DE1498901B2 - Diagnostisches mittel und verfahren zum nachweis bzw. zur bestimmung von harnsaeure im blut - Google Patents

Diagnostisches mittel und verfahren zum nachweis bzw. zur bestimmung von harnsaeure im blut

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Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel und ein Verfahren zum Nachweis von Harnsäure im Blut.
In der medizinischen Wissenschaft ist der Wert von Analysenmethoden zur Bestimmung von Harnsäure im Blut als Mittel zur Diagnose verschiedener Krankheiten und unter Umständen zur Unterscheidung zwischen eng miteinander verwandten anormalen Zuständen, z. B. Gicht und Arthritis, seit langem anerkannt. Gicht kennzeichnet sich durch einen anormalen Anstieg des Harnsäurespiegels im Blut, während bei Arthritis ein derartiger Anstieg des Harnsäuregehaltes nicht stattfindet. Es besteht daher ein beträchtliches Bedürfnis nach einem einfachen und wirtschaftlichen Test zur genauen quantitativen Bestimmung des Harnsäuregehaltes des Blutes.
Normalerweise kommt Harnsäure im Blut in wechselnden geringen Mengen zwischen etwa 0,7 und 3,7 mg/100 ml vor. Bei den obengenannten anormalen Zuständen erreicht der Harnsäurespiegel im Blut oft Werte von 27 mg/100 ml oder mehr.
Es sind bereits verschiedene Methoden zur Bestimmung oder Schätzung der Harnsäurekonzentration im
ίο Blut bekannt. Zu ihnen gehören die sehr häufig angewandten Methoden der kolorimetrischen Bestimmung an Blutfiltraten. Einige dieser Verfahren beruhen auf der Ausfällung der Harnsäure aus dem Blutfiltrat, z. B. als Silbersalz, in welchem Falle die Harnsäure kolorimetrisch durch Umsetzung mit Phosphorwolframsäure oder mit Arsenwolframsäure bestimmt wird. Andere bekannte Methoden unter Verwendung von Blutfiltraten beruhen auf der direkten Behandlung des Filtrates mit Wolframsäure in Gegenwart einer Cyanid-Harnstofflösung und Ablesung der dabei entwickelten Farbe an einem Photometer.
In neuerer Zeit ist eine Methode bekanntgeworden, die auf der enzymatischen Umwandlung der in der Blutprobe enthaltenen Harnsäure in Allantoin beruht.
Diese Umsetzung wird in einem Spektrophotometer durchgeführt, mit dessen Hilfe das Verschwinden des Harnsäurespektrums bei der Umwandlung zu Allantoin festgestellt wird. Dieses Verfahren, das genauere Bestimmungen ermöglicht als die anderen bekannten Methoden, erfordert jedoch weitgehend geschulte Arbeitskräfte und viel Zeit.
Die bekannten Methoden zur Bestimmung von Harnsäure im Blut leiden an einem oder mehreren der folgenden Nachteile: Sie erfordern besonders ausgebildete Arbeitskräfte; ihre Durchführung erfordert viel Zeit; sie liefern keine zuverlässigen genauen Ergebnisse, und sie müssen innerhalb äußerst enger Zeitgrenzen durchgeführt werden. Ferner beruhen die bekannten Methoden entweder auf dem Nachweis der Harnsäure als solcher oder auf der Geschwindigkeit ihrer Umwandlung in andere Stoffe.
Die Aufgabe der Erfindung bestand daher in der Schaffung eines diagnostischen Mittels, das eine genaue Bestimmung von Harnsäure im Blut in kurzer Zeit und mit einfachsten Mitteln ermöglicht.
Die Lösung dieser Aufgabe besteht erfindungsgemäß in einem diagnostischen Mittel, das aus zwei Komponentenmischungen mit unterschiedlichem pH-Wert besteht, und zwar einem Wasserstoffperoxyd erzeugenden Gemisch aus Uricase, einem Katalase-Inhibitor und einer Puffersubstanz mit einem pH-Wert von 8,5 bis 10, und einem das Wasserstoffperoxyd bestimmbar machenden Gemisch aus einem Farbbildner, einem die Oxydation des Farbbildners durch Wasserstoffperoxyd katalysierenden Stoff mit peroxydierender Aktivität und einer Puffersubstanz mit einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5.
Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel ermöglicht die Durchführung von Harnsäurebestimmungen im Laboratorium auch von ungeschulten Arbeitskräften. Es bietet ferner die Vorteile einer äußerst raschen Farbentwicklung und der Beständigkeit des maximalen Farbwertes über einen längeren Zeitraum hinweg.
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß die Menge des bei der enzymatischen Umwandlung von Harnsäure in Allantoin erzeugten Wasserstoffperoxyds direkt proportional der Menge der im Blut enthaltenen
3 4
Harnsäure ist. Das erzeugte Wasserstoffperoxyd kann wart eines Stoffes mit peroxydierender Aktivität statt-
dann an einer Farbänderung gemessen werden, die bei findet. Es wird angenommen, daß sich hierbei die
der Oxydation einer farbbildenden Substanz in Gegen- folgenden allgemeinen Reaktionen abspielen:
Harnsäure + O2 + 2H2O > Allantoin + H2O2 + CO2
IT. lCtv·,, ,ο. Stoff mit peroxydierender Aktivität Farbänderung
H2O2 + farbbildende Substanz - >
Bisher war es nicht möglich, die Menge des bei der von Metallionen empfindlich ist, ist es zweckmäßig,
ümwandlungsreaktion erzeugten Wasserstoffperoxyds die Urat-Oxydase mit einem Chelatisierungsmittel,
genau zu messen, weil das Blutserum Enzyme, z. B. wie Äthylendiamin, 1,2-Propylendiamin oder anderen
Katalase, enthält, die das Wasserstoffperoxyd zer- 15 Diaminen oder substituierten Diaminen, zu stabili-
stören, sobald es sich bildet. Diese Schwierigkeit wird sieren, die die hemmende Wirkung von zweiwertigen
durch die Erfindung beseitigt. und anderen mehrwertigen Metallionen auf die Urat-
Beim Nachweis von Harnsäure im Blut mit dem Oxydase wieder aufheben. Ein bevorzugtes Stabilisier-
erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel wird diese mittel ist z. B. Äthylendiamintetraessigsäure.
Harnsäure zunächst unter Verwendung des Wasser- 20 Ein System zur Erzeugung von Wasserstoffperoxyd,
stoffperoxyd erzeugenden Systems in Allantoin über- wie das oben beschriebene, kann in verschiedenen
geführt. Dann wird das System zum Nachweis des Formen verwendet werden. Zum Beispiel können die
V ίί'(> Wasserstoffperoxyds verwendet, um die Menge des Bestandteile in flüssiger Form oder je nach der Erhält-
V .·*■ bei der Umwandlung der Harnsäure in Allantoin ge- lichkeit fester Enzyme in Pulverform miteinander gebildeten Wasserstoffperoxyds zu bestimmen. Die von 25 mischt werden. Die flüssigen Mittel können dann
dem Farbindikator in dem System zum Nachweis des lyophilisiert werden, und das dabei erhaltene Produkt
Wasserstoffperoxyds entwickelte Farbe wird dann mit kann zu jedem späteren Zeitpunkt durch einfachen
einer geeichten Farbtafel oder mit Normalfarbmustern Zusatz von Wasser wieder in Lösung gebracht werden,
verglichen, um die in der ursprünglichen Probe ent- Gegebenenfalls können die Pulver in Form von
haltene Harnsäuremenge zu bestimmen. 3° Tabletten gebracht werden. Auch andere Formen
Im allgemeinen soll die Reaktion zur Erzeugung des können angewandt werden, was weitgehend von Fragen
Wasserstoffperoxyds innerhalb 5 Minuten oder weniger der Beständigkeit, der Verpackung und Lagerung
vollständig verlaufen, um den Test in der vorteil- abhängt.
haftesten Weise ausführen zu können und die Disso- Die Pufferung des das Wasserstoffperoxyd be-
ziation des Enzyms, die mit der Zeit ansteigt, auf ein 35 stimmbar machenden Komponentengemischs muß
Minimum zu beschränken. Zu diesem Zweck kann die innerhalb eines pH-Bereiches von etwa 4,5 bis 5,5
Konzentration der Urat-Oxydase so eingestellt werden, erfolgen. Hierfür können als Puffer z. B. Citrat,
daß die höchste zu erwartende Harnsäurekonzentra- Succinat, Tris-(hydroxymethyl)-methylamin-glutamat
tion im Blutserum innerhalb eines Zeitraums von nicht und Tris-(hydroxymethyl)-methylamin-malonat, aber
mehr als etwa 5 Minuten quantitativ in Allantoin 40 auch andere Puffer verwendet werden, die für diesen
übergeführt wird. pH-Bereich in Betracht kommen. Dieser saure pH-
■ Das Enzym Urat-Oxydase kann aus der Leber oder Bereich ist erforderlich, damit sich die beständigste
den Nieren aller Tiere gewonnen werden, die imstande Farbe entwickelt. Es wurde gefunden, daß bei höheren
t C \) sind, Harnsäure in Allantoin umzuwandeln, z. B. aus pH-Werten die Farbe sehr schnell verblaßt.
^' Leber oder Nieren von Schweinen oder Rindern. 45 Obwohl die Konzentrationen der verschiedenen Be-
Da dieses Enzym innerhalb des oben angegebenen standteile in den beiden Komponentenmischungen des
Zeitraumes seine maximale Aktivität im pH-Bereich diagnostischen Mittels nicht besonders ausschlag-
von etwa 9,0 bis 9,2 entfaltet, muß zusammen mit der gebend sind, lassen sich doch in dieser Beziehung
Urat-Oxydase ein Puffer angewendet werden, der das gewisse Richtlinien aufstellen. Die verschiedenen Stoffe
Gemisch in diesem pH-Bereich hält. In diesem Sinne 50 werden im allgemeinen in solchen Konzentrationen
verwendbare Puffer sind z. B. Boratpuffer, Glycin und verwendet, daß der Konzentrationsbereich der Harn-
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Die Konzentra- säure, die bestimmt werden soll, dadurch umfaßt wird,
tion des Puffers ist nicht besonders ausschlaggebend. Abgesehen davon, sind die Konzentrationsbereiche in
Vorzugsweise verwendet man aber verhältnismäßig den betreffenden Reagenzien nicht besonders wichtig,
verdünnte Pufferlösungen; Konzentrationen von 55 Hinsichtlich des Puffers wurde jedoch gefunden, daß
0,1 Mol/l sind empfehlenswert. beim Zusatz des zweiten Puffers zwecks Herabsetzung
Da Blutserum das Enzym Katalase enthält, welches, des pH-Wertes auf den Bereich von etwa 4,5 bis 5,5
wie oben erwähnt, das Wasserstoffperoxyd zerstört, das Verhältnis der Menge dieses Puffers zu derjenigen
muß dem für die Erzeugung des Wasserstoffperoxyds des alkalischen Puffers, der für das Erzeugungssystem
bestimmten Stoffgemisch noch eine Substanz zugesetzt 60 verwendet wird, unter der Annahme der gleichen
werden, die die Wirkung der Katalase hemmt. Zu molaren Konzentration beider Puffer im allgemeinen
diesem Zweck ist Natriumazid besonders zu empfehlen. etwa 3 :1 betragen soll.
Gegebenenfalls können auch Cyanide, wie Kalium- Als Farbbildner können verschiedene organische
cyanid oder Natriumcyanid, verwendet werden. Stoffe verwendet werden, und zwar hauptsächlich die-
Vielfach hat es sich als zweckmäßig erwiesen, dem 65 jenigen, die von Anilin und Phenol abgeleitet sind.
System zur Erzeugung des Wasserstoffperoxyds noch Zum Beispiel eignen sich als Farbbildner o-Tolidin,
j ein Stabilisiermittel für die Urat-Oxydase zuzusetzen. o-Toluidin, p-Toluidin, o-Phenylendiamin, N,N'-Di-
Da Urat-Oxydase in verdünnter Lösung gegen Spuren methyl-p-phenylendiamin, Benzidin, o-Anisidin,
p-Anisidin, Diaiiisidin, o-Kresol, m-Kresol, λ- und /5-Naphthol, Brenzcatechin, Guajakol, Pyrogallol, 2,7-Diaminofluoren, Leukoindophenole und Guajakharz. Die einzige Beschränkung hinsichtlich des Farbbildners ist die, daß er in Gegenwart von Wasserstoffperoxyd und einem als Oxydationskatalysator wirkenden Stoff mit peroxydierender Aktivität eine Farbänderung erleiden muß.
Als Stoff mit peroxydierender Aktivität wird bevorzugt, das. Enzym Peroxydase verwendet. Peroxydase kann aus Meerrettich, Feigenblättern oder Kartoffeln gewonnen werden. Andere Stoffe mit peroxydierender Aktivität sind z. B. normales Blut, rote Blutzellen, lyophilisiertes Blut und ähnliche natürliche und synthetische Metallporphyrine. Auch Gemische aus Kaliumjodid und Natriummolybdat sowie aus anderen wasserlöslichen Jodiden, wie Natriumjodid und Ammoniumjodid, und anderen löslichen Molybdaten, wie Kaliummolybdat und Ammoniummolybdat, können verwendet werden. Ebenfalls verwendbar ist Natriummolybdat sowie andere Molybdate für sich allein. Urohämin und andere, bekanntermaßen als Oxydationskatalysatoren bekannte Porphyrine sind ebenfalls verwendbar. Von den Metallporphyrinen wird zwar Hämin bevorzugt; es können aber auch verschiedene komplexbildende Verbindungen, die gewisse andere, an sich nicht verwendbare Metallporphyrine aktivieren, in Kombination mit diesen anderen Metallporphyrinen zur Herstellung wirksamer Katalysatoren verwendet werden. Solche Stoffe sind z. B. 2-Aminobenzthiazol, Pyridin, Bipyridyl, Bipyridylpyridin, Nicotinsäure u. dgl. Andere Stoffe von nichtenzymatischem Charakter, die die gewünschte Oxydationsreaktion katalysieren, sind Verbindungen, wie Eisensulfocyanat, Eiseniamat, Ferroferrocyanid, Kaliumchromisulfat und andere.
Das zweite Komponentengemisch kann ebenfalls in verschiedenen Formen zur Verfügung gestellt werden. Zum Beispiel kann dieses Gemisch in Form einer Flüssigkeit als lyophilisierte Flüssigkeit oder als lyophilisiertes Pulver hergestellt werden. Gegebenenfalls können die Stoffe in trockener Form gemischt und als Pulver oder in Form von Tabletten verwendet werden. Eine andere Form, in der das Nachweissystem angewandt werden kann, ist die Form von Stäbchen oder Streifen aus saugfähigem Material, wie absorbierendem Papier, welches mit den Bestandteilen getränkt ist. Das Mittel kann auch in verschiedenen anderen Formen angewandt werden.
Beispiel 1
Die folgenden Stoffe werden gemischt, lyophilisiert nnd in Wasser wieder in Lösung gebracht:
Natriumborat als Puffer (0,lmolar,
pH = 9,2) 0,1 ml
Äthylendiamintetraessigsäure (1 %) · · 0,01 ml
Natriumazid (0,1 molar) 0,05 ml
Urat-Oxydase (0,02-Einheiten)*) 0,03 ml
*) Eine Einheit an Urat-Oxydase-Aktivität ist diejenige Enzymmenge, die die Umwandlung von Harnsäure in Allantoin mit einer Geschwindigkeit von 1 Mikromol je Minute bei 25° C katalysiert, wenn die Harnsäure in einer Konzentration von 20 mg/1 angewandt wird.
Dann werden 0,02 ml Blutserum zugesetzt, welches 9,2 mg Harnsäure je 100 ml enthält. Die Umsetzung wird 5 Minuten fortgesetzt.
Nach Beendigung der anfänglichen Umsetzung wird das folgende Stoffgemisch lyophilisiert, dann in Wasser in Lösung gebracht und zu der obigen Lösung zugesetzt:
5
Natriumeitrat als Puffer (0,2molar,
pH = 4,5) 0,15 ml
Peroxydase (1 mg/ml — Aktivität
200 Einheiten *)mg) 0,06 ml
ίο o-Tolidin (25 mg/10 ml) 0,06 ml
*) Eine Einheit an Peroxydase-Aktivität ist diejenige Menge des Enzyms, die die Zersetzung von Wasserstoffperoxyd mit einer Geschwindigkeit von 1 Mikromol/Minute bei 25° C katalysiert.
Innerhalb 10 Sekunden entwickelt sich eine blaue Farbe. Die Farbe wird mit einer geeichten Farbtafel verglichen und ergibt einen Harnsäuregehalt von 9 mg je 100 1.
zo Um dieses Verfahren weiter zu prüfen, werden die nach dem obigen Verfahren für verschiedene Serumproben erhaltenen Ergebnisse mit denjenigen verglichen, die aus spektrophotometrischen Werten erhalten worden sind. Die nachstehende Tabelle gibt eine Übersicht über diese Werte.
Harnsäurekonzentration in der Serumprobe, mg/100 ml
Das folgende Beispiel zeigt die Wirksamkeit niedrigerer Konzentrationen an Urat-Oxydase.
Beispiel 2
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit 0,01 ml (0,007 Einheiten) an Urat-Oxydase. Das lyophilisierte Pulver wird mit 0,1 ml Wasser wieder in Lösung gebracht. Die durch Vergleich mit einer geeichten Farbtafel und auf spektrophotometrischem Wege erhaltenen Werte stimmen mit der Genauigkeit des Beispiels 1 miteinander überein.
Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung eines anderen Puffers für das Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssystem.
Beispiel 3
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit einer
0,lmolaren Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan als Puffer an Stelle des Boratpuffers. Dieser Puffer liefert einen pH-Wert von 9,2. Die Ergebnisse sind die gleichen wie im Beispiel 1.
Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung eines anderen Katalase-Inhibitors.
Farbtafel Spektrophotometer
1 1,7
3 2,6
3 3,4
4 4,2
6 5
6 7,1
7 6,3
7 6,4
9 9,2
11 10,8
Beispiel 4
Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch mit einem 0,2molaren Boratpuffer bei einem pH-Wert von 8,5
und mit Kaliumcyanid als Inhibitor für die Katalase. Die Ergebnisse sind die gleichen wie im Beispiel 1.
Es wurde gefunden, daß man bei allen pH-Werten von etwa 8,5 bis 10,0 zufriedenstellend arbeiten kann.
Das folgende Beispiel erläutert die Verwendung eines anderen Nachweissystems für das Wasserstoffperoxyd.
Beispiel 5
Man arbeitet nach Beispiel 2, jedoch mit dem folgenden Gemisch zum Nachweis des Wasserstoffperoxyds :
Natriumsuccinat (pH = 5,0) 17,7 mg
Peroxydase 0,06 mg
o-Tolidin 0,15 mg
Das Gemisch wird lyophilisiert und wieder in Wasser gelöst. Die Ergebnisse sind die gleichen wie im Beispiel 2.
Das folgende Beispiel erläutert die Anwendung eines Mittels zur Erhöhung des Farbunterschiedes.
Beispiel 6
Man arbeitet nach Beispiel 4, jedoch unter Zusatz von 0,017 mg Tartrazin (FD & C-GeIb Nr. 5) zu dem Farbbildner. Die sich entwickelnden Farben liegen im Bereich von Gelb-grün bis Blau-grün und gestatten eine klare Unterscheidung zwischen verschiedenen Harnsäurekonzentrationen im Blutserum, wie im Beispiel 5.
ίο Kurz zusammengefaßt, betrifft die Erfindung ein Mittel und ein Verfahren zum Nachweis der Menge der in Blutserum enthaltenen Harnsäure. Das Mittel besteht aus einem Wasserstoffperoxyd-Erzeugungssystem, wie einem Gemisch aus Urat-Oxydase und einem Katalase-Inhibitor, welches auf einen pH-Wert gepuffert ist, der nahe bei dem für die Urat-Oxydase-Aktivität günstigsten Wert liegt, und einem Wasserstoffperoxyd-Nachweissystem, wie einem Gemisch aus einem Farbbildner und einem Stoff mit peroxydierender Aktivität, der imstande ist, die Oxydation des Farbbildners durch das Wasserstoffperoxyd zu katalysieren, wobei dieses System auf einen pH-Wert in der Nähe des für die Farbentwicklung günstigsten Wertes gepuffert ist.
309514/324

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Harnsäure im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß es aus zwei Komponentenmischungen mit unterschiedlichem pH-Wert besteht, und zwar einem Wasserstoffperoxyd erzeugenden Gemisch aus Uricase, einem Katalase-Inhibitor und einer Puffersubstanz mit einem pH-Wert von 8,5 bis 10, und einem das Wasserstoffperoxyd bestimmbar machenden Gemisch aus einem Farbbildner, einem die Oxydation des Farbbildners durch Wasserstoffperoxyd katalysierenden Stoff mit peroxydierender Aktivität und einer Puffersubstanz mit einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5.
2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Katalase-Inhibitor ein Alkaliazid oder ein Alkalicyanid vorhanden ist.
3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Stoff mit peroxydierender Aktivität Peroxydase vorhanden ist.
4. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbbildner o-Tolidin vorhanden ist.
5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Komponentenmischungen in Form lyophilisierter fester Stoffe vorliegen.
6. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem einen pH-Wert von 8,5 bis 10 aufweisenden Komponentengemisch ein Stabilisierungsmittel und/oder ein Chelatisierungsmittel für die Uricase enthalten ist.
7. Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man Blutserum zunächst mit einer einen pH-Wert von 8,5 bis 10 aufweisenden Komponentenmischung aus Uricase, einem Katalase-Inhibitor und einer Puffersubstanz umsetzt und danach mit einer einen pH-Wert von 4,5 bis 5,5 aufweisenden Komponentenmischung aus einem Farbbildner, einem die Oxydation des Farbbildners durch Wasserstoffperoxyd katalysierenden Stoff mit peroxydierender Aktivität und einem Puffer, das bei der Umsetzung erzeugte Wasserstoffperoxyd bestimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung des Blutserums nicht langer als etwa 5 Minuten durchführt.
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