DE2729125A1

DE2729125A1 - Enzymatisches reagens und dessen verwendung in einem verfahren zur erhoehung der empfindlichkeit von enzymatischen substratanlaysen unter verwendung von sauerstoffbestimmungsanalysatoren

Info

Publication number: DE2729125A1
Application number: DE19772729125
Authority: DE
Inventors: Carole A Polito
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-07-01
Filing date: 1977-06-28
Publication date: 1978-02-02
Also published as: BE856291A; CH621871A5; DE2729125C2; US4116773A; JPS5642920B2; FR2356938A1; CA1081588A; FR2356938B1; JPS5333688A

Description

Patentanwälte Dipl.-lng. Curt Wallach Dipl.-lng. Günther Koch Dipl.-Phys. Dr Tino Haibach Dipl.-lng. Rainer Feldkamp

D-8000 München 2 · Kaufingerstraße 8 · Telefon (0 89) 24 02 75 · Telex 5 29 513 wakai d Unser Zeichen: 15 931

Bezeichnung:

Enzymatisches fieagens und dessen Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit von enzymatischen Substratanalysen unter Verwendung von Sauerstoffbestimmungsanalysatoren

Anmelder:

Beckman Instruments, Inc.

2500 Harbor Boulevard, Pullerton, Californien 92634, V.St.A.

Vertreter gem. § 16
PatG:

Wallach, C, Dipl.-lng.; Koch, G., Dipl.-lng.; Haibach, T., Dipl.-Phys.Dr.rer.nat.; Feldkamp R., Dipl.-lng.'; Pat .-Anwälte, 8000 München

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BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein neuos enzymatisches Reagens und dessen Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der Empfindlichkeit von enzymatischen Substratanalysen unter Verwendung von Sauerstoffbestimmungsanalysatoren.

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren und eine besonders vorteilhafte Vorrichtung zur Messung der Konzentration von enzymatischen Substraten in Probelösungen ist in den US-Patentschriften 3 857 771 und 3 933 593 beschrieben. In diesen Patentschriften sind insbesondere Analysatoren und Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Substrat-Anfangskonzentrationen durch Messung der Geschwindigkeit, mit der Sauerstoff in einer chemischen Reaktion, die das enzymatische Substrat umfaßt, verbraucht wird, beschrieben.

Obgleich die in den vorgenannten US-Patentschriften beschriebenen und andere ähnliche Sauerstoffbestimmungsanalysatoren Vorrichtungen zur schnellen Bestimmung der Anfangskonzentrationen des eiizymatischen Substrats darstellen, sind die von solchen Analysatoren erzeugten Signale, die diesen Konzentrationen entsprechen, manchmal sehr schwach. Unter diesen Umständen ist man seit langem bestrebt, die Empfindlichkeit des Sauerstoffbestimmungsanalysators, die auch als Signal/-Rausch-Verhältnis bezeichnet wird, beträchtlich zu erhöhen.

Es wurde nun gefunden, dn.ß dann, wenn ein Salz oder eine Salzkombination Enzymreagentien zugesetzt wird, die mit dem Sauerstoff in Proben reagieren, welche die zu bestimmenden

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Enzymsubstrate enthalten, die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reagens herabgesetzt wird. Es wurde insbesondere gefunden, daß die Zugabe solcher Salze in Mengen, die ausreichen, um die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reagens im Vergleich zu der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30 % herabzusetzen, zu einer beachtlichen und unerwarteten Verbesserung in bezug auf das Signal/Rausch-Verhältnis (die Empfindlichkeit) der in Sauerstoffbestimmungsanalysatoren erzeugten Signale führt, welche die Anfangskonzentrationen des Enzymsubstrats anzeigen. Dies beruht auf der Beobachtung, daß bei Abnahme der Löslichkeit des Sauerstoffs in einem enzymatischen Reagens weniger Sauerstoff zur Verfügung steht für die Umsetzung mit dem enzymatischen Reagens. Bei Sauerstoffbestimmungsanalysatoron, in denen polarographische Sensoren verwendet und die Anfangskonzentrationen des enzymatischen Substrats auf der Basis der Geschwindigkeit der Änderung des Sauerstoffverbrauche errechnet werden, bedeutet dies, daß die gleiche Geschwindigkeit der Änderung der Sauerstoffkonzentration gemessen wird als größere Geschwindigkeit der Änderung des SauerstoffVerbrauchs als vorher. Wenn polarographische Sauerstoffsensoren verwendet werden, wird der Partialdruck anstelle der Konzentration des gelösten Sauerstoffs gemessen. In einem gegebenen Medium ist der Partialdruck proportional zu der Konzentration« Wenn die Sauerstofflöslichkeit herabgesetzt wird, wird die Proportionalitätskonstante größer und die gleiche Abnahme der Sauerstoffkonzentration führt zu einer größeren Partialdruckänderung und damit zu einer größeren Abnahme des Sensor-Outputs. Dadurch erhält man ein proportional größeres Signal und es wird eine beträchtliche Verbesserung in bezug auf das Signal/Rausch-Verhältnis erzielt, das mit dem Analysator vei^bunden ist, ohne daß eine Änderung seiner elektronischen Ausrüstung erfolgt.

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So wurde beispielsweise gefunden, daß dann, wenn ein Phosphatsalz einer etwa 1,0 molaren Lösung einem enzymatischen Reagens zugesetzt wird, das in dem in den oben genannten US-Pai entschriften beschriebenen Sauerstoffbestimmungsanalysator zur Messung der Cholesterinkonzentration verwendet wird, die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reagens um mehr als 30 % verringert wird und das dabei erhaltene Signal, welches die Cholesterin-Anfangskonzentration anzeigt, auf das 10-fache verstärkt wird, verglichen mit dem Signal-Output in Abwesenheit des Phosphatsalzes.

Die Erfindung wird nachfolgend an Hand bevorzugter Ausführungsformen in spezifischen Reagenssystemen für spezifische Substrat-Assays (biodiemisdaen Nachweisverfahren) näher beschrieben, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Es sei darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung auch jedes beliebige enzymatische Reagenssystem umfaßt, das in Verbindung mit einem Sauerstoffbestimmungsanalysator zur Messung von Substratkonzentrationen verwendet werden kann.

Cholesterin-Assay

In Verbindung mit einem Reagens für den biochemischen Nachweis von Cholesterin wurden die Salze, die sich in bezug auf die Herabsetzung der Sauerstofflöslichkeit als zufriedenstellend erwiesen haben, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus einer Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Natriummonohydrogenphosphat in beliebigem Verhältnis, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Kaliumchlorid.

Bei der Bestimmung der optimalen Herabsetzung der Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reagens von mindestens 30 % im Vergleich zu der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser wurde gefunden, daß die Konzentrationen der Salze, die eine solche

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ST

Herabsetzlang der Löslichkeit ergeben, in Abhängigkeit von den jeweiligen Zusammensetzungen der Bezugsreagentien variieren. Unter Berücksichtigung der optimalen Löslichkeitsverringerung von mindestens 3O % für Sauerstoff können diese Konzentrationen von dem Pachmanne auf diesem Gebiet unter Berücksichtigung der hier gegebenen Informationen leicht bestimmt werden.

Zur Erläuterung der Erfindung sind jedoch in der nachfolgenden Tabelle I spezifische Salzkonzentrationen und die daraus resultierende Wirkung auf die Sauerstofflöslichkeit in einer Bezugs-Rea^ensZusammensetzung und die entsprechende Signalverstärkung in einem Sauerstoffbestimmungsanalysator des in den oben genannten US-Patentschriften beschriebenen Typs angegeben. Bei der für den Cholesterin-Assay verwendeten Bezugs-Eeagenszusammensetzung handelte es sich um eine wäßrige Lösung aus einer 0,01 M Kaliumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 6,0, 0,5 mg pro ml Natriumcholat, 0,02 g Triton X-100 (einem Warenzeichen für das oberflächenaktive Mittel Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, das etwa 10 Moleküle Äthylenoxid pro Molekül des Polymerisats auf 10p ml Lösung enthält), einer 0,001 M Natriumazidlösung, einer internationalen Einheit Cholesterinoxydase (Brevibacterium sp.), £.C.1.1.5«6 und 0,02 internationalen Einheiten Cholesterinesterase E.C.3.I.I.I3.

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	Tabelle I	Prozentsatz der Abnahme des Sauer stoffgehalt s	Zunahme der Stärke des Signals**
Salz	Molarität der Reagenslösung	60 40 35 35 35	10-fach 4-fach 10-fach 7-fach 4-fach
KHpPOi, und Na₂HPO₄ KH₂PO₄ und Na₂HPO₄ (NH₄)₂S0₄ Na₂SO₄ KCl	1,0* 0,50* 0,75 0,50 1,50

* Die Molarität der Heagenslösung umfaßt die Molarität, die auf das Kaliumphosphat in der Bezugs-Reagenszusammensetzung zurückzuführen ist.

** Die Zunahme wird verglichen mit dem Signal, das bei Verwendung identischer Reagentien, jedoch in Abwesenheit jedes der in der obigen Tabelle angegebenen Salze erzeugt wird.

Glucose-Assay

Im Rahmen eines Reagens für einen Glucose-Assay wurden die Salze, die sich für die Herabsetzung der Sauerstofflöslichkeit als zufriedenstellend erwiesen haben, aus einer Gruppe ausgewählt, die bestand aus einer Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Natriummonohydrogenphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Wie bei dem Cholesterin-Assay wurde gefunden, daß die Konzentrationen der Salze, welche die optimale Herabsetzung der Sauerstofflöslichkeit um mindestens 30 % ergaben, in Abhängigkeit von den Zusammensetzungen der Bezugs-Reagentien variierten. Auch hier können diese Konzentrationen unter Berücksichtigung der Angaben in der vorliegenden Anmeldung vom Fachmanne leicht ermittelt werden.

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-X-

Zur Erläuterung der Erfindung werden in der nachfolgenden Tabelle II spezifische Salzkonzentrationen und die daraus resultierende Wirkung auf die Sauerstofflöslichkeit in einer Bezugs-Reagenszusammensetzung sowie die entsprechende Zunahme der Stärke des Signals in dem Sauerstoffbestimmungsanalysator angegeben. Bei der für den Glucose-Assay verwendeten Bezugs-Reagenszusammensetzung handelte es sich um eine wäßrige Lösung aus einer 0,2 M Natriumphosphatlösung mit einem pH-V7ert von 6,0, einer 0,01 M Kaliumjodidlösung, einer 0,007$ M Ammoniummolybdatlösung, einer 0,0005 M Jodlösung, 5 Gew.-% Äthanol und 150 internationalen Einheiten pro ml ^Glucoseoxydase.

Salz

Tabelle II

Molarität in Prozentsatz der Reagens- der Abnahme lösung des Sauerstoffgehaltes

und

Na₂HPO₄

Na₃SO₄

1,5*

1,5 1,25

65

50
60

Zunahme der Stärke des Signals**

25

35

* Die Molarität der Reagenslösung umfaßt die Molarität, die von dem Kaliumsulfat in der Bezugs-Reagenszusammensetzung herrührt.

** Die Zunahme wird verglichen mit dem Signal, das erzeugt wird bei Verwendung identischer Reagentien, jedoch in Abwesenheit jedes der in der vorstehenden Tabelle ange gebenen Salze.

Harnsäure-Assay

Im Rahmen eines Reagens für den biochemischein Nachweis von Harnsäure wurde als Salz, das eich für die Herabsetzung der Säuerstofflöslichkeit als zufriedenstellend erwiesen hatte, NatriuwBonohydrogenphoephat verwendet. Die Konzentration

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desselben variiert in Abhängigkeit von der jeweiligen Zusammensetzung des Reagens und sie kann von dem Fachmanne auf diesem Gebiet unter Berücksichtigung der Angaben in dieser Anmeldung leicht empirisch ermittelt werden. Zur Erläuterung der Erfindung wurde jedoch gefunden, daß die Zugabe von Natriummonohydrogenphosphat in einer solchen Menge, die eine Molarität von 0,75 abgab, zu einer Abnahme des Sauerstoffgehalt es des Reagens um 45 % und zu einer Zunahme der Stärke des Signals des Sauerstoffbestimmungsanalysators, verglichen mit einem identischen Reagens, jedoch in Abwesenheit von Natriummonohydrogenphosphat, um 40 % führte. Bei dem für die Durchführung eines Harnsäure-Assay zusammen mit Natriummonohydrogenphosphat verwendeten spezifischen Reagens handelte es sich um eine wäßrige Lösung aus einer 0,1 M Natriumtetraboratlösung mit einem pH-Wert von 8,5 und 0,25 internationalen Einheiten pro ml Uricase.

Es wurde gefunden, daß die Zugabe von Ammoniumsulfatsalz oder Kaliumchloridsalz zu dem oben genannten Reagens für den Harnsäure-Assay zu einer Abnahme des Sauerstoffgehaltes des Reagens, jedoch zu einer Schwächung des Analysatorsignals anstatt einer Verstärkung führte. Es wird angenommen, daß diese Schwächung des Signals wahrscheinlich zurückzuführen ist auf die Hemmung der Uricase durch die Konzentration an Ammoniumsulfat oder Kaliumchlorid.

Jedes der für die erfindungsgemäße Verwendung in Betracht gezogenen Salze beeinflußt jedes Enzym in einerfür dieses Enzym spezifischen Weise. Infolgedessen kann die Wirkung des Salzes auf den Sauerstoffgehalt und die Signal-Ansprechempfindlichkeit teilweise überdeckt werden durch die Wirkung des Salzes auf das Enzym selbst. So wird beispielsweise durch Zugabe einer 0,5 M Lösung des Phosphatsalzes der Tabelle I, die sich auf das Cholesterinreagens bezieht, der Sauerstoffgehalt des Reagens um 40 % gesenkt und man erhält eine Verstärkung des Signals um das 4-fache· Durch Zugabe einer

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0,5 M Lösung von Natriumsulfat zu dem gleichen Reagens wird jedoch der Sauerstoffgehalt um 4-5 % gesenkt, wobei man jedoch eine Zunahme der Stärke des Signals um das 7-fache erhält. Es wird angenommen, daß dieses Phänomen darauf zurückzuführen ist, daß der erhöhte Gehalt an Phosphationen die Reaktionsgeschwindigkeit eines oder beider Enzyme, die an dem Cholesterin-Assay beteiligt sind, hemmt oder daß durch den erhöhten Gehalt an Natriumsulfat die Reaktionsgeschwindigkeit eines oder beider Enzyme verbessert wird.

Wegen der Vielzahl von Salzen, die für die erfindungsgemäße Verwendung zur Verfügung stehen, ist die Erfindung keinesfalls auf bestimmte Salze beschränkt, wie sie oben angegeben sind, sondern umfaßt die Verwendung aller Salze oder irgendeines anderen damit kompatiblen Agens, die (das) durch ο inen Fachmann daraufhin untersucht werden können (kann), ob sie (es) den Sauerstoffgehalt des jeweiligen enzymatisehen Reagens, dem sie (es) gesetzt werden (wird), in signifikanter Weise vermindern und die Stärke des Signals des Sauerstoffbestimmungsanalysators, dem sie (es) gesetzt werden (wird)^erhöhen.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird.

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Claims

PATENTANSPRtJC II E

' 1J Enzymatisehes Reagens aus einer gepufferten Lösung und einem Enzym für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration eines Substrats mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens außerdem ein Salz oder ein Salzgemisch enthält, welches die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens gegenüber der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30 % herabsetzt und dadurch die Stärke eines durch den Analysator erzeugten Output-Signals erhöht, welches die Substratkonzentration anzeigt.
2. Reagens nach Anspruch 1 für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Cholesterinoxydäse enthält und daß das Salz oder Salzgemisch ausgewählt wird aus der Gruppe:

a) einer Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Natriummonohydrogenphosphat,

b) Ammoniumsulfat,

c) Natriumsulfat und

d) Natriumchlorid.
3. Reagens nach Anspruch 1 für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration von Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Glucoseoxydase enthält und daß das Salz oder Salzgemisch ausgewählt wird aus der Gruppe:

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ORIGINAL INSPECTED

a) einer Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Natriummonohydrogenphosphat,

b) Ammoniumsulfat und

c) Natriumsulfat.
4. Reagens nach Anspruch 1 für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration von Harnsäure, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Uricase und als Salz Natriummonohydrogenphosphat enthält.
5. Enzymatisches Verfahren zur kinetischen Messung von Substratkonzentrationen mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators unter Verwendung eines enzymatischen Reagens, das eine gepufferte Lösung und ein Enzym enthält, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reagens ein Agens zugesetzt wird, welches die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens im Vergleich zu der Löslichkeit von Sauerstoff in Wasser um mindestens 30 % herabsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Agens ein Salz oder ein Salzgemisch verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin unter Verwendung eines Cholesterinoxydase enthaltenden Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß ein Agens verwendet wird, das ausgewählt wird aus der Gruppe der Salze:

a) einer Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Natriummono-

hydrogenphosphat,

b) Ammoniumsulfat,

c) Natriumsulfat und

d) Natriumchlorid.
8. Verfahren nach Anspruch 5 zur kinetischen Messung der Konzentration von Glucose unter Verwendung eines Glucoseoxydase enthaltenden Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß

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ein Agens verwendet wird, das ausgewählt wird aus der Gruppe der Salze:

a) einer Mischung aus Kaliumdihydrogenphosphat und Natriummonohydrogenphosphat,

b) Ammoniumsulfat und

c) Natriumsulfat.

9· Verfahren nach Anspruch 5₅zur kinetischen Messung der Konzentration von Harnsäure unter Verwendung eines Uricase enthaltenden Reagens, dadurch gekennzeichnet, daß als Agens Natriummonohydrogenphosphat verwendet wird.

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