DE2729125C2 - Enzymatisches Reagens und Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators - Google Patents

Enzymatisches Reagens und Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators

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DE2729125C2
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Description

(a) Ammoniumsulfat,
(b) Natriumsulfat
sowie, im Falle der Cholesterin-Messung,
(c) Kaliumchlorid
enthält, welches die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens gegenüber der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30% herabsetzt.
2. Enzymatisches Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators unter Verwendung eines enzymatischen Reagens, das eine gepufferte Lösung und ein Enzym enthält, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reagens ein Agens zugesetzt wird, bei dem es sich um ein Salz oder ein Salzgemisch handelt, das ausgewählt wird aus der Gruppe
(a) Ammoniumsulfat,
(b) Natriumsulfat
sowie, im Falle der Cholesterin-Messung,
(l) Kaliumchlorid,
welches die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens. im Vergleich zur Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30% herabsetzt.
40
Die Erfindung betrifft ein enzymatisches Reagens aus einer gepufferten Lösung und einem Enzym für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators sowie ein enzymatisches Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators unter Verwendung dieses enzymatischen Reagens.
Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose in Probelösungen ist in den US-Patentschriften 57 771 und 39 33 593 beschrieben. Die darin beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen dienen insbesondere der Bestimmung der Anfangskonzentration von Cholesterin oder Glucose durch Messung der Geschwindigkeit, mit der Sauerstoff in einer chemischen Reaktion in der Lösung verbraucht wird. Die von diesen bekannten Sauerstoffbestimmungsanalysatoren erzeugten Signale, die den Anfangskonzentraticnen von Cholesterin oder Glucose entsprechen, sind jedoch häufig sehr schwach, so daß man seit langem bestrebt ist, die Empfindlichkeit derartiger Sauerstoffbestimmungsanalysatoren zu erhöhen.
Aus der Zeitschrift »Anal. Chem.«, And 261 (1972), Seiten 333 bis 336, ist die Bestimmung von Glucose in einem mit Luft gesättigten Reaktionsmedium bekannt, das unter anderem 120 mMol Phosphatpuffer enthält Die Molarität dieses Phosphatpuffers reicht jedoch nur aus, um die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reaktionsmedium um etwa 24% gegenüber der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser herabzusetzen. Eine Herabsetzung der Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reaktionsmedium um mindestens 30% ist jedoch erforderlich, um ausreichend starke Signale und damit eine genügend hohe Empfindlichkeit des Sauerstoffbestimmungsanalysators zu erzielen. Eine Erhöhung des Phosphatpuffergehaltes zur Erzielung einer ausreichenden Verringerung der Sauerstofflöslichkeit in dem Reaktionsmedium kam jedoch nicht in Betracht, weil aus der US-Patentschrift 38 57 771 (insbesondere Spalte 11, Zeilen 58 ff) bekannt war, daß ein derart hoher Puffergehalt die Glucosebestimmung in nachteiliger Weise beeinflussen würde.
Aus »Clin. Chem.«, New York 22 (1976). Heft 3, Seiten 336 bis 340, ist zwar die Verwendung eines Natriumphosphatpuffers bei pH 7 in einem Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Cholesterin und Glucose bekannt; wie aus Fig. 4 dieser Literaturstelle hervorgeht, wird jedoch erst ab einer Natriur.iphosphatpuffer-Konzentration von etwa 0,6 Mol die Sauerstofflöslichkeit in dem Reagens um mindestens 30%, nämlich um 34%, verringert. Bei einer solchen Natriumphosphatpuffer-Konzentration treten aber bereits nachteilige Effekte auf die Sauerstoffverbrauchsrate auf.
Aufgabe der Erfindung war es nun, ein enzymatisches Reagens und ein Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalystors zu entwikkeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, das Signal/Rauschverhältnis, d. h. die Empfindlichkeit des verwendeten Sauerstoffbestimmungsanalysators gegenüber den bisher bekannten Sauerstoffbestimmungsanalysatoren beträchtlich zu erhöhen.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe gelöst werden kann mit einem enzymatischen Reagens aus eine gepufferten Lösung und einem Enzym für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators, das außerdem ein bestimmtes Salz oder ein bestimmtes Salzgemisch enthält, das in der Lage ist, die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens gegenüber der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30% herabzusetzen.
Gegenstand der Erfindung ist ein enzymatisches Reagens aus einer gepufferten Lösung und einem Enzym für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reagens außerdem ein Salz oder ein Salzgemisch, ausgewählt aus der Gruppe
(a) Ammoniumsulfat,
(b) Natriumsulfat
sowie, im Falle der Cholesterin-Messung,
(c) Kaliumchlorid
enthält, welches die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens gegenüber der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30% herabsetzt.
Mit dein erfindunsgemäßen Reagens ist es möglich, das Signal/Rausch-Verhältnis und damit die Empfindlichkeit der in Sauerstoffbestimmungsanalysatoren erzeugten Signale, welche die Anfangskonzentration des Cholesterin und der Glucose anzeigen, beträchtlich zu
erhöhen.
Dies beruht darauf, daß bei Abnahme der Löslichkeit des Sauerstoffein dem enzymatischen Reagens weniger Sauerstoff zur Verfugung steht für die Umsetzung mit dem enzymatischen Reagens. Bei Sauerstoffbestimmungsanalysatoren, in denen polarographische Sensoren verwendet werden und die Anfangskonzentrationen von Cholesterin oder Glucose auf der Basis der Geschwindigkeit der Änderung des Sauerstoffverbrauchs errechnet werden, j>edeutet dies, daß die gleiche Geschwindigkeit der Änderung der Sauerstoffkonzentration gemessen wird als größere Geschwindigkeit der Änderung des Sauerstoffverbrauchs als vorher. Dabei wird der Partialdruck anstelle der Konzentration des gelösten Sauerstoffs gemessen. Da in einem gegebenen Medium der Partialdruck proportional zu der Sauerstoffkonzentration ist, wird dann, wenn die Sauerstofflöslichkeit in dem Medium herabgesetzt wird, die Prcportionalitätskorutante größer und die gleiche Abnahme der Sauerstoffkonzentration führt zu einer größeren ?n Partialdruckänderung und damit zu einer größeren Abnahme des Sensor-Outputs. Dadurch erhält man ein proportional größeres Signal und es wird eine beträchtliche Verbesserung in bezug auf das Signal/Rausch-Verhältnis des Sauerstoffbestimmungsanalysators erzielt, ohne daß eine Änderung seiner elektronischen Ausrüstung erfolgt.
So wurde beispielsweise gefunden, daß dann, wenn ein Phosphatsalz einer etwa I.OmoIaren Lösung einem enzymatischen Redens zugesetzt wird, das in dem in den obengenannten US-Patentschriften beschriebenen Sauerstoffbestimrcungsanalytator -cjt Messung der Cholesterinkonzentration verwendet wird, die Löslichkeit des Sauerstoffs in dem Reagens u,n mehr als 30% verringert und das dabei erhaltene Signal, welches die Cholesterin-Anfangskonzentration anzeigt, auf das lOfache verstärkt wird, verglichen mit dem Signa) in Abwesenheit des Phosphatsalzes.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein enzymatisches Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators unter Verwendung eines enzymatischen Reagens, das eine gepufferte Lösung und ein Enzym enthält, das dadurch gekennzeichnet ist. daß dem Reagens ein Agens zugesetzt wird, bei dem es sich um ein Salz oder ein Salzgemisch handelt, das ausgewählt wird aus der Gruppe
(a) Ammoniumsulfat,
(b) Natriumsulfat sowie, im Falle der Cholesterin-Messung,
(c) Kaliumchlorid,
welches die Löslichkeit von Sauerstoff in dem Reagens im Vergleich zur Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser um mindestens 30% herabsetzt.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert.
Cholesterin-Assay
Löslichkeit des Sauestoffs in dem Reagens um mindestens 30% im Vergleich zu der Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser wurde gefunden, daß die Konzentrationen der Salze, die eine solche Herabsetzung der Löslichkeit ergaben, in Abhängigkeit von der jeweiligen Zusammensetzung der Bezugs?eagentien variierten. Unter Berücksichtigung der optimalen Löslichkeitsverringerung von mindestens 30% für Sauerstoff können Ojese Konzentrationen von dem Fachmanne auf diesem Gebiet unter Berücksichtigung der hier gegebenen Informationen leicht bestimmt werden.
Zur Erläuterung der Erfindung sind jedoch in der nachfolgenden Tabelle I spezifische Salzkonzentrationen und die daraus resultierende Wirkung auf die Sauerstofflöslichkeit in einem Bezugs-Reagens und die entsprechende Signalverstärkung in einem Sauerstoffbestimmungsanalysator des in den obengenannten US-Patentschriften beschriebenen Typs angegeben.
Bei dem für den Cholesterin-Assay verwendeten Bezugs-Reagens handelte es sich um eine wäßrige Lösung aus einer 0,01 M Kaliumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 6,0, 0,5 mg pro ml Natriumcholat, 0,02 g des oberflächenaktiven Mittels Isooctylphenoxypolyethoxyethanol, das etwa 10 Moleküle Ethylenoxid pro Molekül des Polymerisats auf 100 ml Lösung enthielt, einer 0,001 M Natriumaoidlösung, 1 internationalen Einheit Cholesterinoxidase (Brevibacterium sp.), EC. 1.13.6 und 0,02 internationalen Einheiten Cholesterinesterase EC. 3.1.1.13.
Tabelle I
Salz Molarität Prozent Zunahme
der satz der der
Reagens Abnahme Stärke
lösung*) des des
Sauerstoff Signals")
gehaltes
(NH4J2SO4 0,75 35 1Ofach
Na2SO4 030 35 7fach
KCI 130 35 4fach
60
In Verbindung mit einem Reagens für den biochemischen Nachweis von Cholesterin wurden die Salze, die sich in bezug auf die Herabsetzung der Sauersstofflöslichkeit als zufriedenstellend erwiesen haben, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Ammoniümsulfat, Natriumsulfat und Kaliumchlorid.
Bei der Bestimmung der optimalen Herabsetzung der *) Die Molarität der Reagenslösung umfaßt die Molarität, die von dem Kaliumphosphat in dem Bezugs-Reagens herrührt.
") Die Zunahme wird verglichen mit dem Signal, das bei Verwendung identischer Reagentien. jedoch in Abwesenheit jedes der in der obigen Tabelle angegebenen Salze, erzeugt wird.
Glucose-Assay
Im Rahmen eines Reagens für einen Glucose-Assay wurden die Salze, die sich für die Herabsetzung der Sauerstofflöslichkeit als zufriedenstellend erwiesen haben, aus einer Gruppe ausgewählt, die bestand aus Ammoniumsulfat und Natriumsulfat.
Wie bei dem Cholesterin-Assay wurde gefunden, daß die Konzentration der Salze, welche die optimale Herabsetzung der Sauerstofflöslichkeit um mindestens 30% ergaben, in Abhängigkeit von den Zusammensetzungen der Bezugs-Reagentien variierten. Auch hier können diese Konzentrationen unter Berücksichtigung der Angaben in der vorliegenden Anmeldung vom Fachmann leicht ermittelt werden.
Zur Erläuterung der Erfindung werden in der nachfolgenden Tabelle II spezifische Salzkonzentrationen und die daraus resultierende Wirkung auf die Sauerstofflös-
lichkeit in einem Bezugs-Reagens sowie die entsprechende Zunahme der Stärke des Signals in dem Sauerstoffbestimmungsanalysator angegeben.
Bei dem für den Glucose-Assay verwendeten Bezugs-Reagens handelie es sich um eine wäßrige Lösung aus einer 0,2 M Natriumphosphatlösung mit einem pH-Wert von 6,0, einer 0,01 M Kaliumjodidlösung, einer 0,0075 M Ammoniummulybdatlösung, einer 0,0005 M Jodlösung, 5 Gew.-% Ethanol und 150 internationalen Einheiten pro ml Glucoseoxidase.
Tabelle II
Salz Molarität Prozent Zunahme
in der satz der der
Reagens Abnahme Stärke
lösung*) des des
Sauerstoff Signals**)
gehalts
(NHj)2SO4
Na2SO4
1.5 1,25
50 60
35 53
*) Die Molarität der Reagenslosung umfaßt üb Molarität. die von dem Kaliumphosphat in der Bezugs-Reagenszusammensetzung herrührt. **) Die Zunahme wird verglichen mit dem Signal das erzeugt wird bei Verwendung identischer Reagentien. jedoch in Abwesenheit jedes der in der vorstehenden Tabelle angegebenen Salze.
Jedes der für die erfindungsgemäße Verwendung in Betracht gezogenen Salze beeinflußt jedes Enzym in einer für dieses Enzym spezifischen Weise. Infolgedessen kann die Wirkung des Salzes auf den Sauerstoffgehalt und die Signal-Ansprechempfindlichkeit teilweise überdeckt werden durch die Wirkung des Salzes auf das Enzym selbst So wird beispielsweise durch die Zugabe einer 0,5 M KH2PO4 und Na2HPO4-Lösung beim Cholesterin-Assay der Sauerstoffgehalt des Reagenses um 40% geserkt und man erhält eine Verstärkung des Signals um das 4fache. Durch Zugabe einer 0.5 M Lösung von Natriumsulfat zu dem gleichen Reagens wird jedoch der Sauerstoffgehalt um 45% gesenkt, wobei man jedoch eine Zunahme der Stärke des Signals um das 7fache erhält
Es win? angenommen, daß dieses Phänomen darauf zurückzuführen ist, daß der erhöhte Gehalt an Phosphationen die Reaktionsgeschwindigkeit eines oder beider Enzyme, die an dem Cholesterin-Assay beteiligt sind, hemmt oder daß durch den erhöhten Gehalt an Natriumsulfat die Reaktionsgeschwindigkeit eines oder beider Enzyme verbesser; wird.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Enzymatisches Reagens aus einer gepufferten Lösung und einem Enzym für die Verwendung zur kinetischen Messung der Konzenration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens außerdem ein Salz oder ein Salzgemisch, ausgewählt, aus der Gruppe
DE2729125A 1976-07-01 1977-06-28 Enzymatisches Reagens und Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators Expired DE2729125C2 (de)

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US05/701,920 US4116773A (en) 1976-07-01 1976-07-01 Enzymatic reagent and method for increasing the sensitivity of enzymatic substrate analyses using oxygen rate analyzers

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Publication Number Publication Date
DE2729125A1 DE2729125A1 (de) 1978-02-02
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DE2729125A Expired DE2729125C2 (de) 1976-07-01 1977-06-28 Enzymatisches Reagens und Verfahren zur kinetischen Messung der Konzentration von Cholesterin oder Glucose mittels eines Sauerstoffbestimmungsanalysators

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FR2356938A1 (fr) 1978-01-27
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