DE69104438T2 - Verfahren zur bestimmung von glukose-6-phosphat und zusammensetzung dafür. - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von glukose-6-phosphat und zusammensetzung dafür.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Bestimmung von Glukose-6-Phosphat und eine dafür verwendete Zusammensetzung.
  • Die in der vorliegenden Spezifikation für Nukleinsäuren, Nukleotide, Saccharide, Enzyme od.dgl. verwendeten Abkürzungen entsprechen den Empfehlungen der Commission on Biological Nomenclature (CBN) oder den auf diesem Gebiet üblicherweise verwendeten Abkürzungen, und sie lauten insbesondere wie folgt:
  • ADP: Adenosindiphosphat
  • AMY: Amylase
  • ATP: Adenosintriphosphat
  • CR: Kreatin
  • CK: Kreatinkinase
  • CMS: Carboximethylstärke
  • CP: Kreatinphosphat
  • GA: Glukoamylase
  • Glc: Glukose
  • Glck: Glukokinase
  • G6P: Glukose-6-Phosphat
  • G6PDH: Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
  • HK: Hexokinase
  • NAD: oxydiertes Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid
  • NADH: reduziertes Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid
  • 6PG: 6-Phosphoglukonat
  • 6PG-δ-L: 6-Phospho-D-Glukono-δ-Lacton
    • Stand der Technik
  • Techniken der Bestimmung werden allgemein eingesetzt, um verschiedene Enzyme oder physiologisch aktive Substanzen zu analysieren, welche in biologischen Flüssigproben enthalten sind, wie zum Beispiel in menschlichem Serum, und zwar auf der Grundlage der spezifischen Reaktionen von Enzymen, und die erzielten Resultate werden dann für die Diagnose von Erkrankungen und die Durchführung von klinischen Untersuchungen verwendet. Unter diese Techniken der Bestimmung fällt ein bekanntes Verfahren für die Bestimmung verschiedener physiologisch aktiver Substanzen, bei dem die nachzuweisenden physiologisch aktiven Substanzen quantitativ in Glukose-6-Phosphat (G6P) umgewandelt werden und das erhaltene Glukose-6-Phosphat (G6P) in der Gegenwart von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PGH) und NAD oder ADP dehydriert wird, um 6-Phosphoglukonat (6PG) herzustellen, wie dies durch die folgende Reaktionsformel (I) verdeutlicht wird:
  • wobei die Menge des gleichzeitig hergestellten NADH oder NADPH mit Hilfe der entsprechenden dekadischen Extinktion gemessen und so die nachzuweisende physiologisch aktive Substanz quantifiziert wird.
  • Als physiologisch aktive Substanzen, welche durch Umwandlung in G6P quantitativ bestimmt werden können, gelten zum Beispiel Kreatinkinase (CK), welche ein diagnostischer Indikator für einen Herzinfarkt, eine muskuläre Dystrophie od.dgl. ist; oder Amylase, welche als diagnostischer Indikator für Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse, der Leber od.dgl. dient; und Glukose (Glc), welche als diagnostischer Indikator für Diabetes od.dgl. dient. Es ist möglich, NAD(P)H durch die Reaktion nach der Formel (I) aus dem quantitativ umgewandelten G6P zu gewinnen und den Anstieg von NAD(P)H zum Beispiel aus der Veränderung der dekadischen Extinktion bei 340 nm zu messen und die Menge der physiologisch aktiven Substanz aus dem gemessenen Wert zu analysieren, um auf diese Weise eine Diagnose von Erkrankungen oder klinische Untersuchungen durchzuführen.
  • Wenn jedoch bei konventionellen Bestimmungsverfahren der in der Probe vorhandene Gehalt der physiologisch aktiven Substanz eine bestimmte Menge übersteigt, so wird die Menge des mit Hilfe eines vorbestimmten Komponentenverhältnisses eines verwendeten Reagens und innerhalb einer vorbestimmten Reaktionszeit hergestellten NAD(P)H manchmal nicht quantitativ erhöht und es ist dann nicht möglich, den Gehalt der physiologisch aktiven Substanz exakt zu messen. Wenn also die ursprüngliche Messung gezeigt hat, daß ein hoher Anteil der physiologisch aktiven Substanz in der Probe enthalten ist, so ist es notwendig, diese Probe in geeigneter Weise zu verdünnen und das Verfahren der Bestimmung zu wiederholen.
  • Es ist daher das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Möglichkeit vorzuschlagen, welche eine exakte Bestimmung selbst in hohen Konzentrationsbereichen ermöglicht, in denen eine präzise Bestimmung mit konventionellen Methoden nicht möglich ist.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Das oben genannte Ziel der vorliegenden Erfindung wird mit Hilfe eines Verfahrens für die Bestimmung von Glukose-6- Phosphat erreicht, bei dem Glukose-6-Phosphat und NAD oder NADP in Gegenwart von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase dehydriert wird, um 6-Phosphoglukonat und NADH oder NADPH herzustellen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Bestimmung in Gegenwart von 6-Phosphoglukonat durchgeführt wird.
  • Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Zusammensetzung für die Bestimmung von Glukose-6-Phosphat, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie 6- Phosphoglukonat, Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und NAD oder NADP enthält.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung des Unterschiedes in den Mengen von Glukose-6-Phosphat, welches in Anwesenheit (Kurve 2) und in Abwesenheit (Kurve 1) von 6-Phosphoglukonat in der vorliegenden Erfindung verbraucht wird.
  • Die Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung des Unterschiedes in den Mengen von Kreatin, welches in Anwesenheit (Kurve 4) und in Abwesenheit (Kurve 3) von 6- Phosphoglukonat in der vorliegenden Erfindung verbraucht wird.
  • Die Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung des Unterschiedes in den Mengen von Glukose, welche in Anwesenheit und in Abwesenheit von 6-Phosphoglukonat in der vorliegenden Erfindung verbraucht wird.
    • Bevorzugter Modus für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
  • Das charakteristische Merkmal des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens und der dafür verwendeten Zusammensetzung beruht auf der Einführung von 6- Phosphoglukonat in das konventionelle Bestimmungssystem für G6P.
  • Daher kann in der vorliegenden Erfindung das aus jedem bekannten Reaktionssystem umgewandelte G6P verwendet werden. Zum Beispiel kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete G6P ein solches sein, welches im Laufe der Bestimmung von Kreatinkinase (CK), Amylase (AMY) oder Glukose (Glc) umgewandelt wurde. Außerdem können in der vorliegenden Erfindung als G6PDH beliebige Enzyme (wie zum Beispiel kommerziell erhältliche Enzyme) eingesetzt werden, die auch in konventionellen Methoden eingesetzt werden.
  • Das in der vorliegenden Erfindung neu eingeführte 6- Phosphoglukonat ist ein bekanntes Enzym, welches die notwendige Aktivität besitzt, um 6-Phospho-D-Glukono-δ- Lacton (6PG-3-L), wie nachstehend erwähnt, in 6- Phosphoglukonolactonat (6PG) umzuwandeln, wie dies zum Beispiel in J. Research Natl. Bur. Standards, 48, 163 (1952) oder Seikagaku (Biochemistry), 37, 788 (1965) beschrieben ist. Das 6-Phosphoglukonat kann zuin Beispiel aus Mikroorganismen gewonnen werden, welche zu den Pseudomonas oder Leuconostocen gehören, oder aber aus Hefe hergestellt werden. Die Menge des zugesetzten 6- Phosphoglukonat ist nicht spezifisch begrenzt. Es ist ausreichend, wenn das 6-Phosphoglukonat in einer genügenden Menge vorhanden ist, damit die Reaktion von 6PG-δ-L in 6PG ablaufen kann.
  • Die analytische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält 0,01 bis 50 E/ml, vorzugsweise 0,01 bis 10 E/ml 6- Phosphoglukonat, 0,5 bis 20 E/ml, vorzugsweise 1 bis 5 E/ml Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, sowie 0,2 bis 20 mM, vorzugsweise 0,5 bis 5 mM NAD oder NADP.
  • In der vorliegenden Erfindung können beliebige Pufferlösungen verwendet werden, welche es ermöglichen, das Bestimmungssystem so einzustellen, daß es entweder sauer oder leicht alkalisch ist (insbesondere ein pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 8,5), wie zum Beispiel eine Pufferlösung aus Imidazol, eine Tri-Pufferlösung, eine Pufferlösung aus Phosphat oder eine Good'sche Pufferlösung.
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Aktivität der nachzuweisenden physiologisch aktiven Substanz dadurch bestimmt werden, daß ein Reagens, welches G6PDH, NAD(P) und 6-Phosphoglukonat enthält, dem G6P beigegeben wird, welches aus der physiologisch aktiven Substanz mit Hilfe von verschiedenen Reaktionssystemen umgewandelt wurde (oder indem dieses Reagens von Anfang an in das Reaktionssystem eingeführt wird, aus dem das G6P gewonnen wird), wonach die Menge des NAD(P)H durch dekadische Extinktion in der Nähe von 340 nm gemessen wird, um die Aktivität der physiologisch aktiven Substanz auf der Grundlage des gemessenen Wertes zu bestimmen.
  • Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Kreatinkinase (CK), die Amylase (AMY) oder die Glukose (Glc) zu bestimmen, welche in wässrigen Flüssigkeiten vorhanden sind, und zwar insbesondere in biologischen Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut oder aber Flüssigkeiten, welche insbesondere aus Blut gewonnen werden (insbesondere Serum oder Plasma), oder aber im Urin oder in Gewebeextrakten. Nachstehend werden Verfahren für die Bestimmung solcher physiologisch aktiven Substanzen beschrieben.
    • Kreatinkinase (CK)
  • Ein Beispiel für das Reaktionsschema bekannter Verfahren für die Bestimmung von CK ist folgendes:
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist 6- Phosphoglukonat in der Dehydrierungsreaktion der obigen Formel (I) vorhanden. Die vorliegende Erfindung kann entweder in einem einschrittigen oder in einem mehrschrittigen Verfahren durchgeführt werden, von denen jedes die Reaktionsschritte der obigen Formeln (II), (III) und (I) umfaßt. Daher kann das 6-Phosphoglukonat von Anfang an in dem Reaktionssystem vorhanden sein, oder aber erst später zugegeben werden. In diesein Verfahren für die Bestimmung von CK ist die nachzuweisende Probe nicht begrenzt, solange die Möglichkeit besteht, daß CK darin enthalten ist. Hier können insbesondere Blut oder solche Flüssigkeiten genannt werden, welche aus Blut gewonnen werden (insbesondere Serum oder Plasma), oder aber Urin oder Gewebeextrakte.
    • Amylase (AMY)
  • Ein Beispiel für das Reaktionsschema des bekannten Verfahrens für die Bestimmung von AMY ist folgendes:
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist 6- Phosphoglukonat in der Dehydrierungsreaktion der obigen Formel (I) vorhanden. Die vorliegende Erfindung kann entweder in einem einschrittigen oder einem vielschrittigen Verfahren durchgeführt werden, von denen jeder die Raktionsschritte der obigen Formeln (IV), (V) und (I) umfaßt. Daher kann das 6-Phosphoglukonat von Anfang an in dem Reaktionssystem vorhanden sein oder aber erst später zugegeben werden. In diesem Verfahren für die Bestimmung von AMY ist die nachzuweisende Probe nicht begrenzt, solange die Möglichkeit besteht, daß AMY darin enthalten ist. Besonders zu erwähnen sind Blut oder aus Blut gewonnene Flüssigkeiten (insbesondere Serum oder Plasma), oder aber Urin oder Gewebeextrakte.
    • Glukose (Glc)
  • Ein Beispiel für das Reaktionsschema des bekannten Verfahrens für die Bestimmung von Glc ist folgendes:
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist 6- Phosphoglukonat in der Dehydrierungsreaktion der obigen Formel (I) vorhanden. Die vorliegende Erfindung kann entweder in einem einschrittigen oder einem vielschrittigen Verfahren durchgeführt werden, von denen jeder die Reaktionsschritte der obigen Formeln (VI) und (I) umfaßt. Daher kann das 6-Phosphoglukonat von Anfang an in dem Reaktionssystem vorhanden sein, oder aber erst später zugegeben werden. In diesem Verfahren für die Bestimmung von Glc ist die nachzuweisende Probe nicht begrenzt, solange die Möglichkeit besteht, daß Glc enthalten ist. Besonders zu erwähnen sind Blut oder aus Blut gewonnene Flüssigkeiten (insbesondere Serum oder Plasma), oder aber Urin oder Gewebeextrakte.
  • Nachstehend wird das Prinzip der Bestimmung nach der vorliegenden Erfindung erläutert, wobei jedoch die vorliegende Erfindung nicht durch die nachfolgend angegebene Beschreibung eingeschränkt werden soll.
  • Wie oben wird, wenn die Dehydrierung von Glukose-6-Phosphat (G6P) in Gegenwart von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) durchgeführt wird, als erstes Produkt 6-Phospho-D- Glukono-δ-Lacton (6PG-δ-L) erhalten und anschließend wird dann das 6-Phosphoglukonat (6PG) produziert.
  • Es wird davon ausgegangen, daß die Reaktion der Formel (I) umkehrbar ist, während die Reaktion der Formel (2) nicht umkehrbar ist. Wenn die Reaktionsrate der Formel (2) höher ist, als diejenige der Reaktion aus Formel (1) in linker Richtung (Reaktion von 6PG-δ-L in G6P), so wird das Reaktionsprodukt der Formel (1), das heißt, das 6PG-δ-L sofort durch die Reaktion der Formel (2) in 6PG umgewandelt und auf diese Weise läuft die Reaktion der Formel (1) nach rechts weiter (von G6P zu 6PG-δ-L) und daher steigt der Gehalt an NAD(P)H in dem Reaktionssystem an. Wenn jedoch die Reaktionsrate der Formel (2) niedriger ist, wird das Reaktionsprodukt der Formel (1), das heißt, das 6PG-δ-L aufgrund der umkehrbaren Reaktion der Formel (1) in G6P zurückverwandelt und gleichzeitig wird das NAD(P)H verbraucht. Daher würde die vorgenannte Reaktion die Erhöhung der Menge von NAD(P)H in dem Reaktionssystem unterbinden.
  • In der Vergangenheit ist man davon ausgegangen, daß die Reaktion der Formel (2) nicht unbedingt die Verwendung eines Enzyms erfordert und daß die Reaktion rasch vonstatten geht, zum Beispiel durch Hydrolyse etc..
  • Die Erfinder haben jedoch herausgefunden, daß wenn das entsprechend der vorliegenden Erfindung eingesetzte 6- Phosphoglukonat fehlt, die Reaktionsrate der Formel (2) bei pH-Werten von 8,5 oder darunter extrem niedrig ist, obwohl die Reaktion nach der Formel (2) bei pH-Werten von 8,5 oder darüber relativ schnell abläuft.
  • Wenn also die Reaktion nach der oben erwähnten Formel (1), das heißt, der Formel (1) und der Formel (2) ohne das entsprechend der vorliegenden Erfindung eingesetzte 6- Phosphoglukonat bei einem pH-wert von 8,5 oder darunter durchgeführt wird, ist die Reaktion nicht innerhalb der normalen Meßzeit beendet und die erzielten Ergebnisse sind dann ungenau. Zum Beispiel liegt hier der optimale pH-Wert für die Bestimmung der Aktivität der Kreatinkinase (CK) im allgemeinen bei 6,5, so daß das oben erwähnte Phänomen das erzielte Ergebnis erheblich beeinflussen kann.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist es entsprechend der vorliegenden Erfindung möglich, schnellere, korrektere und höchst präzise Bestimmungsergebnisse zu erzielen, wenn man ein bestimmtes Enzym in den Prozeß der Hydrierungsreaktion der obigen Formel (I) einführt, um so die Reaktion der Formel (2) zu unterstützen und damit die Reaktion innerhalb kurzer Zeit abzuschließen.
  • Es ist zu bemerken, daß die vorliegende Erfindung besonders vorteilhaft für die Bestimmung bei pH-Werten von 8,5 oder darunter eingesetzt werden kann, wenn sie jedoch für die Bestimmung bei pH-Werten von 8,5 oder darüber eingesetzt werden soll, ist es möglich, noch schnellere, korrektere und genauere Bestimmungsergebnisse zu erzielen.
    • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele im Einzelnen erläutert, diese Beispiele sollen jedoch nicht in irgendeiner Weise als Einschränkung für den Umfang der Erfindung aufgefaßt werden.
    • Beispiel 1
  • Drei Milliliter einer 100 mM Pufferlösung aus Imidazolazetat (pH = 6,7), welche 2 E/ml G6PDH (Boehringer- Mannheim GmbH) und 2,5 mM NADP (Oriental Yeast Co.) enthielt (nachstehend als Lösung A bezeichnet), wurden mit 30 µl einer 100 mM Puf ferlösung aus Imidazolazetat (pH = 6,7) vermischt, welche 8 mM G6P (Oriental Yeast Co.) enthielt. Diese Mischung wurde bei einer Temperatur von 37º C reagiert und die Veränderung der dekadischen Extinktion bei 340 nm, welche den Anstieg von NADPH anzeigt, wurde zehn Minuten lang kontinuierlich gemessen. Die Ergebnisse sind in der Kurve 1 in Fig. 1 gezeigt.
  • Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt der Lösung A, 3 ml einer Lösung verwendet wurden, welche durch Beimengung zu der Lösung A von 6- Phosphoglukonat (zubereitet im Vergleichsbeispiel wie nachstehend erwähnt) hergestellt wurde. Der Anstieg von NADPH wurde zehn Minuten lang gemessen. Die Ergebnisse sind in der Kurve 2 in Fig. 1 dargestellt.
    • Beispiel 2
  • CK (gewonnen aus Muskeln von Kaninchen: Boehringer-Mannheim GmbH) wurde in einer Konzentration von 5.000 E/l menschlichem Serum beigegeben. Anschließend wurde das das CK enthaltende Serum mit gereinigtem Wasser verdünnt, um eine Serie von 10 Verdünnungen anzufertigen (500 E/l, 1.000 E/l, 1.500 E/l, 2.000 E/l, 2.500 E/l, 3.000 E/l, 3.500 E/l, 4.000 E/l, 4.500 E/l und 5.000 E/l).
  • Acht Mikroliter der oben erwähnten Serie von Verdünnungen wurden mit 320 µl einer 100 mM Imidazolazetat-Lösung (pH = 6,7) vermischt, welche 4 E/ml Glukokinase (Unitika), 25 mM Glukose, 2 mM ADP, 1,5 E/l G6PDH (Boehringer-Mannheim GmbH) und 2,8 mM NADP (Oriental Yeast) enthielt (nachstehend als Lösung B bezeichnet) sowie mit 80 µl einer 25 mM Trihydrochlorid-Pufferlösung (pH = 7,5), welche 125 mM Kreatinphosphat und 50 mM Magnesiumazetat enthielt. Die Mischung wurde bei einer Temperatur von 37º C reagiert. Anschließend wurden die Veränderungen der dekadischen Extinktion innerhalb eines Zeitraumes von 3 bis 5 Minuten nach Einsetzen der Reaktion gemessen, um die Veränderung der dekadischen Extinktion pro Zeiteinheit (AAbs/min) zu messen. Die Ergebnisse werden durch die offenen Kreise (Linie 3) in Fig. 2 dargestellt.
  • Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt der Lösung B 320 pl einer Lösung verwendet wurden, welche durch Beimengung zu der Lösung B von 0,2 E/l 6-Phosphoglukonat (zubereitet nach dem Vergleichsbeispiel wie nachstehend erwähnt) hergestellt wurde. Die Menge des NADPH wurde gemessen. Die Ergebnisse sind durch die geschlossenen Kreise (Linie 4) in der Fig. 2 dargestellt.
    • Beispiel 3
  • Durch Verdünnung von Glukose mit gereinigtem Wasser wurden verdünnte Lösungen mit Konzentrationen im Bereich von 400 mg/dl, 700 mg/dl und 1.000 mg/dl Glukose zubereitet.
  • Zwei Milliliter einer 100 mM Imidazolazetatlösung (pH = 6,5), welche 4 E/ml Glukokinase (Unitika), 1,5 E/ml G6PDH (Boehringer-Mannheim GmbH) und 2,8 mM NADP (Oriental Yeast Co.) enthielt, (nachstehend als Lösung C bezeichnet), wurden mit 0,50 ml einer 100 mM Imidazolazetat-Lösung (pH = 6,5) vermischt, welche 8,5 mM ATP (Boehringer-Mannheim GmbH) enthielt und danach wurden jeweils 20 µl der verdünnten Glukoselösung beigegeben. Die Mischung wurde bei einer Temperatur von 37º C reagiert. Anschließend wurden die Veränderungen der dekadischen Extinktion bei 340 nm kontinuierlich über einen Zeitraum von zehn Minuten nach Einsetzen der Reaktion gemessen.
  • Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt der obigen Lösung C eine Lösung verwendet wurde, welche durch Beimengung von 6-Phosphoglukonat (hergestellt nach dem Vergleichsbeispiel wie nachstehend erwähnt) der Lösung C beigemengt wurde, so daß die entsprechende Konzentration 0,09 E/ml betrug. Es wurde dann die Menge des NADPH gemessen.
  • Die Ergebnisse sind in der Fig. 3 dargestellt. In der Fig. 3 kennzeichnet die Kurve 5C den Fall, in dem 6- Phosphoglukonat der verdünnten Lösung beigemischt wurde, welche 400 mg/l Glukose enthielt, und die Kurve 6C kennzeichent den Fall, in dem 6-Phosphoglukonat nicht der 700 mg/l Glukose enthaltenden verdünnten Lösung beigemischt wurde, die Kurve 6E kennzeichnet den Fall, in dem der 700 mg/l Glukose enthaltenenden verdünnten Lösung 6- Phosphoglukonat beigemischt wurde, die Kurve 7c kennzeichnet den Fall, in dem der 1.000 mg/l Glukose enthaltenenden verdünnten Lösung 6-Phosphoglukonat nicht beigemischt wurde, die Kurve 7E kennzeichnet den Fall, in dem der 1.000 mg/l Glukose enthaltenenden verdünnten Lösung 6-Phosphoglukonat beigemischt wurde, und die Kurve 8 kennzeichnet den Fall, in dem 6-Phosphoglukonat gereinigtem Wasser beigemischt wurde, welches keine Glukose enthielt.
    • Vergleichsbeispiel: Zubereitung von 6-Phosphoglukonat
  • (1) In einer Penassy-Kulturbrühe (Difco Co.) wurde Pseudmonas fluorescens (RIMD 1615005; bereitgestellt von der Universität von Osaka, Research Institute for Microbial Diseases) einen Tag lang bei einer Temperatur von 30º C kultiviert. Das kultivierte Medium wurde einen Tag lang bei 30º C in einem Infusionsmittel für Herzen inokuliert. Die erhaltene inkubierte Flüssigkeit wurde dann zentrifugiert, um die jeweiligen Zellen abzutrennen. Die Zellen wurden in physiologischem Wasser gewaschen, durch Beschallung in einer Tripufferlösung zerstört und noch einmal zentrifugiert. Die an der Oberfläche schwimmenden Partikel wurden mit Ammoniaksulfat mit einem pH-Wert von 7,5 fraktioniert und die Proteinkomponente, welche mit einer Sättigung von 30 bis 70 % ausgeschieden wurde, wurde wiederum zentrifugiert und dann aufgefangen. Die Proteinkomponente wurde anschließend in einer Tripufferlösung gelöst und dialysiert und danach in einer DEAE-Zellulose-Säule grob gereinigt. Das erhaltene Rohprodukt wurde weiterhin mit Hilfe von HPLC [Packmaterial: ZORBAX GF-250 (Du Pont)] gereinigt und danach wurde die gewünschte 6-Phosphoglukonat als eine einzige Spitzenfraktion isoliert, welche mit einem Molekulargewicht von 30.000 bis 50.000 abgeschieden wurde.
  • (2) Die Aktivität des isolierten 6-Phosphoglukonat wurde mit Hilfe des folgenden Versuches bestimmt:
    • Verwendete Lösungen:
  • Lösung D: Zubereitet mit Hilfe einer 100 mM Imidazolazetat- Pufferlösung (pH = 6,5), welche 10 mM Magnesiumchlorid enthielt, so daß sie 0,85 mM NADP und 0,08 mM G6P enthielt.
  • Lösung E: Zubereitet durch Lösen von G6PDH (ohne 6- Phosphoglukonat) in gereinigtem Wasser mit einer Konzentration von 200 E/ml.
  • Lösung F: Eine Suspension aus Ammoniaksulfat von 6-PGDH (120 E/ml: Boehringer-Mannheim GmbH).
    • Verfahren:
  • Die Lösung D (3 ml) wurde mit der Lösung E (10 µl) vermischt und die Reaktion wurde 2 Minuten lang bei einer Temperatur von 37º C durchgeführt. Nach Beimischung von 20 µl der nach dem Vergleichsbeispiel (1) hergestellten 6- Phosphoglukonat-Lösung, ließ man das Produkt 2 Minuten lang bei einer Temperatur von 37º C ruhen und danach wurden 5 µl der Lösung F beigemischt. Anschließend wurden die Veränderungen der dekadischen Extinktion bei 340 nm innerhalb eines Zeitraumes von 2 bis 4 Minuten nach der Beimischung der Lösung F gemessen.
  • Bei dem Versuch wurden, wenn die dekadische Extinktion 2 bis 4 Minuten später mehr als 0,06 Abs. betrug, oder wenn die dekadische Extinktion vor Ablauf von 2 Minuten mehr als 0,8 Abs. betrug, die Messung wiederholt, nachdem das 6- Phosphoglukonat mit gereinigtem Wasser verdünnt worden war.
  • Es wurden Gegenversuche durchgeführt, bei denen gereinigtes Wasser statt dem 6-Phosphoglukonat verwendet wurde.
  • Die Aktivität wurde mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:
  • Aktivität von 6-Phosphoglukonat (E/ml) =
  • In dieser Gleichung kennzeichnet ΔE die Veränderung der dekadischen Extinktion, T kennzeichnet die Reaktionszeit (min), ε kennzeichnet den Index der dekadischen Extinktion von NADPH (6,22 cm²/µmol), d kennzeichnet die Länge einer Zelle (cm), V kennzeichnet die endgültige Menge der Flüssigkeit (ml), v kennzeichnet eine Menge der Flüssigkeit, welche 6-Phosphoglukonat (ml) enthält und DF kennzeichnet die Verdünnungsrate der das 6-Phosphoglukonat enthaltenden Flüssigkeit.
    • Durchführbarkeit im industriellen Maßstab
  • Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine raschere, bessere und präzisere Bestimmung durchzuführen, indem man 6-Phosphoglukonat in den Reaktionsprozeß der Dehydrierung einführt, welcher 6-Phosphoglukonat (6PG) aus Glukose-6-Phosphat (G6P) abtrennt, um so die Reaktion von G6P in 6PG zu unterstützen.
  • Daher ist es möglich, rasch, präzise und korrekt den Anteil der in verschiedenen biologischen Proben enthaltenen physiologisch aktiven Substanzen zu analysieren, wie zum Beispiel Kreatinkinase (CK), welche einen diagnostischen Indikator für Herzinfarkte, muskuläre Dystrophie od.dgl. darstellt, oder Amylase (AMY), welche als diagnostischer Indikator für Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse, der Leber od.dgl. dient, oder aber Glukose (Glc), welche als diagnostischer Indikator für Diabetes od.dgl. dient, indem man G6P quantitativ aus der physiologisch aktiven Substanz umwandelt, um NAD(P)H zu erhalten und dann anschließend die entsprechende Menge mißt, so daß Diagnosen von Erkrankungen und klinische Untersuchungen durchgeführt werden können.

Claims (6)

1. Verfahren für die Bestimmung von Glukose-6-Phosphat, bei dem Glukose-6-Phosphat und NAD oder NADP in Gegenwart von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase dehydriert wird, um 6-Phosphoglukonat und NADH oder NADPH herzustellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von 6-Phosphoglukonat durchgeführt wird.
2. Verfahren für die Bestimmung von Kreatinkinase, bei dem eine Probe mit Kreatinphosphat, Glukose, Hexokinase, ADP, NAD oder NADP und Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von 6-Phosphoglukonat durchgeführt wird.
3. Verfahren für die Bestimmung von Amylase, bei dem eine Probe mit Stärke, Glukoamylase, Hexokinase, ATP, NAD oder NADP und Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von 6-Phosphoglukonat durchgeführt wird.
4. Verfahren für die Bestimmung von Glukose, bei dem eine Probe mit Hexokinase, ATP, NAD oder NADP und Glukose-6- Phosphat-Dehydrogenase in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von 6-Phosphoglukonat durchgeführt wird.
5. Zusammensetzung zur Verwendung für die Bestimmung von Glukose-6-Phosphat, dadurch gekennzeichnet, daß sie 6-Phosphoglukonat, Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und NAD oder NADP enthält.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,01 bis 50 E/ml 6-Phosphoglukonat, 0,5 bis 20 E/ml Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase und 0,2 bis 20 mM NAD oder NADP enthält.
DE69104438T 1990-02-20 1991-02-19 Verfahren zur bestimmung von glukose-6-phosphat und zusammensetzung dafür. Revoked DE69104438T2 (de)

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