DE2705859C2

DE2705859C2 -

Info

Publication number: DE2705859C2
Application number: DE2705859A
Authority: DE
Inventors: Kenneth Jonas Pierre; Ker-Kong Tung; Geb. Svetlik Henriette Vista Calif. Us Nadj
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1976-02-13
Filing date: 1977-02-11
Publication date: 1988-09-08
Also published as: NO770446L; GB1540320A; JPS5527800B2; DK160844B; NO155844C; DK61077A; CA1076935A; JPS52119296A; FR2394804A1; SE7701564L; DE2705859A1; NL173285B; DK160844C; US4097336A; NL173285C; IT1077151B; FR2394804B1; NL7701455A; NO155844B; SE442406B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kinetischen Bestim mung von α -Amylase in wäßriger Lösung durch Umsetzung eines Polysaccharids aus Glucoseeinheiten, die hauptsächlich durch α-1,4-Bindungen miteinander verbunden sind, mit der die α -Amylase enthaltenden Probe und Messung der bei der enzyma tischen Reaktion entstehenden Abbauprodukte, sowie ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens.

α -Amylase ist ein vom menschlichen Körper erzeugtes Enzym und findet sich in den verschiedensten Körperflüssigkeiten, beispielsweise im Blut, Urin und Speicher. Es ist noch nicht völlig geklärt, welcher Teil des Körpers α -Amylase produziert, es gilt jedoch als sicher, daß die im Körper eines gesunden Menschen vorliegende α -Amylasekonzentration innerhalb eines bestimmten Bereiches variieren kann, während in bestimmten pathologischen Zuständen des Körpers die α -Amylasekonzentration entweder höher oder niedriger ist, d. h. außerhalb dieses normalen Schwankungsbereiches liegt. So liegt beispiels weise bei einem Menschen, der an Pankreatitis, Mumps oder Bauchspeicheldrüsenkrebs leidet, die a -Amylasekonzentration deutlich über dem Normalpegel, während bei Lebererkran kungen die α -Amylasekonzentration unterhalb dieses Normal pegels liegt.

Die bekannten Methoden zur Bestimmung der α-Amylasekonzentra tion beruhen im allgemeinen auf der Verwendung von Stärke wegen der katalytischen Wirkung der α -Amylase auf die Hydro lyse der 1,4-Bindungen der Amylose- und Amylopectin-Frakti onen der Stärke. Läßt man diese Hydrolyse bis zum Ende ablau fen, wird die Stärke durch die α -Amylase fortschreitend zu Glucose, Maltose und Oligosacchariden abgebaut. Es wurde auch bereits versucht, die Abnahme der Trübung oder der Vis kosität einer wäßrigen Stärkelösung nach der Amylose-Hydro lyse zu der α -Amylasekonzentration in Beziehung zu setzen. Bei einer weiteren Analysenmethode wird die Menge der durch die α -Amylase/Stärke-Reaktion gebildeten reduzierenden Sub stanzen zur α -Amylasekonzentration in Beziehung gesetzt oder es wird das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit der Farbstoff freisetzung aus gefärbter Stärke durch α -Amylase bestimmt. Dazu gehört das jodometrische Verfahren, das auf der Reaktion zwischen Jod und Stärke unter Bildung einer blauen Farbe beruht. Dabei wird eine blau gefärbte Stärke-Jod-Lösung mit α -Amylase hydrolysiert, wobei die blaue Farbe mit zunehmendem Abbau der Stärke durch die α -Amylase abnimmt. Diese Farbän derung der blauen Stärke-Jod-Lösung stellt das Maß für die Bestimmung der α -Amylasekonzentration dar. Die obengenannten und das zuletzt genannte Verfahren gelten jedoch nicht als zuverlässig und hinreichend bestimmt, da angenommen werden muß, daß die Farbänderung in keiner linearen Beziehung zur Konzentration der α -Amylase steht.

Es wurden auch bereits enzymatische Methoden zur Bestimmung der α -Amylasekonzentration entwickelt, die auf der Verwen dung von α -Amylase und anderen Enzymen bei der Hydrolyse von Stärke zu Glucose beruhen, die dann durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion gemessen wird. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der DE-OS 24 42 561 beschrieben, bei dem zur Bestimmung des α -Amylasegehalts einer Probe als Sub strat entweder Maltotetraose oder Maltopentaose zu der die α -Amylase enthaltenden Probe zugegeben wird und dann die Glu cose als Reaktionsprodukt der α -Amylase mit dem Substrat bei konstanter Temperatur und konstantem pH-Wert der Lösung bestimmt wird. Aber auch diese Verfahren sind nicht zufrie denstellend, weil beim Abbau von Polysacchariden unter dem Einfluß des Enzyms α -Amylase variierende Mengen der verschie denartigsten Abbauprodukte entstehen, die erst in weiteren Stufen in Glucose überführt werden müssen, da nur diese im Rahmen gekoppelter enzymatischer Reaktionen quantitativ gemes sen werden kann. Dabei tritt noch die Komplikation auf, daß in vielen Analyseproben Glucose von vornherein in einer nicht vernachlässigbar geringen Konzentration zusätzlich zu der durch die enzymatische Hydrolyse gebildeten Glucose vor liegt, so daß bei diesen Verfahren die anfänglich vorhandene Glucose zunächst aus der Probe eliminiert werden muß, bevor die Analyse durchgeführt werden kann (vgl. in diesem Zusam menhang Robyt et al., "Arch. Biochem. Biophys.", 122, 8-16 [1967] und A. F. Holleman, "Lehrbuch der organischen Chemie", Verlag Walter de Gruyter und Co., Berlin 1960, Seite 275).

Alle diese bekannten Verfahren reichen zwar aus, sich einen allgemeinen Überblick über die α -Amylasekonzentration in einer wäßrigen Probe zu verschaffen, sie ermöglichen jedoch keine wissenschaftlich genauen Messungen und/oder sind zu zeitaufwendig.

Aufgabe der Erfindung war es daher, den Einfluß von in α -Amylase enthaltenden Proben vorliegender Glucose und die damit verbundenen meßtechnischen Nachteile, die in der Notwendigkeit der vorherigen Eliminierung der Glucose zu sehen sind, zu vermeiden.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch ein Verfahren zur Bestimmung von α -Amylase, bei dem die Aktivität der a -Amylase kinetisch mit Hilfe einer Reaktionsfolge bestimmt wird, die von der in der Probe vorliegenden Glucose nicht beeinflußt wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur kinetischen Bestimmung von α -Amylase in wäßriger Lösung durch Umsetzung eines Polysaccharids aus Glucoseeinheiten, die hauptsächlich durch α -1,4-Bindungen miteinander verbunden sind, mit der die α -Amylase enthaltenden Probe und Messung der bei der enzyma tischen Reaktion entstehenden Abbauprodukte, das gekennzeich net ist durch die folgende Kombination von Verfahrensmaß nahmen, die bei pH 6 bis 7,5, vorzugsweise bei etwa 6,5, durchgeführt werden:

(i) Umsetzung des Polysaccharids in Gegenwart der die α -Amylase enthaltenden Probe unter Bildung von a -Maltose,
(ii) Umsetzung der gebildeten α -Maltose mit Phosphationen in Gegenwart von Maltosephosphorylase unter Bildung von Glucose und b -D-Glucose-1-phosphat,
(iii) Umsetzung des gebildeten β -D-Glucose-1-phosphats in Gegenwart von β -D-Phosphoglucomutase und Gluco se-16-diphosphat sowie von Mn²⁺-, Mg²⁺-, Co²⁺-, Zn²⁺- oder/und Ni²⁺-Ionen unter Bildung von Gluco se-6-phosphat,
(iv) Umsetzung des gebildeten Glucose-6-phosphats in Gegenwart von Glucose-6-phosphatdehydrogenase und des Coenzyms β -Nicotinamid-adenindinucleotid und/oder β -Nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat unter Bildung der reduzierten Form des Coenzyms und von 6-Phosphogluconat und
(v) Messung der Geschwindigkeit der Bildung des redu zierten Coenzyms in an sich bekannter Weise unter Bedingungen, unter denen die zu bestimmende a -Amy lase geschwindigkeitsbestimmend ist.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Aktivität der in einer wäßrigen Lösung, beispielsweise in Serum und Urin, enthaltenen α -Amylase mit Hilfe einer Reaktionsfolge bestimmt werden, die von der in der Probe gegebenenfalls zusätzlich vorhandenen Glucose nicht beeinflußt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß bei der Durchführung des erfindungsge mäßen Verfahrens eine Indikator-Reaktionsfolge angewendet wird, in der Glucose als Indikator nicht auftritt. Indikatorsubstanz ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren vielmehr α -Maltose, die bisher für diesen Zweck nicht eingesetzt worden ist, ins besondere weil bisher nicht bekannt war, daß die Bildung dieser Substanz beim Abbau des Polysaccharids durch α -Amylase proportional zu der in der zu untersuchenden Probe enthaltenen α -Amylasekonzentration ist.

Aus "J. Biol. Chem." 199, 153 bis 163 (1952), und "J. Biol. Chem."; 236, 2186 bis 2189 (1961), ist es zwar bereits bekannt, daß α -Maltose mit dem Enzym Maltose-phosphorylase in Gegen wart von Phosphationen zu Glucose und β -D-Glucose-1-phosphat umgewandelt werden kann bzw. β -D-Glucose-1-phosphat ein Substrat für die Phosphoglucomutase zur Bildung von Glucose- 6-phosphat darstellt, die geschlossene Reaktionsfolge der gesamten Indikatorreaktion, ausgehend von α -Maltose, ist bisher jedoch zur Bestimmung der α -Amylase in wäßriger Lösung nicht angewendet worden. Auch nahm man bisher an, daß α -Maltose im Rahmen eines kinetischen Verfahrens nicht bestimmt werden kann, weil die Phosphorolyse der Maltose durch Maltose-phosphorylase außerordentlich langsam verläuft (vgl. Kamogawa et al., "Analytical Biochemistry", 57, 303 bis 305 (1974), sowie die Zeitschrift "Clinical Chemistry", Band 22, 1976, Seite 1219).

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird in der Stufe (iv) 6-Phosphogluconat in Gegenwart des Coenzyms und von 6-Phosphogluconat-dehydrogenase umgesetzt unter Bildung der reduzierten Form des Coenzyms und von Ribulose- 5-phosphat.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Reagens zur Durch führung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es enthält

a) ein Polysaccharid aus Glucoseeinheiten, die hauptsäch lich durch α -1,4-Bindungen miteinander verbunden sind,
b) Phosphationen,
c) Maltosephosphorylase,
d) das Coenzym β -Nicotinamid-adenindinucleotid und/oder β -Nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat,
e) Glucose-6-phosphat-dehydrogenase,
f) β -D-Phosphoglucomutase,
g) Glucose-1,6-diphosphat,
h) Mn²⁺-, Mg²⁺-, Co²⁺-, Zn²⁺- oder/und Ni²⁺-Ionen sowie
i) gegebenenfalls 6-Phosphogluconat-dehydrogenase,

wobei die Komponenten (a) bis (i) in solchen Mengen vorlie gen, daß die zu bestimmende α -Amylase geschwindigkeitsbe stimmend ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur kinetischen Bestimmung von α -Amylase in wäßriger Lösung beruht auf der folgenden Kombination von Reaktionen, die bei pH 6 bis 7,5, vorzugs weise 6,5, durchgeführt werden:

wobei die Konzentration des a -Amylase in der wäßrigen Lösung durch Messung des Betrags der Geschwindigkeit der Bildung von NADH bestimmt wird, der ein Maß für die α -Amylasekonzentration darstellt. Die in den oben angegebe nen Reaktionsgleichungen und im weiteren Verlauf der Be schreibung verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:

PO₄ ^3-- Phosphation MP- Maltosephosphorylase β -D-G1P- β -D-Glucose-1-phosphat β -PGM- b -D-Phosphoglucomutase G-1,6-diP- D-Glucose-1,6-diphosphat G-6-P- Glucose-6-phosphat 6-PG- 6-Phosphogluconat G6PDH- Glucose-6-phosphat-dehydrogenase 6PDH- 6-Phosphogluconat-dehydrogenase NAD- β -Nicotinamid-adenindinucleotid NADH- reduzierte Form von β -Nicotinamid-adenin dinucleotid.

Das erfindungsgemäße Reagenssystem enthält das Ausgangsma terial der Reaktion (i), d. h. a -1,4-gebundenes Glucan und sämtliche weiteren Bestandteile, mit Ausnahme von α -Amylase, wie sie für den Ablauf der angegebenen vier Reaktionen erforderlich sind, d. h. also Phosphationen, MP, β -PGM und G6PDH. Dieses Reagenssystem kann als ein Gemisch geliefert und verwendet werden; alternativ kann es auch in Form eines Analyse-Sets aus mehreren Reagentien geliefert werden, die jeweils einen oder mehrere der Be standteile des Reagenssystems enthalten und zur Verwendung für die erfindungsgemäße α -Amylase-Analyse miteinander gemischt werden. Die Komponenten des erfindungsgemäßen Reagenssystems scheinen sämtlich als ein Gemisch stabil zu sein, so daß die Lieferung des Reagenssystems als ein fertiges Gemisch vorzuziehen ist, da es einfacher ist, mit einem Reagens als mit mehreren Reagentien zu arbeiten.

Im folgenden werden die Reaktionen (i) bis (v) des erfin dungsgemäßen Verfahrens näher beschrieben.

Bei dem α -1,4-gebundenen Glucan handelt es sich um ein Polysaccharid aus Glucoseeinheiten, die hauptsächlich durch α -1,4-Bindungen, auf welche die α -Amylase einwirken kann, miteinander verbunden sind. Beispiele derartiger Poly saccharide sind Stärke, Amylopectin, Amylose, Glycogen und/ oder Dextrin.

Stärke wird als Glucan für die vorliegenden Zwecke be vorzugt, da es die beste Kombination hinsichtlich Löslich keit, niedriger Kosten, Rückgewinnung und Stabilität bietet.

Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Stärke SL 500 ist eine handelsübliche modifizierte Amylose. Diese Stärke besitzt gute Kaltwasserlöslichkeit, zeigt ein besseres Ansprechverhalten und höhere Linearität als andere Stärken, ergibt eine gute Reproduzierbarkeit und ist in Lösung trübungsfrei. SL 500 ist ein weißes, körniges Material mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10%, einem pH-Wert 7 und einer Film-Zugfestigkeit von mehr als 55,23 N/mm². Die Viskosität von SL 500 bei 66°C beträgt 18,5 mPa · s für 14% Feststoffgehalt, 5,5 mPa · s für 10% Feststoffgehalt und 1,0 mPa · s für 5% Feststoffgehalt. Bei 24°C beträgt die Viskosität 200 mPa · s für 14% Feststoffgehalt, 27,5 mPa · s für 10% Feststoffgehalt und 3,0 mPa · s für 5% Feststoff gehalt. SL 500 ist in Wasser bei Zimmertemperatur leicht löslich, im Gegensatz zu den meisten Stärken, welche eini ges Umrühren und/oder Erwärmen benötigen, bevor sie in Lö sung gehen. SL 500 wird aus der modifizierten Amylose fraktion von Kartoffelstärke hergestellt und enthält keinen nennenswerten Anteil der Amylopectinfraktion von Stärke.

GR-Stärke ist eine andere handelsübliche Stärke, die sich zur Verwendung gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eignet. Diese Stärke wird vor der Anwendung dialysiert und besitzt die folgenden Eigenschaften: maximale Sulfatasche von 7 Gew.-%; 10% Gewichtsverlust beim Trocknen; 1 g GR-Stärke besitzt ein Reduktionsvermö gen äquivalent 7 mg Maltose; pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5, sowie günstige Werte im Empfindlichkeitstest.

Für die Zwecke der Erfindung ist es erforderlich, daß die α -Amylasemenge geschwindigkeitsbestimmend ist. Daher sollen die anderen Bestandteile des Reagenssystems gemäß der Erfindung in solchen Mengen vorliegen, daß gewährlei stet ist, daß die für das gesamte Analysesystem beobach tete und gemessene Reaktionsgeschwindigkeit charakteri stisch für die Geschwindigkeit der durch die α -Amylase katalysierten Reaktion (Reaktion [i]) ist und durch diese bestimmt wird. Für die Analyse wäßriger Lösungen von menschlichem Blut oder Urin ist eine Konzentration im Be reich von 1,0 bis 20 g eines α -1,4-gebundenen Glucans pro Liter Reagens vorzuziehen. Eine Glucankon zentration von etwa 5 g pro Liter Reagens wird für die be vorzugte Ausführungsform verwendet.

Die bei der ersten Reaktion (i) gebildete α -Maltose wird mit Phosphationen zur Reaktion gebracht unter Verwendung von Maltose-Phosphorylase als enzymatischer Katalysator zur Erzeugung von Glucose und β -D-Glucose-1-phosphat.

Die Phosphationen werden dabei aus einer mit dem erfin dungsgemäßen Reagenssystem kompatiblen Quelle zugeführt. Beispiele einer derartigen geeigneten Quelle sind anorga nische Phosphate. Die gemäß der bevorzugten Ausführungs form der Erfindung verwendete Phosphatkomponente ist ein Gemisch aus K₂HPO₄ und KH₂PO₄; dieses bildet bei einem pH- Wert von etwa 6,5 eine gepufferte Lösung als Optimum.

Die Konzentration der Phosphationen soll einen Wert be sitzen, der gewährleistet, daß α -Amylase die geschwin digkeitsbestimmende Verbindung ist. Jedoch ist eine zu hohe Konzentration von Phosphationen unerwünscht, da sehr hohe Konzentrationen die Aktivität des β -PGM-Enzyms in hibieren können. Vorzuziehen ist eine 0,01 bis 0,1 molare Konzentration an anorganischem Phosphat; eine Konzentration von etwa 0,025 molar ist für die Analyse von Serum der vorteilhafteste Wert.

Maltosephosphorylase ist ein die Reaktion von α -Maltose und anorganischem Phosphat katalysierendes Enzym. We nigstens 200 Internationale Einheiten (IU) dieses Enzyms pro Liter Reagens sind erforderlich, der bevorzugte Wert ist etwa 2000 IU pro Liter.

Die bevorzugte Quelle für Maltose-Phosphorylase ist ein Stamm des Mikroorganismus Lactobacillus brevis (ATCC8287); dieser Mikroorganismus wurde von der Firma Beckman Instruments, Inc., Microbics Operations in Carlsbad, California, gezüchtet und hieraus das Enzym nach herkömm lichen Methoden extrahiert und gereinigt. Anderweitige Quellen für dieses Enzym sind Stämme von Neisseria meningitides, Neisseria perflava, sowie andere Lacto bacilli-Stämme.

Das Enzym β -Phosphoglucomutase (β -PGM) katalysiert die Umwandlung von β -D-Glucose-1-phosphat in Glucose-6- phosphat. β -Phosphoglucomutase soll in einer Menge von wenigstens 100 IU pro Liter Reagens vorliegen, so daß α -Amylase in Reaktion (i) der geschwindigkeitsbestimmende Bestandteil bleibt. Zur Analyse von α -Amylase in menschli chem Serum ist eine Anwendung von etwa 500 IU β -PGM pro Liter Reagens vorzuziehen. Die bevorzugte Quelle für β - PGM ist Lactobacillus brevis (ATCC8287). Die Züchtung und Reinigung dieses Mikroorganismus erfolgt nach herkömmli chen Verfahren der Enzymreinigung. Weitere Quellen sind Stämme von Neisseria meningitides, Neisseria perflava und Euglena gracilis.

Ferner muß Glucose-1,6-diphosphat (Glu-1,6-diP) in dem Enzymsystem vorliegen, zur Wirkung als Cofaktor bzw. Hilfsstoff für β -PGM. β -PGM verlangt zur Wirksamkeit die β - Form von Glu-1,6-diP, es darf jedoch angenommen werden, daß auch die α -Form dieses Cofaktors wirksam ist. Die be vorzugte Konzentration von Glu-1,6-diP soll wenigstens etwa 0,01 g Liter Reagens betragen. Die optimale Kon zentration beträgt etwa 0,075 g pro Liter.

Des weiteren müssen auch zweiwertige Kat ionen aus der Gruppe Mn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Zn²⁺ und Ni²⁺ in dem Enzymsystem vorliegen als Cofaktor für β -PGM. Die Kationen Mn²⁺, Mg²⁺ oder Co²⁺ sind dabei gegenüber Zn²⁺ oder Ni²⁺ vorzuziehen. Die Kationenkonzentration sollte wenigstens etwa 1 mMol pro Liter Reagens betragen, vor zugsweise ist sie 8,4 mMol pro Liter.

Das Glucose-6-phosphat wird mit β -Nicotinamid-adenin dinucleotid und G6PDH zur Reaktion gebracht zur Bildung von 6-Phosphogluconat und NADH.

Die Menge NAD sollte dabei genügend groß sein, so daß α -Amylase der geschwindigkeitsbestimmende Bestandteil bleibt. Etwa 1 bis etwa 10 mMol pro Liter Reagens ist ein geeigneter Bereich für die NAD-Konzentration. Die be vorzugte NAD-Konzentration beträgt etwa 2,5 mMol. Anstelle von NAD kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch β -Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat (NADP) verwendet werden.

Die Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) soll eben falls in einer Konzentration von wenigstens etwa 500 IU pro Liter Reagens vorliegen, damit diese Reaktion nicht geschwindigkeitsbestimmend wird. Die bevorzugte Konzen tration des G-6-PDH-Enzyms beträgt etwa 5000 IU pro Liter Reagens. Die bevorzugte Quelle für G-6-PDH ist Leuconostoc mesenteroides (ATCC 12291), jedoch kann es auch aus ander weitigen Quellen erhalten werden.

Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Anwendung einer fünften Reaktion als Teil des Analyse verfahrens erwünscht:

Zweck dieser fünften Reaktion ist eine Erhöhung der Emp findlichkeit und Genauigkeit der Analyse durch Erhöhung der erzeugten NADH-Menge.

Die Mindestkonzentration von 6-PDH soll wenigstens etwa 200 Internationale Einheiten (IU) pro Liter Reagens be tragen. Die optimale 6-PDH-Konzentration ist etwa 700 IU pro Liter. Die bevorzugte Quelle für dieses Enzym ist Leuconostoc mesenteroides (ATCC 12291), aus welchem das Enzym nach herkömmlichen bekannten Methoden gezüchtet und gereinigt wurde; jedoch kann es auch aus anderen Quellen erhalten werden.

Zur Erhöhung der Aktivität der α -Amylase kann dem Reagens system Natriumchlorid zugesetzt werden.

Zur Einstellung des optimalen pH-Wertes für die Durchfüh rung der Reaktionssequenz können Puffer, wie insbesondere sekundäres und primäres Kaliumphosphat (K₂HPO₄ bzw. KH₂PO₄), verwendet werden. Auch Nicht-Phosphatpuffer können angewandt werden, sind jedoch weniger vorteilhaft, da Phosphatpuffer gleichzeitig eine Quelle für Phosphationen darstellen. Beispiele anderweitiger Puffer, die untersucht wurden und sich als zufriedenstellend erwiesen haben, sind Piperazin-N,N′-bis (2-ethansulfonsäure), Tris(hydroxy methyl)-aminomethan, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2- ethansulfonsäure, sowie Triethanolamin. Beispiele ander weitiger, ebenfalls zufriedenstellender Puffer sind N-(2- Acetamido)iminodiessigsäure, N-(2-Acetamido)-2-aminoethan sulfonsäure, sowie N,N′-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethan sulfonsäure.

Die Geschwindigkeit der NADH-Erzeugung und die Umwandlung dieser Geschwindigkeit in ein Maß für die Konzentration von α -Amylase erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Eine derartige Methode verwendet spektralphotometrische Vorrichtungen zur Messung der Änderung des Lichtabsorp tionsvermögen infolge der NADH-Bildung bei Wellenlängen im Bereich von 300 bis 370 mµm (nm) bei einer Temperatur im Bereich von 15°C bis 50°C. Die Vorzugswerte sind eine Wellenlänge von etwa 340 nm bei etwa 37°C.

Nachdem das Ausmaß bzw. die Geschwindigkeit der Änderung des Absorptionsvermögens gemessen wurde, kann die Konzen tration der α -Amylase nach der folgenden Gleichung be rechnet werden, in welcher die Änderung des Absorptions vermögens bei einer Wellenlänge von 340 nm und einer Tem peratur von 37°C gemessen wurde.

Δ A= Änderung des Absorptionsvermögens/Minute V_t= Gesamt-Reaktionsvolumen V_s= das die α -Amylase enthaltende Probenvolumen 6,22= millimolarer Absorptionsindex von NADH bei 340 nm.

Beispiel Ansatz des Analysengemisches für α -Amylase

Im folgenden wird die Zusammensetzung des Reagens gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung angegeben, und zwar als 1-Liter-Lösung in entionisiertem Wasser:

Stärke SL 5005,00 g sekundäres Kaliumphosphat2,65 g primäres Kaliumphosphat1,33 g Maltosephosphorylase2000 IU b -Phosphoglucomutase500 IU NAD · 4 H₂O1,8 g Glucose-6-phosphat-dehydrogenase5000 IU 6-Phosphogluconat-dehydrogenase700 IU MgCl₂ · 6 H₂O1,7 g Natriumchlorid0,5 g G-1,6-diP0,075 g

Der pH-Wert wird auf 6,0 bis 7,5, vorzugsweise 6,5, einge stellt.

Das erfindungsgemäße Reagenssystem kann als wäßrige Lösung gelagert und verwendet werden, alternativ kann die Lösung auch in herkömmlicher Weise gefriergetrocknet und zur Gebrauchsfertigkeit mit Wasser rekonstituiert werden. Das Reagenssystem kann auch mit den angegebenen Bestand teilen in Pulverform hergestellt werden und zur Gebrauchs fertigkeit in Wasser gelöst werden.

Claims

1. Verfahren zur kinetischen Bestimmung von α -Amylase in wäßriger Lösung durch Umsetzung eines Polysaccharids aus Glucoseeinheiten, die hauptsächlich durch α -1,4-Bin dungen miteinander verbunden sind, mit der die α -Amylase enthaltenden Probe und Messung der bei der enzymatischen Reaktion entstehenden Abbauprodukte, gekennzeichnet durch die folgende Kombi nation von Verfahrensmaßnahmen, die bei pH 6 bis 7,5 durchgeführt werden:

(i) Umsetzung des Polysaccharids in Gegenwart der die a -Amylase enthaltenden Probe unter Bildung von α -Maltose,
(ii) Umsetzung der gebildeten α -Maltose mit Phosphatio nen in Gegenwart von Maltosephosphorylase unter Bildung von Glucose und β -D-Glucose-1-phosphat,
(iii) Umsetzung des gebildeten β -D-Glucose-1-phosphats in Gegenwart von b -D-Phosphoglucomutase und Glu cose-1,6-diphosphat sowie von Mn²⁺-, Mg²⁺-, Co²⁺-, Zn²⁺- oder/und Ni²⁺-Ionen unter Bildung von Glucose-6-phosphat,
(iv) Umsetzung des gebildeten Glucose-6-phosphats in Gegenwart von Glucose-6-phosphatdehydrogenase und des Coenzyms β -Nicotinamid-adenindinucleotid und/ oder b -Nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat un ter Bildung der reduzierten Form des Coenzyms und von 6-Phosphogluconat und
(v) Messung der Geschwindigkeit der Bildung des reduzier ten Coenzyms in an sich bekannter Weise unter Bedin gungen, unter denen die zu bestimmende α -Amylase ge schwindigkeitsbestimmend ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß in der Stufe (iv) 6-Phosphogluconat in Gegenwart des Coenzyms und von 6-Phosphogluconat-dehydrogenase umge setzt wird unter Bildung der reduzierten Form des Coenzyms und von Ribulose-5-phosphat.

3. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ent hält

(a) ein Polysaccharid aus Glucoseeinheiten, die hauptsäch lich durch α -1,4-Bindungen miteinander verbunden sind,
(b) Phosphationen,
(c) Maltosephosphorylase,
(d) das Coenzym β -Nicotinamid-adenindinucleotid und/oder β -Nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat,
(e) Glucose-6-phosphat-dehydrogenase,
(f) β -D-Phosphoglucomutase,
(g) Glucose-1,6-diphosphat,
(h) Mn²⁺-, Mg²⁺-, Co²⁺-, Zn²⁺- oder/und Ni²⁺-Ionen
(i) sowie gegebenenfalls 6-Phosphogluconat-dehydrogenase,

wobei die Komponenten (a) bis (i) in solchen Mengen vor liegen, daß die zu bestimmende α -Amylase geschwindigkeits bestimmend ist.