DE2264847C2

DE2264847C2 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin

Info

Publication number: DE2264847C2
Application number: DE2264847A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr.Rer.Nat. Beaucamp; Hans Ulrich Prof. Dr.Rer.Nat. Bergmeyer; Erich Bernt; Wolfgang Dr. Phil.Nat. Gruber; Alexander Dr.Rer.Nat. Hagen; Gunter Lang; Peter Dr.Rer.Nat. Roeschlau
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1972-05-17
Filing date: 1972-05-17
Publication date: 1978-11-30
Also published as: DE2224132C2; NL7306738A; GB1429525A; CH589295A5; AT324580B; DE2224132A1; BE799543A; NL181282C; AU5586173A; NL181282B; DE2224132B1; FR2191743A5; DE2264847A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymaiisehen Bestimmung von verestertem und freiem Cholesterin und ein Reagenz zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die Bestimmung von Cholesterin hat für die medizinische Diagnostik eine erhebliche Bedeutung. Ein 2^r> erhöhter Cholesterinspiegel im Blut ist ein wesentlicher Risikofaktor der Arteriosklerose. Bei hohen Cholesterinwerten, also Hypercholesterinämie, kommen Koronarinsuffizienz und Herzinfarkt häufiger vor als bei niedrigen Cholesterinwerten. Hypercholesterinämie be- «1 günstigt das Auftreten von Arteriosklerose und Koronarerkankungen und muß daher frühzeitig erkannt werden, damit die Behandlung rechtzeitig beginnen kann. Erhöhte Cholesterinwerte finden sich häufig auch bei Diabetes mellitus, nephrotischem Syndrom, Hypot- r> hyreose und Leberkrankheiten, wie der biliären Cirrhose. Eine rasche und zuverlässig durchführbare Methode zur Bestimmung von Cholesterin hat daher große Bedeutung.

Die bekannten und brauchbaren Methoden zur Cholesterinbestimmung basieren auf der Reaktion nach Liebermann und Burchard. Freies und verestertes Cholesterin bilden danach mit Essigsäureanhydrid und konzentrierter Schwefelsäure blaugrüngefärbte Verbindungen, deren Farbintensität der Cholesterinkonzentration proportional ist und spektrometrisch gemessen wird.

Dieses bekannte Verfahren weist jedoch wesentliche Nachteile auf. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens liegt in seiner Unspezifität Die Liebermann-Burchard-Reaktion stellt eine relativ unspezifische Steroidreaktion dar, die außer von Cholesterin auch von anderen Steroiden eingegangen wird. Da beispielsweise im Plasma noch 1 bis 3% Dihydrocholesterol und 0,5 bis 1,4% 4⁷-Cholestenol neben anderen Steroiden vorhanden sind, ergibt sich ein unerwünscht großer Fehler. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß mit aggressiven und ätzenden Reagenzien gearbeitet werden muß.

Nach einem älteren, nicht vorveröffentlichten Vorschlag wird Cholesterinoxidase, ein H₂O₂ bildendes Enzym, für die Bestimmung verwendet Die Freisetzung des gebundenen Cholesterins erfolgt dabei jedoch in einem gesonderten Verfahrensschritt durch alkaliische Verseifung.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen vollenzymatischen Verfahrens und eines Reagenzes zur Bestimmung von verestertem und freiem Cholesterin, welches die obenerwähnten Nachteile nicht aufweist und insbesondere absolut spezifisch für Cholesterin ist und keine aggressiven Reagenzien erfordert

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin durch Inkubation von Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterinoxidase und Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs oder des gebildeten H₂O₂ bzw. Cholestenon, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zur vollenzymatischen Umsetzung von verestertem und von freiem Cholesterin und ermöglicht damit die Bestimmung: von sowohl Gesamtcholesterin, gebundenem Cholesterin als auch freiem Cholysterin durch Messung eines der oben aufgeführten Reaktionsprodukte bzw. des bei der Reaktion verbrauchten Sauerstoffs.

Cholesterinoxydase ist ein neues Enzym, welches nachstehende Reaktion katalysiert:

Cholesterin + O, Cholesterinoxydase Cholestenon 4- H₂O₂

Durch die erfindungsgemäße Koppelung dieser Reaktion mit der enzymatischen Spaltung von verester- w tem Cholesterin wird eine rasche und quantitative Spaltung des veresterten Cholesterins erzielt und auch freigesetztes Cholesterin rasch quantitativ weiteroxydiert Das Verfahren ermöglicht damit eine absolut spezifische und genaue quantitative Bestimmung des « gesamten Cholesterins.

Cholesterinoxydase, das Ausgangsmaterial zu ihrer Gewinnung, ihre Reinigung und die Eigenschaften sind in den deutschen Offenlegungsschriften DE-OS 22 24 133.4 und 22 24 131.2 beschrieben. t,o

Das Verfahren der Erfindung eignet sich zur Bestimmung von Cholesterin in wäßrigen Medien aller Art, wie Lebensmittelextrakten, Körperflüssigkeiten und insbesondere Serum, in denen Cholesterin auch in veresterter Form vorkommt. b5

Als Cholesterinesterase wird eine solche aus Leber oder Pankreas bevorzugt.

Dip Messung des Sauerstoffverbrauchs, der H?O?-Bil-

dung oder der Cholestenonbildung gemäß obiger allgemeiner Gleichung kann nach den hierfür bekannten und üblichen Methoden erfolgen.

Geeignete Methoden zur Bestimmung des Sauerstoffverbrauches sind beispielsweise Gaschromatographie und Depolarisationsverfahren. Bevorzugt wird die polarometrische Bestimmung mittels Sauerstoffelektrode, da sich dieses Verfahren besonders zur automatisierten Durchführung der Cholesterinbestimmung eignet. Derartige Bestimmungsmethoden sind bekannt. Besonders geeignet erwiesen sich die in den deutschen Offenlegungsschriften 21 30 340 und 21 30 308 beschriebenen Methoden zur polarometrischen Messung des Sauerstoffverbrauchs in wäßrigen Medien.
' Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann sowohl titrimetrisch als auch potentiometrisch, polarographisch und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt werden die enzymatischen Methoden unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase, da diese nicht nur äußerst spezifisch und zuverlässig sind,

sondern auch mit der Hauptreaktion unter Bildung von Wasserstoffperoxyd auf einfachste Weise kombiniert werden können. Als besonders geeignet erwies sich insbesondere die Bestimmung mittels Kataiase in Gegenwart von 0-Diketonen, z. B. Acetylaceton und Methanol bzw. Äthanol oder Methylenglycol, sowie die Bestimmung mittels P'eroxydase in Gegenwart eines Chromogens. Bei der Bestimmung mittels Kataiase, Acetylaceton und Methanol wird letzteres zu Formaldehyd oxydiert, der mit Acetylaceton eine Farbreaktion eingeht, die gemessen werden kann. Bei der Bestimmung mittels Peroxydase werden als Chromophor Verbindungen zugesetzt die nach der Reaktion photometrisch bestimmt werden können. Ein Beispiel für ein geeignetes Chromophor ist 2£'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure.

Die Bestimmung des Cholestenons erfolgt mit Hilfe von Ketoreagenzien, vorzugsweise einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung umsetzenden Hydrazinderivat, wie z. B. 2-4-Dinitrophenylhydrazin. -">

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, welches aus Cholesterinoxydase, einem System xur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon und aus Cholesterinesterase besteht. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform besteht dieses Reagenz aus Cholesterinoxydase,, Cholesterinesterase, Kataiase, Acetylaceton, Methanol und Puffer, einzeln oder gemischt In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagenz aus Cholesterinoxydase, 1« Choiesterinesterase, Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagenz aus r. Cholesterinoxydase, Cholesterinesterase und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt 41)

Die obenerwähnten bevorzugten Reagenzkombinationen können außer den aufgeführten obligaten Bestandteilen zusätzlichen übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren und/oder oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann ■>'> bekannt und in Nachweiissystemen für Wasserstoffperoxyd bzw. Cholestenon üblich.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

0,02 ml Serum werden zu 10,0 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, der 0,4% Hydroxypolyäthoxydodecan enthält gegeben. Es wird die Extinktion (E,) bei 240 nm in einem geeigneten Spektralphotometer abgelesen und die Reaktion mit 0,02 ml (entsprechend 0,2 U) Cholesterinoxydase gestartet Nach 5 min wird erneut die Extinktion (E₂) abgelesen. Die Konzentration des gebildeten 4⁴-Cholesten-3-ons und damit des freien Cholesterins ergibt sich aus der Differenz zwischen der ersten und der zweiten Ablesung unter Berücksichtigung des molaren Extinktionskoeffizienten für A⁴-Cho-Iesten-3-on bei 240 nm (ε = 15,5 αη²/μΜο1).

Zur Bestimmung des veresterten Cholesterins werden nun 0,02 ml (=0,2 U) Cholesterinesterase aus Candida spec (WS 90024) dazugegeben und nach 15 min die Extinktion (E3) abgelesen. Die Konzentration des veresterten Cholesterins ergibt sich aus der Differenz E3 — E2 unter Berücksichtigung der Eigenabsorption der Cholesterinesterase. Die Messung einer typischen Probe ergab 50 mg% freies Cholesterin und 148 mg% verestertes Cholesterin. Die Vergleichsbestimmung nach Liebermann/Burchard ergab 212 mg% Gesamtcholesterin (freies und verestertes Cholesterin).

Beispiel 2

10 g Ammoniumhydrogenphosphat werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 85%iger Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden 6,6 · 10⁵U Kataiase zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung wird eine Mischung von 0,2 ml Acetylaceton, 10 ml Methanol, 1,2 g Polyäthylenglykol und 1,2 g Natriumcholat auf 100 ml aufgefüllt

5,0 ml der so erhaltenen Lösung werden mit 0,05 ml Serum bzw. 0,05 ml einer Cholesterin-Standard-Lösung mit einem Gehalt von 200 mg% Cholesterin gemischt. Aliquots der serumhaltigen Probe sowie der Cholesterin-Standard-haltigen Probe werden mit je 0,2 U Cholesterinoxydase und 0,2 U Cholesterinesterase aus Pankreas versetzl und 70 min bei 37°C inkubiert Dann wird der gebildete Farbstoff bei 405 nm photometrisch gemessen unter Berücksichtigung des Reagentienleerwertes.

Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe wird unter Benutzung des Standards als Bezugsgröße bestimmt. Kontrollbestimmungen nach Liebermann/ Burchard ergaben eine Abweichung von etwa 5%.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin durch Inkubation desselben mit Cholesterinoxidase in wäßrigem Medium und Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs oder des gebildeten H₂O₂ bzw. Cholestenons, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt wird. ι u

2. Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin, enthaltend Cholesterinoxidase, ein System zur Bestimmung von H₂O₂ oder ein System zur Bestimmung von Cholestenon, dadurch gekennzeichnet, daß es Cholesterinesterase enthält