DE2652678A1 - Antibiotica und verfahren zur herstellung derselben - Google Patents
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Description
Dr. Karus-A. Ci-auns Ü
U.V.i^UMir.a \ ^g1 HOVEMBER 1976
15 837
MSRCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.
Antibiotica und Verfahren zur Herstellung derselben
Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaxton
von. Penicillin hat grosses Interesse auf diesem Gebiet
wachgerufen, das zur Auffindung vieler anderer wertvoller antlblotlscher
Stoffe geführt hat; solche Antibiotica .sind z.B. andere Penicilline, Streptomycin, Bacitracin, Tetracycline,
Chloramphenicol j Erythromycine und dergleichen. Im aligeaieinar)
erstreckt sich die antibakterielle Aktivität eines jeden dieser Antibiotica nicht auf gewisse klinisch wichtige pathogene
Bakterien. So wirken einige hauptsächlich nur gegs-n gram-positive
Arten von Bakterien. Im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung bisher bekannter Antibiotica zur Behandlung von
bakteriellen Infektionen hat dia erv/orbene Resistenz zum Auftauchen
schwieriger Resistenzprobleme geführt.
Daher haben die Mangel der bekannten Antibiotica eine weitere
Forschung zur Auffindung anderer Antibiotica angeregt, die gegen einen v/eiteren Bereich von Krankheitserregern sowie auch
gegen resistente Stämme besonderer Mikroorganismen aktiv
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Die Erfindung betrifft zwei neue Antibiotica. Insbesondere bezieht
sie sich auf die neuen antibiotischen Stoffe, die hier als Desacetyl-890A-j und Desacetyl-890A, bezeichnet werden. Die
Erfindung umfasst die Antibiotica in verdünnten Formen, als rohe Konzentrate und in reinen Formen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue und wertvolle Antibiotica zur Verfügung zu stellen, die in hochgradig wirksamer
Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmen. Eine weitere Aufgabe
der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Antibiotica durch enzymatische Desacetylierung der Verbindungen
890A^ bzw. 890A^ zur Verfügung zu stellen. Schliesslich
liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Desacetylieren von N-Acety!thienamycin zur Verfügung zu
stellen.
Die neuen antibiotischen Substanzen gemäss der Erfindung werden
durch Hydrolyse der N-Acetylgruppe von 890A* und 890A^
mit Hilfe einer Amidohydrolase hergestellt, die imstande ist, die N-Acetylgruppe zu hydrolysieren. Geeignete Quellen für
eine Amidohydrolase, die diese Fähigkeit aufweist, sind Amidohydrolase erzeugende Stämme des Mikroorganismus
Protaminobacter ruber. Das durch Protaminobacter ruber erzeugte Enzym ist N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase, ein Vertreter
der Untergruppe von Enzymen, die gemäss der empfohlenen Enzymnomenklatur der "International Union of Pure and Applied
Chemistry" und der "International Union of Biochemistry" als E.C. 3.5.1 bezeichnet wird.
Der Mikroorganismus, der imstande ist, das Desacetylierungsverfahren
durchzuführen, wurde aus einer Bodenprobe isoliert und auf Grund von klassifizierenden Untersuchungen als zu der
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Species Protaminobacter ruber gehörend identifiziert. In der
Kultursammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., ist er mit
MB-3528 bezeichnet worden. Eine Kultur des Mikroorganismus ist unbeschränkt permanent in der Kultursammlung der Northern
Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service,
U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt worden und hat die Kennzeichnungsnummer NRRL B-8143 erhalten.
Die morphologischen Eigenschaften und die Kultureigenschaften von Protaminobacter ruber NRRL B-8143 sowie die Einzelheiten
über die Ausnutzung von Kohlenstoff und Stickstoff und die biochemischen Reaktionen des Mikroorganismus sind nachstehend
angegeben:
Morphologie - Die Zellen sind stabförmig mit abgerundeten Enden, 0,9-1,2 χ 2,3-4,6 μ gross und kommen einzeln oder in
Paaren vor. 24 und 48 Stunden alte Zellen werden gram-negativ mit einem körnigen Aussehen gefärbt. Die Körner, besonders
die polaren Körner, werden von Sudanschwarz B schwarz gefärbt. Die Zellen sind bei 28° C beweglich, aber bei 37° C ist die
Beweglichkeit fraglich.
Kulturmerkmale - Kolonien auf Nähragar sind zunächst dünn,
punktförmig, halbtransparent und farblos; dann werden sie niedrig-konvex, undurchsichtig, glatt, randvollständig (edge
entire), in der Konsistenz etwas trocken und rosa bis rosarot pigmentiert.
Kulturen in Nährbrühe sind gleichmässig trüb ohne Häutchen.
Die Pigmenterzeugung ist von Licht oder den untersuchten Temperaturen
(28 C und 37 C) unabhängig. Das Pigment ist in
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15837 >
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Aceton löslich, in Wasser oder Chloroform aber unlöslich.
Bei 28 C erfolgt das Wachstum auf Nähragar und Hirn-Herz-Aufguss-Agar
unter aeroben Bedingungen etwas langsam, aber gut; bei 37 C ist das Wachstum mäßig bis gut, aber langsamer;
bei 50 C findet kein Wachstum statt.
Bei Verwendung eines basalen Salzmediums mit Ammoniumsulfat als N-Quelle ist das Wachstum mit Arabinose gut, mit Xylose
mäßig und mit Dextrose, Fructose, Mannose, Rhamnose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Cellulose, Inosit und Mannit
schlecht.
N-Acetyläthanolamin kann als einzige C- und N-Quelle verwendet
werden.
In OF-Basalem Medium (Difco Laboratories, Detroit, Michigan)
wird aus Dextrose oder Lactose unter aeroben oder anaeroben Bedingungen keine Säure und kein Gas gebildet.
Die biochemischen Reaktionen beruhen auf Standardmethoden,
die in "Manual of Microbiological Methods", herausgegeben von der Society of American Bacteriologists, Verlag McGraw-Hill
Book Co., New York, 1957, beschrieben sind.
Katalase - positiv
Oxidase - negativ
Stärke wird nicht hydrolysiert Casein wird nicht hydrolysiert Gelatine wird nicht verflüssigt
Lackmusmilch bleibt in der Konsistenz unverändert, wird aber nach 7 Tagen etwas alkalisch
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Indol - negativ
HpS - negativ
Nitrate werden nicht reduziert Urease - positiv
Lysin- und Ornithindecarboxylase - negativ.
N-Acetylthienamycin, 890A1 und 890A, sind die Bezeichnungen
für Isomere des Antibioticums der Strukturformel
CH1-CH(OH) . . . „
3 1 Λ S-CH0-CH0-NH-C-CH3
OOH
N-Acetylthienamycin, seine Beschreibung und ein Verfahren zur Herstellung desselben sind in der USA-Patentanmeldung Serial
Nr. 634 301 vom 21. November 1975 offenbart. 890A1 und 890A^,
ihre Beschreibung und Verfahren zur Herstellung derselben sind in der USA-Patentanmeldung Serial No. 634 300 vom 21. November
1975 offenbart.
Die neuen Antibiotica gemäss der Erfindung, nämlich Desacetyl 890A1 und Desacetyl 890A,, sind Isomere der Strukturformel
CH,-CH(OH)
3 I x S-CH2-CH2-NH2
COOH
und werden durch enzymatische Hydrolyse von 890A1 bzw.
mit Hilfe einer Amidohydrolase hergestellt, die in Species des Genus Protaminobacter vorkommt.
Das neue Verfahren gemäss der Erfindung beruht auf der Abspal-
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tung der N-Acetylgruppe der Verbindungen der Strukturformel
CH,-CH (OH) , S \ ?
3 I \ S-CH2-CH2-NH-C-CH3
COOH
und besteht darin, dass man die Verbindungen in innige Berührung mit einer Amidohydrolase bringt, die imstande ist, die
N-Acetylgruppe zu hydrolysieren. Insbesondere ermöglicht das Verfahren gemäss der Erfindung die N-Desacetylierung von
N-Acety!thienamycin, 890A-] und 890A* durch engen Kontakt dieser
Verbindungen mit der Amidohydrolase N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase.
Es wurde eine überraschende Homologie zwischen N-Acetyläthanolamin
und N-Acetylthienamycin gefunden, indem Extrakte von Mikroorganismen
mit dem bisher noch nicht beschriebenen Enzym N-Acetyläthanolamin-Amidohydrolase in vielen Fällen imstande
sind, N-Acetylthienamycin zu hydrolysieren. Ferner wurde gefunden,
dass Amidohydrolasen, die imstande sind, N-Acetylthienamycin zu hydrolysieren, auch die Fähigkeit haben, die
Antibiotica 890A^ und 890A^ in ihre neuen Desacetylformen
überzuführen. Ein anderes neues Merkmal der Erfindung bezieht sich auf das Verfahren zur Gewinnung solcher Mikroorganismen,
welches darin besteht, dass man diejenigen Stämme auswählt, die imstande sind, für ihr Wachstum N-Acetyläthanolamin auszunutzen,
und diese Mikroorganismen dann auf die Anwesenheit von N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase untersucht.
Das Antibioticum Thienamycin, welches nach dem neuen N-Desacetylierungsverfahren
aus N-Acetylthienamycin erhalten wird, ist ein wertvolles Antibioticum. Seine Beschreibung, Herstel-
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lung und gewerbliche Verwertbarkeit sind in der USA-Patentanmeldung
Serial Nr. 526 992 vom 25. November 1974 offenbart. Die Antibiotica Desacetyl--890A-| und Desacetyl—890A^ sind neue
und wertvolle Antibiotica.
Ein Merkmal der Erfindung ist die neue Desacetylierung von N-Acetylthienamycin. Es gibt zwei Quellen für N-Acety!thienamycin.
N-Acetylthienamycin wird durch Fermentation einer Flüssigkeit mit dem Mikroorganismus Streptomyces cattleya NRRL-8057
hergestellt. Dieser Mikroorganismus erzeugt ausserdem Thienamycin, welches dann chemisch N-acetyliert werden kann.
Auf Grund umfangreicher klassifizierender Untersuchungen wurde der aus einer Bodenprobe isolierte Mikroorganismus Streptomyces
cattleya als Actinomycete identifiziert und in der KuI-tursammlung
von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., als MA-4297 bezeichnet. Eine Kultur dieses Mikroorganismus ist permanent
in der Kultursammlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development
Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt worden und hat die
Kennzeichnungsnummer NRRL 8057 erhalten.
Die KlassifizierungsSchlussel für das Genus Streptomyces und
die Kulturbeschreibungen der Species Streptomyces in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (7-Auflage,
1957) und in "The Actinomycetes", Band II (1961) von
S.A. Waksman und in "Cooperative Descriptions of Type Cultures
of Streptomyces" von E.B. Shirling und D. Gottlieb, "International
Journal of Systematic Bacteriology", Band 18, Seite 69-189 (1968), Band 18, Seite 279-392 (1968), Band 19, Seite
391-512 (1969) und Band 22, Seite 265-394 (1972), wurden nach
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einer Species von Streptomyces durchsucht, die ähnliche
morphologische Eigenschaften und Kulturmerkmale aufweist wie MÄ-4297. In diesen klassischen Handbüchern ist jedoch keine
Species von Streptomyces mit der orchideenfarbigen Pigmentierung des Luftmycels, den morphologischen Merkmalen und der Abwesenheit von diffusionsfähigem Pigment beschrieben, die zusammen die unterscheidenden Merkmale von MA-4297 darstellen.
Aus diesem Grunde war die Identifizierung einer neuen Species von Streptomyces gerechtfertigt und notwendig.
morphologische Eigenschaften und Kulturmerkmale aufweist wie MÄ-4297. In diesen klassischen Handbüchern ist jedoch keine
Species von Streptomyces mit der orchideenfarbigen Pigmentierung des Luftmycels, den morphologischen Merkmalen und der Abwesenheit von diffusionsfähigem Pigment beschrieben, die zusammen die unterscheidenden Merkmale von MA-4297 darstellen.
Aus diesem Grunde war die Identifizierung einer neuen Species von Streptomyces gerechtfertigt und notwendig.
Die charakteristischen morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften
von Streptomyces cattleya sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Morphologie r- Die Sporophoren sind kompakte Spiralen, die
als Seiten- und Endverzweigungen an dem Luftmycel auftreten. Die Sporen sind ellipsoidal bis zylindrisch in der Form,
haben eine Grosse von 0,9μ x 1,2 u und kommen in Ketten von mehr als 10 vor.
als Seiten- und Endverzweigungen an dem Luftmycel auftreten. Die Sporen sind ellipsoidal bis zylindrisch in der Form,
haben eine Grosse von 0,9μ x 1,2 u und kommen in Ketten von mehr als 10 vor.
Kulturmerkmale
Tomatenbrei-Hafermehl-Agar
Tomatenbrei-Hafermehl-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - bräunlich, flach, sich
ausbreitend;
Luftmycel - Orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Weiss;
Lösliches Pigment - keines.
Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar)
Vegetatives Wachstum - farblos, flach, sich ausbreitend;
Luftmycel - spärlich, weiss mit rosa Stich;
Lösliches Pigment - keines.
Luftmycel - spärlich, weiss mit rosa Stich;
Lösliches Pigment - keines.
Eieralbumin-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich mit grau-orchideenfarbenem Anflug, flach, sich ausbreitend;
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Luftmycel - orchideenfarben (10 ge), gemischt mit helleren
Tönen von Orchideenfarben und etwas Weiss; Lösliches Pigment - keines.
Glycerin-Asparagin-Agar Vegetatives Wachstum - Rückseite - bräunlich mit grau-rosa
Anflug, flach, sich ausbreitend; Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit etwas Weiss;
Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar Vegetatives Wachstum - bräunlich mit grau-rosa Anflug;
Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Rosa-Weiss; Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Rosa-Weiss;
Lösliches Pigment - keines.
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftnycel - keines;
Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Melanin - negativ; HpS-Entwicklung - negativ.
Nähragar
Vegetatives Wachstum - hellbräunlich; Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines.
Nährstärke-Agar
Vegetatives Wachstum - rahmfarben bis bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Hydrolyse von Stärke - mäßig.
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Nährgelatine-Agar
Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - mäßig.
Senkrechtes Gelatineröhrchen Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - mäßig.
Kartoffelpfropfen
Vegetatives Wachstum - mäßig, bräunlich; Luftmycel - spärlich, gräulich-rosa-weiss;
Lösliches Pigment - keines.
Loefflersches Blutserum Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung - keine.
Magermilch-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - spärlich, weisslich;
Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Hydrolyse von Casein - positiv.
Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - bräunlich bis braun; Luftmycel - keines; Farbe - kein lösliches Pigment, Lackmusindikator wird
bläulich;
Koagulation und/oder Peptonisierung - teilweise Peptonisierung, wird alkalisch.
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Magermilch
Vegetatives Wachstum - bräunlich;
Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines;
Koagulation und/oder Peptonisierung - teilweise Peptonisierung, wird alkalisch.
Tyrosin-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich;
Luftmycel - Mischung aus Orchideenfarben (10 gc) und Weiss;
Lösliches Pigment - keines;
Zersetzung von Tyrosin - positiv.
Alle oben angegebenen Merkmale wurden, falls nichts anderes gesagt ist, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 C festgestellt.
Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Die in der Beschreibung
verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in "Color Harmony Manual", 4.Auflage (1958), herausgegeben
von der Container Corporation of America, Chicago, Illinois.
Streptomyces cattleya wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht,
verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus drei Wochen
bei 28 C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat in einer Konzentration
von 1 % enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH 6,8 bis 7,2).
Tabelle I zeigt die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces cattmeya, wobei + ein gutes Wachstum, - ein
schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.
- 11 -
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Glucose + Maltose -
Arabinose - Mannit +
Cellulose - Mannose
Fructose - Raffinose
Inosit - Rhamnose
Lactose - Saccharose Xylose
Für das Ausmaß des Wachstums mit Temperaturänderung, den
Sauerstoffbedarf und die Wirkung des Mikroorganismus auf Nitrat gilt folgendes:
Temperaturbereich (Hefeextrakt-Glucose + Salzagar); 28° C - gut
37° C - mäßig
50° C - kein Wachstum
37° C - mäßig
50° C - kein Wachstum
Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultur in Hefeextrakt-Glucose-
Salzagar);
aerob.
Nitratreduktion - positiv.
aerob.
Nitratreduktion - positiv.
Hinsichtlich der Erzeugung von Thienamycin ist die Erfindung nicht auf den Mikroorganismus Streptomyces cattleya oder auf
Mikroorganismen beschränkt, die den obigen Wachstumsmerkmalen und mikroskopischen Merkmalen vollständig entsprechen. Die Erfindung
umfasst vielmehr auch die Verwendung von Mutanten, die aus den oben beschriebenen Organismen durch verschiedene Hilfsmittel,
wie Röntgenstrahlen, ultraviolette Strahlen, N-Senfgas, Einwirkung von Phagen und dergleichen, erzeugt werden.
Thienamycin wird bei der aeroben Fermentation geeigneter wässriger
Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch Beimpfung
mit dem Organismus Streptomyces cattleya erzeugt. Für die Her-
- 12 -
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stellung von Thienamycin eignen sich die gleichen wässrigen Medien, die auch für die Herstellung anderer Antibiotica geeignet
sind. Solche Medien enthalten von dem Mikroorganismus assimilierbare C- und M-Quellen sowie anorganische Salze.
Ein anderes Merkmal der Erfindung ist die neuartige Desacetylierung
von 890A1 und 89OA5. 890A1 und 89OA5 werden durch
Fermentation einer Flüssigkeit mit dem Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 erzeugt. Das Antibioticum 890A1
kann auch durch Fermentation von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 hergestellt werden.
Auf Grund umfangreicher klassifizierender Untersuchungen wurde festgestellt, dass die Stämme von Mikroorganismen der Species
Streptomyces flavogriseus angehören, und diese sind in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., als
MA-4434a und MA-4600a bezeichnet worden. Eine Kultur eines jeden dieser Stämme ist unwiderruflich und permanent in der Kultursammlung
der Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural
Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, niedergelegt worden und hat die Kennzeichnungsnummer
NRRL 8139 bzw. 8140 erhalten.
Streptomyces flavogrisrus NRRL 8139 erzeugt beide Antibiotica
890A1 und 890A^, die in praktisch reiner Form aus der Fermenrationsflüssigkeit
isoliert werden. Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 erzeugt das Antibioticum 890A1 ohne nachweisbare
Mengen von 890A-
3'
Die charakteristischen morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale
von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 sind in der nachstehenden Übersicht zusammengestellt.
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Morphologie - Die Sporophoren sind sich verzweigende, gerade
bis geschlängelte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten haben eine Länge von mehr als 10 Sporen. Die Sporen sind
kugelförmig bis oval - 0,9w χ 1,2μ (bei 970-facher Vergrösserung).
Hafermehl-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich, pergamentartiges Wachstum;
Luftmycel - hellgrau mit mittelgrauem Rand; Lösliches Pigment - keines.
Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar)
Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit dunkelbraunem Rand;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig;
Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums.
Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums.
Eieralbumin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich
mit braunem Rand;
Luftmycel - mittelgrau, gemischt mit gelblichgrau (2dc)
Luftmycel - mittelgrau, gemischt mit gelblichgrau (2dc)
und graustichigem Gelb (2db);
Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.
Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.
Glycerin-Asparagin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich,
flach, sich ausbreitend;
Luftmycel - samtartig, hellgrau mit stark gelblichem Ton
Luftmycel - samtartig, hellgrau mit stark gelblichem Ton
bis grau (2dc);
Lösliches Pigment - keines.
Lösliches Pigment - keines.
Anorganische Salze-Stärkeagar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun; Luftmycel - mittelgrau, samtartig;
Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.
Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.
- 14 709822/1031
Hefeextrakt-Dextrose + Salzagar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit sehr dunkelbraunem
Rand;
Luftmycel - dunkelgrau, gemischt mit hellgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun;
Luftmycel - dunkelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
Magermilch-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - spärlich, gräulich; Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums;
Hydrolyse von Casein - gut.
Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - mäßiger Wuchsring, dunkelbräunlich; Luftmycel - keines;
Farbe - purpur;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung;
wird alkalisch, pH 8,2.
Magermilch
Vegetatives Wachstum - mäßiger Wuchsring, bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - bräunlich;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung;
wird alkalisch, pH 8,0.
Tyrosin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau;
Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - keine.
- 15 -
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Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - spärlich, gräulich;
Lösliches Pigment - keines; Melanin - keines;
HpS-Entwicklung - keine.
HpS-Entwicklung - keine.
Nähragar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - hell gräulichbraun mit
dunklerem graubraunen Rand; Luftmycel - hellgrau mit dunkelgrauem Rand;
Lösliches Pigment - keines„
Nährstärke-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich mit grauem Rand; Luftmycel - mittelgrau mit dunkelgrauem Rand;
Lösliches Pigment - keines; Hydrolyse von Stärke - gut.
Nährgelatine-Agar
Vegetatives Wachstum - farblos mit dunkelgrauem Rand;
Luftmycel· - gräulich-weiss; Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - gut»
Kartoffelpfropfen
. Vegetatives Wachstum - gutes Wachstum, stark gerunzelt; Luftmycel - grau bis grünlichgrau;
Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums.
Loefflersches Blutserum
Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung - keine.
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung - keine.
- 16 -
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Senkrechtes Gelatineröhrchen
Vegetatives Wachstum - rahmfarben;
Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines;
Verflüssigung von Gelatine - gut.
Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines;
Verflüssigung von Gelatine - gut.
Alle oben angegebenen Merkmale wurden, falls nichts anderes gesagt ist, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 C festgestellt.
Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Die in der Beschreibung
verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in "Color Harmony Manual", 4.Auflage (1958), herausgegeben
von der Container Corporation of America, Chicago, Illinois.
Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 wurde ferner auf seine Fähigkeit
untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus
drei Wochen bei 28° C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat
in einer Konzentration von 1 % enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral
(pH 6,8 bis 7,2). Tabelle II zeigt die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, wobei + ein
gutes Wachstum, - ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.
Glucose + Maltose +
Arabinose + Mannit +
Cellulose - Mannose +
Fructose + Raffinose -
Inosit - Rhamnose +
Lactose + Saccharose -
Xylose +
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Für das Ausmaß des Wachstums mit Temperaturänderung und den Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus gilt folgendes:
Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salzagar); 28° C - gut
37° C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50° C - kein Wachstum
Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultur in Hefeextrakt-Dextrose-Salzagar);
aerob.
aerob.
Die charakteristischen morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale
von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 sind in der nachstehenden Übersicht zusammengestellt.
Morphologie - Die Sporophoren sind sich verzweigende, gerade
bis geschlängelte Ketten von Sporen, die Büschel bilden. Ketten haben eine Länge von mehr als 10 Sporen. Die Sporen
sind rund bis oval - 0,9p x 1,2u (bei 970-facher Vergrösserung).
Hafermehl-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich mit dunkelbraunem Rand;
Luftmycel - hellgrau mit mittelgrauem Rand; Lösliches Pigment - keines.
Czapek-Dox-Agar (Saccharose-Nitrat-Agar) Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit dunkelbraunem
Rand;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
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Eieralbumin-Agar
Vegetatives Wachstum - Rückseite - gräulich-bräunlich mit stark gelbbräunlichen Abschnitten;
Luftmycel - mittelgraue, gräulich-weisse und gelblichgraue (2dc) Abschnitte;
Lösliches Pigment - sehr hellbräunlich.
Glycerin-Asparagin-Agar Vegetatives Wachstum - gelblich-bräunlich;
Luftmycel - spärlich, gräulich; Lösliches Pigment - keines.
Anorganische Salze-Stärke-Agar Vegetatives Wachstum - Rückseite - gräulich-rahmfarben;
Luftmycel - mittelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Dextrose + Salz-Agar Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun;
Luftmycel - dunkelgrau, gemischt mit hellgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines«
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun;
Luftmycel - dunkelgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar Vegetatives Wachstum, bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Melanin - keines; HpS-Entwicklung - keine.
Nähragar
Vegetatives Wachstum - hellbräunlich; Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines.
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Nährstärke-Agar
Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Hydrolyse von Stärke - gut»
Nährgelatine-Agar
Vegetatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines; Lösliches Pigment - keines;
Verflüssigung von Gelatine - gut.
Senkrechtes Gelatineröhrchen Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel — keines;
Lösliches Pigment - keines; Verflüssigung von Gelatine - vollständig.
Magermilch-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines; Hydrolyse von Casein - gut.
Lackmusmilch
Vegetatives Wachstum - bräunlicher Wuchsring; Luftmycel - keines;
Farbe - bräunlich-purpur;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptoni«
sierung, wird alkalisch, pH 8,0.
Magermilch
Vegetatives Wachstum - bräunlich, mäßiger Wuchsring; Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - hellbraun;
Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung,
wird alkalisch, pH 8,5.
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7 0 9 822/1031
is 837 IH 2852678
Kartoffelpfropfen
Vegetatives Wachstum - gut, bräunlich; Luftmycel - sehr spärlich, weisslich;
Lösliches Pigment - keines»
Loefflersches Blutserum
Vegetatives Wachstum - rahmfarben;
Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines;
Verflüssigung - keine«
Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines;
Verflüssigung - keine«
Tyrosin-Agar
Vegetatives Wachstum - bräunlich;
Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums; Zersetzung von Tyrosin - sehr schwach.
Falls nichts anderes angegeben ist, wurden alle obigen Beobachtungen
nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 C durchgeführt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr
neutral (pH 6,8-7,2). Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in "Color
Harmonv Manual", 4.Auflage (1958), Verlag Container Corporation of America, Chicago, Illinois.
Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 wurde ferner auf seine Fähigkeit
untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus
drei Wochen bei 28 C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat
in einer Konzentration von 1 % enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral
(pH 6,8-7,2). In Tabelle III ist die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 angegeben,
wobei + ein gutes Wachstum, - ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.
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Glucose + Maltose +
Arabinose + Mannit +
Cellulose - Mannose +
Fructose + Raffinose -
Inosit - Rhamnose +
Lactose + Saccharose
Xylose +
Für das Ausmaß des Wachstums bei Temperaturänderung und den Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus gilt folgendes:
Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salz-Agar);
28° C - gut
37° C - mäßiges vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50° C - kein Wachstum
Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultur in Hefeextrakt-Dextrose-Salzagar);
aerob.
Die Erzeugung von 890A,. und 890A^ ist nicVit auf den Mikroorganismus
Streptomyces flavogriseus oder auf Mikroorganismen beschränkt, die den obigen Wachstumsmerkmalen und mikroskopischen
Merkmalen vollständig entsprechen. Die Erfindung umfasst vielmehr auch die Verwendung von Mutanten, die aus den
oben beschriebenen Organismen durch verschiedene Hilfsmittel, wie Röntgenstrahlen, ultraviolette Strahlen, N-Senfgas, Einwirkung
von Phagen und dergleichen, erzeugt werden.
^ und 890A^ werden bei der unter gesteuerten Bedingungen
durchgeführten aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien erzeugt, die mit Stämmen des Organismus Streptomyces
flavogriseus beimpft worden sind. Für die Herstellung von
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890A1 und 890A^ eignen sich wässrige Medien, wie diejenigen,
die auch zur Erzeugung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche Medien enthalten C-, N-Quellen und anorganische Salze,
die von dem Mikroorganismus assimiliert werden.
Die Verbindungen gemäss der Erfindung Desacetyl-890A1 und Desacetyl-890A^
sind wertvolle Antibiotica, die gegen die verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aktiv
sind und daher sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin Verwendung finden. Die Verbindungen gemäss der
Erfindung können als antibakterielle Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive
oder gram-negative Bakterien verursacht werden, z.B. gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae und Pseudomonas aeruginosa. Die antibakteriellen Mittel gemäss der Erfindung
können ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden.
Zum Beispiel können sie in wässrigen Mitteln in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 100 Teilen Antibioticum je Million
Teile Lösung oder vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 1 bis 10 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung verwendet
werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Ausrüstungsgegenständen zu zerstören
und zu hemmen, sowie als Bactericide für technische Anwendungszwecke, z.Bο in Anstrichfarben auf wässriger Basis, in
dem Siebwasser von Papierfabriken und zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien.
Die Antibiotica gemäss der Erfindung können in den verschiedensten
pharmazeutischen Präparaten als alleinige Wirkstoffe oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antibiotica
oder mit einem oder mehreren pharmakologisch aktiven Stoffen verwendet werden. Als Beispiel für den erstgenannten
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15 837
Fall kann ein Aminocyclitol-Antibioticum, wie Gentamicin, mit
den Antibiotica gemäss der Erfindung gemeinsam dargereicht
werden, um die Möglichkeit des Auftretens von resistenten Organismen
auf ein Minimum zu beschränken. Als Beispiel für den letzteren Fall kann man Diphenoxylat und Atropin in Dosisformen
für die Behandlung von Magen-Darmerkrankungen kombinieren. Die Antibiotica können in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern,
flüssigen Lösungen oder als Suspension oder Elixiere verwendet werden. Sie können oral, lokal, intravenös oder
intramuskulär dargereicht werden.
Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisform
vorliegen und herkömmliche Streckmittel, wie Bindemittel, Z0B0 Sirup, Akazienharz, Gelatine, Sorbit,
Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon, Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin,
Gleitmittel, z.B„ Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol,
Siliciumdioxid, den Zerfall fördernde Mittel, z.B. Kartoffelstärke
oder unbedenkliche Netzmittel, wie Nätriumlaurylsulfat,
enthalten. Die Tabletten können nach an sich bekannten Metho- '■ , den beschichtet sein. Oral darzureichende flüssige Präparate
^- können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen,
Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw. vorliegen oder als %; trockenes Produkt zum Anmachen mit Wasser oder anderen geeigneten
Trägern vor der Verwendung hergestellt werden. Solche flüssigen Präparate können herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel,
z.B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose,
Alüminiumstearatgel oder hydrierte geniessbare Fette, Emulgiermittel, z.B. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akazienharz,
nicht-wässrige Träger, wie geniessbare Öle, z.B. Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, Propylenglykol
oder Äthylalkohol, Konservierungsmittel, z.B. p-Hydroxybenzoe-
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7 09822/1031
säuremethyl- oder -propylester oder Sorbinsäure, enthalten.
Zäpfchen enthalten herkömmliche Zäpfchenbasen, wie Kn-^orutter
oder andere Glyceride.
Mittel für die Injektion können in Einheitsdos isf orm in An-pullen
oder in Mehrfachdosisform in r.ehüibern unter Zusatz von
Konservierungsmitteln zur Verfügung ft;:.-te7.lt -.ve rc en. Dia I'ittel
können die Form von Suspension'η, Lösungen, Emulsionen in
öligen oder wässrigen Trägern aufweisen und vorniuli?rj-.Tsnittel,
wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel
enthalten. Der 'wirkstoff kann auch in Pulverform vorliegen
und vor der Verwendung mit einer. geeign?ten Träger, z.3.
sterilem, pyrogenfreierr. Wasser, angemacht werden.
Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und de.^ Rachens oder der Ercnchialgewebe
geeigneter Form hergestellt werden, z.B. als Pulver oder flüssige Sprüh- oder Inhaliermittel, Pastillen, Rach-^nanstrichrnittel
usw. Zur Behandlung der Augen oder Ohren kc· .:~n die Präparate
als einzelne Kapseln, in flüssiger odsr halbflüss-gor
Form zur Verfügung gestellt oder als Tropfen usw. ver".·"->niet
werden. Für die lokale '-.pplika tion können sie in hydrophoben
oder hydrophilen Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Anstrichmittel, Pulver usw. vorliegen.
Ausser einem Träger können die Mittel gemäss der Erfindung andere
Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Oxidationsverzögerer,
Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, die Viscosität beeinflussende Mittel oder Geschnacksstoffe
und dergleichen, enthalten.
In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Kühnem, Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, können die Mittel
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709822/1031 BAD omaWAL
z.B. als Präparate zum Injizieren in die Erust formuliert
werden, die auf Langzeitwirkung abbestellt sini oder den V.'irkstoff
schnell in Freiheit setzen.
Die darzureichende Dosis richtet sich weitgehend nach dem Zustand
des zu behandelnden Tiare.?., iem Gewicht desselben und
der Art der Infektion, der Art und Häufigkeit der Darreichung, wobei die parenterale Darreichung bei allgemeine··; Infektionen
und die orale Darreichung bei Darninfektiorien bevorzugt virex.
Zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei^i X..nschen werden
die Verbindungen gemäss der Erfindung oral o"er p2.renter.~:l
nach herkömmlichen Methoden für die borimid .lung mit Antibiotics
in Mengen von etwa 2 bis 600, vorzugsweise etwa L~>
bis ICO mg/kg/Tag dargereicht und vorzugsweise in Einzeldosen unterteilt,
die ZoB. drei- bis viermal pro Tag dargereicht v/erden. Es können Einheitsdosisforraen verwendet werden, dia z.B. 2.5,
250, 330, 400 oder 1000 mg V/irk.= toff zusammen ;.:i~ physiologisch
unbedenklichen Tragern oder Streckraitteln civtnslten.
Die Dosiseinheiten liegen in Form von flüssigen Präparaten,
wie Lösungen oder Suspensionen, oder als feste Stoffs in Tabletten
oder Kapseln vor. Die optimale Dosis richtet sich für jeden einzelnen Fall nach Art und Schwere der Injektion, wobei
für die Behandlung von Kindern kleinere Dosen angewandt werden; alle derartigen Bemessungsregeln sich den Fachmann bs~
kannt.
Das Antibioticum Thienamycin kann in der gleichen Weise dargereicht
werden wie die Antibiotica Desacetyl-~89ÖA- und Desacetyl-890A,,.
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BAD QÜQiiMAL
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Analysenverfahren auf Antibioticum N-Acetylthienamycin
I. Bioanalyse
Analysen auf die antibakterielle Aktivität werden nach der folgenden Scheibendiffusionsrnothode unter Verwendung von
Vibrio percolans ATCC 8461 odor Staphylococcus aureus ATCC 6538P als PrüfOrganismus durchgeführt.
Platten mit Vibrio percolans ATCC 8461 werden folgendermaßen
hergestellt:
Eine gefriergetrocknete Kultur von Vibrio percolans ATCC 8-61
wird in 15 ml eines sterilen Mediums suspendiert, welches 8 g/l Difco-Nährbrühe und 2 g/l Hefeextrakt in destilliertem
Wasser enthält (nachstehend aus KnYE abgekürzt). Die Kultur
wird übernacht in einer rotierenden Schüttslmaschine bei 28 C
inkubiert. Diese Kultur wird verwendet, um die Oberfläche veη
Schrägröhrchen zu beimpfen, die 1,5 % Agar in Ν3ΥΞ enthalten.
und die beimpften Schrägröhrchen werden übernacht bei 23"1 C
inkubiert und dann im Kühlschrank aufbewahrt.
Die aus einer einzigen gefriergetrockneten Kultur her?.o.stellten
gekühlten Schrägröhrchen werden für einen Zeitraum bin zu
4 Wochen nach ihrer Herstellung folgendermaßen verwencat:
Eine Öse mit Impfgut aus dem Schrägröhrchen wird in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben in 50 ml NBYE dispergiert. Die Kultur
wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50-prozentige
Lichtdurchlässigkeit bei 66Ο nm ergibt. 33,2 ml dieser verdünnten Kultur v/erden zu einem Volumen von 1 1 NBYS zugesetzt,
das 15g Agar enthält und auf 46° C gehalten wird. Das beimpfte, agarhaltige Medium wird in Petrischalen aus
Kunststoff von 100 χ 15 mm in Mengen von 5 ml je Schale ge-
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gössen, gekühlt und bis zu einem Zeitpunkt von 5 Tagen vor
der Verwendung auf 2 bis 4 C gehalten.
der Verwendung auf 2 bis 4 C gehalten.
Platten mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P werden folgendermaßen
hergestellt:
Eine übernacht entwickelte Kultur des Analysenorganisiriv.5
Staphylococcus aureus ATCC 6538P in NährbrUhe, die 0.2 % Hofe— extrakt enthält, wird mit 0,2 % Kefeextrakt enthaltender Nöhrbrühe zu einer Suspension mit einer optischen Durchlässigkeit von 55 % bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt. Diese
Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2,0 g/1 Difco-Hefeextrakt ergänzt worden ist und sich auf einer Temperatur von 47 bis UQ C befindet, wobei man eine Mischung erhält, die 33,2 ml der Sue-pension .je Liter Agar enthält.. 5 eil
dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 r.rn Durchmesser gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 C gehalten.
Staphylococcus aureus ATCC 6538P in NährbrUhe, die 0.2 % Hofe— extrakt enthält, wird mit 0,2 % Kefeextrakt enthaltender Nöhrbrühe zu einer Suspension mit einer optischen Durchlässigkeit von 55 % bei einer Wellenlänge von 660 nm verdünnt. Diese
Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2,0 g/1 Difco-Hefeextrakt ergänzt worden ist und sich auf einer Temperatur von 47 bis UQ C befindet, wobei man eine Mischung erhält, die 33,2 ml der Sue-pension .je Liter Agar enthält.. 5 eil
dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 r.rn Durchmesser gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 C gehalten.
Proben des zu analysierenden Antibioticums werden mit Fhosphatpufferlösung
vom pH 7 auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Filterpapierscheiben rait einen Durchmesser von 6,55
oder 12,7 mm werden in die Testlösung getaucht und auf die
Oberfläche der Analysenplatten gelegt. Die Platten werden
übernacht bei 37 C inkubiert, worauf man den Durchmesser der Hemmzone in Millimeter bestimmt. Der Durchmesser der Kemir.-.one in Millimeter bestimmt die relative Stärke.
oder 12,7 mm werden in die Testlösung getaucht und auf die
Oberfläche der Analysenplatten gelegt. Die Platten werden
übernacht bei 37 C inkubiert, worauf man den Durchmesser der Hemmzone in Millimeter bestimmt. Der Durchmesser der Kemir.-.one in Millimeter bestimmt die relative Stärke.
II. Durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion (absorbance)
Der Anteil der bei 301 nm gemessenen Extinktion (absorbance), der auf den Gehalt unreiner Proben an dem Antibioticum zurückgeführt
werden kann, wird durch die selektive Auslöschung dis-
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ORIGINAL INSPECTED
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709822/1031
ser Extinktion (absorbance) (unter gleichzeitiger Inaktivierung
der antibiotischer /-ktivität) durch Reaktion mit verdünntem
Hydroxylamin bestimmt.
Proben, die das zu untersuchende Antibioticum enthalten, werden in 0,01-molarer Kiliumphocphatpufferlösung (pH 7) so hergestellt,
dass sie eine anfängliche A7^1 zwischen 0,1. und 1,0
aufweisen. Frisch hergestelltem, neutralisierten Hydroxylamin
(NH2OH-HCl + NaOH bis zu einem End-pH-wert vcn 1) wird bis zu
einer Endkonzentration von 10-mmolar zugesetzt, worauf ττ.βη
die Reaktion bei Raumtemperatur mindestens 30 Minuten ablauf ei": lässt, ^enn man den so erhaltenen A^n.-Wert von der ursprünglichen
Ablesung (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagens) subtrahiert, erhält man die durch
Hydroxylamin ausiöschbare Lxtinktion (absorbance). Lösungen
von reinem N-Acetylthienamycin zeigen eine durch Hydroxylamin
auslöschbare Extinktion (absorbance) von 86,0 %.
Analysenverfahren für Thienamycin
I. Bioanalyse
I. Bioanalyse
Analysen der antibakteriellen Aktivität werden, falls nichts anderes angegeben ist, nach der folgenden Scheibendiffusionsmethode
durchgeführt. Die Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine Übernacht entwickelte Kultur des
Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6535? in Klihrbrühe,
die 0,2 % Hefeextrakt enthält, wird mit 0F2 % Hefeextrakt
enthaltender Nährbrühe zu einer Suspension mit einer optischen Durchlässigkeit von 55 % bei einer Wellenlänge vcn
660 nm verdünnt. Diese Suspension wird zu Difco-Xähragar zugesetzt,
das durch 2,0 g/l Difco-Hefeextrakt ergänzt worden i~t und sich auf einer Temperatur von 47 bis 48 C befindet, wobei
man eine Mischung erhält, die 33,2 ml der Suspension je Liter Agar enthält. 5 ml dieser Suspension werden in Petri-
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schalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und diese Platten werden
gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 C gehalten.
Proben des zu analysierenden Antibioticums werden mit Phosphatpufferlösung
vom pH 7 auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 12,7 πιτ.
werden in die Testlösung getaucht und auf die Oberfläche der
Analysenplatten gelegt; zwei Scheiben einer jeden Prob? werden normalerweise einander gegenüber auf eine Platte aufgelegt.
Die Platten werden übernacht bei 37 C inkubiert, und
die Hemmzone wird in Millimeter Durchmesser gc^ess^n» Die in
Millimeter gemessene Hernrr.zcri-2 bestimmt dia relativen Stärken
oder, wenn sie mit einem gereinigten Bezugsstani?ird, wie
Cephalothin, verglichen wird, die Stärke des Antibioticum in
Einheiten/ml. Die Aktivitätseinheit hat Cephalot'nin-Standard.-lösungen
von 8, 4, 2 und 1 y/ml zur Grundlage. Sine Einheit
ist als diejenige Menge definiert, die dar Berechnung zufolge die gleiche Hemmung erzeugt wie 1 γ Cephalothin ja Milliliter,
wobei diese Hemmzone einen Durchmesser zwischen 16 und 21 mn aufweist.
II. Durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion (absorbance)
Der Anteil der bei 297 nm gemessenen Extinktion (absorbancc),
der auf den Gehalt unreiner Proben an dem Antibioticum zurückgeführt
werden kann, wird durch die selektive Auslöschung dieser Extinktion (absorbance) (unter gleichzeitiger Inaktivierung
der antibiotischen Aktivität) durch Reaktion mit verdünntem Hydroxylamin bestimmt.
Proben werden in 0,01-molarer Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7,0) so hergestellt, dass sie eine anfängliche A~QV zwisehen
0,05 und 2,0 aufweisen. Frisch hergestelltes, neutral!-
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ORIGINAL INSPECTED
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siertes Hydroxylamin (NHpOH.HCl + NaOH bis zu eins:" Enc-pH-wert
von 7) wird bis zu einer Endkonzentration von 1O-mmolar
zugesetzt, worauf man die Reaktion bei Raumtemperatur mindestens
30 Minuten ablaufen lässt. Wenn man den so erhaltenen Apqy-Wert von der ursprünglichen Ablesung (nach Korrektur für
die Verdünnung durch das zugesetzte Reagens) subtrahiert, erhält man die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion
(absorbance). Lösungen vcn reinem Thienamycin zeigen eine
durch Hydroxylamin auslöschb;re Extinktion (absorbance) vcn
94,5 56.
Analysenmethoden für 890A^ und 890A^
Eine Agarplatten-Scheibendiffusionsmethode wird angewandt,
wobei entweder Vibrio percolans ATCC 8461 oder Salmonella gallinarum
MB-1287 als PrüfOrganismus verwendet wird. Eine gereinigte
Probe des Antibioticum^ 89CA1 wird als Standard verv/endet.
Platten, die Vibrio percolans ATCC S461 enthalten, werden folgendermaßen
hergestellt:
Eine gefriergetrocknete Kultur von Vibrio percolans ATCC 8451
wird in 15 ml eines sterilen Mediums suspendiert, welches 8 g/l Difco-Nährbrühe und 2 g/l HefeextraVt in destilliertem
Wasser enthält und als "Nährbrühe-Hefeextrakt" (nachstehend als NBYE abgekürzt) bezeichnet wird. Die Kultur wird übernacht
in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 C inkubiert. Diese Kultur wird verwendet, um die Oberfläche von
Schrägröhrchen zu beimpfen, die 1,5 % Agar in NBYE enthalten, und die beimpften Schrägröhrchen werden übernacht bei 28° C
inkubiert und dann im Kühlschrank aufbewahrt.
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Die aus einer einzigen gefriergetrockneten Kultur hergestellten gekühlten Schrägröhrchen werden für einen Zeitraum bis zu
4 Wochen nach ihrer Herstellung folgendermaßen verwendet:
Eine Öse mit Impfgut aus dem Schrägröhrchen vrird in einem
250 ml-Erlenmeyerkolben in 50 ml Γ»Ί;ϊΞ dispergiert. Eie Kultur
wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28"
inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50-prozentige Lichtdurchlässigkeit bei 660 nm ergibt. 33,2 ml dieser
verdünnten Kultur werden zu einem Volumen von 1 1 Ν3ΥΞ zugesetzt,
das 15g Agar enthält und auf A6 C gehalten wird.
Das beimpfte, agarhaltige Medium wird in Petrischalen aus Kunststoff von 100 χ 15 mm in Kengen von 5 ml je Schale gegossen,
gekühlt und bis zu einem Zeitpunkt von 5 Tagen vor der Verwendung auf 2 bis 4° C gehalten.
Die Salmonella gallinarum MB-1287 enthaltenden Platten werden
folgendermaßen hergestellt:
Ein verschlossenes Rohr, das gefrorene und gefriergetrocknete Zellen von Salmonella gallinarum MB-1287 in Magermilch enthält
und unter Vakuum verschlossen worden ist, wird geöffnet und auf 15 ml Hirn-Herz-Aufgussbrühe aufgeimpft. Man lässt die
Zellen ohne Schütteln bei 37 C übernacht wachsen, und die Kultur wird auf Schrägröhrchen aufgeimpft, die 0,8 50 BBL-Nährbrühe
+ 0,2 % Difco-Hefeextrakt + 1,5 % Agar enthalten. Mach dem Wachstum übernacht bei 37° C wird eine Öse der Kultur aus
dem Schrägröhrchen in einen Kolben übertragen, der 50 ml 0,8-prozentige Nährbrühe + 0,2-prozentigen Hefeextrakt enthält.
Der Kolben wird übernacht geschüttelt, und 1 1 von 0,8 % Nähr-
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brühe + 0,2 % Hefeextrakt + 1,5 % Agar, der zuvor sterilisiert
und auf 48 C gekühlt vor den ist, wird mit 20 ml dieser Politur
beimpft. Das beimpfte KBYE-Agar wird sofort in Petrischale:!
aus Kunststoff von 100 χ 15 mm (5 ml je Schale) gegossen, und
die Platten werden bis zur Verwendung auf 0 bis 5 C gehalten.
Filterpapierscheiben von 12,7 rcm Durchmesser v.-srden in die zu
analysierende Lösung getaucht und ->uf das Agar aufgelegt. Nach
einer anderen Methode können die Scheiben beladen werden, indem man 0,1 ml der Lösung auf eine trockene Scheibe aufpipettiert
und die Scheibe dann auf das Agar auflegt. Nach geeigneter
Inkubation (für Salmonella gallinarun ΓΟ-1257 9 bis 18
Stunden bei 37° C, für Vibrio percolans ATCC 8461 12 bis 24
Stunden bei 25 C) wird der Durchmesser der Hsmmzone gemessen.
Falls erforderlich, v/erden Verdünnungen der zu analysierenden Lösungen in 0,05-molarem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,^; nachstehend
als KPB abgekürzt) oder in entmineralisiertem Wasser
hergestellt.
Die Stärke wird folgendermaßen berechnet: Ein Gefälle wird bestimmt, indem man die Zonendurchmesser einer Lösung des Antibioticums
890A1 oder 890A^ und einer vierfachen Verdünnung
dieser Lösung (in KPB) misst. Zv/ei- Scheiben einer jeden Konzentration
werden auf einer einzigen Platte analysiert, und die mittlere Zonengrösse wird bei einer jeden Konzentration
bestimmt. Das Gefälle ist gleich der Hälfte der Differenz der Mittelwerte der Zonengrcssen. Die Stärke wird dann nach der
folgenden Gleichung berechnet:
Stärke (Einheiten/ml) =
-D3] log 2
Gefälle (Stärke des Standards) χ Verdünnung χ 10
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In der obigen Gleichung bedeuten D den mittleren Durchmesser
der von der unbekannten Probe gebildeten Zonen, D-, den mittleren
Durchmesser der Standardzonen und "Verdünnung11 den Grad,
zu dem die unbekannte Probe vor der Analyse verdünnt worden
ist. Wenn kein Standard verwendet v.ird, ni^.-r.t man D„ als 23 mn
und die Grosse (Stärke des Srandaris) als 1 Einh-it/ml an,
wenn als Prüforganismus Vibrio porcolans ATCC 8·'ν6ΐ verwendet
wird. Es wird bestimmt, dass reines 890Λ-, eins Sv-.'.rke von
250 Einheiten je Einheit der durch Hydroxylamin ^uslöcchbaren
Extinktion (absorbance) bei 300 nz>. hat, wc-rir. es als Standard
verwendet wird. Dementsprechend beträgt die Stärke des Aritibioticums
890A7, 31 Einheiten je Einheit der durch Hydroxylamin
auslöschbaren Extinktion (absorbance) bei 300 n.T;.
Für Analysen auf Platten mit Salmonella gallinarun MB-I287
wird das Gefälle in der gleichen Waise wie mit Vibrio porcolans
ATCC 8461 bestimmt. Wenn kein Standard vervmdst wird,
werden nur relative Stärken berechnet, ''denn kein Gefälle gemessen
wird, wird ein Wert von 2,3 ram angenommen. Die Stärkeberechnungen
werden, wie bei der Analyse mit Vibrio percolsns ATCC 8461, durchgeführt» Wenn kein 890A1-Standard verwendet
wird, kann man mit einer Kontrolle vcn Penicillin G bei 250 γ/ml arbeiten, um nachzuweisen, dass die Empfindlichkeit
der Organismen im normalen Bereich liegt.
II. Analysenmethcde zur Bestimmung von "890-Anglyseneinheiten"
Man arbeitet nach der herkömmlichen Scheiben-Flattenanalysenmethode
mit Scheiben von 12,7 mm Durchmesser. Man arbeitet mit routinemäßig vergossenen 10 ml pro Platte, beimpft mit Vibrio
percolans (ATCC 8461) und verwendet als Standard Cephaloridin. Vier Konzentrationen von Cephaloridin, nämlich 3,12, 6,25,
12,5 und 25 r/ml, bilden den Standard, wobei die Konzentration
von 12,5 7/ml als Bezugslösung verwendet wird. Die Zonendurch-
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MMftlNAL WSPECTEO
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messer auf einer 5-ml-Platte für den Standard sind die folgen
den:
| Konzentration, | ,12 | γ /ml |
| 3 | ,25 | |
| 6 | • - | |
| 12 |
16.δ 22,3 25,0 29,6
Eine Einheit ist als diejenige Menge des Antibioticums definiert,
die auf einer 5 ml-?latte eine Kemmzone vcn 25 mm erzeugt.
Daher wird bei dieser Analyse eine Konzentration an Cephaloridin von 12,5 y/ml als einer Einheit von 890A äquivalent
angesehen. Da das Gefälle der Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, werden die Berechnungen der Stärke einer Probe unter
Verwendung eines Gefälles von 4,0 vorgenommen.
III. Hydroxylaminreaktion
Die beiden Antibiotica 890A1 und 890A^ reagieren rait Hydroxylamin
unter Bildung eines Stoffes, der die Extinktion (absorbance) bei 300 nm stark vermindert. Dies liefert eine
Grundlage für die quantitative Analyse auf die Antibiotica und
Die zu analysierende Lösung wird in einer Kaliumphosphatlösung (pH 7,4) auf 0,05-molar eingestellt, indem man 1/20 Raumteil
einer Lösung von 0,8-molar K^1HPO<
und 0,2-molar KHpPO^
zusetzt. Dann setzt man I/IOO Raumteil 1-molar Hydroxylaminhydrochlorid
zu und bestimmt in Zeitabständen von 1/2 bis 2 Minuten die Extinktion (absorbance) bei 300 nm. Die Umsetzung
wird bei 22 bis 28 C durchgeführt. Man nimmt eine kinetische Reaktion erster Ordnung an und bestimmt die Halbwertszeit aus
der Abnahme der Extinktion (absorbance) während der ersten 10 Minuten. Aus dieser Halbwertszeit wird der Zeitpunkt geschätzt,
über den hinaus keine weitere Abnahme der Extinktion
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(absorbance) beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen
werden über diesen Zeitpunkt hinaus fortgeführt, tienn keine
weitere Abnahme über diesen Zeitpunkt hinaus beobachtet wird,
wird die gesamte Abnahme der Extinktion (absorbance) (korrigiert für den Verdünnungseffekt und die Extinktion (absorbar.ce)
des Hydroxylamine) als "durch Hydroxylamin auslcschbare Extinktion
(absorbance) bei 300 nm" festgesetzt (nachstehend abgekürzt
als HAEA^00)= Wenn über diesen Zeitpunkt hinaus eine
Abnahme der Extinktion (absorbance) stattfindet, wird die Geschwindigkeit der Abnahme der Hintergrundextinktion berechnet
und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt für die Abnahme
der Hintergrundextinktion korrigiert, wobei angenommen wird, dass die Abnahme der Hintergründextink.ti.on. linear mit
der Zeit verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als ΗΛΕΑ
verzeichnet.
Die Anzahl der HAEA,00-Einheiten ist gleich dem V/ert von
, multipliziert mit dem Volumen in ml.
Verfahren zum Isolieren von N-Acetylthienamycin-Amidohydrolaso
erzeugenden Organismen
Man stellt eine Suspension von 1 g fruchtbarem Rasenboden in 100 ml steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung der folgenden
Zusammensetzung her:
NaCl 8,8 g
1-molarer Phosphatpuffer, pH 7,5* 10 ml destilliertes Wasser 1000 ml
* 1-molarer Phosphatpuffer, pH 7,5 16 ml 1-molare KH2PO^-Lösung werden mit 84 ml
1-molarer KpHPO/ -Lösung gemischt. Der pH-Viert des
Phosphatpuffers wird durch Zusatz von etwas 1-molarer KH2PO^-LoSUiIg oder 1-molarer K2HPO^-Lösung
auf 7,5 eingestellt.
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Anteile dieser 1-%igen Stammbodensuspension werden verwendet,
um 10-fache, 100-fache und 1000-fache Verdünnungen herzustellen.
Anteile der Stammsuspension zu je 1 ml bzw. Anteile der 10-fachen, 100-fachen und 1000-fachen Verdünnungen zu je 1 ml
werden zu je 2 ml steriler, 1,0-%iger Agarlösung bei" 4S° C zugesetzt.
Die Gemische werden schnell über die Oberfläche von sterilen Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, die je
20 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium A
KH2PO4 3,0 g
K2HPO4 7,0 g
MgSO4 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml N-Acetyläthanolaminlösung* 8,5 ml
* N-Acetyläthanolaminlösung
N-Acetyläthanolamin wird mit Wasser auf das 10-fache
verdünnt und membransterilisiert. Diese Losung wird nach der Autoklavbehandlung zugesetzt.
Für feste Medien setzt man 20 g Agar zu.
Die Petrischalen werden 18 Tage bei 28° C inkubiert. Gut isolierte
Kolonien werden ausgewählt und auf Medium B aufgestrichen. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:
Medium B
Tomatenbrei 40 g
Gemahlenes Hafermehl 15 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 6 eingestellt. Für feste Medien werden 20 g Agar zugesetzt.
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Einzelne Klone werden ausgewählt und 2 Tage bei 28 C auf Schrägröhrchen von Medium 3 gezüchtet.
Ein Teil der Schrägröhrchenkultur wird verwendet, um einen
250 ml-Erlenmeyerkolben, der 50 ml Medium A enthält, einen
250 ml-Erlenmeyerkolben, der 50 ml ergänztes Medium B enthält
(ergänzt nach der Autoklavbehandlung durch 0,4 ml einer menbransterilisierten
Lösung von mit Wasser auf das 1C-fache verdünntem N-Acetyläthanolamin), und einen 250 ml-Srlenmeyerkolben,
der 50 ml Medium C enthält, zu beimpfen. Medium C hat die
folgende Zusammensetzung:
Medium C
| Dextrose | 20 g |
| Pharmamedia | S g |
| Maisquellwasser | |
| (auf Nassbasis) | 5 g |
| destilliertes Wasser | 1000 ml |
pH mit NaOH oder HCl auf 7 eingestellt N-Acetyläthanolaminlösung* 8,5 ml
* N-Acetyläthanolaminlösung
N-Acetyläthanolamin wird mit Wasser auf das 10-fache verdünnt und membransterilisiert. Diese Losung wird
nach der Autoklavbehandlung zugesetzt.
Die Kolben werden 4 Tage bei 28° C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm)
geschüttelt. 30 ml eines jeden Kolbeninhalts werden 15 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Der überstehende Teil wird entfernt,
so dass nur genug hinterbleibt, um eine dicke Suspension von Zellen und Mediumfeststoffen zu bilden. Die Hälfte
der Suspension wird in einem Branson-Eeschallungsgerät, Modell LS-75, mit einer 12,7 mm-Sonde der Ultraschallbehandlung
unterworfen, um die Zellen zu zerreissen. Die Ausgangsleistung wird auf die Stellung Nr0 4 eingestellt, und man arbeitet
mit vier aufeinanderfolgenden Beschallungstakten zu je
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15 Sekunden, wobei die Suspension während und zwischen den einzelnen Beschallungsvorgängen in Eiswasser gekühlt wird.
Um das Ganzzellenpräparat oder das Beschallungsprodukt auf N-Acetylthienamycin-Amidohydrolaseaktivität zu untersuchen,
werden Anteile beider Suspensionen analysiert, indem man je 5 ul dieser Suspensionen mit Lösungen inkubiert, die 20 μΐ
einer Lösung von 1,586 mg N-Acetylthienamycin je ml 10-mmoiarer
Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) und 10 ul 0,2-molare Kaliumphosphatpufferlösung" (pH 7,4) enthalten. Kontrollversuche
werden einerseits mit Antibioticum und Puffer allein und andererseits mit Zellensuspensionen durchgeführt, die kein
Antibioticum enthalten. Nach dem Inkubieren dieser Gemische übernacht bei 28° C- werden 2 iil-Anteile entnommen und auf mit
Cellulose beschichtete Dünnschichtchromatographieplatten (TLC-Platten) aufgebracht, die dann mit einem Gemisch aus 70 %
Äthylalkohol und 30 % Wasser entwickelt werden. Nach dem Trocknen an der Luft werden die TLC-Platten 5 Minuten auf
Analysenplatten von Staphylococcus aureus ATCC 6538P aufgelegt,
Die TLC-Platten werden entfernt und die Analysenplatten über-,o
J l
Die Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine übernacht in Nährbrühe mit einem Hefeextraktgehalt von
0,2 % entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P wird mit Mährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt
enthält, zu einer Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 nm eine optische Durchlässigkeit von 60 %
aufweist. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt ist und sich
auf einer Temperatur von 47 bis 48 C befindet; das so erhaltene
Gemisch enthält 33,2 ml der Suspension je Liter Agar. 40 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 22,5 x ■
22,5 cm gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur
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Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4° C gehalten.
Die Aktivität an N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase in den inkubierten
Gemischen ergibt sich aus einem bioaktiven Bereich bei R-. 0,44-0,47, der auf Thienamycin zurückzuführen ist. Das
nicht-umgesetzte, bioaktive N-AcetylthienaEycin erscheint bei R-P 0,7-0,89. Das Verfahren dieses Beispiels ermöglicht die
Isolierung von N-Acetyläthanolamin-Amidohydrolase erzeugenden
Mikroorganismen mit N-Acetylthienamycin-Amidohydrolaseaktivität.
Man stellt eine Suspension von 1 g fruchtbarem Rasenboden in 100 ml steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung der folgenden
Zusammensetzung her:
NaCl 8,8 g
1-molarer Phosphatpuffer, pH 7,5* 10 ml destilliertes Wasser 1000 ml
* 1-molarer Phosphatpuffery pH 7,5
16 ml 1-molare KH^PO;-Lösung werden mit 84 ml
1-molarer KpHPO/-Lösung gemischte Der pH-Wert des
Phosphatpuffers wird durch Zusatz von etwa 1-molarer KH2P0^-Lösung oder 1-molarer K^HPO^-Lösung
auf 7,5 eingestellt.
Anteile dieser 1-%igen Stammbodensuspension werden verwendet,
um 10-fache, 100-fache und 1000-fache Verdünnungen herzustellen.
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Anteile der Stammsuspension zu je 1 ml bzw. Anteile der 10-fachen, 100-fachen und 1000-fachen Verdünnungen zu je 1 ml
werden zu je 2 ml steriler, 1,O-?oiger Agarlösung bei 43° C zugesetzt.
Die Gemische werden schnell über die Oberfläche von sterilen Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, die je
20 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthalten.
Medium A
KH2PO4 3,0 g
K2HPO4 7,0 g
MgSO4 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml
N-Acetyläthanolaminlösung* 8,5 ml
* N-Acetyläthanolaminlösung
N-Acetyläthanolamin wird mit Wasser auf das 10-fache
verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autokiavbehandlung zugesetzt.
Für feste Medien setzt man 20 g Agar zu.
Die Petrischalen werden 18 Tage bei 28 C inkubiert. Eine gut
isolierte Kolonie wird ausgewählt und auf eine Petrischale mit Medium B aufgestrichen. Kedium B hat die folgende Zusammensetzung:
Medium B
Tomatenbrei 40 g
gemahlenes Hafermehl 15 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 6 eingestellt. Für feste Medien setzt man 20 g Agar zu.
Ein einzelner Klon wird ausgewählt und 2 Tage bei 28 C auf
einem Schrägröhrchen mit Medium B gezüchtet. Ein Teil der Kultur
dieses Schrägröhrchens wird auf die Oberfläche von sechs
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mit Medium B hergestellten Schrägröhrchen aufgestrichen. Diese
Schrägröhrchen werden 2 Tage bei 28 C inkubiert. Diese Kultur ist als Protaminobacter ruber identifiziert und in der Kultursammlung
von Merck & Cot., Ine, Ranway, New Jersey, unter der
Bezeichnung MB-3528 niedergelegt worden.
Ein Teil der Schrägröhrchenkultur von Protaminobacter ruber
MB-3528 wird verwendet, um einen 250 ml-Erlenmeyerkolben zu
beimpfen, der 50 ml Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium C
Dextrose 20 g
Pharmamedia 8 g Maisquellwasser
(auf Nassbasis) 5 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH oder HCl auf 7 eingestellt N-Acetyläthanolaminlösung* 8,5 ml
• * N-Acetyläthanolaminlösung
N-Acetyläthanolamin wird mit Wasser auf das 10-fache
verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavbehandlung zugesetzt.
Der Kolben wird 4 Tage bei 28° C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm)
geschüttelt. 25 ml des Kolbeninhalts werden 15 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird
entfernt, und die Zellen auf der Oberfläche der Mediumfeststoffe werden in 0,5 ml 0,05-molare Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7,4) hineingeschabt. Die so erhaltene Suspension wird in einem Branson-Beschallungsgerät, Modell LS-75, mit
einer 12,7 mm-Sonde bei der Einstellung Nr. 4 der Ultraschallbehandlung
unterworfen, um die Zellen zu zerreissen. Man arbeitet mit vier Beschallungstakten zu Je 15 Sekunden
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to 2652ÖV8
und kühlt die Suspension während und zwischen den einzelnen Behandlungsperioden in Eiswasser. 10 pl des Beschallungsproduktes
werden mit 25 μΐ einer Lösung gemischt, die 840 y/:nl
N-Acetylthienamycin in 10-mmolarer Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7) enthält, und übernacht bei 28 C inkubiert. Es werden Kontrollversuche einerseits mit Antibioticum und Puffer allein
und andererseits mit beschallten Zellen und Puffer ohne Antibioticum durchgeführt. Nach dem Inkubieren übernacht bei
28° C werden je 2 ul auf mit Cellulose beschichtete TLC-Platten
aufgebracht, die mit einem Gemisch aus 70 % Äthylalkohol und 30 % Wasser entwickelt werden. Nach dem Trocknen an der
Luft werden die TLC-Platten 5 Minuten auf Analysenplatten von Staphylococcus aureus ATCC 6538P aufgelegt.
Die Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine übernacht in Nährbrühe mit einem Hefeextraktgehalt von
0,2 % entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus
aureus ATCC 6538P wird mit Nährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt enthält, zu einer Suspension verdünnt, die bei einer
Wellenlänge von 660 nm eine optische Durchlässigkeit von 60 %
aufweist. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt ist und sich
auf einer Temperatur von 47 bis 48 C befindet; das so erhaltene Gemisch enthält 33»2 ml der Suspension je Liter Agar.
40 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 22,5 x
22,5 cm gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 C gehalten.
Die TLC-Platten werden entfernt und die Analysenplatten übernacht bei 37° C inkubiert. Ausser dem bioaktiven Fleck für
nicht-umgesetztes N-Acetylthienamycin bei R- 0,7-0,89 beobachtet
man einen bioaktiven Fleck bei R~ 0,44-0,47, der auf
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Thienamycin zurückzuführen ist- Die Kontrollinkubationsinischungen
von Antibioticum + Puffer, beschall.ter Zellensuspension + Puffer und einer Probe von Antibioticum + Puffer, zu der die
beschallte Zellensuspension erst unmittelbar vor der TLC-Analyse
zugesetzt worden ist, zeigen kein bioaktives Material bei Rf 0,44-0,47c
Desacetylierung von 890A1
Ein Teil der Schrägröhrchenkultur von Protaminobacter ruber
MB-3528 wird verwendet, um einen 250 ml-Erlenmeyerkolben zu
beimpfen, der 50 ml Medium C der folgenden Zusammensetzung
enthält:
Medium C
Dextrose 20 g
Pharmamedia 8 g
Maisquellwasser (auf Nassbasis) 5 g
destilliertes .Wasser 1000 ml
pH mit NaOH oder HCl auf 7 eingestellt
N-Äcetyläthanolaminlösung* 8,5 ml
* N-Acetyläthanolaminlösung
N-Acetyläthanolamin wird mit Wasser auf das 10-fache
verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavbehandlung zugesetzt.
Der Kolben wird 4 Tage bei 28° C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm)
geschüttelt. 25 ml des Kolbeninhalts werden 15 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird
entfernt, und die Zellen auf der Oberfläche der Mediumfeststoffe werden in 0,5 ml 0,05-molare Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7,4) hineingeschabt. Die so erhaltene Suspension wird in einem Branson-Beschallungsgerät, Modell LS-75, mit
einer 12,7 mm-Sonde bei der Einstellung Nr. 4 der Ultra-
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schallbehandlung unterworfen, um die Zellen zu zerreissen.
Man arbeitet mit vier Beschallungstakten zu je 15 Sekunden und kühlt die Suspension während und zwischen den einzelnen
Behandlungsperioden in Eiswasser. 10 μΐ des Beschallungsproduktes
werden mit 25 μΐ einer 890A1-Lösung gemischt, die 4,85
mit Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten bei 300 nm je ml enthält« Kontrollversuche werden einerseits mit
Antibioticum und Puffer allein und andererseits mit der beschallten Zellensuspension mit Puffer, aber ohne Antibioticum,
durchgeführt. Nach der Inkubation Übernacht bei 28 C werden
Anteile zu je 5 ul auf eine mit Cellulose beschichtete TLC-Platte aufgebracht, die mit einem Gemisch aus 70 % Äthanol
und 30 % Wasser entwickelt wird. Mach dem Trocknen an der Luft wird die TLC-Platte 5 Minuten auf eine Analysenplatte von
Staphylococcus aureus ATCC 6538P aufgelegt.
Die Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine Übernacht in Nährbrühe mit einem Hefeextraktgehalt von
0,2 % entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P wird mit Nährbrühe, die 0,2 % Hefeextrakt
enthält, zu einer Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 nm eine optische Durchlässigkeit von 60 %
aufweist. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt ist und sich
auf einer Temperatur von 47 bis 48° C befindet; das so erhaltene Gemisch enthält 33,2 ml der Suspension je Liter Agar.
40 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 22,5 x 22,5 cm gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur
Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 C gehalten.
Die TLC-Platte wird entfernt und die Analysenplatte übernacht bei 37° C inkubiert. Ausser dem Fleck bei Rf 0,7-0,89 für das
unveränderte bioaktive 890A1 wird ein neuer bioaktiver Fleck
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bei Rf 0,44-0,47 beobachtet, der auf Desacetyl-890A^ zurückzuführen
ist. Kontrollinkubationsmischungen aus Antibioticum + Puffer sowie aus beschallten Zellen + Puffer ergeben kein bioaktives
Material bei R£ 0,44-0,47.
Beispiel 4
Desacetylierung von
Das Antibioticum 890A^ wird nach dem in Beispiel 3 für die Desacetylierung
von 890A* beschriebenen Verfahren desacetyliert.
B, e.!spiel 5
Herstellung von
Sechs 250 ml-Erlenmeyer-Impfkolben, die je 50 ml Medium C enthalten,
werden mit einem Teil einer SchrägrÖhrchenkultur von Protaminobacter ruber MB-3528 beimpft. Medium C hat die folgende
Zusammensetzung:
Medium C
Dextrose 20 g
Pharmamedia 8 g
Maisquellwasser (auf Nassbasis) 5 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH oder HCl auf 7 eingestellt N-Acetyläthanolaminlösung* 8,5 ml
* N-Acetyläthanolaminlösung
N-Acetyläthanolamin wird mit Wasser auf das 10-fache
verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavbehandlung zugesetzt.
Die Kolben werden einen Tag bei 28° C mit 220 U/min (Hub 5,1cm]
geschüttelt.
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15 837 J
42 2-Liter-Produktionskolben, die je 400 ml Medium C enthalten,
werden mit je 7 ml der Kultur aus diesen Impfkolben beimpft.
Diese Produktionskolben werden 6 Tage bei 28 C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Der Kolbeninhalt wird vereinigt
und 15 Minuten mit 8000 U/min zentrifugiert. Die Zellen werden von dem Klumpen der Mediumfeststoffe abgeschabt
und mit 0,05-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4) zu einem Endvolumen von 1600 ml angemacht. Diese Suspension wird
wiederum 15 Minuten mit 8000 U/min zentrifugiert. Die Zellen werden wieder von dem Klumpen der Mediumfeststoffe abgeschabt
und mit 0,05-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4) zu einem Endvoiumen von 160 ml angemacht. Diese Suspension wird
auf 5 C gekühlt, und Anteile von je 15 ml werden nacheinander
der in Beispiel 1 beschriebenen Ultraschallbehandlung in 15 Sekunden-Takten unterworfen, bis keine weitere Abnahme der
Trübung beobachtet wird, wenn eine 500-fache Verdünnung der Suspension in Phosphatpuffer-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung
hergestellt wird:
NaCl 8,8 g
1-molarer Phosphatpuffer, pH 7,5* 10 ml destilliertes Wasser 1000 ml
* 1-molarer Phosphatpuffer, pH 7,5
16 ml 1-molare KH2PO,-Lösung werden mit 84 ml
1-molarer KpHPO,-Lösung gemischt. Der pH-Wert des Phosphatpuffers wird durch Zusatz von etwas 1-molarer
KHpPO-Lösung oder 1-molarer KpHPO,-Lösung auf 7,5 eingestellt.
Zu 1 1 0,005-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,4) werden
250 mg Antibioticum 890A1 zugesetzt. Dieses Gemisch wird
mit 160 ml des Beschallungsextraktes von Protaminobacter ruber versetzt, der N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase enthält. Das
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Gemisch wird 20 Stunden langsam mit einem Magnetrührer bei
28° C gerührt. Dann wird das Gemisch bei 10 000 g 15 Minuten
zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit entfernt, auf 5 C gekühlt und mit Essigsäure auf einen pH-Wert von
4,5 - 0,2 eingestellt. Die Trennung des Desacetyl-890A-, von dem nicht-hydrolysierten Antibioticum und von anderen Bestandteilen
des Reaktionsgemisches wird folgendermaßen durchgeführt, wobei man eine Schel^endiffusions-Bioanalyse gegen
Staphylococcus aureus ATCC 6538P und Messungen der mit
Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion (absorbance) bei 297 nm (wie unter der Überschrift "Analysenverfahren für Thienamycin"
beschrieben) anwendet, um die Leistung der Reinigungsverfahren zu überwachen.
Das angesäuerte, zentrifugierte Reaktionsgemisch wird mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/min an 120 ml Dowex-50 χ 4 in der
Natriumform (300-840 u) adsorbiert. Das Adsorbat v/ird mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und dann mit einer
Geschwindigkeit von 6 ml/min mit 2-%iger wässriger Pyridinlösung eluiert. Sobald 75 ml Eluat durch die Kolonne gelaufen
sind, werden die folgenden 240 ml vereinigt, auf 25 ml eingeengt und das Konzentrat auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.
Die 25 ml Konzentrat werden mit einer Geschwindigkeit von
1 ml/min an 25 ml Dowex-1 χ 2-Harz in der Chloridform (150-300 u) adsorbiert. Das Harz wird mit der gleichen Geschwindigkeit
mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Nach Durchlauf von 25 ml durch die Kolonne werden die folgenden
50 ml vereinigt, auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert und zu 10 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird mit Essigsäure auf
einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und in ein Bett von Dowex-50 χ 8-Harz (37-74 u) in der 2,6-Lutidiniumform eingegeben,
das einen Durchmesser von 1 cm und eine Höhe von 50 cm auf-
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weist und zuvor mit 0,1-molarem 2,6-Lutidinacetatpuffer
(pH 6,3) ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Plan eluiert mit dem Puffer mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min. Sobald
25 ml Eluat aus der Kolonne ausgelaufen sind, werden die folgenden
35 ml vereinigt und gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,5 ml 0,1-molarem
2,6-Lutidinacetatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Lösung wird in eine Kolonne mit Bio-Gel P-2 (37-74 ;u) eingegeben, die
einen Durchmesser von 1 cm und eine Höhe von 50 cm hat und zuvor mit diesem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist.
Dann wird das Gel mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min entwickelt. Nach dem Durchlauf von
25 ml Eluat durch die Kolonne werden die folgenden 10 ml vereinigt und gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 4 ml destilliertem Wasser gelöst und in eine Kolonne mit einem Durchmesser
von 1,7 cm eingegeben, die mit 90 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt und bei 5 C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht
gebracht worden ist. Vor der Verwendung wird das XAD-2 nacheinander mit 1)5 Raumteilen 1n NaOH und anschliessend
mit entmineralisiertem Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 2) 5 Raumteilen 1n HCl und anschliessend mit entmineralisiertem
Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, 0,001-molarer Tetranatrium-EDTA-Lösung
und schliesslich destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Aufgeben der Probe giesst man zwei Anteile
zu je 2 ml destillierten Wassers nach. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit destilliertem Wasser
gewaschen. Das Eluat wird in Fraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die Fraktionen 25 bis 58 werden vereinigt und gefriergetrocknet;
man erhält Desacetyl-890A,..
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15 837 5?
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in
0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung
suspendiert:
| Davis-Salze | 0,5 | g |
| Natriumeitrat | 7,0 | g |
| K2HPO4 | 3,0 | g |
| 1,0 | g | |
| ( TVTT T ι G! C\ V V\Π / J nüU/ |
0,1 | g |
| MgSO4.7H2O | 1000 | ml |
| destilliertes Wasser | ||
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:
Medium A
| Hefeautolysat (Ardamine*) | 10,0 | g |
| Glucose | 10,0 | g |
| Phosphatpuffer** | 2,0 | ml |
| MgSO4-7H2O | 0,05 | g |
| destilliertes Wasser | 1000 | ml |
pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt. * Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Für Schrägröhrchen setzt man 25»0 g Agar je Liter zu,
Für Schrägröhrchen setzt man 25»0 g Agar je Liter zu,
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28° C inkubiert
und dann bei 4 C gelagert.
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15 837 JH
10 ml Medium A (ohne Agar) werden aseptisch auf eines dieser
Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension geschabt, und 1,2 ml dieser Suspension werden
verwendet, um drei mit Umlenkorganen versehene 2 1-Erlenmeyerkolben
zu beimpfen, die je 500 ml Medium A (ohne Agar) enthaltene Diese Impfkolben werden 24 Stunden bei 28 C mit
160 U/min geschüttelt, worauf sicti eine zufriedenstellende
Kultur entwickelt hat«
Die Kulturen aus diesen Impfkolben werden vereinigt und verwendet,
um 467 1 Medium A (ohne Agar) in einem 756 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Dieser Fermenter
arbeitet 24 Stunden bei 28 C, wobei man mit 130 U/min rührt und 283 1 Luft je Minute hindurchleitet. Nach Bedarf wird
Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow Chemical Corp.), jedoch nicht in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt.
Die pH-Bestimmungen haben die folgenden Ergebnisse:
Alter, h 0 24
pH 6,3 6,4
454 1 der Kultur in diesem Impffermenter werden verwendet, um
4082 1 Medium E in einem 5670 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Medium E hat die folgende Zusammensetzung:
Medium E
Cerelose
Maisquellwasser (auf Hassbasis) lösliche Schlempebestandteile Baumwollsaatmedium (Pharmamedia)
CoCl2*6H2O
CaCO^ (nach pH-Einstellung) Polyglycol 2000
Leitungswasser
Leitungswasser
pH mit NaOH auf 7,3 eingestellt.
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| 25,0 | g |
| 15,0 | g |
| 10,0 | ε |
| 5,0 | g |
| 0,01 | g |
| 3,0 | g |
| 0,25 | % |
| 1000 | ml |
15 837 S^
Dieser Fermenter wird 138 Stunden bei 24 C unter Rühren mit 70 U/min und Hindurchleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit
von 1,54 m /min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel
(Polyglycol 2000), aber nicht in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen
mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:
ATCC Nr. 6633 (9,5 mm-Scheiben),
Alter, h pH Heminzone, mm
| 0 | 6,9 | 0 |
| 24 | 6,3 | 0 |
| 36 | 6,0 | 0 |
| 48 | 5,9 | 0 |
| 60 | 6,0 | 23 |
| 72 | 5,9 | — |
| 84 | 6,0 | 21 |
| 96 | 6,2 | — |
| 108 | 6,5 | 35 |
| 120 | 6,6 | 36 |
| 132 | 6,7 | 41 |
| 138 | 6,7 | 39 |
Die 4082 1 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76cm-Filterpresse
unter Beimischung eines Filterhilfsmittels in einer Menge von 4 Gewichtsteilen je 100 Raumteile filtriert.
Zu dem Filtrat werden 46 g Natriumsalz von Äthylendinitriltetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6 C
gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 - 0,2 eingestellt und auf 6 C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit
von 48 l/min in eine 480 1 fassende Kolonne mit Dowex-50 χ 4 Na (300-840 μ) eingegeben. Nach einem Vorlauf
von 1400 1 wird ein Ablauf von 18,9 1 aufgefangen, dessen pH-Wert mit Natronlauge auf 7,08 eingestellt wird, und der
bei 5° C gelagert wird»
Eine Kolonne von 3,8 cm Durchmesser, die mit 300 ml Dowex-1x2
(150-300 u) in der Chloridform gefüllt ist, wird mit 600 ml entmineralisiertem Wasser von 5 C gewaschen. 4 1 des
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15 837 b^
kalten Ablaufs von der Dowex-50 χ 4-Kolonne werden mit einer
Geschwindigkeit von 30 ml/min durch diese Kolonne geleitet. Dann wird die Kolonne mit 300 ml 25-umolarer EDTA-Lösung fre-
waschen. Das Antibioticum N-Acetylthienamycin wird mit einer
Geschwindigkeit von 15 ml/min bei 5 C mit 900 ml 5-%iger
Kochsalzlösung eluiert, die 0,01-molar an Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) und 25-umolar an EDTA sind. 14 Fraktionen zu je
75 ml werden aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode auf ihre biologische Aktivität analysiert. Die Eluatfraktionen
Nr. 3 bis 9, deren Menge 525 ml beträgt., werden vereinigt
und im Vakuum zu 115 ml eingeengt. Das Konzentrat enthält
65 % des gesamten, in die Dowex-1 χ 2 Cl -Kolonne eingebrachten
bioaktiven Materials.
Das Konzentrat des Dowex-1 χ 2 Cl~-Eluats wird bei 5° C in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 3,8 cm eingegeben, die
mit 450 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist. Das XAD-2 wird kolonnenweise nacheinander mit je 4 Kolonnenvolumina
1) 0,001-molarer EDTA-Lösung, 2) 1n NaOH, 3) entmineralisiertem
Wasser, 4) 1n HCl, 5) entmineralisiertem Wasser, 6) Methanol, 7) Aceton, 8) entmineralisiertem V/asser und
vor der Verwendung mit 2250 ml 5-%iger NaCl-Lösung vorgewaschen,
die 25-umolar an EDTA ist.
Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne gibt man zwei Anteile zu .je 25 ml Wasser auf. Die Kolonne wird mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/min bei 5 C mit entmineralisiertem Wasser entwickelt. Es werden eine erste Fraktion von
400 ml und dann 11 weitere Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen. Der pH-Wert einer jeden Fraktion wird mit 1n Natronlauge bzw.
1n Salzsäure zwischen 6,9 und 7,13 eingestellt. Die Fraktionen
Nr. 3 bis 9, die 46 % des gesamten, in die XAD-2-Kolonne eingegebenen
bioaktiven Materials enthalten, werden zu einem Gesamtvolumen von 490 ml vereinigt. Eine Probe von 45 ml wird
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für Bioanalysen nach der Standard-Scheibendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P entnommen. Die verbleibenden
445 ml werden unter Vakuum auf 50 ml eingeengt.
Die 50 ml Konzentrat des XAD-2-Eluats werden bei 5 C mit
einer Geschwindigkeit von 1 ml/min in eine Kolonne von 1,5 cm Durchmesser eingegeben, die mit 40 ml vorgewaschenem Dowex-1
χ 4 Cl (Teilchengrössen <37 u) beschickt ist. Das Dowex-1x4
Cl~-Harz (<37 u, bestimmt durch Dekantieren von Wasser) wird vor der Verwendung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min
kolonnenweise mit 240 ml 0,2-molarer Kochsalzlösung, die 0,005-molar an NH-Cl und 0,1-mmolar an NH^OH ist, und dann mit
der gleichen Geschwindigkeit mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen.
Im Anschluss an diese Probe werden zwei Anteile zu je 5 ml
entmineralisierten Wassers in die Kolonne eingegeben. Die Kolonne wird bei 5 C mit einer Geschwindigkeit von 0,92 ml/min
mit 0,07-molarer Kochsalzlösung entwickelt, die 0,005-molar an NH^Cl und 0,1-mmolar an NH-OH ist. Dabei werden Fraktionen
zu 8,6 bis 9,3 ml aufgefangen« Die Fraktionen, die mit einem Ablaufvolumen von 600 ml beginnen und mit einem Volumen von
710 ml enden, werden vereinigt; sie enthalten 98 % des gesamten, in die Dowex-1 χ 4-Kolonne eingebrachten bioaktiven Materials.
Diese Flüssigkeit wird im Vakuum auf 2 ml eingeengt.
Das Dowex-1 χ 4-Konzentrat wird in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 2,2 cm eingegeben, die mit 225 ml Bio-Gel P-2
(37-74 u) mit einer Ausschlussgrenze von 1800 Dalton (zuvor bestimmt durch Dekantieren von destilliertem Wasser) beschickt
ist.
Vor der Verwendung wird die Bio-Gel P-2-Kolonne mit 225 ml
1-molarer Kochsalzlösung und dann mit 100 ml entmineralisier-
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15 837 52
tem Wasser gewaschen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit
von 1 ml/min bei 5 C mit entmineralisiertem Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden. Die
von 104 bis 128 ml aufgefangenen Eluatfraktionen enthalten 83 % der in die Bio-Gel P-2-Kolonne eingebrachten Bioaktivität
und werden vereinigt und zu 1,58 ml eingeengt.
Eine Kolonne mit 50 ml XAD-2 (1,6 cm χ 27 cm) wird hergestellt
und kolonnenweise mit je 200 ml 1-mmolarer EDTA-Lösung,
1n Natronlauge, entmineralisiertem Wasser, 1n HCl, entmineralisiertem
Wasser, Methanol, Aceton und entmineralisiertem Wasser vorgewaschen. Das Konzentrat des Bio-Gel P-2-Eluats,
das 44,4 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird bei 5 C in die XAD-2-Kolonne eingegeben,
worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nachgiesst. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von
1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, bis die UV-Extinktion (absorbance) der Waschflüssigkeiten bei 300 nm
auf 0,060 abgenommen hat« Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit
von 1 ml/min mit 50-%igem Methanol in entmineralisiertem Wasser gewaschen, wobei Fraktionen zu je 1 ml aufgefangen
werden. Die Fraktionen mit einer Extinktion (absorbance) bei 300 nm von mehr als 0,1 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt.
Als Produkt erhält man N-Acetylthienamycin mit 11,6 durch Hydroxylamin auslöschbaren optischen Dichteeinheiten.
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya MA-4297 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in
0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert:
- 55 -
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| Davis-Salze | 0,5 | g |
| Natriumeitrat | 7,0 | g |
| K2HPO4 | 3,0 | g |
| KH2PO4 | 1,0 | g |
| (NH4)2S04 | 0,1 | g |
| MgSO4.7H2O | 1000 | ml. |
| destilliertes Wasser | ||
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit
Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:
Medium A
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer* 2,0 ml
MgSO4.7H2O 0,05 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt. * Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
| KH2PO4 | Wasser | 1 | 91, | 0 | g |
| Na2HPO4 | 95, | 0 | g | ||
| destilliertes | 000 | ml | |||
Für Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu.
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28 C inkubiert
und dann bei 4 C gelagert.
10 ml Medium A werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension
geschabt, und 1,2 ml dieser Suspension werden verwendet, um drei mit Umlenkorganen versehene 2 1-Erlenmeyerkolben zu
beimpfen, die je 500 ml Medium A (ohne Agar) enthalten. Diese
Impfkolben werden 24 Stunden bei 28° C mit 160 U/min geschüttelt,
worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.
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Die Kulturen aus diesen Impfkolben werden vereinigt und verwendet,
um 467 1 Medium A (ohne Agar) in einem 756 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Dieser Fermenter
arbeitet 24 Stunden bei 28 C, wobei man mit 130 U/min rührt und 283 1 Luft je Minute hindurchleitet. Nach Bedarf wird
Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow Chemical Corp.), jedoch nicht in Mengen von mehr als 0,1 %, zugesetzt.
Die pH-Bestimmungen haben die folgenden Ergebnisse:
Alter 0 24
pH 6,3 6,4
454 1 der Kultur in diesem Impffermenter werden verwendet, um
4082 1 Medium E in einem 5670 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Medium E hat die folgende Zusammensetzung:
Medium E
Cerelose 25,0 g
Maisquellwasser (auf Nassbasis) 15,0 g
lösliche Schlempebestandteile 10,0 g
Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) 5,0 g
CoCl2«6H2O 0,01 g
CaCO^ (nach pH-Einstellung) 3,0 g
Polyglycol 2000 ' 0,25 %
Leitungswasser 1000 ml
pH mit NaHO auf 7,3 eingestellt.
Dieser Fermenter wird 138 Stunden bei 24° C unter Rühren mit 70 U/min und Hindurchleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit
von 1,54 m /min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht in Mengen von
mehr als 0,1 %, zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:
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Alter, h
pH
ATCC Nr. 6633
(9,5 inm-Scheiben), Hemmzone, mm
| 0 | 6,9 | 0 |
| 24 | 6,3 | 0 |
| 36 | 6,0 | 0 |
| 48 | 5,9 | 0 |
| 60 | 6,0 | 23 |
| 72 | 5,9 | — |
| 84 | 6,0 | 21 |
| 96 | 6,2 | — |
| 108 | 6,5 | 35 |
| 120 | 6,6 | 36 |
| 132 | 6,7 | 41 |
| 138 | 6,7 | 39 |
Die 4082 1 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76 cm-Filterpresse
unter Beimischung eines Filterhilfsmittels in einer Menge von 4 Gewichtsteilen je 100 Raumteile filtriert.
Zu dem Filtrat v/erden 46 g Natriumsalz von Äthylendinitriltetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6 C
gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 - 0,2 eingestellt und auf 6 C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit
von 48 l/min in eine 480 1 fassende Kolonne mit Dowex-50 χ 4 Na (300-840 μ) eingegeben. Nach einem Vorlauf von
1400 1 wird ein Ablauf von 18,9 1 aufgefangen, dessen pH-Wert mit Natronlauge auf 7,08 eingestellt wird, und der bei 5 C
gelagert wird.
Eine Kolonne von 3,8 cm Durchmesser, die mit 300 ml Dowex-1x2
(150-300 u) in der Chloridform gefüllt is.t9 wird mit
300 ml entmineralisiertem Wasser von 5 C gewaschen. 4 1 des kalten Ablaufs von der Dowex-50 χ 4-Kolonne werden mit einer
Geschwindigkeit von 30 ml/min durch diese Kolonne geleitet« Dann wird die Kolonne mit 350 ml 25-umolarer EDTA-Lösung gewaschen
und bei 5 C mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min mit 900 ml 5-%iger NaCl-Lösung eluiert, die 0,01-molar an
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15 837 β/
TrisoHCl (pH 7) und 25-umolar an EDTA ist. Es werden Fraktionen
zu je 75 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC 653SP analysiert.
Die Fraktionen Nr= 4 bis 10, die 47 % der eingebrachten Bioaktivität
enthalten, werden zu 42,5 ml der Probe zugesetzt, die in Beispiel 6 aus den vereinigten Fraktionen von der ersten
XAD-2-Adsorption für die Analyse entnommen worden war. Diese vereinigten Fraktionen werden im Vakuum zu 100 ml eingeengt
und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,32 eingestellt.
Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 3,8 cm, die mit 450 ml
XAD-2-Harz beschickt ist, wird kolonnenweise nacheinander mit je 4 Kolonnenvolumina 1) 0,001-molarer EDTA-Lösung,
2) 1n NaOH, 3) entmineralisiertem Wasser, 4) 1n HCl,
5) entmineralisiertem Wasser, 6) Methanol, 7) Aceton, 8) entmineralisiertem Wasser vorgewaschen und vor der Verwendung
mit 2250 ml 5-%iger NaCl-Lösung gewaschen, die 25-umolar an EDTA ist. Das obige Konzentrat wird in die XAD-2-Kolonne·
eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 5 ml entmineralisiertem Wasser nachgiesst» Die Kolonne wird bei 5 C mit einer
Geschwindigkeit von 10 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt. Es werden eine erste Fraktion zu 40 ml und weitere
Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert. Die Fraktionen Nr. 9 bis 15, die
22 % der in die XAD-2-Kolonne eingegebenen Bioaktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu 56 ml eingeengt.
Eine 21 cm χ 1,7 cm messende Kolonne, die mit 40 ml Dowex-1x4
Cl~ (<37 u, bestimmt durch Dekantieren von Wasser) beschickt
ist, wird vor der Verwendung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit 240 ml 0,2-molarer NaCl-Lösung, die
0,005-molar an NH^Cl und 0,1-mmolar an NH/OH ist, und dann
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15 837 (
mit der gleichen Geschwindigkeit mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen.
Das XAD-2-Konzentrat wird in die Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisiertes Wasser und dann
zwei Anteile zu je 2 ml Eluierungspuffer nachgiesst. Die Kolonne
wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min bei 5 C mit einer 0,07-molaren NaCl-Lösung, die 0,005-molar an NH^Cl
und 0,1-mmolar an NH^OH ist, eluiert. Es werden Fraktionen zu
je 10 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert. Die von 544 bis 647 ml aufgefangenen Eluatfraktionen
enthalten scheinbare 100 % der eingegebenen Bioaktivität und werden miteinander vereinigt und im Vakuum auf 2,3 ml
eingeengt. Das Konzentrat enthält 36,4 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten.
Eine 2,2 cm χ 62 cm messende Kolonne, die mit 225 ml Bio-Gel P-2-Harz (37-74 u) mit einer Ausschlussgrenze von 1800 Dalton
beschickt ist, wird vor der Verwendung mit 225 ml 1-molarer Kochsalzlösung und dann mit 100 ml entmineralisiertem Wasser
gewaschen. Das Dowex-1 χ 4-Konzentrat wird in die Kolonne eingegeben,
worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nachgiesst. Die Kolonne wird bei 5 C mit einer Geschwindigkeit
von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden, die
dann nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert werden. Die Fraktionen von 124 bis 129 ml, die 7,04 durch Hydroxylamin
auslöschbare optische Dichteeinheiten enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu 2 ml einer wässrigen Lösung des
Produkts N-Acetylthienamycin eingeengt. Die von 117 bis 123 ml
und von 130 bis 139 ml Eluat aufgefangenen Fraktionen werden zu einer Lösung des Produkts N-Acetylthienamycin vereinigt,
die 13,7 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichte-
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2852678
15 837 QlH
einheiten enthält. Durch Desacetylierung des so erhaltenen
Materials nach dem Verfahren des Beispiels 2 erhält man das Antibioticum Thienamycin.
Beispiel 8
Herstellung von Thienamycin
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya MA-4297 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in
50 ml sterilem Medium A in einem mit Umlenkorgan versehenen 250 ml-Erlenmeyerkolben suspendiert. Medium A hat die folgende
Zusammensetzung:
Medium A
| Hefeautolysat (Ardamine*) Glucose Phosphatpuffer** MgSO4=7H2O |
10, 10, 2, 0, |
0 0 0 05 |
g | g g ml g |
| destilliertes Wasser | 1000 | g | ml | |
| ml | ||||
| Corporation | ||||
| 91,0 | ||||
| pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt. | 95,0 | |||
| *Ardamine: Yeast Products | 1000 | |||
| ** Phosphatpufferlösung | ||||
| KH2PO4 | ||||
| Na2HPO4 | ||||
| destilliertes Wasser | ||||
Der beimpfte Kolben wird bei 28° C 48 Stunden mit 220 U/min
(Hub 5,1 cm) geschüttelt. Aus der 48 Stunden alten Fermentationsflüssigkeit
werden 40 ml aseptisch entnommen und mit 40 ml sterilem, 20-vol.%igem wässrigem Glycerin gemischt.
Mengen von je 2 ml dieses Gemisches werden in sterile, 3,53 ml fassende Ampullen einpipettiert, dann ausgefrcren und in der
Dampfphase einer mit flüssigem Stickstoff betriebenen Gefriervorrichtung gelagert.
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>15 837 β 3
Der gefrorene Ampulleninhalt wird verwendet, um einen mit Umlenkorgan
versehenen 250 ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, der
50 ml Medium A enthält. Dieser Impfkolben wird 24 Stunden bei
28° C mit 160 U/min geschüttelt«
Aus diesem Impfkolben entnommene Anteile von je 10 ml werden verwendet, um mit Umlenkorgan versehene 2 1-Erlenmeyerkolben
zu beimpfen, die je 500 ml Medium A enthalten. Diese Impfkolben
werden 24 Stunden mit 160 U/min bei 28 C geschüttelt.
1000 ml des vereinigten Inhalts dieser Impfkolben werden verwendet,
um 467 1 Medium A in einem 756 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen» In diesem Fermenter wird die
Fermentation 24 Stunden bei 28 C, einer Rührgeschwindigkeit von 130 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von
283 l/min durchgeführt. Nach Bedarf wird Polyglycol 2000 (Dow Chemical Corp«) als Schaumverhütungsmittel, jedoch nicht in
grösserer Menge als 0,1 %, zugesetzt. pH- und Dextrosegehaltmessungen
haben die folgenden Ergebnisses
| Alter, h | mg/ml | 6 | 0 | 12 | 4 | 24 |
| pH | 8 | A | 6> | 1 | 6,6 | |
| Dextrose, | ,1 | 8, | 8,1 | |||
453 1 dieser Kultur werden verwendet, um 4082 1 Medium E in
einem 5670 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen«,
Medium E hat die folgende Zusammensetzung?
Medium E
Cerelose 25s0 g
Maisquellwasser (auf Massbasis) 15s>0 g
lösliche Schlempebestandteile 10,0 g
Baumwollsaatmedium (Pharmamedia) 5,0 g
CoCl2.6H2O 0,01 g
CaCO, (nach pH-Einstellung) 3,0 g
Polyglycol 2000 0,25 %
Leitungswasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,3 eingestellt«
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15 837 (s>b
In diesem Fermenter wird die Fermentation 144 Stunden bei 24 C mit einer Rührgeschwindigkeit von 70 U/min und einer
Luftströmungsgeschwindigkeit von 1,54 m /min durchgeführt. Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel Polyglycol 2000,
aber nicht in grösseren Mengen als 0,1 %, zugesetzt. Die zentrifugierte
Fermentationsflüssigkeit wird nach der Standard-Scheibendiffusionsmethode
gegen Staphylococcus aureus ATCC-6538P analysiert. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden
Tabelle unter der Überschrift "Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P". Ferner werden Analysen nach der Scheibendiffusionsmethode
unter Verwendung von 9,5 mm-Filterpapierscheiben und 10 ml-Analysenplatten durchgeführt; die Ergebnisse dieser
Analysen sind in der nachstehenden Tabelle unter der Überschrift "Antibiotische Aktivität (10 ml-Platten)" angegeben.
Die 10 ml-Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine übernacht in Nährbrühe mit einem Hefeextraktgehalt von
0,2 % entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P wird mit Nährbrühe, die 0,2 % Kefeextrakt
enthält, zu einer Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 nm eine optische Durchlässigkeit von 40 % aufweist.
Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt ist und sich auf
einer Temperatur von 47 bis 48 C befindet; das so erhaltene Gemisch enthält 33,2 ml der Suspension je Liter Agar. Je
10 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis
zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4 C gehalten.
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709822/1031
| Alter | pH | Dextrose, mg/ml | Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538P, mm Hemmzone |
Antibiotische Aktivität (10 mm- Platten), min Hemmzone |
| O | 6,6 | 22,2 | ||
| 12 | 6,3 | 20,2 | ||
| 24 | 5,8 | 18,0 | 0 | |
| 36 | 6,0 | 13,2 | 21,5 | |
| 48 | 6,0 | 8,6 | 21,5 | |
| 60 | 5,7 | 6,4 | 26,5 | |
| 72 | 5,8 | 2,7 | 25,5 | |
| 84 | 6,2 | 0,3 | 27,5 | |
| 96 | 6,4 | 0,2 | 36,0 | |
| 108 | 6,4 | 0 | 35,0 | |
| 120 | 6,3 | 41,5 | 37,0 | |
| 132 | 5,8 | 37,5 | ||
| 144 | 5,9 | 43,0 | 37,5 |
Die 4082 1 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76 cm-Filterpresse
nach Zumischung von 5 Gewichtsteilen Filterhilfsmittel je 100 Raumteile filtriert. Das Filtrat wird mit 12 g
Natriumsalz von Äthylendinitrilotetraessigsäure versetzt. Das
Filtrat wird auf 6 C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 - 0,2 eingestellt und auf 6 C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit
einer Geschwindigkeit von 48 l/min an 480 1 Dowex-50 χ 4 Na (300-840 u) adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 480 1 entmineralisiertem
Wasser gewaschen und dann mit einer Geschwindigkeit von 24 l/min mit 2-%igem wässrigem Pyridin eluiert. Dabei v/erden
drei Fraktionen zu 300 1, 520 1 bzw. 240 1 aufgefangen und bei einem pH-Wert von 7,0 analysiert. Die Analysen zeigen,
dass die Eluatfraktionen 4 %, 16 % bzw. 6 % der in die Dowex-50
χ 4 Na -Kolonne eingegebenen Bioaktivität enthalten. Die Eluatfraktion Nr. 2 wird auf 48 1 eingeengt und auf einen pH-Wert
von 7 eingestellt.
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15 837 (%
Die 48 1 Konzentrat werden auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und mit einer Geschwindigkeit von 7,6 l/min an 76 1
Dowex-1 χ 2 in der Chloridform (150-300 u) adsorbiert. Das Harz wird mit der gleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem
Wasser eluiert. Es werden vier Fraktionen, zwei zu je 48 1, eine zu 70 1 und eine zu 48 1, aufgefangen. Die Fraktionen
werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Analysen zeigen, dass 68 % der Ausgangsbioaktivität in der 70 1-Fraktion
enthalten sind. Diese Fraktion wird bei einem pH-Wert von 7,0 auf 18 1 eingeengt und durch ein "Millipore"-Filter mit
Poren von 0,45 ρ filtriert. Das Filtrat wird in Schalen gefriergetrocknet;
man erhält 99 g Produkt mit einer Stärke von 310 Einheiten/mgo
10 g der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarem
2,6-Lutidinacetat-Puffer (pH 6,3) aufgenommen. 125 ml dieser
Lösung werden mit Essigsäure wieder auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und in eine Kolonne von Dowex-50 χ 8 in der
2,6-Lutidinform (Teilchengrösse 37-74 n, Abmessungen 7,6 χ 142 cm) eingegeben, die zuvor mit dem Puffer ins Gleichgewicht
gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeiz von 25 ml/min mit 0,1-molarer Pufferlösung entwickelt.
Nach einem Vorlauf von 3 1 werden 200 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Jede vierte der Fraktionen Nr. 36 bis
192 wird bei einer Verdünnung von 1:200 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 56 bis 192 und
erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr. 92 bis 96. Die Fraktionen Nr. 80 bis 136 werden vereinigt und durch Zusatz
von 590 ml entmineralisiertem Wasser auf ein Volumen von 1760 ml gebracht» Die vereinigte, verdünnte Lösung, die 62 %
der in die Dowex-50 χ 8-Kolonne eingebrachten Ausgangsbioaktivität
enthält, wird gefriergetrocknet.
- 65 -
709822/1031
15 837 W
Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer
2,6-Lutidinacetatlösung (pH 7,0) gelöst. Die Lösung (27 ml)
wird in eine 5 x 112 cm messende Kolonne mit Bio-Gel ?-2 (37-7^ u) eingegeben, die zuvor mit 0,1-molarer Pufferlösung
ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit der gleichen Pufferlösung
entwickelt.
Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer
(Meccomatic) überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden
sind. Jede der Fraktionen Nr. 70 bis 93 wird bei einer Verdünnung von 1:300 analysiert. Die Bioaktivität findet sich
in den Fraktionen Nr. 73 bis 82 und erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr. 77 und 78. Die Fraktionen Nr. 75 bis 80
werden zu 90 mg Antibioticum mit einer mittleren Stärke von 10 000 Einheiten/mg gefriergetrocknet.
Die 90 mg gefriergetrocknete Feststoffe werden in 4 ml 0,01-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) aufgenommen.
Diese Lösung, die 596 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält (dieses Maß für den Thienamycingehalt
ist in dem Abschnitt II über "Analysenverfahren für Thienamycin" beschrieben), wird in eine Kolonne mit einem
Durchmesser von 1,7 cm eingegeben, die mit 90 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist und vor der Verwendung bei 5° C mit
180 ml 0,01-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) ins Gleichgewicht gebracht worden ist« Das XAD-2 wird vor der Verwendung
nacheinander mit 1)5 Raumteilen 1n NaOH und anschliessend
entmineralisiertem Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 2) 5 Raumteilen 1n HCl und anschliessend entmineralisiertem
Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, 0,001-molarer Tetranatrium-EDTA-
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15 837 JO
Lösung und schliesslich destilliertem Wasser gewaschen. Vor der Verwendung wird an alle diese Lösungsmittel ein Vakuum angelegt«
Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne giesst man zwei Anteile zu je 2 ml Phosphatpufferlösung nach,, Die Kolonne
wird bei 5 C mit der Pufferlösung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Es werden Eluatfraktionen
zu je 4 ml aufgefangen Die nach Durchlauf von 100 ml Eluat bis zum Durchlauf von 253 ml aufgefangenen Fraktionen
werden miteinander vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer unter Vakuui
auf 6 ml eingeengt.
auf 6 ml eingeengt.
dämpfer unter Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 10 C
Diese Lösung, die 436 mit Hydroxylamin auslöschbare optische
Dichteeinheiten enthält, wird in eine Kolonne mit 1,7 cm Durchmesser eingegeben, die mit 90 ml, wie oben beschrieben,
vorgewaschenem XAD-2 beschickt und bei 5 C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach Aufgabe
der Probe giesst man zwei Anteile zu je 2 ml destillierten Wassers nach. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von
2 ml/min mit destilliertem Wasser entwickelt. Dabei werden Eluatfraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die Fraktionen, die
nach Durchlauf von 100 ml Eluat bis zum Durchlauf von 151 ml
aufgefangen werden, werden miteinander vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf ein Volumen von 2,73 ml eingeengt,
und diese Lösung wird gefriergetrocknet. Man erhält 6,49 mg Thienamycin. Die zwischen 152 ml und 345 ml erhaltenen Eluatfraktionen
werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf ein Volumen von 3,34 ml eingeengt und gefriergetrocknet.
Sie ergeben 11,53 mg Thienamycin. Diese Fraktionen enthalten insgesamt 369 durch Hydroxylamin auslöschbare optische
Dichteeinheiten. Dies entspricht einer 3,1-fachen Reinigung
- 67 709822/1031
15 837 q^
des in die erste XAD-2-Kolonne eingegebenen Materials und
liefert eine berechnete Stärke von 31 OOO Einheiten/mg. Die spektrophotometrische Analyse einer Probe dieses Produkts
zeigt eJ = 253, gemessen in Phosphatpufferlösung (pH 7)
ι cm
bei 297 nm.
Eine Probe von 10 g der 99 g gefriergetrockneter Feststoffe, die bei der oben beschriebenen Reinigung mit Dowex-1 χ 2 erhalten
worden sind,- wird in 0,1-molarem 2,6-Lutidinacetatpuffer
(pH 6,3) aufgenommen« Die Lösung (125 ml) wird mit Essigsäure wieder auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und in
eine 7,6 χ 142 cm messende Kolonne mit Dowex-50 χ 8 in der
2,6-Lutidinform eingegeben, die zuvor mit der Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit
einer Geschwindigkeit von 35 ml/min mit 0,1-molarer Pufferlösung entwickelt. Nach einem Vorlauf von 3,6 1 werden 200
Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Jede vierte der Fraktionen Nr. 6 bis 194 wird bei einer Verdünnung von 1:200 analysiert.
Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 18 bis 178 und erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr. 62 bis 82. Die
Fraktionen Nr. 42 bis 102 werden vereinigt und durch Zusatz von 640 ml entmineralisiertem Wasser auf ein Volumen von
1920 ml gebracht. Die vereinigte, verdünnte Lösung enthält 63 % der in die Dowex-50 χ 8-Kolonne eingebrachten Bioaktivität
und wird gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1-molarer
2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst. Diese Lösung (25 ml) wird in eine 5 x 112 cm messende Kolonne mit Bio-Gel
P-2 (37-74 ji) eingegeben, die zuvor mit 0,1-molarer Pufferlösung
ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit der gleichen Pufferlösung
entwickelt.
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709822/1031
Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer
(Meccomatic) überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt,
bis 125 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen Nr. 70 bis 89 wird bei einer Verdünnung
von 1:300 analysiert» Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 72 bis 81 und erreicht ein Maximum in der
Fraktion Nr. 77. Die Fraktionen Nr. 75 bis 79 werden zu 100,5 mg Antibioticum mit einer Stärke von 8320 Einheiten/mg
gefriergetrocknet.
Die 100,5 mg gefriergetrockneter Feststoffe werden in 4 ml 0,01-molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) aufgenommen.
Diese Lösung, die 692 mit Hydroxylamin auslöschbare optische Einheiten enthält, wird in eine Kolonne mit 1,7 cm Durchmesser
eingegeben, die mit 90 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist und vor der Verwendung mit 180 ml 0,01-molarer Kaliumphosphatpufferlösung
(pH 7) bei 5 C ins Gleichgewicht gebracht wird. Vor der Verwendung wird das XAD-2 nacheinander mit
1)5 Raumteilen 1n Natronlauge und anschliessend mit entmineralisiertem
Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 2) 5 Raumteilen 1n HCl und anschliessend mit entmineralisiertem
Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 3) je 5 Raumteilen
Methanol, Aceton, 0,001-molarer Tetranatrium-EDTA-Lösung
und schliesslich destilliertem Wasser gewaschen. An alle diese Lösungsmittel wird vor der Verwendung Vakuum angelegt.
Nach dem Eingeben der Probe in die Kolonne werden zwei Anteile zu je 2 ml Phosphatpufferlösung nachgegossen. Die Kolonne
wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min bei 5 C mit der Pufferlösung entwickelt» Dabei werden Eluatfraktionen
zu je 4 ml aufgefangen. Die nach Durchlauf von 109 ml Eluat beginnenden und mit dem 3O9ten Milliliter endenden Fraktionen
werden gesammelt und miteinander vereinigt. Zu diesem ver-
- 69 709822/1031
15 837 f^
einigten Eluat werden die 11,53 mg des oben beschriebenen,
mit XAD-2 gereinigten Antibioticums zugesetzt, die 186 mit
Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthalten. Das vereinigte Eluat wird zusammen mit dem zugesetzten Antibioticum
in einem rotierenden Verdampfer unter Vakuum bei einer Temperatur unter 10 C auf 7 ml eingeengt.
Diese Lösung, die 720 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird in eine Kolonne mit 1 ,7 cm
Durchmesser eingegeben, die mit 90 ml, wie oben beschrieben, vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist und vor der Verwendung bei
5 C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach der Probe werden zwei Anteile zu je 2 ml destillierten
Wassers in die Kolonne eingegossen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit destilliertem
Wasser entwickelt, wobei Eluatfraktionen zu je 4 ml aufgefangen
werden. Die vom Durchlauf von 109 ml Eluat bis zum Durchlauf von 301 ml Eluat aufgefangenen Fraktionen werden miteinander
vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf 10,3 ml eingeengt. Diese Lösung, die 589 durch Hydroxylamin
auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird zu 23,6 mg Antibioticum mit einer berechneten Stärke von 30 140 Einheiten/mg
gefriergetrocknet.
Das so hergestellte Antibioticum Thienamycin ist ein weisser amorpher fester Stoff von faseriger Konsistenz. Eine Probe
erleidet, wenn sie in einer Glaskapillare mit einer Geschwindigkeit von 3 C/min erhitzt wird, Zersetzung, ohne dass eine
flüssige Phase auftritt. Es werden die folgenden Stufen beobachtet: Erweichen findet bei 130 bis 140° C unter Volumenkontraktion
des festen Stoffes statt und setzt sich bis 170 bis 174 C fort; im letztgenannten Bereich färbt sich das M
terial gelb; Sintern und fortschreitende Farbvertiefung bis
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2552678
15 837 ψ\
zu rötlichbraun wird im Bereich von 180 bis 200 C beobachtet, und schliesso-ich kommt es bei 205 C zur Verkohlung, wobei
restliche Feststoffspuren hinterbleiben.
Eine weitere Probe dieses Materials zeigt bei der spektrophotometrischen
Analyse ein Extinktionsmaximum (absorbance
peak) bei 296,5 nm mit einem E1 ^_ = 268,2. Die Elementar-
ι cm
analyse liefert die folgenden Ergebnisse: 1) Gewichtsverlust von 5,67 % bei 4 Stunden langem Trocknen bei Raumtemperatur
unter Vakuum und 2) Zusammensetzung: 47,68 % Kohlenstoff, 6,22 % Wasserstoff, 11,48 % Stickstoff. Diese Ergebnisse
stimmen mit der empirischen Formel C^H^gNpO^S.(NH,)Q ^q überein;
die dieser empirischen Formel entsprechende, berechnete Zusammensetzung beträgt C = 47,68 %, H = 6,13 %t N = 11,52 %,
S = 11,57 % und 0 = 23,1 %. Die polarimetrische Analyse einer
Probe von 1 mg/ml in 10-mmolarer Kaliumphosphatpufferlösung
zeigt eine spezifische optische Drehung [α] Q +80. Das Infrarotspektrum
einer Suspension dieser Probe in Nujol zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 1765 cm ,
1650-1550 cm"1, 2800-2500 cm"1 und 3500-3100 cm"1. Ein NMR-Spektrum
bei 100 MHz einer Probe dieses Produkts, gelöst in D9O, zeigt ein Dublett bei ο 1,275, ein Dublettenpaar bei
r Γ r~
ο 3,39 und Multiplette bei ό 3,15 und ö 4,20; diese Maxima
sind charakteristisch für Thienamycin.
Das so erhaltene Thienamycin kann nach dem Verfahren des Beispiels
8 zu N-Acetylthienamycin acetyliert werden.
10,9 mg Thienamycin werden 10 Minuten bei 0° C in einem Gemisch aus 1 ml trockenem Dimethylformamid und 2 ml frisch her-
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15 837 75*
gestelltem Essigsäureanhydrid gerührt. Das Dimethylformamid und das Essigsäureanhydrid werden durch mehrmaliges (5- bis
6-maliges) Waschen mit je 25 -bis 40 ml Hexan und letztmaliges
Waschen mit Hexan nach Zusatz von 1 ml trockenem Äthyläther entfernt. Die rohe Probe von N-Acetylthienamycin wird in 20 ml
entmineralisiertem V/asser, welches 100-umolar an Tris-Base
[Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan] und 35-^molar an HCl ist,
gelöst. Nach dem Lösen der Probe beträgt der pH-Wert 7,9. Die
Lösung enthält 244 Extinktionseinheiten (absorbance units) bei 298 nm, und eine 1,27 cm-Analysenscheibe, die 0,1 ml einer
1000-fachen Verdünnung der Probe enthält, erzeugt beim Inkubieren auf Platten mit ATCC 8461 bei 25° C eine Hemmzone mit
einem Durchmesser von 23 mm.
Diese Probe wird in eine Kolonne (Bettabmessungen 1,3 cm χ 14
cm) von Dowex-1 χ 4 (Cl") (Teilchengrössen
<37 u) eingegeben. Die Kolonne wird mit 10 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen
und das Antibioticum N-Acetylthienamycin mit einer an NaCl 0,07-molaren, an NH^Cl 0,005-molaren und an NH^ 0,0001-molaren
Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,7 ml/min werden Fraktionen zu
je 6,1 ml aufgefangen» Der Hauptgipfel der UV-Extinktion (UV absorbance) bei 298 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 36
bis 50 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 40. Die Fraktionen
Nr. 38 bis 46 werden vereinigt und enthalten insgesamt 107 Extinktionseinheiten (absorbance units) bei 298 nm. Die
vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml eingeengt und mit 5 pl 1-molarer
Natronlauge versetzt.
Dieses Konzentrat wird in eine Kolonne (Bettabmessungen
2,2 χ 80 cm) mit Bio-Gel P-2 (37-74 u) eingegeben. Die Probe
wird mit zwei Anteilen zu je 1 ml entmineralisierten Wassers
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15 837 7fc
hineingewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von
0,6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden
Fraktionen zu je 3,04 ml aufgefangen.
Der Hauptgipfel der UV-Extinktion (UV absorbance) bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 58 bis 64 mit einem Maximum
in der Fraktion Nr. 60. Die Fraktionen Nr. 59 bis 62 enthalten 83,7 A^QQ-Einheiten und werden miteinander vereinigt. Ein
2,2 A^QQ-Einheiten äquivalenter Teil wird als Bezugsprobe entnommen
und der Rest auf 1,5 ml eingeengt und in einer 14 ml fassenden Glasampulle zu 3,9 mg N-Acetylthienamycin gefriergetrocknet.
nm' Emax/Emin. = 4'45' E%301 in entmineralisier
tem Wasser = 208.
Durch Desacetylierung dieses Ausgangsmaterials nach dem Verfahren des Beispiels 2 erhält man das Antibioticum Thienamycin.
Herstellung des Antibioticums 890A,
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:
Natriumeitrat 0,5 g
K2HPO4 7,0 g
KH2PO4 3,0 g
(NH4)2S04 1,0 g
MgSO4.7H2O 0,1 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
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15 837 TT
Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit
Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung hat:
| Medium A | 20,0 g |
| Glycerin | 5,0 g |
| Primärhefe | 15,0 g |
| Fischmehl | 1000 ml |
| destilliertes Wasser | 20,0 g |
| Agar | |
pH mit NaOH auf 7,2 eingestellt.
Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 27 bis 28° C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6° C
aufgehoben (nicht langer als 21 Tage).
10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung: Medium B
Hefeautolysat (Ardamine*) 10,0 g
Glucose 10,0 g
Phosphatpuffer** 2,0 ml
MgSO4"7H2O 50 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit HCl oder NaOH auf 6,0 eingestellt. *Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension geschabt,
und 3,3 ml dieser Suspension werden verwendet, um einen 2 fassenden, mit Umlenkorgan versehenen Erlenmeyerkolben zu beimpfen,
der 500 ml Medium B enthält. Dieser Impfkolben wird 36 Stunden bei 28° C in einer mit 160 U/min arbeitenden
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15 837 iS
Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf die Kultur sich zufriedenstellend entwickelt hat«
Die Kultur aus diesem Impfkolben wird verwendet, um einen
189 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, der 160 1 Medium B enthält. Dieser Fermenter wird 24 Stunden
bei 28° C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 150 U/min bei einer Luftströmung von 85 l/min betrieben. Ein
Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow Chemical Corp.) wird nach Redarf verwendet, aber nicht in grösserer
Konzentration als 0,1 %„ Die pH-Werte sind die folgenden:
Alter, h 0 12 pH 6,3 6,35
43 1 der Kultur dieses Impffermenters werden verwendet um
einen 756 1 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, der 467 1 Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium C
Tomatenbrei 20,0 g
Primärhefe 10,0 g
Dextrin (Amidex) 20,0 g
CoCl2*6H2O 5,0 mg
destilliertes Wasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
Dieser Fermenter wird 92 Stunden bei 25 C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 146 U/min bei einer Luftströmung
von 255 l/min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht mehr als 0,1 %,
zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percolans ATCC 8461 mit den folgenden
Ergebnissen durchgeführt:
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Alter, h O 12 24 36 48 60 72 84 92
pH 6,6 6,7 6,65 6,3 6,0 6,4 6,15 6,5 6,5
MB-1287, mm S 19 26 28 32
ATCC 8461,mm Q ΟΛ o, or ^n
(1-10) — — — s """ 21 24 2b 30
890A-Einhei-
ten/ml NA NA 6,8 13,5 24,9 24,3
Die 890A-Einheiten/ml werden, wie in Abschnitt II über "Analysenmethoden für die Antibiotica 890A1 und 890Ay beschrieben,
bestimmt.
473 1 Fermentationsflüssigkeit werden auf 5 C gekühlt und in
einer Zentrifuge (Titan P-9) zentrifugiert. 22,7 kg Celite werden zu 378,5 1 der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt, und
die Suspension wird durch eine 45,7 cm-Filterpresse (Shriver) filtriert. Die 344,4 1 Filtrat werden an eine Kolonne adsorbiert,
die 26,5 1 Dowex-1 χ 2 (Cl") mit Teilchengrössen von
150 bis 300 μ enthält, und die Kolonne wird mit 37,85 1 entmineralisiertem
Wasser gewaschen. Das Gemisch aus den Antibiotica 890A1 und 89OA3 wird mit 113,5 1 5-%iger Kochsalzlösung,
die 0,01-molar an Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 25-nmolar
an neutraler EDTA ist, in entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 18,9 1 aufgefangen. Das Gemisch aus
den Antibiotica 890A1 und 890A^ erscheint in den Fraktionen
Nr. 3 bis 6 mit einer maximalen Stärke in den Fraktionen Nr. 4 und 5. Die Fraktionen Nr. 4, 5 und 6, die 8 % der Aktivität
der filtrierten Fermentationsflüssigkeit enthalten, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zu 7,6 1
eingeengt.
Die 7,6 1 Konzentrat werden in eine Kolonne eingegeben, die
37,85 1 XAD-2 enthält und zuvor mit 189 1 60-%igen wässrigen Acetons, dann mit 189 1 entmineralisiertem Wasser und schliess-
- 76 709822/10 31
15 837 80
lieh mit 189 1 5-%iger Kochsalzlösung gewaschen worden ist.
Das Adsorbat dieses Konzentrats wird mit 142 1 entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden drei Fraktionen zu 9,5 1 und
sechs Fraktionen zu 18,9 1 aufgefangen. Die Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 1 bis 6 mit einer maximalen
Stärke in der Fraktion Nr. 3. Die Fraktionen Nr. 4 und 5, die
64 % der in die XAD-Kolonne aufgegebenen Aktivität oder 370 000 Einheiten enthalten, werden vereinigt.
Die Fraktionen Nr. 4 und 5 werden durch Eindampfen unter vermindertem
Druck zu 120 ml eingeengt. Der pH-Wert wird auf 6,5
eingestellt und das Konzentrat in eine Kolonne (7 x 50 cm) von XAD-2 aufgegeben, die zuvor mit 8 1 60-%iger wässriger
Acetonlösung, dann mit 4 1 entmineralisiertem Wasser und schliesslich mit 8 1 5-%iger Kochsalzlösung in entmineralisiertem
Wasser gewaschen worden ist. Die,Probe wird bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes ablaufen gelassen und die
Kolonne dreimal mit je 20 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und jedesmal bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen.
Dann wird das Antibioticum mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 l/min mit 7 1 entmineralisiertem Wasser eluiert. Es
werden acht Fraktionen zu je 200 ml und dann 14 Fraktionen zu je 400 ml aufgefangen. Die antibiotische Aktivität erscheint
in den Fraktionen Nr. 4 bis 19, die 77 % der in die Kolonne eingegebenen Bioaktivität (bestimmt gegen Salmonella gallinarum
MB1287) enthalten; ein Maximum der Aktivität findet sich in
den Fraktionen Nr. 6 bis 8.
Man bestimmt das Verhältnis der Bioaktivität der Fraktionen gegen Vibrio percolans ATCC 8461 zu dem HAEA,QQ-Wert dieser
Fraktionen. Diejenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis etwa 250 beträgt, enthalten das Antibioticum 890A1, und die-
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15 837 2λ
jenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis etwa 31 beträgt, enthalten das Antibioticum 89OA^. Dementsprechend werden die
Fraktionen Nr. 10, 11, 12 und 13, die den grössten Teil des Antibioticums 890A^ enthalten, zur weiteren Verarbeitung miteinander
vereinigt.
Die aus der zweiten XAD-2-Kolonne erhaltenen vereinigten Fraktionen
Nr. 10 bis 13 werden zu 40 ml eingeengt und in eine Kolonne (Bettabmessungen 2,15 cm χ 40 cm) von Dowex-1 χ 4
(Cl") mit Teilchengrössen unter 37 u eingegeben. Das Antibioticum
wird mit 3 1 einer an NH/Cl 0,075-molaren und an
NH^ 0,001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser bei
einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen zu je 9 ml aufgefangen. Die gegen Vibrio
percolans ATCC 8461 bestimmte antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr0 165 bis 234 mit einer maximalen
Aktivität in den Fraktionen Nr. 195 bis 201.
Die Fraktionen Nr. 186 bis 213 werden vereinigt; sie enthalten insgesamt 472 A^0Q-Einheiten, von denen 312 durch Umsetzung
mit Hydroxylamin auslöschbar sind.
Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 4,2 ml eingeengt. Das Konzentrat
wird in eine Kolonne mit Bio-Gel P-2 (37-74 u; Bettabmessungen 2,15 cm χ 60 cm) eingegeben. Die Probe wird bis zur Höhe des
Bettes ablaufen gelassen, zweimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und dabei jedesmal bis zur Betthöhe ablaufen
gelassen. Dann wird die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert, wobei
man Fraktionen zu je 2,6 ml auffängt.
- 78 -
709822/1031
Das Antibioticum 89OA75 wird in den Fraktionen Nr. 38 bis 48
eluiert; die maximale Aktivität, bestimmt durch die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion (absorbance) bei 300 nm,
tritt in der Fraktion Nr. 41 auf. Die Fraktionen Nr. 40 bis 43 werden vereinigt; sie enthalten 260 A^0Q-Einheiten, von
denen 173 mit Hydroxylamin auslöschbar sind.
Um die restliche Verunreinigung des Antibioticums 890A^ durch
das Antibioticum 890A1 zu entfernen, werden die vereinigten
entsalzten Fraktionen Nr. 40 bis 43 mit 50 ul Penicillinase
[Difco "Bacto-Penase", enthaltend 500 000 Einheiten je ml
(1000 LU/ml, wobei der Ausdruck LU sich auf Levy-Einheiten bezieht; 1000 LU inaktivieren 500 000 Einheiten Penicillin G)]
und 0,1 ml 1-molarer Tris-HCT-Pufferlösung (pH 7,5) versetzt.
Man lässt das Reaktionsgemisch 6 Stunden bei 23 C stehen und setzt dann 3 ml entmineralisiertes Wasser und 15 nil Methanol
zu. Dieses Gemisch wird in eine Kolonne (2,15 x 44 cm Bettabmessungen) von Dowex-1 χ 2 (Cl") (Teilchengrösse unter 37 μ)
eingegeben, die in 50-%igem Methanol gefüllt und mit 2 1 50-vol„%igem Methanol gewaschen worden ist. Das Antibioticum
890A^ wird mit 2 1 50-%igem Methanol eluiert, das an Kochsalz
0,05-molar, an NH^Cl 0,005-molar und an NH ^ 0,0001-molar ist.
Es werden Fraktionen zu je 9,2 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum der UV-Extinktion (UV absorbance), gemessen bei 300 nm, tritt
in den Fraktionen Nr. 74 bis 88 auf. Die Fraktionen Nr. 78 bis 85 werden vereinigt. Nach dem Abtreiben des Methanols unter
vermindertem Druck beträgt der Gesamtwert an Extinktionseinheiten (absorbance units) dieser Fraktionen bei 300 nm
97,6, wovon 87,5 durch Reaktion mit Hydroxylamin auslöschbar sind.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 70 bis 85 werden in einem rotierenden
Verdampfer unter vermindertem Druck auf 3,92 ml einge-
- 79 709822/1031
15 837 %T
engt, und das Konzentrat wird in eine Kolonne von Sephadex-G-10
(Bettabmessungen 2,15 x 70 cm) eingegeben, die mit 4 ml 4-molarer Ammoniaklösung gewaschen und dann mit 0,.15-mmolarer
Ammoniaklösung in entmineralisiertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach zweimaligem Waschen mit je 1 ml
0,02-mmolarer NH,-Lösung wird das Antibioticum 890A, mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min mit 0,02-mmolarer NH,-Lösung eluiert. Es werden zunächst 49 Fraktionen zu je 2,45 ml
und dann 20 Fraktionen zu je 3,33 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum
der Extinktion (absorbance) bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr=, 35 bis 53. Die Fraktionen Nr. 38 bis 46,
die die höchsten A,00/A2^5-Werte aufweisen, werden für die
weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 65 Extinktionseinheiten (absorbance units)
bei 300 nm auf. Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 2,84 ml
eingeengt, in zwei gleiche Teiie geteilt und gesondert in 14 ml-Glasampullen schnellgefroren und gefriergetrocknet. So
erhält man das Antibioticum 890A,. Eine Probe enthält 32,0 «
in 0,88 mg, die andere Probe enthält 31,9 in 0,82 mgο Die erstgenannte Probe, die 32,0
A,Q0-Einheiten enthält, zeigt bei der NMR-Analyse die folgenden
Peaks:
1,29 (d, J = 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d von d, J = 5 und J = 2,4);^ 4,01-4,28 (m); 3,14 (d von d, J = 5
und J -9); 3,39 (t, J = 6,5); 3,92 (d von t, J =^4
und J = 6").
In der obigen Tabelle sind die 100 MHz-NMR-Signale für das
Natriumsalz von 890A, in D2O im Verhältnis zu Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat
als innerem Standard angegeben; die chemischen Verschiebungen sind in ppm und die Kupp-
- 80 -
709822/1031
15 837 gH
lungskonstanten in Hz angegeben, ferner sind auch Mehrfachwerte
angegeben.
Durch Desacetylierung des so gewonnenen Materials nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhält man das Antibioticum Desacetyl-890A^.
Herstellung des Antibioticums 890A1
Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4600a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt
in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium A
Hefeextrakt 10,0 g
Glucose 10,0 g
MgSO4.7H2O 0,05 g
Phosphatpuffer* 2 ml
destilliertes Wasser 1000 ml
* Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,Og
destilliertes Wasser 1000 ml.
Diese Suspension wird verwendet, um einen 250 ml fassenden, mit drei Umlenkorganen versehenen Erlenmeyer-Impfkolben zu
beimpfen, der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung
enthält:
Medium B
Autolysierte Hefe (.Ardamine*) 10,0 g Glucose 10,0 g
MgSO4.7H2O 0,05 g
Phosphatpuffer** 2 ml
destilliertes Wasser 1000 ml
- 81 709822/ 1031
15 837 %ζ
pH mit NaOH auf 6,5 eingestellte
* Ardamine: Yeast Products Corporation
** Phosphatpufferlösung
KH2PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml.
Der Impfkolben wird mit einem Wattepfropfen verschlossen und 30 Stunden bei 28 ί 1° C in einer
5,1 cm) bei 220 U/min geschüttelt.
5,1 cm) bei 220 U/min geschüttelt.
30 Stunden bei 28-1 C in einer Drehschütte!maschine (Hub
| 20,0 | g |
| 10,0 | g |
| 20,0 | S |
| 5,0 | mg |
| 1000 | ml |
50 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Umlenkorgane, die je
250 ml Inhalt haben und je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit je 1 ml der aus dem.Impfkolben gewonnenen Fermentationsflüssigkeit
beimpft. Die Produktionskolben werden mit Wattepfropfen verschlossen»
Medium C
Tomatenbrei Primärhefe Dextrin (Amidex) CoCl2·6Η20
destilliertes Wasser
pH mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.
Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 3 Tage bei 28 - 10C unter Schütteln in einer mit 220 U/min arbeitenden
Drehschüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegen Standardanalysenplatten mit
Vibrio percolans ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27 cm-Scheiben analysiert, die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben
getaucht werden. Die Proben werden mit 0,05-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,4) verdünnt. Die Ergebnisse
sind die folgenden:
- 82 709822/1031
Kulturalter, h 72
pH 6,4
Vibrio percolans,
Verdünnung 1/100,
Hemmzone, mm 23
890-Analyseneinheiten/ml 103
Die 890A-Einheiten/ml werden bestimmt, wie es im Abschnitt
WII. Analysenverfahren für 890A^ und 890Αχ" beschrieben ist.
Die gesamte Fermentationsflüssigkeit wird in Anteilen von 200 ml in Polycarbonatflaschen je 15 Minuten mit 9000 U/min
zentrifugiert, wobei man 1600 ml vereinigte überstehende Flüssigkeiten mit einer Stärke von 104 Einheiten/ml erhält. Hierzu
werden 0,5 ml neutrale EDTA-Lösung zugesetzt.
Die zentrifugierte Fermentationsflüssigkeit wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 bis 20 ml/min an einer Kolonne
mit Dowex-1 χ 2 (Cl") (150-300 u, Bettabmessungen 3,8 χ 22 cm)
adsorbiert. Die Kolonne wird mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von
6 ml/min mit 1 1 entmineralisiertem Wasser eluiert, welches 50 g Kochsalz enthält und 0,02-molar an Tris-HCl-Puffer
(pH 7,0) sowie 25-umolar an neutraler EDTA ist. Es werden
Fraktionen zu je 10 ml aufgefangen.
Das Antibioticum 890A1 erscheint in den Fraktionen Nr. 13 bis
81 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 25 bis 33, gerechnet von dem ersten Aufguss des Salzeluats. Die Fraktionen
Nr. 24 bis 41, die die höchsten Verhältnisse von Bioaktivität zu Ap2o haben, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 29 000 Einheiten oder 17 % der aufgegebenen Bioaktivität.
- 83 -
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15 837 Of
Das Dowex-Eluat wird zu 10 ml eingeengt, der pH-Wert mit verdünnter
Salzsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat in eine Kolonne mit XAD-2 (Bettabmessungen 3,3 x 36 cm) eingegeben,
die zuvor mit je 2 1 60-%igem wässrigem Aceton, entmineralisiertem
Wasser und einer Lösung von 5 Gewichtsteilen Kochsalz in 100 Raumteilen entmineralisiertem Wasser gewaschen
worden ist. Die Probe wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert,
wobei Fraktionen von 40 bis 260 ml aufgefangen werden.
Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. bis 14, die von 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens reichen,
Das Maximum ist in den Fraktionen Nr0 9 und 10 enthalten, die
sich von 370 bis 590 ml des eluierten Volumens erstrecken. Die Fraktionen Nr. 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens
umfassen, weisen die höchsten Verhältnisse HAEA^OO/Ap2o
auf und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen haben 36 600 Einheiten, was 126 % der scheinbaren
aufgegebenen Aktivität entspricht.
Die vereinigten Fraktionen Nr. 9 bis 12 werden zu 100 ml eingeengt,
und das Konzentrat wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min in eine Kolonne mit Dowex-1 χ 4 (Cl")
eingegeben, in der das Adsorptionsmittel Teilchengrössen unter 37 ρ und Bettabmessungen von 2,2 χ 41 cm aufweist. Die
Kolonne wird mit- 50 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit 3 1 einer an
Kochsalz 0,07-molaren, an NH^Cl 0,005-molaren und an NH^
0,0001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Beginnend mit der ersten Aufgabe des Eluierungsmittels, werden
Fraktionen zu 10,8 ml aufgefangen.
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15 837
Der Hauptgipfel der Aktivität des Antibioticums 890A-. erscheint
in den Fraktionen Nr. 181 bis 217 mit einem Maximum in der Fraktion Nr0 198. Die Fraktionen Nr. 186 bis 210, die
insgesamt 114 Absorptionseinheiten (absorption units) bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen werden zu 4,0 ml eingeengt und der pH-Wert durch Zusatz von 16 ul 1-molarer Natronlauge auf 7,3
eingestellt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne mit Bio-Gel-P-2 (37-74 u; Bettabmessungen 2,15 x 70 cm) eingegeben und
dreimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser hineingewaschen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von
0,96 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 3,85 ml aufgefangen.
Der Hauptgipfel der Aktivität des Antibioticums 890A1 erscheint
in den Fraktionen Nr. 24 bis 44 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 33 und 34. Die Fraktionen Nr. 27 bis 38,
die die höchsten A^^/ApAc-Verhältnisse aufweisen, werden für
die Gefriertrocknung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 72 A^0Q-Einheiten.
Um die Gefriertrocknung durchzuführen, werden die vereinigten Fraktionen zu 3,0 ml eingeengt, und der pH-Wert des Konzentrats
wird durch Zusatz von 10 ml 0,1-molarer Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile zu je
1,50 ml geteilt, die dann gesondert aus 14 ml-Glasampullen
mit Schraubkapseln schnellgefroren und gefriergetrocknet werden.
Jede Probe enthält 1,73 mg 890A^, entsprechend
35,8 A^00-Einheiten.
Durch Desacetylierung des so erhaltenen Materials nach dem Verfahren des Beispiels 3 gelangt man zu dem Antibioticum Desacetyl-890A1.
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15 837 £
Mittel, die die AntiMotica gemäss der Erfindung, nämlich Desacetyl-890A-]
und Desacetyl-890A,, enthalten, sowie Mittel, die Thienamycin enthalten, können in verschiedenen Dosisformen,
z.B. in fester oder flüssiger oraler Dosisform dargereicht werden. Die Mittel können, gleich ob sie flüssig oder fest
sind, je Einheitsdosis 0,1 bis 99 % Wirkstoff enthalten; der bevorzugte Bereich beträgt etwa 10 bis 60 %. Das Mittel enthält
im allgemeinen etwa 25 bis 1000 mg Wirkstoff, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels; im allgemeinen verwendet
man jedoch Dosismengen im Bereich von etwa 250 bis 1000 mg. Für die parenterale Darreichung liegt die Einheitsdosis gewöhnlich
als reine Verbindung in etwas angesäuerter steriler wässriger Lösung oder in Form eines zum Lösen bestimmten Pulvers
vor. Typische Gemische können nach den folgenden Verfahren hergestellt werden:
400 mg
Lactose, U.S.P., zum Füllen von Kapseln
Nr. 0 ausreichende Menge, ungefähr je 475 mg.
In dem obigen Beispiel werden Wirkstoff und Verdünnungsmittel zu einem gleichmässigen Gemisch vermischt, welches dann von
Hand oder maschinell in Hartgelatinekapseln Nr. 0 eingefüllt wird. Das Mischen und Füllen erfolgt vorzugsweise in einem
Raum mit einer relativen Feuchte von weniger als 40 %.
Tabletten . je Tablette
Desacetyl-egOA^! 330 mg
Calciumphosphat 192 mg
Lactose, U.S.P. 190 mg
Maisstärke 80 mg
Magnesiumstearat 8 mg
800 mg.
- 86 709822/1031
15 837 90
In dem obigen Beispiel wird der Wirkstoff mit dem Calciumphosphat,
der Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke gemischt. Das Gemisch wird mit einem 15-%igen Maisstärkebrei
granuliert, grob gesiebt und dann wieder durch ein Sieb mit 1,19 mm Maschenweite gesiebt. Nach Zusatz des Restes der
Maisstärke und des Magnesiumstearats wird das Gemisch zu Tabletten verpresst, die einen Durchmesser von etwa 1,27 cm haben
und je 800 mg wiegen.
Nach einem anderen Verfahren mischt man den Wirkstoff mit dem Calciumphosphat, der Lactose und der Hälfte der Maisstärke.
Das Gemisch wird in einer Hochleistungspresse zu verdichteten, tablettenähnlichen Massen verarbeitet. Diese werden zu Körnern
von einem Durchmesser von etwa 1,2 mm zerkleinert. Dann setzt man den Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat zu und
verpresst das Gemisch zu Tabletten von etwa 1,27 cm Durchmesser und 800 mg Gewicht.
Lyo-Form (für die Injektion) je Ampulle·
Desacetyl-egOA^ 25 mg
Mit Wasser für Injektionen, U.S.P.,
aufgefüllt auf 5 ml.
In dem obigen Beispiel wird der Wirkstoff in dem angegebenen Verhältnis in einer genügenden Menge Wasser für Injektionen
aufgelöst. Die Lösung wird durch Selas-Kerzen oder "Millipore"-Membranfilter
filtriert, um sie zu sterilisieren. Die Lösung wird auf sterile Ampullen verteilt. Die Amuppen werden mit
ihrem Inhalt gefroren, und das Wasser wird aseptisch durch Gefriertrocknung entfernt. Die den sterilen trockenen Feststoff
enthaltenden Ampullen werden aseptisch verschlossen.
- 87 -
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15 837 ^A
Um eine Lösung für die parenterale Darreichung zu regenerieren,
setzt man 5 ml steriles Wasser für Injektionen zu dem Inhalt
einer Ampulle zu. '
Desacetyi-890A.j
Saccharose
Glucose
Natriumbenzoat
konzentriertes Orangenöl
mit gereinigtem Wasser, U.S.Po, aufgefüllt auf
Die Saccharose und die Glucose werden in etwa 400 ml Wasser unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wird gekühlt und zunächst
mit Natriumbenzoat und dann mit konzentriertem Orangenöl versetzt. Die Lösung wird mit Wasser auf etwa 900 ml aufgefüllt,
worauf man das Antibioticum zusetzt. Die Lösung wird durch Filtrieren durch ein grobes Filter geklärt.
| je 1000 | ml |
| 1,0 | g |
| 600,0 | g |
| 250,0 | g |
| 1,0 | g |
| 0,2 | ml |
| 1000,0 | ml |
- 88 -
70 9822/103 1
Claims (7)
- Merck & Co., Inc. ^c- -^yPatentansprüche
- 2. Desacetyl-890A3·
- 3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der StrukturformelCH,-CH(OH)COOHdadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der StrukturformelCH-.-CH (OH) 3S-CH0-CH9-NH-C-CH-COOHin innige Berührung mit einer Amidohydrolase bringt, die imstande ist, die N-Acetylgruppe zu hydrolysieren.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Amidohydrolase eine N-Acetylthienairiycin-Amidohydrolase verwendet.- 89 -7 0 3 8 2 2/103115 837
- 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass rran als Amidohydrolase eine N-Acetyläthanolamin-Amidohydrolase verwendet.
- 6. Verfahren zur Gewinnung von Mikroorganismen mit N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Züchtung diejenigen Mikroorganismen auswählt, die imstande sind, N-Acetyläthanolamin auszunutzen, und diese Mikroorganismen auf die Anwesenheit von Iv-Acetylthienamycin-Amidohydrolase untersucht.
- 7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man es mit einer Amidohydrolase durchführt, die durch einen Amidohydrolase erzeugenden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber erzeugt worden ist.8. Verfahren zur Herstellung von Thienamycin, dadurch gekennzeichnet, dass man N-Acetylthienamycin in innige Berührung mit dem von einem Amidohydrolase erzeugenden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber erzeugten Enzym N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase bringt.9. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-890A>i , dadurch gekennzeichnet, dass man 890A-, in innige Berührung mit dem von einem Amidohydrolase erzeugenden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber erzeugten Enzym N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase bringt.10. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-890A^, dadurch gekennzeichnet, dass man 89Ok^ in innige Berührung mit dem von einem Amidohydrolase erzeugenden Stamm des Mikroorganismus Protaminobacter ruber erzeugten Enzym N-Acetylthienamycin-Amidohydrolase bringt.- 90 703822/1031837 ^ 2 B B ? G 711. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine antibakteriell wirksame Menge der Verbindung Desacetyl-890A^ und einen nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.12. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine antibakteriell wirksame Menge der Verbindung Desacetyl-SSOA^ und einen nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthält.- 91 -7 0 9 n.7 ? I 1 0 3 1
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