DE2701168A1 - Verfahren zur bestimmung der aethanolkonzentration in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der aethanolkonzentration in koerperfluessigkeiten

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Description

VON KREISLER SCHONWALD MEYER EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler "J" 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln
f Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln
» Dipl.-Ing. G. Suiting, Köln
AvK/Ax
5 KÖLN 1 12.1.77
DtICMMANNHAUS AM HAUPTUAHNHOf
Chembro Holdings (Proprietary) Limited,
105 Quartz Street, Hillbrow, Johannesburg (Südafrika)
Verfahren zur Bestimmung der Äthanolkonzentration in Körperflüssigkeiten
Die Erfindung betrifft eine verbesserte Methode zur Bestimmung des Alkoholspiegels, d.h. zur Bestimmung des Äthanolgehalts in Körperflüssigkeiten und Reagentien für die Verwendung bei dieser Methode. Die Alkoholbestimmung in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut, ist ein allgemein anerkannter und eingeführter Routinetest, der in der ganzen Welt für medizinische und rechtliche Zwecke durchgeführt wird.
Zahlreiche chemische Methoden werden zur Alkoholbestimmung aus dem Blut angewendet. Die meisten Methoden beruhen auf der Oxydation des Äthanols und der volumetrischen oder kolorimetrischen Bestimmung der erforderlichen Menge des Oxydationsmittels (F.Landquist, Methods of Bio-chemical Analysis 7 (1959) 217). Allen diesen Methoden ist ein großer Mangel an Genauigkeit und Spezifität gemeinsam, da alle verwendeten Oxydationsmittel nicht nur mit Äthanol, sondern auch mit verschiedenen anderen flüchtigen Substanzen reaktionssind.
Telefon: (02 21) 23 45 41-4 ■ Tc-Ie«: 8 2307 dopa d Tc-Iufjrainni: Dompcjlcnt Köln
Die Extraktion von Äthanol aus Blut, aus dem die Eiweiß· körper entfernt worden sind,und der Nachweis durch Gas-Flüssigkeitschromatographie ist äußerst spezifisch und genau, jedoch sehr zeitraubend. Die enzymatische Bestimmung von Äthanol unter Verwendung von Alleoholdehydrogenase wird in vielen Laboratorien wegen der hohen Spezifität und Empfindlichkeit der Methode weitgehend angewendet ( R.Bonnichsen, H.Theorell, Scand.J.Clin.Lab. and Invest. 3 (1951) 58). Da jedoch die NADHp-Bildung bei 340 nm gemessen wird, ist ein Spektrophotometer erforderlich. Ferner kann die Analyse nicht am ganzen Blut durchgeführt werden.
Guilbault (G.G.Gilbault und S.H. Sadar, Anal.Lett. 2 (1969) 41) schlugen die Verwendung einer Alkoholoxydase von Basidiomyceten bei einer fluorometrischen Bestimmung von Äthanol vor, da diese Oxydase eine größere Spezifität als Alkoholdehydrogenase hat, obwohl es auch Methanol nachweist. Eine amperometrische Enzymelektrode unter Verwendung des gleichen Enzyms wurde ebenfalls von Guilbault vorgeschlagen (G.GGuilbault und G.J. Lubrano, Analytica Chimica Acta 69 (1974) 189). Bei dieser Methode wird das bei der enzymatischen Reaktion gebildete Wasserstoffperoxyd amperometrisch überwacht. Die Alkoholoxidase aus Basidiomyceten verbraucht Äthanol nur njit 28% der Geschwindigkeit, mit der es Methanol verbraucht.
Gegenstand der Erfindung ist eine Alkoholbestimmungsmethode aus Körperflüssigkeiten, bei der man ein vorbestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit beschafft, das Äthanol in der Körperflüssigkeit durch Einwirkung von Alkoholoxydase in einem geeigneten Puffer in Gegenwart von überschüssigem molekularem Sauerstoff oxydiert und die Geschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs mißt, wobei die Oxydation in Gegenwart eines Mittels stattfindet,
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das die Bildung von Sauerstoff durch Zersetzung von Peroxyd zu unterdrücken vermag.
Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs ist direkt proportional der Konzentration des Äthanols in der Körperflüssigkeit. Die Äthanolkonzentration in der Körperflüssigkeit läßt sich somit leicht beispielsweise durch Ablesen der Äthanolkonzentration von einer geeigneten graphischen Darstellung der Äthanolkonzentration in Abhängigkeit vom Sauerstoffverbrauch oder durch Vergleich der für eine gegebene Probe bestimmten Geschwindigkeit mit einer Bezugsprobe bestimmen.
Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wird vorzugsweise unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode gemessen. Die Verwendung einer Sauerstoffelektrode bietet eine Reihe besonderer Vorteile. Eine Sauerstoffelektrode ist verhältnismäßig billig. Sie ermöglicht eine schnelle Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs/ In sehr trüben oder farbigen Lösungen. Die Sauerstoffelektrode ist eine polarographische Vorrichtung zur Messung der Konzentration des in einem gegebenen Medium gelösten Sauerstoffs. Der Messung liegt die Elektrolyse von gelöstem Sauerstoff an einer schwach negativen Elektrode zu Grunde. Die Sauerstoffelektrode ist seit den Anfängen dieses Jahrhunderts bekannt. 1956 verbesserte »Clark die Elektrode wesentlich durch Verwendung einer für Sauerstoff durchlässigen, nicht leitenden Membran zur Isolierung der Elektrolysenzelle von der Meßprobe. (L.C. Clark, Trans. Am. Soc. Art. Int.Org. (1956) 41). Sauerstoffclektroden sind im Handel erhältlich. Die Sauerstoffelektrode kann in bekannter Weise mit einem üblichen Registriergerät, z.B. einem "Cimatic Clmapot T5 Recorder" gekoppelt werden, um die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs zu verfolgen und zu registrieren.
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Wie bereits erwähnt, wird die Oxydation in Gegenwart von überschüssigem Sauerstoff durchgeführt, d.h. der Sauerstoff darf kein geschwindigkeitsbegrenzender Reaktant sein. Da der Bereich wahrscheinlicher Äthanolkonzentrationen in den Körperflüssigkeiten bekannt ist, läßt sich in einfacher Weise sicherstellen, daß überschüssiger Sauerstoff vorhanden ist. Im allgemeinen wird die Oxydation in luftgesättigten Lösungen durchgeführt. In diesem Fall ist es einfach erforderlich, sicherzustellen, daß genügend luftgesättigte Lösung vorhanden ist, damit molekularer Sauerstoff im Überschuß vorliegt. Dies läßt sich für jeden gegebenen Fall leicht berechnen.
Die Methode gemäß der Erfindung dient im allgemeinen zur Alkoholbestimmung aus dem Blut, kann jedoch auch zur Messung des Äthanolgehalts in anderen Körperflüssigkeiten, z.B. im Plasma und Serum, angewendet werden.
Die Alkoholoxydase muß die Oxydation des Äthanols zu katalysieren vermögen. Eine Reihe solcher Oxydasen ist bekannt. Bevorzugt wird die Oxydase, die aus einem Stamm der von Prof. K. Ogata, Abteilung für landwirtschaftliche Chemie der Universität Kyoto, Japan, beschafften Kloecke-· ra-Hefe isoliert wurde. Die Oxydase wurde aus der Hefe extrahiert und nach üblichen Methoden der Proteinreinigung bis zur Homogenität gereinigt. Diese Methode wird nachstehend kurz beschrieben. Eine Schicht der Hefe wurde von Professor Ogata beschafft und auf Methanol als Kohlenstoffquelle gezüchtet. Die Zellen der Hefe wurden durch Ultraschallwellen zerrissen. Der Überstand aus dieser Stufe wurde der Ausfällung mit Ammoniumsulfat, der Ionenaustauschchromatographie an DEAE-CeIlulose und der Gelfiltration am Ionenaustauscherharz "G 200 Sephadex" unterworfen, worauf das Produkt gebrauchsfertig war. Das Enzym hatte in dieser Stufe eine Aktivität zwischen 90 und 100 Einheiten/ml. Eine
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Einheit der Enzymaktivität wird definiert als die Enzymmenge, die den Verbrauch von 1 mMol Sauerstoff/Min. bei 37°C mit Äthanol als Substrat verursacht.
Geeignet ist ferner die von Guilbault verwendete Alkoholoxydase (G.G.Guilbault und G.J. Lubrano, Anal. Chim. Acta 69 (1974) 189), die von einem Basidiomyzet isoliert wurde.
Der Puffer muß so beschaffen sein, daß er die Oxydation nicht hemmt. Bevorzugt wird ein Puffer mit einem pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise von 7,8. Geeignet als Puffer sind beispielsweise Kaliumphosphatpuffer, Boratpuffer und Trisihydroxymethyl)aminomethanpuffer. Vorzugsweise wird als Puffer ein Kaliumphosphatpuffer mit einer Molarität von 0,01 bis 2 und einem pH-Wert von 7 bis 9 verwendet. Bevorzugt wird eine Molarität von 1 und ein pH-Wert von 7,8.
Die Oxydation wird vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 45°C durchgeführt. Zweckmäßig wird bei etwa 37°C gearbeitet.
Während der Oxydation des Äthanols wird Wasserstoffperoxyd gebildet. Das Wasserstoffperoxyd zersetzt sich unter Bildung von Sauerstoff. Diese Zersetzung wird durch Verunreinigungen, die zuweilen in der Alkohol— oxydase vorhanden sind, katalysiert. Daher muß ein Mittel vorhanden sein, das die Sauerstoffbildung durch die Zersetzung des Peroxyds unterdrückt. Vorzugsweise
enzym
werden zu diesem Zweck ein Peroxydase/ und ein geeignetes Donatormolkül, d.h. ein Molekül, das durch das Wasserstoffperoxyd in Gegenwart das PeroxydaseToxy— dierbar ist, verwendet. Geeignete Donatormoleküle sind bekannt. Als Beispiele sind o-Tolidin (4,4f-Diamino-3,3*-dimethyldiphenyl), o-Dianisidin und Aminoantipyrin zu nennen. Geeignet sind ferner Verbindungen, die die Katalase inhibieren, die bekanntlich die Zersetzung
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von Wasserstoffperoxyd katalysiert· Als Beispiel einer solchen Verbindung kann Natriumazid genannt werden.
Die Erfindung umfaßt ferner einen Reagentiensatz für die Verwendung bei der erfindungsgemäßen Methode. Dieser Satz umfaßt
a) ein Gefäß, das eine Alkoholoxydase, deren Aktivität im Bereich von 1 bis 1000 Einheiten/ml, vorzugsweise etwa 100 Einheiten/ml beträgt, in einem der oben genannten geeigneten Puffer enthält, und
b) ein Gefäß, das das Mittel, das die Bildung von Sauerstoff durch Zersetzung des Peroxyds zu unterdrücken vermag, in einem geeigneten Puffer enthält, der im allgemeinen der gleiche Puffer wie für die Alkoholoxydase ist.
Als Mittel zur Unterdrückung der Sauerstoffbildung wird vorzugsweise eine Perox"ydase mit einer Aktivität von 1 bis 50 Einheiten/ml und ein geeignetes Donatormolekül in einer Konzentration von 0,01 bis 2% (Gew./ Vol.), vorzugsweise 0,2% (Gew./Vol.) verwendet. Die Aktivitätseinheiten werden später definiert.
Jedes Gefäß kann außerdem eine Substanz enthalten, die zur Komplexbildung mit Metallionen, die die Alkohol— oxydase,inhibieren, enthalten. Als Komplexbildner wird vorzugsweise EDTA-Na2 in einer Menge von 10 uMol bis 10 tnMol, vorzugsweise etwa 100 uMol, verwendet.
Die Erfindung wird nachstehend an Hand eines Beispiels beschrieben. Bei diesem Versuch wurden die folgenden Reagentien verwendet:
1) Alkoholoxydase, hergestellt aus Klockera-Hefe in der oben beschriebenen Weise.
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2) Meerrettich-Peroxydase: Dieses Enzym (Donator: Wasserstoffperoxydoxidcfeduktase E.C.Nr. 1.11.1.7) mit einer Aktivität von 60 Einheiten/mg wurde von Miles-Seravac, Kapstadt, bezogen. Eine Einheit wird vom Hersteller als Enzymmenge definiert, die in
20 Sekunden bei 20°C 1 mg Purpurogallin aus Pyro-'gallol bildet.
3) Mittel zur Unterdrückung der Sauerstoffbildung durch die Zersetzung des Peroxyds: Eine 0,2%ige (Gew./ Vol.) Lösung von o-Tolidin.HCl wurde durch Auflösen des Salzes in 1-molarem Phosphatpuffer von pH 7,8, der 4 Einheiten der vorstehend beschriebenen Meerrettichperoxydase pro ml Lösung enthielt, hergestellt. Der Phosphatpuffer wurde durch Mischen geeigneter Mengen von wässriger 1,0-molarer Kaliumdihydrogenphosphatlösung und wässriger 1,0-molarer Dikaliumhydrogenphosphatlösung bis zum gewünschten pH-Wert hergestellt.
4) Standard-Äthanollösung: Eine wässrige Standard-Äthanol lösung (10 uMol/ml) wurde unter Verwendung von über Magnesium getrocknetem absolutem Äthanol hergestellt.
Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs einer Anzahl von Äthanolproben von bekannter Konzentration wurde unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode und der oben genannten Reagentien gemessen. (Lieferant der Sauerstoffelektrode: Clinical Sciences and Manufacturing Laboratories, 'Johannesburg). Die Sauerstoffelektrode wurde an ein bei 37°C gehaltenes Bad von umgewälztem Wasser angeschlossen. Die Elektrode wurde mit einer 12,7 u dicken Membran aus Polytetrafluoräthylen bedeckt. Das Volumen der Zelle wurde bei etwa 1,0 ml gehalten. Das Ausgangssignal wurde mit einem Aufnahmegerät "Cimatic Cimapot T5»» registriert.
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In die Reaktionszelle der Sauerstoffelektrode wurden 0,95 ml des Phosphat-Donator-Peroxydase-Puffersystems
thermischen von pH 7,8 gegeben. Der Inhalt wurde der yGleichgewichtseinstellung bei 37°C überlassen. In die Reaktionszelle wurden dann 100 ul (9,3 Einheiten) der Alkoholoxydase gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe unterschiedlicher Mengen (0 bis 50 ul) der Standard-Äthanollösung ausgelöst. Die Anfangsgeschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wurde für jede verwendete Alkoholkonzentration registriert. In jedem Fall wurde die Geschwindigkeit nach Abzug einer Substratblindprobe in Abhängigkeit von der Konzentration der Äthanollösung graphisch dargestellt. Die erhaltene Kurve ist in der beigefügten Abbildung dargestellt. In dieser graphischen Darstellung ist die Anfangsgeschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs in uMol/Min. als Ordinate und die Menge der Äthanollösung als Abszisse aufgetragen.
Die endogene Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs wurde in Abwesenheit der Äthanollösung vor Auslösung der Reaktion gemessen. Die Sauerstoffkonzentration in den verwendeten luftgesättigten Lösungen wurde nach der Methode von Glasstone berechnet (S.Glasstone, Elements of Physical Chemistry, I.Auflage 1946, Seite 343-344, D.Van Nostrand Co., Inc., New York). Das Registriergerät wurde unter Verwendung von luftgesättigtem Wasser geeicht.
Bei einem weiteren Versuch wurden bekannte Äthanolmengen mit dem von Personen entnommenen Blut zugesetzt. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten;
10 ul frisch entnommenes Blut wurden zu 1,0 ml des Phosphat-Peroxydase-Donator-Puffersystems von pH 7,8 in der Reaktionszelle der Sauerstoffelektrode gegeben. Nach Zusatz von 9,3 Einheiten Alkoholoxydase wurde
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das System der thermischen Gleichgewichtseinstellung (37°C) und der Oxydation von etwaigem Alkohol, der möglicherweise bereits im Blut vorhanden ist, überlassen. Unterschiedliche aliquote Teile (O bis 50 ul) der wässrigen Äthanollösung wurden dann zugesetzt und die Anfangsgeschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs registriert. In jedem Fall waren die erhaltenen Werte mit den Werten identisch, die in Abwesenheit von Blut mit der gleichen Äthanolmenge registriert wurden. Die Anwesenheit von 10 ul ganzem Blut hat somit keinen Einfluß auf das Bestimmungsystem.
Aus Gründen der Genauigkeit bei Verwendung von ganzem Blut als Probenmaterial sollte das Blut dem Puffersystem zuerst zugesetzt und die Reaktion mit der Alkoholoxydase ausgelöst werden. In dieser Weise kann eine etwaige Aufnahme von endogenem Sauerstoff im Blut kompensiert werden.
Der Methode gemäß der Erfindung liegt die Anfangsgeschwindigkeit des SauerstoffVerbrauchs zu Grunde. Demzufolge ist die Bestimmung sehr schnell. Sie kann in weniger als 1 Minute durchgeführt werden. Als Probe kann ganzes Blut verwendet werden. Für routinemäßige Alkoholbestimmungen sind nur 5 ul Blut erforderlich. Ein Fingerstich liefert somit ausreichend Material für die'Analyse. Eine gesonderte Probe für eine Blindbestimmung ist nicht erforderlich, da eine etwaige Aufnahme von endogenem Sauerstoff vor der Zugabe der Alkoholoxydase berücksichtigt wird. Die Methode ist spezifischer als die meisten heute verfügbaren Methoden.
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Claims (14)

Patentansprüche
1)Werfahren zur Bestimmung der Athanolkonzentration in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein vorbestimmtes Volumen der Körperflüssigkeit entnimmt, das Äthanol in der Körperflüssigkeit durch Einwirkung von Alkoholoxydase in einem geeigneten Puffer in Gegenwart von überschüssigem molekularem Sauerstoff oxydiert und die Geschwindigkeit des Sauerstoff Verbrauchs mißt, wobei die Oxydation in Gegenwart eines Mittels stattfindet, das die Bildung von Sauerstoff durch Zersetzung von Peroxyd unterdrückt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode mißt.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Alkoholoxydase, die von einem Stamm der Hefe Klockera isoliert worden ist, verwendet.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer einen pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise von 7,8 hat.
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Kaliumphosphatpuffer mit einer Molarität von 0,01 bis 2 und einem pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise mit einer Molarität von 1 und einem pH-Wert von 7,8 verwendet.
6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 45°C durchführt.
7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mittel zur Unterdrückung der Sauer-
enzym
Stoffbildung ein Peroxydase/und ein geeignetes Donator-
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OAlQlNAL INSPECTED
molkül verwendet.
8) Reagentiensatz für das Verfahren 1 bis 7, gekennzeichnet durch
a) ein Gefäß, das eine Alkoholoxydase, die eine Akti- » vität im Bereich von 1 bis 1000 Einheiten (gemäß vorstehender Definition) pro ml hat, in einem geeigneten Puffer enthält, und
b) ein Gefäß, das ein Mittel, das die Bildung von Sauerstoff durch Zersetzung von Peroxyd zu unterdrücken vermag, in einem geeigneten Puffer enthält.
9) Reagentiensatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß beide Gefäße den gleichen Puffer enthalten.
10) Reagentiensatz nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer in jedem Gefäß einen pH-wert von 7 bis 9 hat.
11) Reagentiensatz nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefäße als Puffer einen Kaliumphosphatpuffer mit einer Molarität von 0,01 bis 2 und einem pH-Wert von 7 bis 9, vorzugsweise mit einer Molarität von 1 und einem pH-Wert von 7,8 enthalten.
12) Reagentiensatz nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Gefäß eine Peroxydase mit einer Aktivität von 1 bis 50 Einheiten (gemäß vorstehender Definition) pro.ml und einem geeigneten Donatormolekül in einer konzentration von 0,01 bis 2% (Gew./Vol.) enthält.
13) Reagentiensatz nach Anspruch 8 bis 12, dadurch gekenn-
wenigstens
zeichnet, daß/eines der Gefäße außerdem eine Substanz enthält, die zur Komplexbildung mit Metallionen, die die Alkoholoxydase inhibieren, fähig ist.
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14) Reagentiensatz nach Anspruch 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Komplexbildner EDTA-Na^ in einer Menge von 10 uMol bis 10 mMol vorhanden ist.
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DE19772701168 1976-01-15 1977-01-13 Verfahren zur bestimmung der aethanolkonzentration in koerperfluessigkeiten Withdrawn DE2701168A1 (de)

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