DE3744830C2 - - Google Patents

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Tatsuo Horiuchi
Toshiko Noda Jp Kurokawa
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Description

Bei den derzeitigen klinischen Tests mißt man Sialinsäure (SA) im Serum und dies spielt eine wichtige Rolle bei der Diagnose von akuten oder chronischen Entzündungen, Schocks, Traumen, Herzinfarkten, Diabetis mellitus, Lebererkrankungen, Krebs und dergleichen.
Die Messung von SA kann grob eingeteilt werden in chemische Methoden und enzymatische Methoden.
Die chemische Methode wird allmählich durch die viel genauere enzymatische Methode ersetzt, weil die chemische Methode in verschiedener Hinsicht nachteilig ist, insbesondere hinsichtlich der Durchführbarkeit und der Gefährlichkeit der verwendeten Mittel.
Bis jetzt hat man, grob gesagt, die nachfolgenden Methoden A und B als enzymatische Methoden angewendet:
Die Methoden A und B sind darin gleich, daß man Neuraminsäurealdolase mit SA umsetzt, um das letztere in N-Acetylmannosamin (N-AM) und Brenz-Traubensäure zu zersetzen. Sie unterscheiden sich aber erheblich darin, daß bei der Methode A N-AM mit Acetylglucosamin-2-epimerase und N-Acetylhexosaminoxidase unter Ausbildung von Wasserstoffperoxid behandelt wird, wobei man das letztere analysiert, während gemäß der Methode B Brenztraubensäure mit Brenztraubensäureoxidase oder Milchsäuredehydrogenase (LDH) behandelt wird, unter Ausbildung von Wasserstoffperoxid oder NADH und diese dann analysiert werden.
Die Methode A hat den Nachteil, daß das Vorhandensein von Acetylglucosamin-2-epimerase das System kompliziert, während Methode B den Nachteil hat, daß sie durch endogene Brenztraubensäure beeinflußt wird.
Zum Stand der Technik betreffend verschiedene enzymatische Verfahren zum Nachweis von Sialinsäure werden die folgenden Druckschriften genannt:
  • (1) DE-Buch: H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, Vol. VI, Verlag Chemie, Weinheim 1984, S. 80 bis 90;
  • (2) EP-A-0 133 694;
  • (3) Patents Abstracts of Japan C 351, June 5, 1986, Vol. 10/No. 15: 61-12 299 (A);
  • (4) Patents Abstracts of Japan C 327, February 6, 1986, Vol. 10/No. 3: 60-184 399 (A).
Ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Sialinsäure, bei dem man eine N-Acetylmannosamindehydrogenase einsetzt, ist aus diesem Stand der Technik nicht bekannt.
Aufgabe der Erfindung ist es ein neues Verfahren zur quantitativen Analyse von Sialinsäure aufzuzeigen das leicht durchführbar ist und die Nachteile der vorerwähnten Methoden A und B nicht aufweist.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.
Gemäß einer Ausführungsform wird die zu bestimmende Sialinsäure durch Umsetzen einer Sialinsäure enthaltenden Probe mit Neuraminidase freigesetzt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform verwendet man eine N-Acetylmannosamindehydrogenase die erhalten wurde indem man Flavobakterium sp. No. 141-8 (FERM BP 1222) kultiviert und von den kultivierten Zellen N-Acetylmannosamindehydrogenase gewinnt.
Die Erfindung betrifft auch ein Gebinde zur Durchführung der qualitativen Analyse von Sialinsäure welches N-Acetylneuraminsäurealdolase, N-Acetylmannosamindehydrogenase, NADH und eine Pufferlösung enthält.
Die Eigenschaften und die Gewinnung der erfindungsgemäß verwendbaren N-Acetylmannosamindehydrogenase die aus Flavobakterium sp. FERM BP-1222 erhalten wurde, werden in der Stammanmeldung P 37 41 198.5-41 beschrieben.
Nachfolgend wird die quantitative Analyse von SA und ein Gebinde für die quantitative Analyse näher erläutert.
Das Prinzip dieser Messung wird nachfolgend gezeigt:
N-AMDH wird mit N-AM in einer Probe umgesetzt und das gebildete NADH wird in bekannter Weise gemessen, z. B. durch die Messung der Absorption bei 340 nm (Ultraviolettbereich).
Andererseits ist es auch möglich, das gebildete NADH zu messen, indem man eine Probe mit verschiedenen Enzymen, die auf einem Feststoff aufgebracht sind, in Berührung bringt. Erforderlichenfalls kann man, um den Einfluß von auch vorhandenem LDH zu vermeiden, einen Inhibitor, wie Oxamsäure, Oxalsäure oder dergleichen, in einer geeigneten Menge zugeben.
Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete N-AMDH kann beliebigen Ursprungs sein. Vorzugsweise erhält man das N-AMDH durch Kultivieren eines Mikroorganismus, insbesondere eines Stammes, ausgewählt aus Bakterien, die zum Genus Flavobacterium gehören.
Als enzymbildender Stamm vom Genus Flavobacterium kommt insbesondere Flavobacterium sp. Nr. 141-8 (FERM BP-1222) in Frage.
Bei der quantitativen Analyse von SA wird eine SA enthaltende Probe mit N-Acetylneutraminsäurealdolase umgesetzt, wobei SA sich zu N-AM und Brenztraubensäure zersetzt und anschließend wird die Lösung mit den Zersetzungsstoffen mit N-AMDH umgesetzt.
Zwar kann man die quantitative Analyse des durch die Wirkung von N-AMDH gebildeten NADH durch beliebige Methoden durchführen, jedoch ist die am häufigsten angewendete Methode die Messung der Absorption bei 340 nm (Ultraviolettbereich). Neben dieser Methode gibt es einige Methoden, bei denen man NADH zu einem Farbstoff, der im sichtbaren Bereich absorbiert, überführt und dann diesen Farbstoff bestimmt, oder eine Methode, bei der man NADH mit Phenazinmethosulfat und Nitroblau-tetrazolium umsetzt und die Absorption des gebildeten Diformazans bei 570 nm mißt, sowie eine weitere Methode, bei der man NADH mit NADH-Oxidase (J. Biochem. 98, 1433 (1985)), Phenazinmethosulfat oder einen Elektronenübertragungssubstanz oder einem metallischen Ion, das ein ähnliches Verhalten unter Ausbildung von Wasserstoffperoxid zeigt, umsetzt und eine Farbe in Gegenwart von Peroxidase und verschiedenen Chromogenen entwickelt, wobei man dann die Absorption bei geeigneten Wellenlängen mißt. Wird NADH in Wasserstoffperoxid überführt, ist es auch möglich, dieses dadurch zu analysieren, daß man die Lumineszenz davon in Gegenwart von Luminol bestimmt. Eine Semiquantitative Analyse von NADH ist möglich, indem man in geeigneter Weise ausgewählte Redoxindikatoren und elektronenübertragende Substanzen hinzugibt und den Farbton feststellt. Alle diese Methoden für den Nachweis können entsprechend den jeweiligen charakteristischen Eigenschaften ausgewählt werden.
Bei der Analyse von SA muß die SA in der Probe in freier Form vorliegen. Liegt SA in einer Kombination mit einem Protein oder einem Glycolipid vor, wie in Serum, Plasma und einigen Geweben, dann wird die SA zunächst durch die Einwirkung von Neuraminidase freigesetzt und dann analysiert. Die für diesen Zweck verwendete Neuraminidase kann beliebigen Ursprungs sein, wobei eine solche, die durch Mikroorganismen vom Stamme Genus Clostridium, Genus Arthrobacter, Genus Corynebacterium, Genus Streptococcus, bevorzugt werden.
Das Gebinde zum quantitativen Analysieren von Sialinsäure enthält N-Acetylneuraminsäurealdolase, N-Acetylmannosamindehydrogenase, NAD und eine Pufferlösung. Diese Reagenzien und Enzyme werden in Form von Flüssigkeiten, Feststoffen oder gefriergetrockneten Materialien verwendet und sie werden in der Pufferlösung vor der Anwendung aufgelöst, wobei man dann ein Meßreagens erhält.
Bei der Bestimmung von SA wird N-Acetylneuraminsäurealdolase zunächst unter Ausbildung von N-AM mit der Probe umgesetzt. Dann wird N-AMDH unter Ausbildung von NADH umgesetzt. Das NADH wird entweder direkt oder nach Zugabe von NADH-messenden Reagenzien bestimmt. Das Meßsystem kann irgendein Reagenssytem sein, das Einzelreagenzien, zwei Reagenzien oder zahlreiche Reagenzien enthält.
Verwendet man erfindungsgemäß N-AMDH, dann kann man N-AM quantitativ mit hoher Genauigkeit analysieren und basierend darauf wird die Menge an SA bekannt. Als Ergebnis kann man zahlreiche Krankheiten wirksam diagnostizieren.
Weiterhin kann man gemäß der Erfindung N-AM genau quantitativ analysieren, ohne daß die Bestimmung durch die Coexistenz von N-Acetylhexosamin gestört wird. Dies ist äußerst wichtig bei der Untersuchung von komplexen Zuckern. Weiterhin ermöglicht die vorliegende Erfindung die quantitative Analyse von SA in hoher Genauigkeit, ohne den Einfluß von endogener Brenztraubensäure. Dies ist bei Diagnosen, die auf klinischen Tests von SA beruhen, äußerst wichtig.
Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Die Menge an SA im Serum wurde nach dem folgenden Verfahren und Verwendung der nachstehenden Reagenzien bestimmt.
(1) Reagenzien:
A. 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,6)|1 ml
Neuraminidase (5 Einheiten/ml) 1 ml
N-Acetylneuraminsäurealdolase (10 Einheiten/ml) 1 ml
B. 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) 5,7 ml
N-AMDH (123 Einheiten/ml) 0,6 ml
NAD (60 mM) 0,5 ml
Oxamsäure 4,4 mg
(2) Bestimmungsmethode:
20 Mikroliter Serum wurden in einem Reagensglas aufgenommen und dazu wurden 300 Mikroliter des Reagenses A. gegeben. Nach 15minütigem Umsetzen bei 37°C wurden 680 Mikroliter des Reagenses B. zugegeben und weitere 10 Minuten umgesetzt. Die Absorption des Reaktionsmediums wurde bei 340 nm gemessen. Bei einer Blindprobe wurde das vorerwähnte Verfahren wiederholt, wobei jedoch das Reagens A. durch Wasser ersetzt wurde. Die Absorption der Blindprobe wurde von der der Probe abgezogen. Eine Kalibrierungskurve wurde aus Lösungen mit bekannten Konzentrationen an N-Acetylneuraminyllactose aufgestellt. Aus der Kalibrierungskurve konnte die SA-Konzentration der Probe bestimmt werden.
Beispiel 2
Die Konzentration von SA in einer Lösung wurde nach dem folgenden Verfahren mit den nachfolgenden Reagenzien bestimmt.
(1) Reagenzien:
0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0)
610 Mikroliter
N-Acetylneuraminsäurealdoloase (10 Einheiten/ml) 300 Mikroliter
NAD (60 mM) 53 Mikroliter
N-AMDH (123 Einheiten/ml) 60 Mikroliter
Probelösung 20 Mikroliter
(2) Bestimmungsmethode:
Vorbestimmte Mengen an Reagenzien wurden in ein Reagensglas überführt und 10 Minuten bei 37°C umgesetzt und dann wurde die Absorption der Reaktionsmischung bei 340 nm gemessen. Bei einer Blindprobe wurde das vorerwähnte Verfahren wiederholt, wobei jedoch N-Acetylneuraminsäurealdolase durch eine identische Menge Wasser ersetzt wurde. Die Absorption der Blindprobe wurde von der der Probe abgezogen und der Rest wurde als die Absorption der Probelösung angesehen. Unabhängig davon wurde eine Kalibrierungskurve hergestellt, indem man SA-Lösungen bekannter Konzentration in gleicher Weise wie oben behandelte. Aus der Kalibrierungskurve wurde die SA-Konzentration in der Probelösung bestimmt. Fig. 1 ist die Kalibrierungskurve.
Beispiel 3
Die Konzentration von SA in einer Lösung wurde nach dem folgenden Verfahren mit den nachfolgenden Reagenzien bestimmt.
(1) Reagenzien:
0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) (enthaltend 0,1% Triton X-100)
100 Mikroliter
Phenazinmethosulfat (1 mg/ml) 5 Mikroliter
Nitroblau-tetrazolium (10 mg/ml) 5 Mikroliter
NAD (40 mg/ml) 20 Mikroliter
N-Acetylneuraminsäurealdolase (10 Einheiten/ml) 40 Mikroliter
N-AMDH (123 Einheiten/ml) 10 Mikroliter
Probelösung 10 Mikroliter
(2) Bestimmungsmethode:
Vorbestimmte Mengen der vorerwähnten Ragenzien wurden in ein Reagensglas überführt und 15 Minuten bei 37°C umgesetzt. Nach Zugabe von 2,0 ml 0,3 N Salzsäure wurde gründlich gerührt. Die Absorption der gebildeten Farbe wurde bei 570 nm gemessen. Bei einer Blindprobe wurde das vorerwähnte Verfahren wiederholt, wobei jedoch die N-Acetylneuraminsäurealdolase durch eine identische Menge Wasser ersetzt wurde. Die Absorption der Blindlösung wurde von der der Probelösung abgezogen und der Rest wurde als Absorption der Probe angesehen. Unabhängig davon wurde eine Kalibrierungskurve hergestellt, indem man SA-Lösungen bekannter Konzentration in gleicher Weise wie oben behandelte. Aus der Kalibrierungskurve konnte die SA-Konzentration in der Probelösung bestimmt werden.

Claims (4)

1. Verfahren zur quantitativen Analyse von Sialinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Sialinsäure enthaltende Probe mit N-Acetylneuraminsäurealdolase und N-Acetylmannosamindehydrogenase entweder nacheinander oder gleichzeitig umsetzt und das gebildete NADH mißt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Sialinsäure durch Umsetzen einer Sialinsäure enthaltenden Probe mit Neuraminidase freisetzt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Acetylmannosamindehydrogenase verwendet, die erhalten wurde indem man Flavobakterium sp. No. 141-8 (FERM BP 1222) kultiviert und von den kultivierten Zellen N-Acetylmannosamindehydrogenase gewinnt.
4. Gebinde zum quantitativen Analysieren von Sialinsäure gemäß Anspruch 1, enthaltend N-Acetylneuraminsäurealdolase, N-Acetylmannosamindehydrogenase, NAD und eine Pufferlösung.
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