DE4306278C2 - Verfahren zur quantitativen Analyse von 1,5-Anhydroglucitol - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol (im folgenden als "1,5-AG" bezeichnet), das als Indikator zur Diabetesdiagnose dienen kann, auf einfache und schnelle Weise. Dieses Verfahren ist auch in einer automatisierten Analysenvorrichtung anwendbar.

1,5-AG ist eine Verbindung, die in der Cerebrospinalflüssigkeit und dem Plasma von Menschen vorkommt. Es wurde berichtet, daß seine Menge in Plasmen, die von Patienten mit bestimmten Krankheiten, insbesondere Diabetes, entnommen wurden, deutlich verringert ist (Yasuo Akanuma, Kazuyuki Tobe: Journal of Japanese Internal Medicine Association, 80, 1198-1204, 1991). Man geht daher davon aus, daß 1,5-AG eine Markersubstanz zur Diabetesdiagnose ist.

Als Bestimmungsverfahren für 1,5-AG ist bisher ein auf Gaschromatografie beruhendes Verfahren bekannt (Yoshioka, Diabetes, 25, 1115-1118, 1982; im folgenden als "GC- Verfahren" bezeichnet) ebenso wie Verfahren unter Verwendung von Enzymen (im folgenden als "enzymatische Verfahren" bezeichnet), wie beispielsweise von Pyranoseoxidase (im folgenden als "PROD" abgekürzt) oder L-Sorboseoxidase (JP-OS 63-185397).

Serum oder Plasma, das dem Diabetespatienten entnommen wird, ist im wesentlichen die auf 1,5-AG zu untersuchende Probe. Im Blut eines Diabetespatienten ist die Glucosekonzentration höher als im Blut eines gesunden Menschen. Im Blut eines gesunden Menschen liegt die Glucosekonzentration im Bereich von etwa 60 bis 100 mg/dl, wohingegen im Blut eines Diabetespatienten die Glucosekonzentration weit verteilt in einem Bereich von 100 bis 1000 mg/dl liegt. Andererseits liegt die Konzentration von 1,5-AG im Blut eines gesunden Menschen im Bereich von 1,64 bis 2,68 mg/dl; hingegen ist sie beim Diabetespatienten mit Werten von 0,18 bis 0,21 mg/dl äußerst niedrig (Japanese Clinic, 47, 1989, Extraausgabe, Immunological Inspection in Blood and Urinary Chemical Test over Wide Range; Band 1, 439-442, Kawai). Daher beträgt die 1,5-AG-Konzentration im Blut eines Diabetespatienten etwa 1/470 oder weniger der Glucosekonzentration. Darüber hinaus ist Glucose strukturell 1,5-AG ähnlich, so daß es unmöglich ist, ein selektives Bestimmungsverfahren in Gegenwart von 1,5-AG und Glucose nach dem derzeitigen technischen Entwicklungsstand durchzuführen. Daher ist es ein wesentliches Erfordernis, die Glucose selektiv zu entfernen oder die Probe vorzubehandeln, indem sie geeignet modifiziert wird.

Beim GC-Verfahren erfordert die Vorbehandlung die Entfernung von Glucose und Markierung von 1,5-AG, was das Verfahren kompliziert macht und eine lange Analysendauer mit sich bringt. Aus diesen Gründen ist es schwierig, eine große Anzahl Proben nach dem GC-Verfahren zu untersuchen. Infolgedessen bestehen Probleme bei der Anwendung dieses Verfahrens in der klinischen Analytik.

Beim enzymatischen Verfahren wird die Vorbehandlung durchgeführt, indem man Glucose unter Verwendung einer Ionenaustauschersäule entfernt oder indem man Glucose durch Phosphorylierung modifiziert. Das enzymatische Verfahren ist mit reichlich komplizierten Trennschritten verbunden, wenn Glucose unter Verwendung einer Ionenaustauschersäule entfernt wird. Bezüglich der Glucosemodifizierung durch Phosphorylierung sind die optimalen Reaktionsbedingungen zur Phosphorylierung, einschließlich unterschiedlicher pH-Optima, verschieden von den optimalen Reaktionsbedingungen für einen quantitativen Assay von 1,5-AG. Daher müssen Phosphorylierung und 1,5-AG-Assay unter jeweils verschiedenen Reaktionsbedingungen ausgeführt werden. Darüber hinaus hat Adenosin-5'-triphosphat (im folgenden als ATP bezeichnet), das zur Phosphorylierung verwendet wird, eine inhibitorische Wirkung auf PROD. Hinsichtlich der Konzentration besteht eine Begrenzung bei der Zugabe von ATP zum Untersuchungssystem zur Beschleunigung der Phosphorylierung, und daher war es schwierig, die Phosphorylierung schnell zu beenden. Jedenfalls ist es unmöglich, eine quantitative Bestimmung (Assay) nach den Verfahren des Standes der Technik schnell durchzuführen. Insbesondere ist auch keines der Verfahren dem Standes der Technik zu einer Anwendung in einer automatisierten Analysenvorrichtung gekommen, wie sie weithin für verschiedene klinische Tests verwendet wird.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die vorhergehenden Nachteile der Verfahren des Standes der Technik zur Bestimmung von 1,5-AG in einer oben beschriebenen Probe zu vermeiden und ein Verfahren zur quantitativen Analyse von 1,5-AG auf einfache und schnelle Weise zur Verfügung zu stellen, ohne daß Trennverfahren, wie Filtration, Zentrifugation, Adsorption usw., erforderlich sind.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Analyseverfahren für 1,5-AG unter Verwendung einer automatisierten Analysenvorrichtung zur Verfügung zu stellen.

Um die vorhergehenden Probleme zu lösen, haben die Erfinder ausgedehnte Untersuchungen unternommen und fanden als Ergebnis, daß die inhibitorische Wirkung von ATP auf PROD in Abhängigkeit vom pH-Wert variiert, und daß PROD durch ATP bei einem pH-Wert im Bereich von 7,2 bis 8,5 kaum inhibiert wird und eine gute Reaktivität bezüglich 1,5-AG zeigt. Daher können durch Anwendung eines Verfahrens, bei dem PROD auf 1,5-AG im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 einwirkt, von 1,5-AG verschiedene Zucker in einer Probe durch Phosphorylierung mit Hexokinase und ATP entfernt werden, und in diesem Fall kann die Phosphorylierung unter Verwendung eines Überschusses von ATP durchgeführt werden, wobei die Reaktion von 1,5-AG mit PROD im Anschluß an die Phosphorylierung durchgeführt werden kann. Somit gelang es, einen 1,5-AG-Assay unter Verwendung einer automatisierten Analysenvorrichtung zu realisieren. Die vorliegende Erfindung wurde so erreicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher das Zurverfügungstellen eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol in einem Spezimen aus menschlichem Blut, menschlichem Blutserum oder menschlichem Blutplasma unter Verwendung einer Pyranoseoxidase, umfassend:

• (a) enzymatische Phosphorylierung mit Hexokinase von anderen Zuckern als 1,5-Anhydroglucitol, insbesondere Glucose, unter Verwendung von ATP in Lösung,
• (b) Umsetzen von 1,5-Anhydroglucitol mit einer Pyranoseoxidase und quantitative Bestimmung des hierbei gebildeten Wasserstoffperoxids,
  dadurch gekennzeichnet, daß
  • - in Schritt (a) ATP in einer molaren Überschußmenge von 100 bis 500 mM zugegeben wird,
  • - die Reaktionslösung aus Schritt (a) als solche in Schritt (b) verwendet wird, und
  • - Schritt (b) bei einem pH von 7,2 bis 8,5 in Gegenwart der Überschußmenge von ATP durchgeführt wird,
    und eine Pyranoseoxidase aus einem Mikroorganismus der Gattung Polyporus, Coriolus, Pycnoporus, Daedaleopsis, Pleurotus, Gloeophyllum, Irpex, Auricularia, Coprinus und Trametes verwendet wird.

Fig. 1 zeigt das pH-Optimum von PROD für 1,5-AG in einer Good-Pufferlösung;

Fig. 2 zeigt die Veränderung der PROD-Inhibierung durch ATP in Abhängigkeit vom pH-Wert;

Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf für eine Bestimmungsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung;

Fig. 4 zeigt eine Eichkurve von 1,5-AG und zeigt auch die Fähigkeit des Reaktionssystems zur Entfernung von Glucose;

Fig. 5 zeigt die Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem Enzymsäulenverfahren.

Im folgenden wird die vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.

Der Begriff "Probe" in der vorliegenden Erfindung wird so verwendet, daß er eine beliebige Probe bedeuten kann. Beispiele solcher Proben schließen Blut, Plasma usw. ein. Es besteht keine besondere Beschränkung bezüglich der verwendeten PROD, solange die PROD als EC 1.1.3.10 gemäß der IUPAC-IUB-Nomenklatur klassifiziert ist und aus den nachfolgend genannten Stämmen von Mikroorganismen abgeleitet ist.

Typische Beispiele von solchen PROD schließen ein: PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zu den Gattungen Polyporus gehören, vertreten durch Polyporus obtusus ATCC 26733, der in der JP-OS 61-239886 beschrieben ist; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Coriolus gehören, vertreten durch Coriolus versicolor IFO 4937, der in der JP-OS 58-43785 beschrieben ist; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung pycnoporus gehören, vertreten durch Pycnoporus coccineus IFO 4923, der in der JP-OS 62-79280 beschrieben ist; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Daedaleopsis gehören, vertreten durch Daedaleopsis styracina IFO 4910, der in der JP-OS 58-43785 beschrieben ist; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Pleurotus gehören, vertreten durch Pleurotus ostreatus Z-64 (NRRL 12507); PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Gloeophyllum gehören, vertreten durch Gloephyllum sepiarium Z-41 (NRRL 12506); PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Irpex gehören, vertreten durch Irpex lacteus ATCC 20123, der in der JP-OS 61-177986 beschrieben ist; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Pycnoporus gehören, vertreten durch Pycnoporus coccineus IFO 4923; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Auricularia gehören, vertreten durch Auricularia polytricha Z-229 (FERM P-7119); PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Coprinus gehören, vertreten durch Coprinus micaceus ATCC 20122; PROD, abgeleitet aus Stämmen von Mikroorganismen, die zur Gattung Trametes gehören, vertreten durch Trametes cinnabarinus IFO 6139.

Von diesen Enzymen werden PROD bevorzugt, die aus den Stämmen von Mikroorganismen abgeleitet sind, die zur Gattung Polyporus gehören, wie Polyporus obtusus ATCC 26733.

In der vorliegenden Erfindung wirkt PROD auf 1,5-AG im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 ein. Ein besonders bevorzugter pH-Bereich liegt zwischen 7,5 und 8,0. Durch Anwendung eines Verfahrens, worin 1,5-AG mit PROD in einem solchen pH-Bereich umgesetzt wird, wird PROD durch ATP kaum inhibiert, sondern zeigt eine gute Reaktivität mit 1,5-AG.

Erfindungsgemäß können daher von 1,5-AG verschiedene Zucker, die in einer Probe vorliegen, selektiv in einem äußerst kurzen Zeitraum entfernt werden, indem man sie unter Verwendung von Hexokinase und einer Überschußmenge ATP in solcher Weise phosphoryliert, daß 1,5-AG in der Probe verbleibt und daß PROD mit 1,5-AG in der resultierenden Proben so wie sie ist, umgesetzt werden kann, wodurch 1,5-AG in der Probe quantitativ bestimmt werden kann.

Als von 1,5-AG verschiedene Zucker in einer Probe wird hauptsächlich auf Glucose Bezug genommen, doch schließen diese Zucker auch andere Zucker ein, die durch Hexokinase phosphoryliert werden.

Als Hexokinase, die zur Phosphorylierung von von 1,5-AG verschiedenen Zuckern, die in einer Probe vorliegen, verwendet wird, einschließlich der Umwandlung von Glucose zu Glucose-6-phosphat, wird bevorzugt eine Hexokinase verwendet, die als EC 2.7.1.1 gemäß der Klassifizierung, wie definiert durch die International Biochemical Association, klassifiziert ist. Bei dieser Umwandlung werden ATP und Magnesiumionen zusammen mit dem Enzym verwendet. Als Quellen für Magnesiumionen können Salze organischer Säuren verwendet werden, wie Magnesiumfettsäuresalze, Magnesiumacetat usw., und Salze anorganischer Säuren, wie Halogenide, Sulfate, Nitrate, Phosphate, usw. Unter diesen sind Acetate und Hydrochloride bevorzugt.

Der Begriff "eine Überschußmenge an ATP", die in der oben beschriebenen Phosphorylierung verwendet wird, bedeutet eine ATP-Menge, die im allgemeinen im Bereich von 2,5 oder mehr mal der Menge in Molen, vorzugsweise 2,5 bis 2500 mal der Menge in Molen, besonders bevorzugt 10 bis 1000 mal der Menge in Molen, der Glucosemenge, von der man annimmt, daß sie in einer Probe enthalten ist, liegt. In der Praxis wird ATP gewöhnlich in einem Untersuchungssystem in einer Menge von 100 bis 500 mmol/l eingesetzt.

Bevorzugte Mengen an Hexokinase, ATP und Magnesiumionen, die tatsächlich bei der oben beschriebenen Reaktion verwendet werden, liegen im Bereich von 5 bis 100 U/ml Hexokinase, 100 bis 500 mmol/l ATP und 5 bis 50 mmol/l Magnesiumionen.

Ein bevorzugter pH-Bereich für die Phosphorylierung liegt zwischen 7,2 und 8,5 (inklusive) wie bei der Reaktion von 1,5-AG mit PROD, wobei ein besonders bevorzugter Bereich zwischen 7,5 und 8,0 liegt.

In der vorliegenden Erfindung erfolgt die Phosphorylierung unter Verwendung einer Überschußmenge von ATP, gefolgt von enzymatischer Reaktion von 1,5-AG in einer Probe mit PROD im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, so wie sie ist, ohne ATP zu entfernen. Diese enzymatische Reaktion wird im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5 durchgeführt, so daß PROD nicht durch ATP, das in der Probe verblieben ist, inhibiert wird, sondern eine gute Reaktivität zu 1,5-AG zeigt. Erfindungsgemäß können daher die Phosphorylierung und die enzymatische Reaktion kontinuierlich in einem kurzen Zeitraum durchgeführt werden.

Nachdem die Zucker selektiv entfernt worden sind, wird das in einer Probe verbliebene 1,5-AG durch die Einwirkung von PROD auf 1,5-AG bestimmt. Durch Umsetzung von PROD mit 1,5-AG wird Wasserstoffperoxid erzeugt. Das Wasserstoffperoxid läßt man auf ein bekanntes Peroxidasesubstrat, wie 2,2'-Azinobis-(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure), o-Phenylendiamin, 5-Aminosalicylsäure, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, eine Kombination von 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2- hydroxysulfopropyl)-m-toluidin einwirken, wobei man ein Enzym verwendet, das als EC 1.11.1.7 gemäß der Klassifikation durch die International Biochemical Association klassifiziert ist. Die Absorption des so vom Substrat erzeugten Farbstoffs wird gemessen.

Die Peroxidase, die zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet wird, ist vorzugsweise Meerrettichperoxidase. Als das Substrat, das zur Herstellung des Farbstoffs zur Messung der Absorption verwendet wird, ist die Kombination von 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)­ m-toluidin bevorzugt. Wenn die Kombination von 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m­ toluidin verwendet wird, liegt die Wellenlänge bei der Absorptionsmessung im Bereich von 500 bis 800 nm. Innerhalb dieses Bereichs können auch zwei oder mehr Wellenlängen zur Messung verwendet werden.

Bevorzugte Mengen an PROD, Peroxidase, 4-Aminoantipyrin und N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin, die in der oben beschriebenen Reaktion verwendet werden, liegen jeweils in den folgenden Bereichen: 5 bis 500 U/ml PROD, 2 bis 20 U/ml Peroxidase, 0,1 bis 10 mmol/l 4-Aminoantipyrin und 0,1 bis 10 mmol/l N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m­ toluidin.

Während der Reaktionen zur Bestimmung von 1,5-AG in einer Probe wird die Reaktionstemperatur zwischen 5 und 40°C, vorzugsweise zwischen 25 und 40°C, gehalten. Die Reaktionszeit beträgt 2 bis 60 Minuten, vorzugsweise 2 bis 30 Minuten. Während des Verlaufs der Herstellung der Reaktionslösung läuft die Reaktion als Ganzes bei einem pH von 7,2 bis 8,5, vorzugsweise 7,5 bis 8,0, ab. Daher werden zur Stabilisierung der Reaktionslösungen der Reagentien im pH-Bereich von 7,2 bis 8,5, vorzugsweise 7,5 bis 8,0, Phosphatpuffer, Tris-Hydrochlorid-Puffer, PIPES- Puffer, HEPES-Puffer, usw. als Pufferlösungen verwendet. Wenn HEPES-Puffer verwendet wird, wird seine Konzentration bevorzugt im Bereich von 50 bis 500 mmol/l gehalten. Zur Kontrolle der Ionenstärke können halogenierte Alkalimetallsalze, vorzugsweise Natriumchlorid, usw., verwendet werden.

Wo 1,5-AG gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wird, können die oben beschriebenen, jeweiligen Komponenten in eine Lösung gegeben werden; alternativ dazu können die jeweiligen Komponenten auch in geeigneter Kombination verwendet werden. Diese Komponenten können entweder in gelöster Form oder gefriergetrocknet vorliegen. Wenn beabsichtigt ist, sie während eines langen Zeitraums aufzubewahren, können die Komponenten vorzugsweise gefriergetrocknet sein. Es ist auch möglich, ein Tensid in einem solchen Konzentrationsbereich zuzusetzen, daß die Bestimmungsreaktion nicht inhibiert wird. Im Fall, daß das Meßsystem lyophilisiert wird, kann ein Stabilisator in geeigneter Menge zugegeben werden.

In der vorliegenden Erfindung können die Phosphorylierung, die enzymatische Reaktion und die daran anschließende Farbbildungsreaktion, durch welche die Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid gemessen wird, unter Verwendung eines automatisierten Analysengeräts ausgeführt werden.

Das automatisierte Analysengerät oder die -vorrichtung, wie sie in der vorliegenden Erfindung kollektiv bezeichnet werden, wird beispielsweise vergegenständlicht durch Modell 7050, Modell 705, Modell 736 und Modell 7150 des Herstellers Hitachi Ltd.; Geräte, die im Handel von Toshiba Co., Ltd., Hoffmann La Roche Co., Ltd., Bacster Co., Ltd., usw., erhältlich sind. Das automatisierte Analysengerät ist nicht auf diese speziellen Vorrichtungen beschränkt, sondern beliebige dazu gleichwertige Geräte sind in der vorliegenden Erfindung verwendbar.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung in größerer Ausführlichkeit unter Bezug auf Beispiele beschrieben, wodurch sie jedoch nicht beschränkt werden soll.

BEISPIEL 1 pH-Optimum von PROD bezüglich 1,5-AG

Das pH-Optimum von PROD, erhalten aus Polyporus obtusus ATCC 26733, bezüglich 1,5-AG wurde bestimmt. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt. Die Reaktionsbedingungen zur Bestimmung waren wie folgt:

Nachdem 280 µl des ersten Reagens mit nachstehender Zusammensetzung und 70 µl des zweiten Reagens mit nachstehender Zusammensetzung zu 10 µl einer 1000 U/l PROD-Lösung zugegeben worden waren, wurde die Reaktion ausgeführt. Die Absorptionsänderung wurde bei zwischen 30 und 40 Meßpunkten bei einer Hauptwellenlänge von 546 nm und einer Nebenwellenlänge von 700 nm mitverfolgt, wobei ein automatisiertes Analysengerät, Hitachi Modell 7150, nach der Funktionsweise des Analysengeräts verwendet wurde. Die relative Aktivität wird gezeigt, bezogen auf die maximale Absorptionsänderung (als der pH 7,0 betrug), die zu 100% gesetzt wurde.

Wie in Fig. 1 gezeigt, zeigt PROD die höchste Aktivität bezüglich 1,5-AG in Good-Pufferlösung, wie MES, PIPES und HEPES, im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5.

ERSTES REAGENS

AL=L<Erstes Reagens im pH-Bereich von 5,5 bis 6,5:
MES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l

AL=L<Erstes Reagens im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5:
PIPES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l

AL=L<Erstes Reagens im pH-Bereich von 7,5 bis 8,5:
HEPES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l

ZWEITES REAGENS

4-Aminoantipyrin	4 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
1,5-AG	100 mmol/l
Puffer	keiner

BEISPIEL 2 Veränderung der PROD-Inhibierung durch ATP in Abhängigkeit vom pH

Der Reaktionsgrad von PROD, abgeleitet aus Polyporus obtusus ATCC 26733 mit 1,5-AG, der von ATP beeinflußt wird, wurde in Good-Puffer im pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 untersucht.

Nachdem 280 µl des ersten Reagens mit der nachstehenden Zusammensetzung und 70 µl des zweiten Reagens mit der nachstehenden Zusammensetzung zu 10 µl einer 1000 U/l PROD-Lösung zugegeben worden waren, wurde die Reaktion durchgeführt. Die Veränderung der Absorption wurde bei zwischen 30 und 40 Meßpunkten bei einer Hauptwellenlänge von 546 nm und einer Nebenwellenlänge von 700 nm mitverfolgt, wobei ein automatisches Analysengerät, Hitachi Modell 7150, nach der Funktionsweise des Analysengeräts verwendet wurde.

Der Inhibierungsgrad durch ATP wird ausgedrückt durch die PROD-Aktivität als relative Aktivität, wobei ATP beim selben pH vorlag, und wobei diejenige PROD-Aktivität zu 100% gesetzt wurde, bei der ATP unter der Bedingung, daß 100 mmol/l ATP frisch zum Puffer des jeweiligen pH zugegeben wurden, nicht mehr vorlag. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Fig. 2 gezeigt.

Wie in Fig. 2 gezeigt, wurde PROD bei einem pH von 7 oder darunter stark durch ATP beeinflußt, doch der Inhibitionsgrad war bei einem pH von 7,5 oder darüber deutlich verringert.

Aus den in Fig. 1 und 2 gezeigten Ergebnissen ist offensichtlich, daß PROD kaum durch ATP in einem pH-Bereich von 7,5 bis 8,0 beeinflußt wird, sondern eine gute Reaktivität zu 1,5-AG zeigt.

ERSTES REAGENS

AL=L<Erstes Reagens im pH-Bereich von 5,5 bis 6,5:
MES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l
ATP	0 mmol/l
oder 100 mmol/l

AL=L<Erstes Reagens im pH-Bereich von 6,5 bis 7,5:
PIPES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l
ATP	0 mmol/l
oder 100 mmol/l

AL=L<Erstes Reagens im pH-Bereich von 7,5 bis 8,5:
HEPES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l
ATP	0 mmol/l
oder 100 mml/l

ZWEITES REAGENS

4-Aminoantipyrin	4 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
1,5-AG	100 mmol/l
Puffer	keiner

BEISPIEL 3 Zeitlicher Verlauf der Meßreaktion in der vorliegenden Erfindung

Physiologische Kochsalzlösung als Blindprobe, 5 mg/dl einer wäßrigen 1,5-AG-Lösung und menschliches Serum wurden als Proben verwendet. Die jeweilige Probe wurde mit dem ersten und zweiten Reagens mit nachstehenden Zusammensetzungen umgesetzt, wobei der zeitliche Reaktionsverlauf gemessen wurde. Die Ergebnisse werden in Fig. 3 gezeigt.

Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 7 µl Probe, 280 µl des ersten Reagens und 70 µl des zweiten Reagens wurden verwendet, und die Bestimmung wurde bei 2 Punkten bei einer Hauptwellenlänge von 546 nm und einer Nebenwellenlänge von 700 nm durchgeführt, wobei ein automatisiertes Analysengerät, Hitachi Modell 7150, verwendet wurde. Die Meßreaktion war in fast 5 Minuten beendet.

ERSTES REAGENS

HEPES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
Magnesiumacetat	10 mmol/l
N-Ethyl-N-(2-hydroxysulfopropyl)-m-toluidin	1 mmol/l
Peroxidase	5 KU/l
Hexokinase	20 KU/l
ATP	100 mmol/l
pH	7,5

ZWEITES REAGENS

HEPES	200 mmol/l
Natriumchlorid	150 mmol/l
4-Aminoantipyrin	4 mmol/l
PROD	62,5 KU/l
pH	7,5

BEISPIEL 4 Eichkurve von 1,5-AG und Entfernung von Glucose in einer Probe

Unter den Meßbedingungen von Beispiel 3 wurden wäßrige Lösungen mit 0 bis 5 mg/dl 1,5-AG, die in Konzentrationsabständen von 0,5 mg/dl hergestellt worden waren, umgesetzt, und die jeweiligen Absorptionen wurden gemessen. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt. Außerdem wurden wäßrige Glucoselösungen mit 0 bis 1500 mg/dl Glucose, hergestellt in Konzentrationsabständen von 150 mg/dl, auf ähnliche Weise umgesetzt und die jeweiligen Absorptionen gemessen. Die Ergebnisse werden ebenfalls in Fig. 4 gezeigt.

Wie aus Fig. 4 ersehen werden kann, ergab sich bei Umsetzung von 1,5-AG eine zufriedenstellende Linearität bis zu 5 mg/dl, die den Ursprung schneidet. Als Glucose umgesetzt wurde, wurde etwa dieselbe Absorption wie bei der Blindprobe bei bis zu 1500 mg/dl erhalten, was anzeigt, daß die Glucose fast vollständig bis zu 1500 mg/dl verschwunden war. Es kann daraus geschlossen werden, daß Glucose hinreichend entfernt wurde und ein guter quantitativer Assay auf 1,5-AG unter den Meßbedingungen in diesem Beispiel gemacht werden kann.

BEISPIEL 5 Wiederfindungstest von zugegebenem 1,5-AG

Unter Verwendung von Sera, die Diabetespatienten mit bekannten 1,5-AG-Konzentrationen entnommen wurden, wurde 1,5-AG zu diesen Seren zugegeben. Jede der so erhaltenen Proben wurde unter den Bedingungen des oben beschriebenen Beispiels 3 umgesetzt. 1,5-AG wurde quantitativ unter Verwendung der im vorhergehenden Beispiel erhaltenen Eichkurve bestimmt.

Die tatsächlich erhaltenen Daten (gefundene Menge) wurde dividiert durch die Summe (theoretische Menge) des 1,5-AG- Gehalts im Serum des Patienten und der Menge des zugegebenen 1,5-AG. Der so erhaltene Wert wurde Wiederfindungsrate genannt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Wiederfindungsrate von zugegebenem 1,5-AG

Wiederfindungsrate von zugegebenem 1,5-AG

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, war die durchschnittliche Wiederfindungsrate etwa 100%, was bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren sehr genau ist.

BEISPIEL 6 Korrelation mit einem herkömmlichen Verfahren

Die Korrelation der Meßdaten des enzymatischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit einem herkömmlichen enzymatischen Verfahren unter Verwendung einer Ionenaustauschersäule, das als sehr verläßliches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG (im folgenden als "Enzymsäulenverfahren" bezeichnet) angesehen worden war, wurde überprüft. Beim Enzymsäulenverfahren wurden 57 menschliche Serumproben untersucht, wobei dem Handbuch unter Verwendung von LANA AG (eingetragenes Warenzeichen), hergestellt von Nippon Kayaku Co., Ltd., gefolgt wurde. Beim enzymatischen Verfahren der vorliegenden Erfindung wurden dieselben menschlichen Sera, wie sie beim Enzymsäulenverfahren verwendet wurden, als Proben verwendet und zur quantitativen Analyse auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 eingesetzt, wobei die in Beispiel 4 erzeugte Eichkurve verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Der Korrelationskoeffizient betrug 0,96, was anzeigt, daß es eine hohe Korrelation zwischen den beiden Verfahren gab.

Wie in den vorhergehenden Beispielen gezeigt, ist das Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-AG gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet zur Anwendung in einem automatisierten Analysengerät. Das bedeutet, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 1,5-AG unter Verwendung eines automatisierten Geräts bestimmt werden kann, was nach herkömmlichen Verfahren nicht möglich war. Darüber hinaus kann eine große Anzahl Proben schnell und genau bearbeitet werden, indem man viele klinische Testproben untersucht.

Claims (5)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol in einem Spezimen aus menschlichem Blut, menschlichem Blutserum oder menschlichem Blutplasma unter Verwendung einer Pyranoseoxidase, umfassend:

• (a) enzymatische Phosphorylierung mit Hexokinase von anderen Zuckern als 1,5-Anhydroglucitol, insbesondere Glucose, unter Verwendung von ATP in Lösung,
• (b) Umsetzen von 1,5-Anhydroglucitol mit einer Pyranoseoxidase und quantitative Bestimmung des hierbei gebildeten Wasserstoffperoxids,
  dadurch gekennzeichnet, daß
  • - in Schritt (a) ATP in einer molaren Überschußmenge von 100 bis 500 mmol/l zugegeben wird,
  • - die Reaktionslösung aus Schritt (a) als solche in Schritt (b) verwendet wird, und
  • - Schritt (b) bei einem pH von 7,2 bis 8,5 in Gegenwart der Überschußmenge von ATP durchgeführt wird,
    und eine Pyranoseoxidase aus einem Mikroorganisinus der Gattung Polyporus, Coriolus, Pycnoporus, Daedaleopsis, Pleurotus, Gloeophyllum, Irpex, Auricularia, Coprinus und Trametes verwendet wird.

2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH im Bereich von 7,5 bis 8,0 liegt.

3. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, worin die Pyranoseoxidase eine Pyranoseoxidase ist, die von Polyporus obtusus abgeleitet ist.

4. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Pyranoseoxidase mit 1,5-Anhydroglucitol in einer Probe umgesetzt wird und 1,5-Anhydroglucitol quantitativ auf Basis der erzeugten Menge an Wasserstoffperoxid gemessen wird.

5. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5- Anhydroglucitol gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren unter Verwendung eines automatisierten Analysengeräts durchgeführt wird.