck bekanntesten

Beispiel 1

A) Herstellung von Aclacinomycin A und B
als Rohprodukt

Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzung wir π hergestellt:
hergestellt:

Kartoffelstärke	1
Glukose	1
Sojabohnenmeh!	1,5
KH₂PO₄	0,1
K₂HPO,	0.1
MgSO₄ · 7H₂O	0,1
NaCl	0,3
Mineralien*)	0.125
Silikon (KM 75)	0,05
pH	7.0
*) Mineralien:
CuSO ■ 5FhO (2,8 g).
FeSO₄ ■ 7 H.O (0.4 g).
MnCb · 4 H-O (3.2 g).
ZnSOi ■ 7 H2O (0.8 e)
in 500 ml Wasser.

100ml dieses M.-diums werden bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500ml-Sakaguchi-Schüttelkolben sterilisiert, der von einer Agar-Schrägkultur von Streptomyees galilaeus MA 144-M1 mittels einer Platinschleife beimpft worden ist.

Die Inkubation verläuft während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei 28°C auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler. 10 1 des zuvor sterilisierten Mediums in einem Gärungsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 201 aus rostfreiem Stahl werden aseptisch mit 200 ml der vorstehenden Impfkultur beimpft. Die Gärung erfolgt bei 28°C während einer Zeitspanne von 32 Stunden unter Rühren (240 Upm) und Belüftung (5 l/Minute). Die erhaltene Kullurbrühe wird auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht, mit adsorbierend wirkender Kieselerde vermischt und von den Myzeln abfiltriert. Das Filtrat sowie der erhaltene Kuchen werden getrennt extrahiert.

Der Kuchen wird in Azeton (3 I pro kg des feuchten Kuchens) suspendiert, während einer Zeitspanne von 2 Stunden gerührt und filtriert. Der Kuchen wird nochmal mit Azeton extrahiert. Die auf diese Weise erhaltenen Extrakte werden auf V10 ihres Volumens im Vakuum eingedampft. Das Kulturfiltrat wird auf einen pH-Wert von 6,8 gebracht und zweimal mit '/] Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat-Extrakte werden auf '/10 ihres Volumens im Vakuum konzentriert.

20 g der erhaltenen öligen Substanzen werden mit 20 g Kieselsäure vermischt, auf eine Säule mit einer Länge von 40 cm und einem Durchmesser von 4,5 cm, gefüllt mit Kieselsäure, aufgebracht und mit einer Benzol/Azeton/Methanol-Mischung eluiert. Das erste Eluat, welches mit einer 1 : 1 :0-Mischung eluiert wird, wird verworfen. Die aktiven Fraktionen werden mit 1 :3 :0- und 1:3: 0,3-Mischungen eluiert und gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. 11,5 g dieser rohen Substanz werden dann in einer kleinen Menge Äthylacetat gelöst und auf die gleiche Kieselsäuresäule wie sie vorstehend beschrieben worden ist, aufgebracht. Nach einem Verwerfen der anfänglichen Eluate, die durch die 1 : I- und 2 : 1-Benzol/Aztton-Mig erhallen wuiucii Miiü, wciücii Aciaunuiiiyuiii

B-Fraktionen zuerst mit den vorstehenden Mischungen in einem Verhältnis von 1 :3 und 1 :5 und Aclacinomycin Α-Fraktionen mit 1 :5 :0,5- und 1 :5:I-Benzol/ Azeton/Methanol-Mischungen eluiert. Die Eluate werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne konzentriert. 4,8 g eines rohen Aclacinomycin A und 3,5 g Aclacinomycin B werden in Form eines gelben Pulvers erhalten.

Q) Reindarstellung von Aclacinomycin D

2,0 g des gemäß Stufe A) erhaltenen rohen Aclacinomycins B werden mit 3 g Kieselsäure vermischt und pinpr S^ul^nc^romato^ra^hie m einer Säule mit einer Länge von 15 cm und einem Durchmesser von 2 cm, gefüllt mit 25 g Kieselsäure, unterzogen. Die Aclacinomycin B-Fraktion wird mit Chloroform eluiert, das 1% Methanol enthält, und auf ein kleines Volumen im Vakuum konzentriert. Aus der konzentrierten Lösung werden durch Zugabe von etwa n-Hexan 40 mg Aclacinomycin B in Form eines gelben Pulvers erhalten.

C) Reindarstellung von Aclacinomycin A

2,0 g rohes Ac'acinornycin A, erhalten gemäß Stufe A). werden in einer kleinen Menge Chloroform aufgelöst und auf eine Säule mit einer Länge von 70 cm und einem Durchmesser von 2,0 cm, gefüllt mit 30 g

Kieselsäure, aufgebracht. Nach einem Wegeluieren der Aglykon-enthr.ltenden Pigmente, von Aclacinomycin B ■ wie anderer Verunreinigungen mit Chloroform und 1,5% Methanol-enthaltendem Chloroform werden Aclacinomycin Α-Fraktionen mit 2% Methanol-enthaltendem Chloroform eluiert, worauf im Vakuum zur Trockne eingedampft wird. 53 mg eines gelben Pulvers aus Aclacinomycin A werden erhalten.

D) Gewinnung von reinem Aclacinomycin A aus
rohem Aclacinomycin A und B-Gemisch

Rohes Aclacinomycin A oder B, erhalten gemäß Stufe A, wird in Chloroform aufgelöst und mit CUSO4 sowie Äthylendiamintei.-aessigsäure behandelt. Dann wird die Chloroformphase abgetrennt und mit Wasser zweimal unter Schütteln gewaschen. Der Chloroformextrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Zugabe von etwas η-Hexan hat eine Ausfällung von reinem Aclacinomycin A zur Folge.

Beispiel 2

Ein wäßriges Medium mit folgender Zusammensetzungwird hergestellt:

Kartoffelstärke	2
Glukose	2
Sojabohnenmehl	2,5
KH₂PO₄	0,1
K₂H PO₄	0,1
MgSO₄ · 7 H₂O	0,1
NaCI	0,3
MnCI₂ · 4 H₂O	0,0005
FeSO₄ ■ 7 H₂O	0,0005
Silikon	0,05
pH	7,2

50 ml dieses Mediums werden bei 120⁰C während einer Zeitspanne von 15 Minuten in einem 500-ml-Erienmeyerkoiben sterilisiert, der mit 1 ml einer gefrorenen Kulturbrühe von Streptomyces galilaeus MA 144-M1 beimpft wird. Die Inkubation wird während einer Zeitspanne von 48 Stunden bei 30°C in einem Rotationsschiittier durchgeführt. 10 I des gleichen Mediums in einem Gärungsgefäß aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsvermögen von 20 I werden aseptisch mit 200 >nl der vorstehenden Kulturen beimpft. Nach einer fnkubalion bei 30°C während einer Zeitspanne von 18 Stunden unter Rühren (300 Upm) und Belüftung (5 l/Minute) werden 10 1 der Kulturbrühe zu 600 1 des in der vorstehend beschriebenen Weise sterilisierten Mediums in einem 1000-1-Tank aus rostfreiem Stahl gegeben, worauf bei 30⁰C während einer Zeitspanne von 48 Stunden unter Belüftung (20 l/Minute) und Rühren (180 Upm) inkubiert wird. Die in einer Menge von 570 I erhaltene Kulturbrühe wird auf einen pH-Wert von 5,0 durch Zugabe von 250 rni einer 30%igen H₂SO₄ gebracht, die mit adsorbierend wirkender Kieselerde vermischt ist. Die 53,5 kg des auf diese Weise erhaltenen Kuchens werden in 70 1 Azeton suspendiert, während einer Zeitspanne von 3 Stunden gerührt und filtriert. Der Kuchen wird nochmals mit 85 1 Azeton extrahiert. Die Extrakte werden im Vakuum auf 40 I eingedampft und 25 1 Äthylacetat zugesetzt. Die Äthylacetatphase wird abgetrennt und auf 1 1 im Vakuum konzentriert. Das rohe Aclacinomycin-Gemisch, das durch Zugabe von 1 I η-Hexan zu dem vorstehend geschilderten Konzentrat ausfällt, wird gesammelt und mit einer Mischung aus η-Hexan und Äthylacetat (50:1) zweimal gewaschen. Man erhält 15.5 g eines orange-gelben Pulvers.

Dieses rohe Pulver wird in 200 ml Äthylacetat aufgelöst und auf eine Säule mit einer Länge von 35 cm und einem Durchmesser von 7 cm, die mit 700 g Magnesiumaluminosilikat gefüllt ist, aufgebracht. Es wird mit einer Mischung aus Äthylacetat und Methanol (1:1) eluiert. Gelbe Fraktionen, welche Aclacinomycin A enthalten, werden im Vakuum zur Trockne eingedampft. 12,<*g eines rohen Aclacinomycin A werden in 100 ml Chloroform aufgelöst und zu 50 ml einer 10-³ m Äthylendiamintetraessigsäure in einem 0,01 m Phosphatpuffer (pH 6,8) gegeben. Nach einem kräftigen Schütteln zur Entfernung von restlichen Metallionen wird die Chloroformphase zweimal unter Schütteln mit Wasser gewaschen, unter wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhall 11.1g Aclacinomycin A in Form eines gelben Pulvers.

llicr/u 4 Hhii; /cichniniiien

Claims

Patentansprüche: 1. Aclacinomycin A und B der Formel

ίο

O—'

CH, \