CH625553A5 - Process for the preparation of an antibiotic in the form of compound 890A1 or compound 890A3 or a mixture of these two compounds - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums in Form eines der neuen antibiotischen Stoffe, die hier als Verbindung 890Ai bzw. 890A3 bezeichnet werden, oder in Form eines Gemischs dieser Verbindungen. Das nach dem Verfahren erhältliche neue Antibioticum kann in verdünnter Form, als rohes Konzentrat und in reiner Form vorliegen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines neuen und wertvollen Anticioticums, das in hochgradig wirksamer Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmt, durch Fermentation von Nährmedien mit Species von Streptomyces zur Verfügung zu stellen.

Die neuen antibiotischen Stoffe werden erfindungsgemäss hergestellt, wie im Patentanspruch 1 definiert.

Auf Grund umfangreicher klassifizierender Untersuchungen wurde festgestellt, dass die im Rahmen der Erfindung verwendeten Stämme von Mikroorganismen der Species Streptomyces flavogriseus angehören, und diese sind in der Kultursammlung von Merck & Co. Inc., Rahway, N.J., als MA-4434a und MA-4600a bezeichnet worden. Eine Kultur eines jeden dieser Stämme ist am 7. November 1975 permanent in der Kultursammlung der Northern Regional Laboratories, Northern Uti-lization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, III., niedergelegt worden und diese haben die Kennzeichnungsnummer N RRL 8139 bzw. 8140 erhalten.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 erzeugt beide Verbindungen 890Ai und 890A3, die in praktisch reiner Form aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert werden können. Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 erzeugt die Verbindung 890Ai ohne nachweisbare Mengen von 890A3.

Die charakteristischen morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale von Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 sind in der nachstehenden Übersicht zusammengestellt.

Morphologie

Die Sporenphoren sind sich verzweigende, gerade bis geschlängelte Sporenketten, die Büschel bilden. Die Ketten haben eine Länge von mehr als 10 Sporen. Die Sporen sind kugelförmig bis oval - 0,9 n x 1,2 |i (bei 970facher Vergrösse-rung).

Kulturmerkmale Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich, pergamentartiges Wachstum;

Luftmycel - hellgrau mit mittelgrauem Rand;

Lösliches Pigment - keines.

Czapek-Dox-Agar (Saccharose-N itrat-Agar)

Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit dunkelbraunem Rand;

Luftmycel - mittelgrau, samtartig;

Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums.

Eieralbumin-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich mit braunem Rand;

Luftmycel - mittelgrau, gemischt mit gelblichgrau (2dc) und graustichigem Gelb (2db);

Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.

Glycerin-Asparagin-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich, flach, sich ausbreitend;

Luftmycel - samtartig, hellgrau mit stark gelblichem Ton bis grau (2dc);

Lösliches Pigment - keines.

Anorganische Salze-Stärkeagar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun;

Luftmycel - mittelgrau, samtartig;

Lösliches Pigment - hellgelblich-bräunlich.

Hefeextrakt-Dectrose und Salzagar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit sehr dunkelbraunem Rand;

Luftmycel - dunkelgrau, gemischt mit hellgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau, samtartig;

Lösliches Pigment - keines.

M agermilch-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

625 553

Luftmycel - spärlich, gräulich;

Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums;

Hydrolyse von Casein - gut.

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum - mässiger Wuchsring, dunkelbräunlich;

Luftmycel - keines;

Farbe - purpur;

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; wird alkalisch, pH 8,2.

Magermilch

Vegetatives Wachstum - mässiger Wuchsring, bräunlich; Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - bräunlich;

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung; wird alkalisch, pH 8,0.

Tyrosin-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau;

Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Zersetzung vonTyrosin - keine.

Pepton-Eisen-Hefextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - spärlich, gräulich;

Lösliches Pigment - keines;

Melanin - keines;

H2S-Entwicklung - keine.

Nähragar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - hell gräulichbraun mit dunklerem graubraunem Rand;

Luftmycel - hellgrau mit dunkelgrauem Rand;

Lösliches Pigment - keines.

Nährstärke-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich mit grauem Rand; Luftmycel - mittelgrau mit dunkelgrauem Rand;

Lösliches Pigment - keines;

Hydrolyse von Stärke - gut.

N ährgelatine-Agar

Vegetatives Wachstum - farblos mit dunkelgrauem Rand; Luftmycel - gräulich-weiss;

Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - gut.

Kartoffelpfropfen

Vegetatives Wachstum - gutes Wachstum, stark gerunzelt;

Luftmycel - grau bis grünlichgrau;

Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums.

Loefflersches Blutserum

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung - keine.

Senkrechtes Gelatineröhrchen

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - gut.

Alle oben angegebenen Merkmale wurden, falls nichts anderes gesagt ist, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C festgestellt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in «Color Harmony Manual», 4. Auflage (1958), herausgegeben von der Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus drei Wochen lang bei 28 °C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat in einer Konzentration von 1% enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Tabelle I zeigt die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, wobei + ein gutes Wachstum, ± ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.

Tabelle I

Glucose

+

Maltose

+

Arabinose

+

Mannit

+

Cellulose

-

Mannose

+

Fructose

+

Raffinose

-

Inosit

-

Rhamnose

+

Lactose

+

Saccharose

±

Xylose

+

Für das Ausmass des Wachstums mit Temperaturänderung und den Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus gilt folgendes:

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dectrose + Salzagar); 28 °C - gut

37 °C - gutes vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50 °C - kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultur in Hefeextrakt-Dextrose-Salzagar) aerob.

Die charakteristischen morphologischen Merkmale und Kulturmerkmale von Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 sind in der nachstehenden Übersicht zusammengestellt.

Morphologie

Die Sporophoren sind sich verzweigende, gerade bis geschlängelte Ketten von Sporen, die Büschel bilden. Ketten haben eine Länge von mehr als 10 Sporen. Die Sporen sind rund bis oval - 0,9x 1,2 n(bei 970facher Vergrösserung).

Kulturmerkmale Hafermehl-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - gelblich-bräunlich mit dunkelbraunem Rand;

Luftmycel - hellgrau mit mittelgrauem Rand;

Lösliches Pigment - keines.

Czapek-Dox-Agar(Saccharose-Nitrat-Agar)

Vegetatives Wachstum - Rückseite - braun mit dunkelbraunem Rand;

Luftmycel - mittelgrau, samtartig;

Lösliches Pigment - keines.

Eieralbumin-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - gräulich-bräunlich mit stark gelbbräunlichen Abschnitten;

Luftmycel - mittelgraue, gräulich-weisse und gelblich-graue (2dc) Abschnitte;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625 553

4

Lösliches Pigment - sehr hellbräunlich.

Glycerin-Asparagin-Agar

Vegetatives Wachstum - gelblich-bräunlich;

Luftmycel - spärlich, gräulich;

Lösliches Pigment - keines.

Anorganische Salze - Stärke-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - gräulich-rahmfarben; ' Luftmycel - mittelgrau, samtartig;

Lösliches Pigment - keines.

Hefeextrakt-Dextrose + Salz-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau, gemischt mit hellgrau, samtartig; Lösliches Pigment - keines.

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - dunkelbraun; Luftmycel - dunkelgrau, samtartig;

Lösliches Pigment - keines.

Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum, bräunlich;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Melanin - keines;

HîS-Entwicklung - keine.

Nähragar

Vegetatives Wachstum - hellbräunlich;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines.

Nährstärke-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Hydrolyse von Stärke - gut.

N ährgelatine-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - gut.

Senkrechtes Gelatineröhrchen

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - vollständig.

Magermilch-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Hydrolyse von Casein - gut.

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum - bräunlicher Wuchsring;

Luftmycel - keines;

Farbe - bräunlich-purpur;

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige Peptonisierung, wird alkalisch, pH 8,0.

Magermilch

Vegetatives Wachstum - bräunlich, mässiger Wuchsring; Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - hellbraun;

Koagulation und/oder Peptonisierung - vollständige peptonisierung, wird alkalisch, pH 8,5.

Kartoffelpfropfen

Vegetatives Wachstum - gut, bräunlich;

Luftmycel - sehr spärlich, weisslich;

Lösliches Pigment - keines.

Loefflersches Blutserum

Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung - keine.

Tyrosin-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - leichte Bräunung des Mediums;

Zersetzung von Tyrosin - sehr schwach.

Falls nichts anderes angegeben ist, wurden alle obigen Beobachtungen nach dreiwöchiger Inkubation bei 28 °C durchgeführt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8-7,2). Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in «Color Harmony Manual», 4. Auflage (1958), Verlag Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus drei Wochen lang bei 28 °C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat in einer Konzentration von 1% enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8-7,2). In Tabelle II ist die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 angegeben, wobei + ein gutes Wachstum, ± ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohlehydrat bedeutet.

Tabelle II

Glucose

+

Maltose +

Arabinose

+

Mannit +

Cellulose

-

Mannose +

Fructose

+

Raffinose ±

Inosit

±

Rhamnose +

Lactose

+

Saccharose ±

Xylose

+

Für das Ausmass des Wachstums bei Temperaturänderung und den Sauerstoffbedarf des Mikroorganismus gilt folgendes: Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salz-Agar); 28 °C - gut

37 °C - mässig vegetatives Wachstum; keine Lufthyphen 50 °C - kein Wachstum Sauerstoffbedarf: aerob.

Die Verbindungen 890Ai und 890A3 sind durch unter gesteuerten Bedingungen durchgeführte aerobe Fermentation wässriger Nährmedien, die mit Stämmen des Organismus Streptomyces flavogriseus beimpft worden sind, erhältlich. Für die Herstellung von 890Ai und 890A3 eignen sich wässrige Medien, wie diejenigen, die auch zur Erzeugung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche Medien enthalten C-, N-Quellen und anorganische Salze, die von dem Mikroorganismus assimiliert werden.

Im allgemeinen können Zucker, wie z. B. Dextrose, Glucose,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

625 553

Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit und dergleichen, und Stärken, wie Dextrin oder Getreide, z. B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, allein oder zusammen mit anderen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in dem Medium richtet sich teilweise nach den übrigen Bestandteilen des Mediums; im allgemeinen variiert jedoch die Menge der Kohlehydrate zwischen 1 und 6 Gewichtsprozent des Mediums. Diese C-Quellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere derartige C-Quellen können in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen können viele Proteinstoffe als N-Quellen bei dem Fermentationsverfahren verwendet werden. Geeignete N-Quellen sind z. B. Hefehydrolysate, Primärhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenbrei und dergleichen. Die N-Quellen können allein oder in Kombination miteinander in Mengen von 0,2 bis 6 Gew.-% des wässrigen Mediums angewandt werden.

Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien zugesetzt werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Carbonationen und andere Ionen liefern. Hierher gehören auch Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan und Eisen.

Die in den Beispielen beschriebenen Kulturmedien dienen nur zur Erläuterung; man kann die verschiedensten Medien verwenden.

Die Fermentation kann bei einer Temperatur von 20 bis 37 °C durchgeführt werden; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man die Fermentation jedoch vorzugsweise bei einer Temperatur von 23 bis 28 °C durch. Der anfängliche pH-Wert des Nährmediums zur Züchtung von Stämmen der Kultur von Streptomyces flavogriseus und zur Erzeugung der Verbindungen 890Ai und 890A3 kann im Bereich von 6,0 bis 8,0 variieren.

Die Verbindungen 890Ai und 890A3 können zwar sowohl in Oberflächenkultur als auch in Submerskultur erzeugt werden; erfindungsgemäss wird die Fermentation jedoch in Submerskultur durchgeführt.

Die Fermentation zur Erzeugung des Antibioticums erfolgt zweckmässig in kleinem Massstab durch Beimpfen eines Nährmediums mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur und Fortführen der Fermentation nach der Übertragung auf ein Produktionsmedium über mehrere Tage hinweg in einer Schüttelmaschine bei konstanter Temperatur von etwa 28 °C.

Man beginnt die Fermentation zweckmässig in einem mit Nährmedium beschickten sterilisierten Kolben über eine oder mehrere Stufen der Impfgutentwicklung. Als Nährmedium für die Impfgutstufe kann man jede Kombination von C- und N-Quellen verwenden. Der Impfkolben wird z. B. einen Tag lang in einer konstanten Temperaturkammer bei etwa 28 °C geschüttelt, bis die Kultur zufriedenstellend ist, und ein Teil der entstehenden Kultur kann verwendet werden, um entweder ein zweistufiges Impfgut oder das Produktionsmedium zu beimpfen. Zwischenstufige Impfkolben können, wenn sie verwendet werden, im wesentlichen in der gleichen Weise entwickelt werden, d. h. ein Teil des Kolbeninhalts der letzten Impfstufe wird verwendet, um das Produktionsmedium zu beimpfen. Die beimpften Kolben werden zweckmässig mehrere Tage lang bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationsperiode kann der Kolbeninhalt zentrifugiert oder filtriert werden.

Für in grossem Massstab durchgeführte Arbeiten erfolgt die Fermentation vorzugsweise in Fermentern, die mit einem Rührer und einer Anlage zum Belüften des Fermentationsmediums versehen sind. Nach dieser Methode kann das Nährmedium in dem Fermenter angemacht und durch Erhitzen auf

Temperaturen bis etwa 120 °C sterilisiert werden. Nach dem Abkühlen kann das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Kultur beimpft und die Fermentation eine Zeitlang, z. B. 1 bis 6 Tage, unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von 24 bis 28 °C, fortgeführt werden. Diese Methode zur Herstellung der Verbindungen 890Ai und 890A3 eignet sich besonders für die Herstellung grosser Mengen der Antibiotica.

Physikalische und chemische Eigenschaften der Verbindungen 890Ai und 890A3

Eigenschaften der Verbindung 890Ai

Die Verbindung 890Ai ist ein saurer Stoff, der bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert zum positiven Pol wandert.

Das Natriumsalz der Verbindung 890Ai ist in der Form, in der es durch Gefriertrocknen aus wässriger Lösung gewonnen wird, ein stark wasserlösliches weisses Pulver.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt ein >.max bei 299,5 nm und ein Àmin bei 242 nm. Eine Lösung des Natriumsalzes der Verbindung 890Ai in Wasser bei neutralem pH-Wert zeigt für eine reine Probe ein E% von 208 bei 300 nm; das Verhältnis der Extinktionswerte bei 300 nm und 245 nm beträgt 4,25, und das Verhältnis A300/A210 beträgt 1,41. Mehr als 92% der Absorption bei 300 nm können durch Reaktion mit Hydroxyl-amin vernichtet werden, und eine ähnliche Abnahme wird auch bei Reaktion mit Cystein beobachtet.

Das Zirkulardichroismusspektrum von 890Ai zeigt ein positives Maximum bei 290,5 nm mit einer spezifischen Elliptizität von 5270 Grad- ml je dm • g, einen Nullpunkt der Elliptizität bei 250 nm und ein negatives Minimum bei 214 nm mit einer spezifischen Elliptizität von -10 910 Grad • ml je dm • g.

In der folgenden Tabelle sind die 100-MHz-NMR-Signale für das Natriumsalz von 890Ai in D2O in bezug auf Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat, nachstehend als DSS abgekürzt, als innerer Standard angegeben, die chemischen Verschiebungen sind in ppm und die Kupplungskonstanten in Hz angegeben; die scheinbaren Mehrfachwerte sind ebenfalls angegen.

1,35 (d, J = 6,5); 1,98 (s); 3,63 (d von d, J = 5,2 und J = 9,8); -4,02-4,26 (m); 3,18 (d von d, J = ~11 und J = 10); 3,41 (t, J = 6); 2,97 (d von t, J = 3,5 und J = 6).

Die antibiotische Stärke von 890Ai, bestimmt an Vibrio per-colans ATCC 8461, ist zu 250 Einheiten je HAEA3oo-Einheit definiert worden.

Eigenschaften der Verbindung 890Aj

Die Verbindung 890A3 ist ein saurer Stoff, der bei der Elektrophorese bei neutralem pH-Wert zum positiven Pol wandert.

Das Natriumsalz ist in dem Zustande, in dem es durch Gefriertrocknen aus wässriger Lösung gewonnen wird, ein weisses Pulver.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum hat ein Maximum bei 300,5 nm und ein Minimum bei 243 nm. Eine Lösung des Natriumsalzes der Verbindung 890A3 in Wasser bei neutralem pH-Wert zeigt ein E% von 375 bei 300 nm für eine reine Probe; das Verhältnis der Extinktionen bei 300 nm und 245 nm beträgt 3,54. Mehr als 90% der Absorption bei 300 nm können durch Reaktion mit Hydroxylamin ausgelöscht werden; eine ähnliche Abnahme wird bei der Umsetzung mit Cystein beobachtet.

Das Zirkulardichroismusspektrum von 890A3 hat ein positives Maximum bei 294 nm mit einer spezifischen Elliptizität von 9127 Grad-ml je dm-g, einen Nullpunkt der Elliptizität bei 249 nm und eine spezifische Elliptizität von -15 053 Grad • ml je dm-g bei 220 nm.

In der folgenden Tabelle sind die 100-MHz-NMR-Signale für das Natriumsalz von 890A3 in D2O in bezug auf DSS als innerer Standard, ferner die chemischen Verschiebungen in ppm, die Kupplungskonstanten in Hz sowie auch die scheinba5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625 553

6

ren Mehrfachwerte angegeben.

1,29 (d, I = 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d von d, J = 5 und J = 2,4); ~4,01-4,28(m);3,14(d vond, J = 5 und J = 9); 3,39 (t, j = 6,5); 2,92 (d von t, J = ~4 und J = 6).

Die antibiotische Stärke von 890A3, bestimmt an Vibrio percoians ATCC 8461, beträgt 31 Einheiten je HAEAäoo-Einheit.

Massenspektralanalyse von 890Ai und 890A3

Die Massenspektraldaten für 890Ai und 890A3 werden an Trimethylsilylderivaten bestimmt, die aus den Ammoniumsalzen der Antibiotica mit Bis-trimethylsilyltrifluoracetamid in Dimethylformamid hergestellt werden. Die Umwandlung der Natriumsalze der Antibiotica in die Ammoniumsalze erfolgt unter Verwendung des Ammoniumsalzes eines sauren Ionen-austauschharzes.

Bei der Trimethylsilylierung von 890Ai und 890A3 bilden sich drei verschiedene Derivate, nämlich ein Di- und ein Tri-tri-methylsilylderivat (Molekulargewichte 458 bzw. 530) und eine geringe Menge eines Tetra-trimethylsilylderivats eines hydroly-5 sierten Produkts (Molekulargewicht 620), bei dem der ß-Lac-tamring offen ist.

Nachstehend sind die Werte der wichtigsten Massenspek-trenfragmente angegeben:

Di-trimethylsilylderi vat : 443,1495; 301,1034; 300,0962; io 241,0590 und 86,0610.

Tri-trimethylsilylderivat: 515,1931 ; 373,1422 und 158,1000.

Tetra-trimethylsilylderivat (man beobachtet nur ein Signal von geringer Auflösung): 620 und 605.

Es wird angenommen, dass die Verbindungen 890Ai und 15 890A3 Isomere der folgenden Molekularstruktur sind:

ch3-ch(oh)

-nh-2-

s-ch2-ch2-nh-C-ch.

(I)

Die Verbindungen 890Ai und 890A3 sind ferner durch die folgenden antibiotischen Spektrumprofile gekennzeichnet:

Die Prüfung zur Bestimmung des antibiotischen Spektrumprofils wird durchgeführt, indem man ein Tröpfchen von 0,015 30 ml auf die Oberfläche einer lOOx 15 mm messenden Petrischale aufbringt, die 5 ml beimpftes Nähragar und 0,2 Gew.-% Hefeextrakt enthält. Die Verbindung 890Ai wird in einer Konzentration von 33 y/ml und die Verbindung 890A3Ìn einer Konzentration von 182 y/ml untersucht. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Durchmesser der Hemmzone in Millimeter, finden sich in Tabelle III.

Tabelle III

Antibakterielles Spektrumprofil (ASP) der Verbindungen 890Ai und 890A3 in vitro

Mikroorganismus

Merck Nr. ATCC Nr. Hemmzonendurchmesser, mm

890Ai 890A3

Bacillus sp.

MB 633

-

40

37

Proteus vulgaris

MB 1012

-

21

24

Pseudomonas aeruginosa

MB 979

-

0

0

Serratia marcescens

-

990

26

28

Staphylococcus aureus

-

6538 P

35

36

Bacillus subtilis

-

6633

38

40

Sarcina lutea

-

9341

38

44

Staphylococcus aureus

MB 698

-

28

34

Streptococcus faecalis

MB 753

-

17

17

Alcaligenes faecalis

-

213

27

34

Brucella bronchiseptica

-

4617

22

27

Salmonella gallinarum

MB 1287

-

33

33

Vibrio percoians

-

8461

34

40

Xanthomonas vesicatoria

MB815

-

26

26

Proteus vulgaris

-

21100

34

34

Escherichia coli

MB 1418

-

27

32

Pseudomonas stutzeri

-

11607

10

32

Klebsiella pneumoniae

MB 1264

-

27

33

Aerobacter aerogenes

MB 835

-

26

30

Erwinia atroseptica

-

4466

20

30

Pseudomonas aeruginosa

MB 2824

-

0

32

Corynebacterium pseudoidph.

-

9742

34

36

Escherichia coli in synthetischem Medium

-

9637

27

29

Streptococcus faecium

MB 2820

-

18

24

Streptococcus agalactiae

MB 2875

-

36

30

Vibrio percoians (resistent gegen Ceph. C)

MB 2566

-

15

34

Proteus vulgaris (Episom)

MB2112

-

32

38

Proteus mirabilis

MB 3126

-

23

30

Vibrio percoians + 2x 105

Einheiten/ml Penicillinase

-

8461

10

35

7

625553

Die Verbindung 890Ai zeigt In-vivo-Aktivität gegen gramnegative und gram-positive Organismen und eignet sich daher zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Tieren und Menschen. Zur Bestimmung der In-vivo-Aktivität wird die Verbindung 890Ai in einer Lösung von 0,15-molar NaCl und 0,01-molar Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst und mit dieser Lösung zu fünf vierfachen Konzentrationen des Antibioticums für die Untersuchung verdünnt. Weibliche weisse Schweizer Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von etwa 21 g werden intraperitoneal mit dem in Fleischbrühe suspendierten Prüforganismus infiziert. Die Anzahl der injizierten Organismen wird nach genormten Platten-Zählmethoden bestimmt. Zum Zeitpunkt der Infektion und 6 Stunden später werden einige der Mäuse intraperitoneal mit dem Antibioticum behandelt. Für jede Konzentration des untersuchten Antibioticums werden fünf Mäuse verwendet. Weitere zwei Mäuse, die nicht infiziert worden sind, werden mit dem Antibioticum behandelt, um zu bestimmen, ob die Menge des injizierten Mittels toxisch war. Zu jedem Test gehören Kontrollen von je fünf Mäusen für jede der verschiedenen Verdünnungen der infizierenden Kultur, um die Anzahl der Organismen zu berechnen, die auf 50% der infizierten, unbehandelten Mäuse lethal wirken (LD50). Diese Berechnung wird auf Grund von Überlebensdaten am siebenten Tag nach der Infektion durchgeführt, und zu diesem Zeitpunkt wird auch die Menge des Antibioticums berechnet, die 50% der infizierten Mäuse schützen sollte (EDso).

Alle so infizierten und nicht mit dem Antibioticum behandelten Mäuse sterben innerhalb 48 Stunden nach der Infektion. Die Wirksamkeit der Verbindung 890Ai mit einer Stärke von 5,5 Einheiten/ y gegen Solmonella schottmuelleri MB-2837 ist nachstehend angegeben:

Einheiten/ml(a) Dar

ED50X2 Dosen

reichungs-

Ver

Einheiten/ml y(b>

art dünnung

908 ip

1:32

14 3

(a) 1 Einheit/ml = diejenige Konzentration, die eine Hemmzone von 25 mm gegen Vibrio percoians ATCC 8461 erzeugt.

6b) Der y-Wert ist auf Grund der geplanten Reinheit von 890Ai bei 5500 Einheiten/mg berechnet.

Die Verbindung 890Ai und 890A3 sind wertvolle Antibiotica, die gegen die verschiedensten gram-positiven und gramnegativen Bakterien aktiv sind und daher sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin Verwendung finden. Die Verbindungen können allein oder in Kombination miteinander als antibakterielle Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien verursacht werden, z. B. gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae. Die antibakteriellen Mittel können ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konvervieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Zum Beispiel können sie in wässrigen Mitteln in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Teilen Antibioticum je Million Teile gewichtsmässig, Lösung oder vorzugsweise in Konzentrationen von 1 bis 10 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Ausrüstungsgegenständen zu zerstören und zu hemmen, sowie als Bactericide für technische Anwendungszwecke, z. B. in Anstrichfarben auf wässriger Basis, in dem Siebwasser von Papierfabriken und zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien. Die Antibiotica können in den verschiedensten pharmazeutischen Präparaten als alleinige Wirkstoffe oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antibiotica oder mit einem oder mehreren pharmakologisch aktiven Stoffen verwendet werden. Als Beispiel für den erstgenannten Fall kann ein Aminocyclitol-Antibioticum, wie Gentamicin, mit den beschriebenen Antibiotica gemeinsam dargereicht werden, um die Möglichkeit des Auftretens von resistenten Organismen auf ein Minimum zu beschränken. Als Beispiel für den letzteren Fall kann man Diphenoxylat und Atropin in Dosisformen für die Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen kombinieren. Die Antibiotica können in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern, flüssigen Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Sie können oral, iokal, intravenös oder intramuskulär dargereicht werden. Ferner können die Verbindungen 890Ai und 890A3 in Kombination miteinander angewandt werden.

Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisform vorliegen und herkömmliche Streckmittel, wie Bindemittel, z. B. Sirup, Akazienharz, Gelatine, Sorbit, Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Gleitmittel, z. B. Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; den Zerfall fördernde Mittel, z. B. Kartoffelstärke oder zulässige Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Tabletten können nach an sich bekannten Methoden beschichtet sein. Oral darzureichende flüssige Präparate können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw. oder als trockenes Produkt zum Anmachen mit Wasser oder anderen Trägern vor der Verwendung vorliegen. Solche flüssigen Präparate können herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel, z. B. Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthyl-cellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte geniessbare Fette; Emulgiermittel, z. B. Lecithin, Sor-bitanmonooleat oder Akazienharz; nicht-wässrige Träger, wie geniessbare Öle, z. B. Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konservierungsmittel, z. B. p-Hydroxybenzoesäuremethyl- oder -propyl-ester oder Sorbinsäure, enthalten. Zäpfchen enthalten z. B. herkömmliche Zäpfchenbasen, wie Kakaobutter oder andere Gly-ceride.

Mittel für die Injektion können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in Mehrfachdosisform in Behältern unter Zusatz von Konservierungsmitteln zur Verfügung gestellt werden. Die Mittel können die Form von Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern aufweisen und Formulierungsmittel, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Der Wirkstoff kann auch in Pulverform vorliegen und vor der Verwendung mit einem Träger, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, angemacht werden.

Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und des Halses oder der Bronchialgewebe geeigneter Form hergestellt werden, z. B. als Pulver oder flussige Sprüh- oder Inhaliermittel, Pastillen, Rachenanstrichmittel usw. Zur Behandlung der Augen oder Ohren können die Präparate als einzelne Kapseln, in flüssiger oder halbflüssiger Form zur Verfügung gestellt oder als Tropfen usw. verwendet werden. Für die lokale Applikation können sie in hydrophoben oder hydrophilen Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Anstrichmittel, Pulver usw. vorliegen.

Ausser einem Träger können die beschriebenen Mittel andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Bindemittel, Oxida-tionsverzögerer, Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, die Viscosität beeinflussende Mittel oder Geschmacksstoffe und dergleichen, enthalten.

In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, können die Mittel z. B. als Präparate zum Injizieren in die Brust formuliert werden, die auf Langzeitwirkung abgestellt sind oder den Wirkstoff schnell in Freiheit setzen.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625 553

8

Die darzureichende Dosis richtet sich weitgehend nach dem Zustand des zu behandelnden Tieres, dem Gewicht desselben und der Art der Infektion, der Art und Häufigkeit der Darreichung, wobei die parenterale Darreichung bei allgemeinen Infektionen und die orale Darreichung'bei Darminfektionen bevorzugt wird.

Zur Behandlung von bakteriellen Infektionen beim Menschen können die beschriebenen Verbindungen oral oder parenteral nach herkömmlichen Methoden für die Behandlung mit Antibiotica in Mengen von 2 bis 600, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg/Tag dargereicht und vorzugsweise in Einzeldosen unterteilt werden, die z. B. drei- bis viermal pro Tag dargereicht werden. Es können Einheitsdosisformen verwendet werden, die z. B. 25,330,400 oder 1000 mg Wirkstoff zusammen mit physiologisch unbedenklichen Trägern oder Streckmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten können in Form von flüssigen Präparaten, wie Lösungen oder Suspensionen; oder als feste Stoffe in Tabletten oder Kapseln vorliegen. Die optimale Dosis richtet sich für jeden einzelnen Fall nach Art und Schwere der Infektion, wobei für die Behandlung von Kindern kleinere Dosen angewandt werden; alle derartigen Bemessungsregeln sind dem Fachmann bekannt.

Die Erfindung umfasst auch die nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salze von 890Ai und 890A3, z. B. die pharmakologisch unbedenklichen Salze, die mit anorganischen oder organischen Basen entstehen. Hierzu gehören z. B. Metallsalze, die von Alkali- oder Erdalkalihydroxiden, -carbonaten oder-bicarbonaten abgeleitet sind, wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Calciumsalze, sowie Salze von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie von Monoalkylaminen, Dialkylaminen, T rialkylaminen, niederen Alkanolaminen, niederen Dialkanolaminen, niederen Alkylendiaminen, N,N-Di-aralkyl-nied.-alkylendiaminen, Aralkylaminen, aminosubstituier-ten niederen Alkanolen, durch niedere N,N-Dialkylaminogrup-pen substituierten niederen Alkanolen, amino-, polyamino- und guanidinosubstituierten niederen Alkansäuren und stickstoffhaltigen heterocyclischen Aminen. Typische Beispiele sind Salze, die von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natri-umcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, T rimethylamin, T riäthylamin, Piperi-din, N-Äthylpiperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Argi-nin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendi-amin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methylpropanol-( 1 ), Theophyllin, N-Methylglucamin und dergleichen abgeleitet sind.

Die Salze der beschriebenen Verbindungen können nach bekannten Methoden hergestellt werden. So erhält man z. B. die Monosalze, wie das Mononatriumsalz, durch Umsetzung von 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit 1 Äquivalent des Produkts des erfindungsgemässen Verfahrens in einem geeigneten Lösungsmittel. Auch Mischsalze mit zweiwertigen Kationen können hergestellt werden, indem man 1 Mol einer zweiwertigen Base mit 1 Mol des Produkts des erfindungsgemässen Verfahrens und 1 Äquivalent einer anderen Säure kombiniert.

Salze können auch hergestellt werden, indem man 1 Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydro-xid, mit 1 Äquivalent des Produkts des erfindungsgemässen Verfahrens umsetzt. Die Salze sind pharmakologisch unbedenkliche, nicht-toxische Derivate, die als Wirkstoffe in pharmazeutischen Einheitsdosisformen verwendet werden können. Sie können auch mit anderen Arzneimitteln kombiniert werden, um Mittel mit einem weiten Aktivitätsspektrum zu erhalten.

Die nach den erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Fermentationsflüssigkeiten, die die Verbindungen 890Ai und/ oder 890A3 enthalten, haben Aktivitäten im Bereich von 2 bis 170 Einheiten/ml, wenn sie nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Vibrio percoians (ATCC 8461)

analysiert werden. Antibiotische Präparate von 890Ai und 890A3 mit einer Aktivität von mindestens 5 Einheiten/mg können gereinigt und die Antibiotica nach verschiedenen Verfahren gewonnen werden. Ein derartiges Verfahren besteht z. B. darin, dass man die Verbindungen 890Ai und 890A3 an stark basischen Anionenaustauschharzen adsorbiert. Beispiele für solche stark basischen Anionenaustauschharze sind diejenigen mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst, z. B. das im Polystyrolkern quaternisierte Ammoniumharz «Dowex»-l x 2 (hergestellt von der Dow Chemical Co., Midland, Michigan) in der Chloridform. Andere repräsentative Glieder dieser Klasse von stark basischen Ionenaustauschharzen sind: «Duolite» A-40, A42, A-101, A-102 und A-l 14 (hergestellt von der Chemical Process Co., Redwood City, California); «Amberlite» IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Man kann auch schwach basische Anionenaustauschharze, wie «Amberlite» IRA-68, verwenden. (Die «Amberlite»-Harze werden von der Firma Rohm und Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt.)

Das adsorbierte Antibioticum lässt sich leicht aus dem ■ Anionenaustauschharz mit wässrigen Salzlösungen eluieren. Das so erhaltene Eluat kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsverfahren weiter gereinigt werden. So kann das Eluat gereinigt werden, indem man es durch eine Kolonne leitet, die mit einem Acrylsäureesterpolymerisat von mittlerer Polarität beschickt ist, wie XAD-7 oder 8, oder durch eine Kolonne, die mit einem unpolaren, hydrophoben, vernetzten Polystyrol-Divi-nylbenzolpolymerisat beschickt ist, wie XAD-1,2 und 4, vorzugsweise XAD-2. (XAD-1,2,4,7 und 8 werden von der Firma Rohm und Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania, hergestellt.) Durch dieses Verfahren werden die Verbindungen 890Ai und 890A3 teilweise getrennt. Die an 890Ai reichen Fraktionen und die an 890A3 reichen Fraktionen können miteinander vereinigt und die vereinigten Fraktionen weiter gereinigt werden.

Weiter gereinigte Verbindungen 890Ai und 890A3 erhält man z. B. durch Gelfiltration durch Polyacrylsäureamidgel mit einer Porengrösse, die Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als 1800 ausschliesst, wie «Bio-Gel» P-2 (hergestellt von Bio - Rad, Richmond, California). Zum Entsalzen können auch andere Gele, wie «Sephadex» G-l 0, verwendet werden.

Das bevorzugte Verfahren, nach dem die Verbindungen 890Ai und 890A3 in hochgradiger Reinheit aus einer Fermentationsflüssigkeit gewonnen werden können, besteht im Abzen-trifugieren oder Abfiltrieren der Feststoffe, der Adsorption und dem Eluieren an bzw. von einem Anionenaustauschharz, wie «Dowex»-l x 2 in der Chloridform, mit 3- bis 5-prozentiger Kochsalzlösung, wodurch das Antibioticum sowohl konzentriert als auch teilweise gereinigt wird, dem Hindurchleiten durch eine Kolonne von in geeigneter Weise vorbereitetem XAD-2, wodurch die Antibiotica verzögert und dadurch gereinigt werden und das Eluat von dem «Dowex»-l x 2 entsalzt wird. Ferner wird die Verbindung 890A3 stärker als die Verbindung 890Ai verzögert, so dass die beiden Verbindungen teilweise voneinander getrennt werden. Die 890Ai und 890A3 enthaltenden Fraktionen können vereinigt und weiter gereinigt werden. Durch Chromatographie an «Dowex»-l x2 (Teilchen-grösse unter 37 p.) und Eluieren mit NaCl und/oder NH4CI erhält man ein Produkt, das von den meisten UV-absorbieren-den Verunreinigungen frei ist (das NH4CI wird verwendet, um dem Eluierungsmittel ein gewisses Pufferungsvermögen zu verleihen); und durch Entsalzung an «Bio-Gel» P-2 oder «Sephadex» G-l 0 wird das Salz entfernt, das bei der Chromatographie an «Dowex»-l x2 eingeführt worden ist, und die Menge der übrigen Verunreinigungen in den antibiotischen Präparaten wird weiter vermindert.

Wenn Fermentationsflüssigkeiten von geringer Stärke nach dem beschriebenen Verfahren behandelt werden, können bedeutende Mengen (mehr als 50%) an äusseren Verunreini5

10

15

20'

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

gungen in dem Endprodukt verbleiben. Diese Verunreinigungen können durch einen zusätzlichen Verfahrensgang der Chromatographie an «Dowex»-l x2 (Teilchengrössen unter 37 ja.) und des Eluierens mit einer Lösung vermindert werden, die Natriumchlorid und 50% Methanol enthält. Wenn das Anti- 5 bioticum aus Fermentationsflüssigkeiten von geringer Stärke isoliert wird, ist es ferner ratsam, eine zweite Stufe der Chromatographie an XAD-2 nachzuschalten. Hierdurch erzielt man eine zusätzliche Reinigung, Rückstandssalze werden entfernt, und die Verbindungen 890Ai und 890A3 werden teilweise von- 10 einander getrennt. Insbesondere wird 890A3 später eluiert als 890Ai, und die beiden Substanzen können durch ihre unterschiedlichen Verhältnisse von Bioaktivität zu HAEA300 voneinander unterschieden werden. Diejenien Fraktionen, die ein Verhältnis von Bioaktivität gegen Vibrio percoians ATCC 8461,5 zu HAEA300 von 250 aufweisen, enthalten die Verbindung 890Ai, und diejenigen Fraktionen, die ein Verhältnis der Bioaktivität gegen Vibrio percoians ATCC 8461 zu HAEA300 von 31 aufweisen, enthalten die Verbindung 890A3.

625553

An der Verbindung 890A3 reiche Fraktionen können mit Penicillinase behandelt werden, um restliche Spuren der Verbindung 890Ai zu entfernen, und durch Chromatographie an «Dowex»-l x 2 und «Sephadex» G-l 0 weiter gereinigt werden.

Beim Arbeiten im Laboratoriumsmassstab (weniger als 201 Probenvolumen) werden alle chromatographischen Verfahrensstufen mit Ausnahme der Chromatographie an XAD-2 zweckmässig in einem Kühlraum bei 2 bis 5 °C durchgeführt. Die Chromatographie an XAD-2 wird, falls nichts anderes angegeben ist, bei Zimmertemperatur durchgeführt. Der pH-Wert der antibiotischen Lösungen wird vor deren Lagerung durch sorgfältigen Zusatz von verdünnter Natronlauge oder Salzsäure auf 7 bis 8 eingestellt. Wässrige Lösungen werden im Kühlschrank oder vorzugsweise in Eiswasser und 50prozentiger methanolische Lösungen bei -20 °C gelagert.

Das Reinigungsverfahren für die Verbindungen 890Ai und 89OA3 wird durch die nachstehenden Fliessdiagramme 1 bzw. 2 erläutert.

Fliessdiagramm 1

Reinigung der Verbindung 890Ai

Fliessdiagramm 1 (Fortsetzung)

\K

"Dowex-1 x k-Eluat

(1) Konzentrieren

(2) Adsorbieren an Bio-Gel P-2

(3) Eluieren mit Wasser

'Bio-Gel" P-2-Eluat

(1) Konzentrieren

(2) Adsorbieren an ^ "Sephadex" G-10

50 % CH30H-

Eluat von *Dowex-1 x 2

Sephadex"G-10-Eluat

(3) Eluieren mit Wasser

(1) Konzentrieren

(2) Gefriertrocknen

(1) Konzentrieren

(2) Zusatz von

1 Raumteil CTUOH

JL

(3) Adsorbieren an "Dowex-1 x 2 (<37 p)

(4) Eluieren mit 0,05-molar NaCl

+ 0,005-molar NH^Cl + 0,001-molar NH^

in 50 % CH^OH

(1) Konzentrieren

(2) Gefriertrocknen

Anderes Verfahren

K) Ul Ui Ui

CO

&>

M

UI

Fliessdiagramm 2

Reinigung der Verbindung 890Ä3

13

625 553

Die nachstehenden prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig, wenn nichts anderes angegeben ist.

Analysenmethoden für die Verbindungen 890Ai und 890A3

I. Mikrobiologische Analyse

Eine Agarplatten-Scheibendiffusionsmethode wird angewandt, wobei entweder Vibrio percoians ATCC 8461 oder Salmonella gallinarum MB 1287 als Prüforganismus verwendet wird. Eine gereinigte Probe der Verbindung 890Ai wird als Standard verwendet.

Platten, die Vibrio percoians ATCC 8461 enthalten, werden folgendermassen hergestellt:

Eine gefriergetrocknete Kultur von Vibrio percoians ATCC 8461 wird in 15 ml eines sterilen Mediums suspendiert, welches 8 g/1 Difco-Nährbrühe und 2 g/1 Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält und als «Nährbrühe-Hefeextrakt» (nachstehend als NBYE abgekürzt) bezeichnet wird. Die Kultur wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 °C inkubiert. Diese Kultur wird verwendet, um die Oberfläche von Schrägröhrchen zu beimpfen, die 1,5% Agar in NBYE enthalten, und die beimpften Schrägröhrchen werden übernacht bei 28 °C inkubiert und dann im Kühlschrank aufbewahrt.

Die aus einer einzigen gefriergetrockneten Kultur hergestellten gekühlten Schrägröhrchen werden für einen Zeitraum bis zu 4 Wochen nach ihrer Herstellung folgendermassen verwendet: Eine Öse mit Impfgut aus dem Schrägröhrchen wird in einem 250-mI-Erlenmeyerkolben in 50 ml NBYE dispergiert. Die Kultur wird übernacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28 °C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50prozentige Lichtdurchlässigkeit bei 660 nm ergibt. 33,2 ml dieser verdünnten Kultur werden zu einem Volumen von 11 NBYE zugesetzt, das 15 g Agar enthält und auf 46 °C gehalten wird.

Das beimpfte, agarhaltige Medium wird in Petrischalen aus Kunststoff von lOOx 15 mm in Mengen von 5 ml je Schale gegossen, gekühlt und bis zu einem Zeitpunkt von 5 Tagen vor der Verwendung auf 2 bis 4 °C gehalten.

Die Salmonella gallinarum MB 1287 enthaltenden Platten werden folgendermassen hergestellt:

Ein verschlossenes Rohr, das gefrorene und gefriergetrocknete Zellen von Salmonella gallinarum MB-1287 in Magermilch enthält und unter Vakuum verschlossen worden ist, wird geöffnet und auf 15 ml Hirn-Herz-Aufgussbrühe aufgeimpft. Man lässt die Zellen ohne Schütteln bei 37 °C übernacht wachsen, und die Kultur wird auf Schrägröhrchen aufgeimpft, die 0,8% BBL-Nährbrühe und 0,2% «Difco»-Hefeextrakt und 1,5% Agar enthalten. Nach dem Wachstum übernacht bei 37 °C wird eine Öse der Kultur aus dem Schrägröhrchen in einen Kolben übertragen, der 50 ml 0,8%ige Nährbrühe und 0,2%igen Hefeextrakt enthält. Der Kolben wird übernacht geschüttelt, und 11 von 0,8% Nährbrühe und 0,2% Hefeextrakt und 1,5% Agar, der zuvor sterilisiert und auf 48 °C gekühlt worden ist, wird mit 20 ml dieser Kultur beimpft. Das beimpfte NBYE-Agar wird sofort in Petrischalen aus Kunststoff von lOOx 15 mm (5 ml je Schale) gegossen, und die Platten werden bis zur Verwendung auf 0 bis 3 °C gehalten.

Filterpapierscheiben von 12,7 mm Durchmesser werden in die zu analysierende Lösung getaucht und auf das Agar aufgelegt. Nach einer anderen Methode können die Scheiben beladen werden, indem man 0,1 ml der Lösung auf eine trockene Scheibe aufpipettiert und die Scheibe dann auf das Agar auflegt. Nach Inkubation (für Salmonella gallinarum MB-1287 9 bis 18 Stunden bei 37 °C, für Vibrio percoians ATCC 8461 12 bis 24 Stunden bei 25 °C) wird der Durchmesser der Hemmzone gemessen. Falls erforderlich, werden Verdünnungen der zu analysierenden Lösungen in 0,05-molarem Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4; nachstehend als KPB abgekürzt) oder in ent-mineralisiertem Wasser hergestellt.

Die Stärke wird folgendermassen berechnet: Ein Gefälle wird bestimmt, indem man die Zonendurchmesser einer Lösung der Verbindung 890Ai oder 890A3 und einer vierfachen Verdünnung dieser Lösung (in KPB) misst. Zwei Scheiben einer jeden Konzentration werden auf einer einzigen Platte analysiert, und die mittlere Zonengrösse wird bei einer jeden Konzentration bestimmt. Das Gefälle ist gleich der Hälfte der Differenz der Mittelwert der Zonengrössen. Die Stärke wird dann nach der folgenden Gleichung berechnet:

Stärke (Einheiten/ml) =

(Stärke des Standards) x Verdünnung x 10

[D-Ds] log 2

Gefälle

In der obigen Gleichung bedeuten D den mittleren Durchmesser der von der unbekannten Probe gebildeten Zonen, Ds den mittleren Durchmesser der Standardzonen und «Verdünnung» den Grad, zu dem die unbekannte Probe vor der Analyse verdünnt worden ist. Wenn kein Standard verwendet wird, nimmt man Ds als 25 mm und die Grösse (Stärke des Standards) als 1 Einheit/ml an, wenn als Prüforganismus Vibrio percoians ATCC 8461 verwendet wird. Es wird bestimmt, dass reines 890Ai eine Stärke von 250 Einheiten je Einheit der durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion bei 300 nm hat, wenn es als Standard verwendet wird. Dementsprechend beträgt die Stärke der Verbindung 890A3 31 Einheiten je Einheit der durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion bei 300 nm.

Für Analysen auf Platten mit Salmonella gallinarum MB-1287 wird das Gefälle in der gleichen Weise wie mit Vibrio percoians ATCC 8461 bestimmt. Wenn kein Standard verwendet wird, werden nur relative Stärken berechnet. Wenn kein Gefälle gemessen wird, wird ein Wert von 2,3 mm angenommen. Die Stärkeberechnungen werden, wie bei der Analyse mit Vibrio percoians ATCC 8461, durchgeführt. Wenn kein 890Ai-Standard verwendet wird, kann man mit einer Kontrolle von Penicillin G bei 250 y/ml arbeiten, um nachzuweisen, dass die Empfindlichkeit der Organismen im normalen Bereich liegt.

II. Analysenmethode zur Bestimmung von «890-Analysenein-heiten»

Man arbeitet nach der herkömmlichen Scheiben-Platten-analysenmethode mit Scheiben von 12,7 mm Durchmesser. Man arbeitet mit routinemässig vergossenen 10 ml pro Platte, beimpft mit Vibrio percoians (ATCC 8461) und verwendet als Standard Cephaloridin. Vier Konzentrationen von Cephalori-din, nämlich 3,12,6,25,12,5 und 25 y/ml, bilden den Standard, wobei die Konzentration von 12,5 y/ml als Bezugslösung verwendet wird. Die Zonendurchmesser auf einer 5-ml-Platte für den Standard sind die folgenden:

Konzentration, y/ml

Zonendurchmesser, mm

3,12

16,8

6,25

22,3

12,5

25,0

25

29,6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625 553

14

Eine Einheit ist als diejenige Menge des Antibioticums definiert, die auf einer 5-ml-Platte eine Hemmzone von 25 mm erzeugt. Daher wird bei dieser Analyse eine Konzentration an Cephaloridin von 12,5 y/ml als einer Einheit von 890A äquivalent angesehen. Da das Gefälle der Linie für Cephaloridin 4,0 beträgt, werden die Berechnungen der Stärke einer Probe unter Verwendung eines Gefälles von 4,0 vorgenommen.

III. Hydroxylaminreaktion

Die beiden Verbindungen 890Ai und 890A3 reagieren mit Hydroxylamin unter Bildung eines Stoffes, der die Extinktion bei 300 nm stark vermindert. Dies liefert eine Grundlage für die quantitative Analyse auf die Verbindungen 890Ai und 890A3.

Die zu analysierende Lösung wird in einer Kaliumphosphatlösung (pH-Wert 7,4) auf 0,05-molar eingestellt, indem man V20 Raumteil einer Lösung von 0,8-molar K2HPO4 und 0,2-molar KH2PO4 zusetzt. Dann setzt man Vm Raumteil 1-molar Hydro-xylaminhydrochlorid zu und bestimmt in Zeitabständen von Vi bis 2 Minuten die Extinktion bei 300 nm. Die Umsetzung wird bei 22 bis 28 °C durchgeführt. Man nimmt eine kinetische Reaktion erster Ordnung an und bestimmt die Halbwertszeit aus der Abnahme der Extinktion während der ersten 10 Minuten. Aus dieser Halbwertszeit wird der Zeitpunkt geschätzt, über den hinaus keine weitere Abnahme der Extinktion beobachtet werden sollte, und die Beobachtungen werden über diesen Zeitpunkt hinaus fortgeführt. Wenn keine weitere Abnahme über diesen Zeitpunkt hinaus beobachtet wird, wird die gesamte Abnahme der Extinktion (korrigiert für den Verdünnungseffekt und die Extinktion des Hydroxylamins) als «durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion bei 300 nm» festgesetzt (nachstehend abgekürzt als HAEA300). Wenn über diesen Zeitpunkt hinaus eine Abnahme der Extinktion stattfindet, wird die Geschwindigkeit der Abnahme der Hintergrundextinktion berechnet und die beobachtete Abnahme zu diesem Zeitpunkt für die Abnahme der Hintergrundextinktion korrigiert, wobei angenommen wird, dass die Abnahme der Hintergrundextinktion linear mit der Zeit verläuft. Der korrigierte Wert wird dann als HAEA300 verzeichnet.

Die Anzahl der H AEA3oo-Einheiten ist gleich dem Wert von HAEA300, multipliziert mit dem Volumen in ml.

In den nachstehenden Beispielen werden Verfahren erläutert, nach denen die Produkte nach dem Verfahren gemäss der Erfindung erhalten werden können. Die Beispiele dienen jedoch nur zur Erläuterung; die Erfindung umfasst auch funktionell äquivalente Produkte und Verfahren zu deren Herstellung. Daher ist jede Abänderung der hier beschriebenen Verfahren, die zur Bildung eines identischen Produkts führt, als eine analoge Methode anzusehen. Die hier beschriebenen Verfahren können erheblich abgeändert werden, und geringe Abweichungen fallen in den Rahmen der Erfindung.

Beispiel 1

Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Verbindungen 890Ai und 890A3 enthält

Ein Teil einer Schrägröhrenkultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird verwendet, um einen mit einem Umlenkorgan versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen, der 50 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält;

Medium A

Dextrose 10,0g

Hefeautolysat («Ardamine»*, Type pH) 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert 6,5

*«Ardamine»; Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Dieser Impfkolben wird 2 Tage lang bei 28 °C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf die Kultur zufriedenstellend ist.

Drei Erlenmeyerkolben zu 250 ml, die je 40 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium B

Tomatenbrei 20,0 g

Vollkornhafer (gemahlen) 20,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt, werden je Kolben mit 2 ml (5%) des Kulturmediums aus dem Impfkolben beimpft. Diese drei Produktionskolben werden bis zu 4 Tage lang bei 28 °C in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Nach 3 Tagen ergibt die von der Fermentationsflüssigkeit abzentrifugierte überstehende Flüssigkeit eine Hemmzone von 22 mm gegen Proteus vulgaris MB 838 und eine Hemmzone von 15 mm gegen Salmonella gallinarum MB 1287 bei Verwendung von 6,35-mm-Analysenscheiben auf Standardanalysenplatten.

Beispiel 2

Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Verbindungen 890Ai und 890A3 enthält

Ein Teil einer Schrägröhrchenkultur von Streptomyces flavogriseus MA 4434a wird verwendet, um einen mit einem Umlenkorgan versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen, der 50 ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium A

Dextrose 10,0g

Hefeautolysat («Ardamine»*, Type pH) 10,0 g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2,0 ml destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert 6,5

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation * * Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

NazHP04 9,50 g destilliertes Wasser 1000 ml

Dieser Impfkolben wird einen Tag lang bei 28 °C in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf die Kultur zufriedenstellend ist. Die Kultur wird dann bis zur Verwendung 2 Tage lang auf 4 °C gehalten.

Drei 2000 ml fassende Erlenmeyerkolben, die je 200 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium B

Tomatenbrei 20,0 g

Vollkornhafer (gemahlen) 20,0 g destilliertes W asser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt, werden je Kolben mit 7 ml (3,5%) der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Diese drei Produktionskolben werden 4 Tage lang bei 28 °C in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt.

Die Analyse von zentrifugierten Anteilen unter Verwendung von 12,7-mm-Scheiben auf Standardanalysenplatten und die Messung der pH-Werte liefert die folgenden Ergebnisse:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15

625 553

Alter

V. percoians ATCC 8461

S. gallinarum MB 1287

pH-Wert

3 Tage

4 Tage

22 mm 26 mm

16 mm 18 mm

6,1 7,5

Nach 4 Tagen werden die Kolben abgeerntet.

Beispiel 3

Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Verbindun-|0 gen 890Ai und 890A3 enthält

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA 4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält: )5

Davis-Salze

Natriumeitrat

K2HPO4

KH2PO4

(NH4)2SC>4

MgS04-7H20

destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1 g 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um Schrägröhrchen und 25 Platten verschiedener Medien zu beimpfen. Von einer dieser Platten wird ein natürliches Isolât ausgewählt und auf ein Schrägröhrchen mit Medium A der folgenden Zusammensetzung auf gestrichen:

Medium A

Dextrose

Pepton

Hefeextrakt

NaCl

KCl

FeS04.(NH4)2S04-6Hz0

MgCl2-6H2

CaCl2-2H20

destilliertes Wasser pH-Wert 7,4 (vor dem Sterilisieren)

Agar

10,0 g 5,0 g 3,0 g 12,705 g 0,72 g 0,0351 g 5,32 g 0,728 g 1000 ml

25,0 g

40

Dieses beimpfte Schrägröhrchen wird 7 Tage lang inkubiert, und nach der Sporenbildung wird eine Sporensuspension 45 mit 0,8 ml sterilen Davis-Salzen hergestellt. Mit dieser Suspension werden vier Medium-A-Schrägröhrchen der zweiten Generation beimpft. Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 28 °C inkubiert und dann bei 4 bis 6 °C aufbewahrt, bis sie 14 Tage später verwendet werden. Die Hälfte der Oberflächenkultur eines dieser Schrägröhrchen der zweiten Generation wird verwendet, um mit Umlenkorgan versehene 250-mI-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:

50

Medium B

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0g

Phosphatpuffer** 2,0 g

MgS04-7H20 50 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt *«Ardamine»: Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

65

Drei Impfkolben werden so beimpft, dass man genügend Impfgut für 12 Produktionskolben zu je 21 erhält, die in diesem Ansatz fermentiert werden. Die Impfkolben werden einen Tag lang bei 28 °C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Die Kolben werden aus der Schüttelmaschine entfernt und einen Tag lang bei 4 °C gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird verwendet, um 12 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Umlenkorgane zu je 21 (8 ml Impfgut je Kolben) zu beimpfen, die"250 ml Produktionsmedium C der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium C

Tomatenbrei

Vollkornhafer destilliertes Wasser pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt.

20,0 g 20,0 g 1000 ml

Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage lang bei 28 °C unter Schütteln in einer mit 220 U/min arbeitenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Sodann werden die Kolben abgeerntet, und die Aktivität wird auf Analysenplatten gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percoians ATCC 8461 unter Verwendung von 12,7-mm-Analysen-■ Scheiben bestimmt, die in zentrifugierte Fermentationsflüssig-keitsproben getaucht werden.

30

Analyse beim Abernten Kulturalter, h pH-Wert

Salmonella gallinarum Hemmzone, mm

Vibrio percoians ATCC 8461 Hemmzone, mm

96 7,4

23

29

55

Die Fermentationsflüssigkeit wird filtriert und der pH-Wert des Filtrats mit verdünnter Salzsäure von 7,7 auf 7,0 gebracht. 2,651 des so eingestellten Filtrats werden mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min an 135 ml IRA68-Harz in der Chloridform (schwach basisches, vernetztes Acrylsäurepolymerisat-Anionenaustauschharz, hergestellt von der Firma Rohm und Haas Co., Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania) adsorbiert, wobei der Ablauf als eine Fraktion aufgefangen wird. Das Adsorbat wird mit 250 ml Wasser gewaschen und in sechs Fraktionen zu 100 ml mit 5% NaCl eluiert. Alle Fraktionen werden nach der Scheiben-Plattenmethode mit Hilfe von Vibrio percoians ATCC 8461 und Salmonella gallinarum MB 1287 analysiert. Diese Analysen zeigen, dass.die Eluatfraktio-nen Nr. 1 bis 3 45% der auf das Harz aufgegebenen Bioaktivität enthalten.

Die Eluatfraktionen Nr. 1 bis 3 werden zu 310 ml Lösung vereinigt. Diese Lösung wird mit 15 g Kochsalz versetzt und auf 2 °C gekühlt. Die kalte Lösung wird mit HCl auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und sofort mit 150 ml n-Butylalko-hol extrahiert. Die Extraktion wird noch zweimal mit weiteren 150 ml n-Butylalkohol wiederholt. Die n-Butylalkoholphasen werden nacheinander dreimal mit je 75 ml Wasser rückextrahiert. Bei der Extraktion werden die wässrigen Phasen durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf einem pH-Wert von 7 gehalten. Alle Fraktionen werden gegen Vibrio percoians ATCC 8461 und Salmonella gallinarum MB 1287 analysiert; die Ergebnisse sind nachstehend als Prozent der Ausgangsbioaktivität angegeben:

625553

16

Fraktion

Gewinnung

Ausgangsgut

100%

wässriger Ablauf

12%

n-ButylalkohoI-Ablauf

Nr. 1

0

Nr. 2

0

Nr. 3

0

wässriger Rückextrakt

Nr. 1

25%

Nr. 2

37%

Nr. 3

5%

Der erste und der zweite Rückextrakt werden einzeln gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten Feststoffe werden miteinander vereinigt und ergeben 984 mg Produkt.

Beispiel 4

Herstellung eines Gemisches, das die Verbindungen 890Ai und 890A3 enthält

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA 4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

K2HPO4 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

(NH4)2S04 1,0 g

MgSCWHzO 0,1g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen zu beimpfen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium A

Dextrose 10,0g

Pepton 5,0 g

Hefeextrakt 3,0 g

NaCl 12,705 g

KCl 0,72 g

FeSC>4 • (N H4>2SC>4 • 6H2O 0,0351 g

MgCl2-6H20 5,32 g

CaCl2-2H20 0,728 g destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert 7,4 (vor dem Sterilisieren)

Agar 25,0 g

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bei 4 bis 6 °C gelagert, bis sie 10 Tage später verwendet werden. Die Hälfte der Oberflächenkultur eines dieser Schrägröhrchen wird verwendet, um mit Umlenkorgan ausgestattete Erlenmeyerkolben von 250 ml Fassungsvermögen zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium B

Hefeautolysat («Ardamine»)* 10,0 g

Glucose 10,0g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04-7H20 50 mg destilliertes Wasser ,1000 ml pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt. *«Ardamine»: Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Drei Impfkolben werden so beimpft, dass man genügend Impfgut für 12 Produktionskolben zu je 21 erhält, die in diesem Ansatz fermentiert werden. Die Impfkolben werden einen Tag lang bei 28 °C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Die Kolben werden aus der Schüttelmaschine entfernt und einen Tag lang bei 4 °C gelagert. Der Inhalt dieser Impfkolben wird verwendet, um 12 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Umlenkorgane zu je 21 (7 ml Impfgut je Kolben) zu beimpfen, die 250 ml Produktionsmedium C der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium C

Tomatenbrei 20,0 g .

Primärhefe 10,0g

Dextrin («Amidex») 20,0 g entmineralisiertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage und 5 Stunden lang bei 24 °C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Nach diesem Zeitraum werden die Kolben abgeerntet, und die Aktivität gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percoians ATCC 8461 wird unter Verwendung von Analysenplatten und 12,7-mm-Analysenscheiben bestimmt, die inzentrifugierte Fermen-tationsflüssigkeitsproben getaucht werden. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Analyse beim Abernten

Kulturalter, h 101

pH-Wert 7,1

Salmonella gallinarum

Hemmzone, mm 31 Vibrio percoians

Hemmzone, mm 43

Die Fermentationsflüssigkeit wird zentrifugiert. Zu den 2,21 des klaren Zentrifugats (pH-Wert 6,8) setzt man 22 mg (Äthy-lendinitrilo>tetraessigsäure zu und stellt den pH-Wert auf 7,2 ein. Das auf den genannten pH-Wert eingestellte Zentrifugat wird mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min an 150 ml «Dowex» 1 x2-Harz in der Chloridform adsorbiert, wobei man den Ablauf als eine Fraktion auffängt. Das Adsorbat wird mit 150 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, die 10 y/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthalten, und mit 5%iger NaCl-Lösung eluiert, die 10 y/ml (ÄthylendinitriloMetraessig-säure enthalten, wobei fünf Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen werden. Alle Fraktionen werden gegen Vibrio percoians ATCC 8461 analysiert. Die Ergebnisse in Prozent der Anfangsbioaktivität sind die folgenden:

Fraktion

Gewinnung

Ausgangsgut

100%

Ablauf

0

5%-NaCI-EIuatfraktionen Nr. 2 bis 4

75%

Wasserverdrängungs-Waschflüssigkeit

1%

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

17

625553

50 ml der Fraktion Nr. 3 des 5%-NaCl-Eluats werden mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt und durch eine 100-ml-Kolonne von XAD-2 geleitet, die zuvor mit dem Fünffachen ihres Volumens an 60-vol.%iger wässriger Ace-tonlösung, dem Fünffachen ihres Volumens an entmineralisier-tem Wasser und dem Fünffachen ihres Volumens an einer Lösung von 5 Gewichtsteilen NaCl in 100 Raumteilen entmine-ralisiertem Wasser, die 25|imolar an neutralem EDTA sind, und sodann mit dem Fünffachen ihres Volumens an entminerlisier-tem Wasser gewaschen worden ist. Das Harz wird mit entmine-ralisiertem Wasser, welches 10 y/ml (Äthylendinitrilo)-tetraes-sigsäure enthält, entwickelt, wobei man zwei Fraktionen zu je 25 ml und fünf Fraktionen zu je 10 ml auffängt und den Ablauf überwacht, bis er gegen saures Silbernitrat negativ reagiert. Am Ende der fünften 10-ml-Fraktion wird eine negative Silbernitratreaktion erhalten. Die Entwicklung mit entmineralisier-tem Wasser wird fortgesetzt, bis vier Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen worden sind. Das Harz wird mit 60%iger wässriger Acetonlösung, die 4 y/ml (Äthylendinitrilo)-tetraessigsäure enthält, entwickelt, bis zwei Fraktionen zu je 50 ml aufgefangen worden sind. Alle Fraktionen werden gegen Vibrio percoians ATCC 8461 analysiert; die Ergebnisse sind die folgenden:

Ausgangsprobe Volumen 50 ml Gewinnung 100%

Fraktion

1

25

0

2

25

0

3

10

0

4

10

0

5

10

1

6

10

4,5

7

10

7

8

100

60

9

100

6

10

100

1

11

100

0

12

50

1

13

50

0

Die Fraktion Nr. 8 wird zu 10 ml eingeengt und zu 34,2 mg Feststoffen gefriergetrocknet.

33,2 mg der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 1,5 ml l%iger wässriger n-Butylalkohollösung aufgenommen, und die Lösung wird in eine 1,4x81,5 cm messende Kolonne von «Bio-Gel» P-2 (37-74 (J.) eingegeben, die zuvor mit l%iger wässriger n-Butylalkohollösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Gel wird mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Geschwindigkeit von 1 ml/min entwickelt, wobei man Fraktionen zu 2 ml auffängt. Jede der Fraktionen Nr. 29 bis 46 wird gegen Vibrio percoians ATCC 8461 analysiert. Die höchste Bioaktivität wird in den Fraktionen Nr. 36 bis 44 bei einem Maximum in der Fraktion Nr. 39 beobachtet. Die Fraktionen Nr. 38 bis 41 werden vereinigt und zu 4,0 mg Antibioticum gefriergetrocknet.

Beispiel 5

Schüttelkolbenproduktion eines Gemisches, das die Verbindungen 890Ai und 890A3 enthält

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

K2HPO4 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

(NH4)2SÜ4 1,0 g

MgS04-7H20 0,1g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung hat:

Medium A

Glycerin 20,0 g

Primärhefe 5,0 g

Fischmehl 15,0g destilliertes Wasser 1000 ml

Agar 20,0 g pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6 °C aufgehoben.

Ein Drittel der Oberflächenkultur von zwei Schrägröhrchen wird verwendet, um sechs mit Umlenkorgan versehene 250-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammenetzung enthalten:

Medium B

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04-7Hz0 50 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt. *«Ardamine»: Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml.

Der Impfkolben wird einen Tag lang bei 27 bis 28 °C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Der Kolben mit Inhalt wird einen Tag lang in Ruhe bei 4 °C aufbewahrt.

22 Erlenmeyer-Produktionskolben zu je 21| die je 300 ml Medium C enthalten, werden je Kolben mit 8 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Tomatenbrei 20,0 g

Primärhefe 10,0g

Dextrin (« Amidex») 20,0 g

CoCb- 6H2O 5,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.

Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage und 5 Stunden lang bei 24 °C in einer mit 212 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden abgeerntet, und die Aktivität wird mit Standardanalysenplatten gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percoians ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27-mm-Analysenscheiben analysiert, die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitspro-ben getaucht werden. Falls erforderlich, werden die Proben mit 0,02-molarem Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) verdünnt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625553

18

Kulturalter, h 101 und die A22o-Werte werden an Verdünnungen bestimmt. Dieje-

pH-Wert 7,1 nigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis der Bioaktivität zu

A220 grösser als die Hälfte des Maximalwertes ist, werden verSalmonella gallinarum einigt. Auf diese Weise werden die Fraktionen Nr. 48 bis 95 ver-Hemmzone, mm 31 5 einigt, die 50% der aufgegebenen Aktivität, entsprechend 17%

der Aktivität der filtrierten Fermentationsflüssigkeit, enthalten. Vibrio percoians Die vereinigten XAD-2-Fraktionen werden auf 50 ml ein

Verdünnung '/10 geengt und in eine Kolonne von «Dowex»-l x4 (Cl~) mit Teil-

Hemmzone, mm 24,5 chengrössen unter 37 n aufgegeben, in der die Abmessungen

890-Analyseneinheiten 46 10 des Harzbettes 1,3x13 cm betragen. Die Kolonne wird mit 15

ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit 400 ml einer 41 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit, die 23 Ein- Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert, die 0,08-molar an heiten/ml enthalten, werden auf 3 °C gekühlt und in Anteilen NaCl, 0,005-molar an NH4 Cl und 0,0001-molar an NH3 ist. Bei von 200 ml je 15 Minuten lang mit 9000 U/min zentrifugiert. Die einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min werden Frak-vereinigten überstehenden Flüssigkeiten (3,61) werden mit 1 ml 15 tionen zu je 10 ml aufgefangen. Eine Aktivität, die 100% der auf-0,1-molarer EDTA-Lösung und 10 ml 1-molarer Tris-HCl-Puf- gegebenen Aktivität äquivalent ist, wird in den Fraktionen Nr. ferlösung (pH-Wert 7,5) versetzt. Die 0,10-molare neutrale 23 bis 30 eluiert; das Maximum der Aktivität tritt in der Frak-EDTA-Lösung wird durch Lösen von 0,1 Mol des Dinatriumsal- tion Nr. 26 auf. Die Fraktionen Nr. 26 und 27 haben das höchste zes von Äthylendiamintetraessigsäure in 11 entmineralisiertem Verhältnis von Extinktion bei 300 nm zu Extinktion bei 220 nm Wasser und Einstellen des pH-Wertes mit Natronlauge auf 7 20 (A300/A220), und diese beiden Fraktionen werden zwecks Entsal-hergestellt. zung vereinigt. Die Gesamtaktivität in den Fraktionen Nr. 26

Die zentrifugierte Fermentationsflüssigkeit wird in einer und 27 beträgt 7390 Einheiten oder 59% der aufgegebenen Kolonne an ein 5,1 x20 cm messendes Bett von «Dowex»-l x2 Aktivität. Die vereinigten Fraktionen Nr. 26 und 27 werden mit (C1-), Teilchengrösse 150-300 n, adsorbiert, das vor der Auf- 5 ^10,01-molarer neutraler EDTA-Lösung versetzt.

gäbe der zentrifugierten Flüssigkeit mit 11 entmineralisiertem 25 Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Wasser gewaschen worden war. Die Strömungsgeschwindig- Verdampfer unter vermindertem Druck auf 1,95 ml eingeengt, keit bei der Adsorption beträgt 50-80 ml/min. Nach beendeter und das Konzentrat wird in eine Kolonne von «Bio-Gel» P-2 Adsorption wird die Kolonne mit 500 ml entmineralisiertem (37-74 p.) aufgegeben, in der die Abmessungen des Adsorp-Wasser, die 25-(xmolar an neutraler EDTA sind, gewaschen und tionsmittelbettes 2,2x80 cm betragen. Die Probe wird mit dann mit 1300 ml 5% NaCI in entmineralisiertem Wasser, das 30 Anteilen zu 1 ml und 2 ml entmineralisiertem Wasser gewa-25-nmoiar an neutraler EDTA ist, eluiert. Von dem ersten Auf- sehen und dann mit einer Geschwindigkeit von 0,7 ml/min mit guss der Kochsalzlösung an gerechnet, werden neun Fraktio- entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen nen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 1 bis 4 enthalten 100 bis zu 2,1 bis 2,2 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum der UV-115 ml je Fraktion, die Fraktionen Nr. 5 bis 9 umfassen je 170 Extinktion findet sich in den Fraktionen Nr. 89 bis 100, die 74% bis 185 ml. Die Fraktionen werden auf ihre Bioaktivität gegen 35 der aufgegebenen Extinktionseinheiten bestimmt bei 300 nm Salmonella gallinarum MB 1287 analysiert. Die Bioaktivität (A3oo-Einheiten), enthalten. Die Fraktionen Nr. 92 bis 98 werden erscheint in den Fraktionen Nr. 2 bis 9 mit einem Maximum bei vereinigt, zu 2 ml eingeengt und gefriergetrocknet, den Fraktionen Nr. 4 und 5. Diese Produktprobe enthält 18,6 A3oo-Einheiten, was 5,8%

Die Ultraviolettabsorption geeigneter Verdünnungen einer der in der Ausgangsfermentationsflüssigkeit enthaltenen jeden Fraktion wird mit einem Spektrophotometer (Gilford 40 Bioaktivität entspricht. Die Fraktionen Nr. 89 bis 91 und Nr. 99 Modell 2000) gemessen und das Verhältnis von Bioaktivität zu bis 100 werden weiter gemäss Beispiel 6 gereinigt.

Extinktion bei 220 nm (A220) für jede Fraktion berechnet. Dieje-nien Fraktionen, bei denen das Verhältnis von Bioaktivität zu Beispiel 6

A220 grösser als die Hälfte des Maximalwertes ist, werden für Schüttelkolbenproduktion der Verbindung 890Ai die weitere Verarbeitung vereinigt. So werden die Fraktionen 45 Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Strepto-Nr. 4 bis 7 vereinigt, die 30% der aufgegebenen Bioaktivität ent- myces flavogriseus MA 4434a wird aseptisch geöffnet und der halten. Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salz-

Das vereinigte NaCl-Eluat wird unter vermindertem Druck lösung der folgenden Zusammensetzung enthält:

auf 100 ml eingeengt, wobei die Temperatur beim Eindampfen unter 35 °C gehalten wird. 50 Davis-Salze

Der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zusatz von 3 ml Natriumeitrat 0,5 g

1-molarer Salzsäure auf 5,2 eingestellt und das Konzentrat in K2HPO4 7,0 g eine 3,5 cm weite und 57 cm lange Kolonne mit XAD-2 aufge- KH2PO4 3,0 g geen, die zuvor mit 31 60-vol.%iger wässriger Acetonlösung, 31 (NH4)2SC>4 1,0 g entmineralisiertem Wasser, 31 einer Lösung von 5 Gewichtstei- 55 MgSC>4- 7H20 ' 0,1 g

Ien Kochsalz je 100 Raumteile entmineralisiertes Wasser, die destilliertes Wasser 1000 ml

25-n.molar an neutraler EDTA ist, und 11 gesättigter Kochsalzlösung gewaschen worden ist. Nach dem Waschen wird die Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen Kolonne in einen kalten Raum überführt, der auf 3 °C gehalten mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammenwird, bevor das Konzentrat aufgegeben wird. 60 Setzung hat:

Das aufgegebene Konzentrat wird bis zur Höhe des Bettes des Adsorptionsmittels ablaufen gelassen, und die aktiven Frak- Medium A

tionen werden mit 1,3125-p.molarer neutraler EDTA-Lösung in Glycerin 20,0 g entmineralisiertem Wasser eluiert. Von der ersten Aufgabe des Primärhefe 5,0 g

Konzentrats in die Kolonne an gerechnet, werden Fraktionen 65 Fischmehl 15,0 g zu je 10 ml aufgefangen. destilliertes Wasser 1000 ml

Jede fünfte Fraktion wird nach der Plattenmethode auf ihre Agar 20,0 g

Bioaktivität gegen Salmonella gallinarum MB 1287 analysiert, pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt.

19

625553

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6 °C aufgehoben.

Ein Drittel der Kultur dieser drei Schrägröhrchen wird verwendet, um neun mit Umlenkorgan versehene 250-ml-Erlen-meyerkolben zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium B

Hefeautolysat («Ardamine»*)

Glucose

Phosphatpuffer**

MgS04-7H20 destilliertes Wasser pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»; Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung

KH2PO4

Na2HP04

destilliertes Wasser

10,0g 10,0 g 2,0 ml 50 mg 1000 ml

91,0 g 95,0 g 1000 ml

20

Der Impfkolben wird einen Tag lang bei 27 bis 28 °C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Der Kolben mit Inhalt wird einen Tag lang in Ruhe bei 4 °C aufbewahrt. 25

33 Erlenmeyer-Produktionskolben zu je 21, die je 250 ml Medium C enthalten, werden je Kolben mit 8 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

30

Medium C

Tomatenbrei 20,0 g

Primärhefe 10,0g

Dextrin («Amidex») 20,0 g

CoCl2*6H20 5,0 mg 35

destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.

Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage bei 24 °C in einer mit 212 U/min laufenden Schüttelmaschine 40 (Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden abgeerntet, und die Aktivität wird mit Standardanalysenplatten gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percoians ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27-mm-Analysenscheiben analysiert, die inzentrifugierte Fermentationsflüssigkeitsproben getaucht 45 werden. Falls erforderlich, werden die Proben mit 0,02-mola-rem Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) verdünnt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Kulturalter, h pH-Wert

Salmonella gallinarum Hemmzone, mm

Vibrio percoians, Verdünnung '/io Hemmzone, mm 890-Analyseneinheiten

96 7,2

29,5

31 40

50

55

71 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit werden auf 3 °C gekühlt und in Anteilen zu 200 ml je 15 Minuten lang bei 9000 U/min zentrifugiert.

Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden mit 7 ml 0,1-molarer neutraler EDTA-Lösung versetzt, und die ganze Probe wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 ml/min an einer Kolonne mit «Dowex»-l x2 (Cl~), Teilchen-grössen 150-300 jx, Bettabmessungen 5,1 x 25 cm, adsorbiert.

60

Die Kolonne wird mit 500 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, die 5 ml 1-molaren Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,0) enthalten und 25-jj.molar an neutraler EDTA sind. Das Antibioticum wird mit 11 entmineralisiertem Wasser mit einem Kochsalzgehalt von 50 g eluiert und die Kolonne dann mit 300 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Von dem ersten Auftreten von Salz im Kolonnenablauf an gerechnet, werden Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen. Die Bioaktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 1 bis 10 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 2. Die Fraktionen mit den höchsten Verhältnissen von Bioaktivität zu A22o werden vereinigt. So werden die Fraktionen Nr. 2 bis 5 vereinigt, die 17% der aufgegebenen Aktivität enthalten.

Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 110 ml eingeengt, und der pH-Wert wird durch Zusatz von 4,2 ml 1-molarer Salzsäure auf 5,8 eingestellt. Das so eingestellte Konzentrat wird in eine XAD-2-Kolonne mit Bettabmessungen von 3,8x50 cm aufgegeben, die zuvor mit 3160-vol.prozentiger wässriger Aceton-lösung, dann mit 31 entmineralisiertem Wasser, mit 31 Kochsalzlösung (5 Gewichtsteile je 100 Raumteile) und 11 Kochsalzlösung (25 Gewichtsteile je 100 Raumteile) in entmineralisiertem Wasser gewaschen worden ist. Man lässt das Konzentrat bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes ablaufen. Das Antibioticum wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 15 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Von der ersten Aufgabe der Probe an gerechnet, werden 22 Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen. Die Bioaktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 6 bis 22 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 9 und 10. Die Fraktionen, deren Verhältnisse von Bioaktivität zu A220 grösser als das 0,3fache des Maximalwertes sind, werden miteinander vereinigt. Auf diese Weise werden die Fraktionen Nr. 9 bis 20 zur weiteren Verarbeitung vereinigt. Zu diesen Fraktionen werden die Fraktionen Nr. 89,90,91,99 und 100 aus der «Bio-Gel» P-2-Kolonne des Beispiels 5 zugesetzt. Dieses Gemisch wird im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 70 ml eingeengt.

Das Konzentrat wird an einer Kolonne mit «Dowex»-l x4 (Cl~),Teilchengrössen unter 37 jx, Bettabmessungen 2,2x27 cm, adsorbiert. Die Kolonne wird mit 50 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und das Antibioticum mit 21 einer an Kochsalz 0,070-molaren, an NH4CI 0,005-molaren und an NH3 0,0001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min eluiert. Dabei werden Fraktionen zu je 9,5 ml aufgefangen.

Das Hauptmaximum des Antibioticums wird in den Fraktionen Nr. 142 bis 163 eluiert. Die Fraktionen Nr. 146 bis 157 enthalten das Material mit den höchsten A3oo/A25o-Verhältnissen und werden zur weiteren Verarbeitung vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen Nr. 146 bis 157 werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 3 ml eingeengt, und das Konzentrat wird durch Zusatz von 5 jj.1 1-molarer NH3-Lösung auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne (2,2 x 70 cm) mit «Bio-Gel» P-2 (37-74 |i) aufgegeben, die zuvor mit 20 ml 5-molarer Kochsalzlösung und 500 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen worden ist. Sobald das Konzentrat bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes abgelaufen ist, wird die Kolonne zweimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser gespült, worauf man wieder bis zur Höhe des Bettes ablaufen lässt. Die Kolonne wird dann mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert, wobei Fraktionen zu je 2,9 ml aufgefangen werden.

Das Hauptmaximum der antibiotsichen Aktivität wird in den Fraktionen Nr. 63 bis 70 eluiert. Die Fraktionen Nr. 64 und 65 haben die höchsten A3oo/A2so-Verhältnisse und werden für die weitere Aufarbeitung vereinigt. Diese beiden Fraktionen enthalten 44% der UV-Absorption bei 300 nm, die in die «Bio-Gel» P-2-Kolonne aufgegeben worden war.

625 553

20

Die vereinigten Fraktionen Nr. 64 und 65 werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml eingeengt und dann 8 Stunden lang in einer 14-ml-Ampulle mit Schraubkapsel gefroren und zu 2,25 mg praktisch reiner Verbindung 890Ai gefriergetrocknet (45,5 A3oo-Einheiten).

Beispiel 7

Schüttelkolbenproduktion der Verbindung 890A3

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA 4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salz-iösung der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

KzHPO* 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

(NH4)2SC>4 1,0 g

MgSCWHiO 0,1g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung hat:

Medium A

Glycerin 20,0 g

Primärhefe 5,0 g

Fischmehl 15,0g destilliertes Wasser 1000 ml

Agar 20,0 g pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6 °C aufgehoben (nicht länger als 21 Tage).

Ein Drittel der Kultur aus vier Schrägröhrchen wird verwendet, um 12 mit Umlenkorgan versehene 250-mI-ErIenmey-erkolben zu beimpfen, die je 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium B

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04-7H20 50 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt. •«Ardamine»: Yeast Products Corporation

**PhosphatpufferIösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HPÛ4 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Der Impfkolben wird einen Tag lang bei 27 bis 28 °C in einer mit 220 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Der Kolben mit Inhalt wird einen Tag lang in Ruhe bei 4 °C aufbewahrt.

44 Erlenmeyer-Produktionskolben zu je 21, die je 200 ml Medium C enthalten, werden mit je 8 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Tomatenbrei 20,0 g

Primärhefe 10,0g

Dextrin («Amidex») 20,0 g

CoCb-6H20 5,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.

Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 4 Tage und 5 Stunden lang bei 24 °C in einer mit 212 U/min laufenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden abgeerntet, und die Aktivität wird mit Standardanalysenplatten gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percoians ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27-mm-Analysenscheiben analysiert, die in zentrifugierte Fermentationsflüssigkeitspro-ben getaucht werden. Falls erforderlich, werden die Proben mit 0,02-molarem Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) verdünnt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Kulturalter, h 101

pH-Wert 7,2

Salmonella gallinarum

Hemmzone, mm 35

Vibrio percoians,

Verdünnung V10

Hemmzone, mm 34

890-Analyseneinheiten 121

Die gesamten 7,01 der vollständigen Fermentationsflüssigkeit werden auf 3 °C gekühlt und in Anteilen zu 200 ml je 15 Minuten lang mit 9000 U/min zentrifugiert. Die vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden mit 1,7 ml 0,1-molarer neutraler EDTA-Lösung versetzt, und der Ansatz wird auf 3 °C gehalten.

Die oben beschriebene Fermentation wird unter den gleichen Bedingungen mit dem Unterschied wiederholt, dass die 44 2-Liter-Erlenmeyer-Produktionskolben mit je 7 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft werden. pH-Wert und Analysenergebnisse sind die folgenden:

Kulturalter, h 101

pH-Wert 7,3

Salmonella gallinarum

Hemmzone, mm 38

Vibrio percoians,

Verdünnung V10

Hemmzone, mm 39

890-Analyseneinheiten 92,8

Die gesamten 7,41 der bei dieser Fermentation erhaltenen Flüssigkeit werden auf 3 °C gekühlt und in Anteilen von 200 ml je 15 Minuten lang mit 9000 U/min zentrifugiert. Zu den vereinigten überstehenden Flüssigkeiten werden 1,8 ml einer 0,1-molaren EDTA-Lösung zugesetzt.

Die überstehenden Flüssigkeiten der Fermentationsflüssigkeiten, die bei den beiden Fermentationsversuchen dieses Beispiels erhalten worden sind, werden zu insgesamt 131 vereinigt, die eine Stärke von 80 Einheiten/ml, bestimmt durch Analyse gegen Vibrio Percoians ATCC 8461, aufweisen.

Die vereinigte überstehende Flüssigkeit wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/min durch eine Kolonne mit «Dowex»-l x 2 (Cl") (Teilchengrösse 150-300 p., Bettabmessungen 4,7x50 cm) geleitet. Die Kolonne wird mit 11 entmineralisiertem Wasser gewaschen und das Antibioticum mit 51 Kochsalzlösung (5 Gewichtsteile Kochsalz je 100 Raumteile), die 0,01-molar an Tris-HCI-Puffer (pH-Wert 7,0) und 25-|i.molar an neutraler EDTA sind, eluiert. Es werden Fraktionen von je 220 ml mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/min auf5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

21

625 553

gefangen und gegen Salmonella gallinarum MB 1287 nach der Plattenmethode analysiert.

Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 3 bis 26 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 5 und 6. Die Fraktionen Nr. 5 bis 9, die das höchste Verhältnis von Bioaktivität zu A220 aufweisen, werden für die weitere Verarbeitung miteinander vereinigt. Der pH-Wert der vereinigten Fraktionen beträgt 7,8, und die vereinigten Fraktionen enthalten 24% der anfänglichen Bioaktivität, bestimmt nach der Plattenmethode gegen Salmonella gallinarum MB 1287.

Die vereinigten Fraktionen Nr. 5 bis 9 werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 150 ml eingeengt und in eine Kolonne (Bettabmessungen 4,9x47 cm) von XAD-2 aufgegeben, die zuvor mit 5160-vol.prozentiger wässriger Acetonlösung, 51 entmineralisiertem Wasser und 51 einer Lösung von 50 g Kochsalz je Liter entmineralisiertes Wasser gewaschen worden ist. Die Probe wird in Anteilen von 20 ml in die Kolonne eingegeben, wobei die Kolonne jedesmal bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen. Nach beendeter Aufgabe der Proben werden drei Anteile zu je 20 ml entmineralisiertes Wasser aufgegeben und jedesmal bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen. Dann wird die Probe mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Alle Arbeitsvorgänge mit der XAD-Kolonne werden bei Zimmertemperatur (24 °C) durchgeführt, und die aufgefangenen Fraktionen werden jedesmal sofort schnell im Eisbad gekühlt. Fraktionen werden von 95 bis 230 ml aufgefangen.

Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 2 bis 21, bestimmt nach der Plattenmethode gegen Salmonella Gallinarum MB 1287, und das Maximum ist in den Fraktionen Nr. 5 bis 7 enthalten (die, gezählt von dem ersten Aufgeben von entmineralisiertem Wasser, von 510 bis 895 ml des eluierten Volumens reichen). Die Fraktionen Nr. 6 bis 21, bei denen die Verhältnisse der Bioaktivität zu A220 innerhalb 50% des beobachteten Maximalwertes liegen, werden vereinigt. Die gesamte gewonnene Bioaktivität beträgt 280 000 Einheiten oder 112% der scheinbaren aufgegebenen Aktivität.

Die vereinigten Fraktionen Nr. 6 bis 21 werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 68 ml eingeengt und dann mit entmineralisiertem Wasser auf 112 ml verdünnt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne (Bettabmessungen 2,2x21 cm) von «Dowex»-l x4 (Cl-) mit Teilchengrössen unter 37 |x eingegeben. Die Kolonne wird mit 20 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, und die Antibiotica werden mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,6 ml/min mit 21 einer an Kochsalz 0,07-molaren, an NH4CI 0,005-molaren und an NH3 0,0001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen zu je 8 ml aufgefangen.

Das Hauptmaximum der Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 153 bis 182 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 162. Die Fraktionen Nr. 157 bis 179, die die höchsten Verhältnisse von Extinktion bei 300 nm zu Extinktion bei 245 nm aufweisen, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 780 Absorptionseinheiten bei 300 nm auf.

Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 7 ml eingeengt, und der pH-Wert wird durch Zusatz von 20 jxl 1-molarer Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Die Lösung wird weiter auf 5 ml eingeengt und in eine Kolonne (2,2x 75 cm) von «Bio-Gel» P-2 (37-74 ja) eingegeben. Die Probe wird in die Kolonne mit zwei Anteilen zu je 1 ml entmineralisiertem Wasser hineingewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Zunächst werden zehn Fraktionen zu je 3,3 ml, dann sechzig Fraktionen zu je 2,65 ml und schliesslich zehn Fraktionen zu je 2,0 ml aufgefangen.

Das Hauptmaximum der Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 60 bis 68. Die pH-Werte der Maximumfraktionen werden durch Zusatz von 1,5 bis 2,5 |il 0,1-molarer Natronlauge auf einen Bereich von 7,5 bis 8,0 eingestellt. Die Fraktionen Nr. 62,63,64 und 65 werden einzeln in 14-ml-Glas-ampullen gefroren und gefriergetrocknet und im Vakuum bei -20 °C gelagert. Diese vier Fraktionen enthalten insgesamt 606 Absorptionseinheiten bei 300 nm.

Um die Verbindung 890A3 frei von der Verbindung 890Ai zu gewinnen, nutzt man die verhältnismässig höhere Widerstandsfähigkeit der Verbindung 890A3 gegen den Abbau durch Penicillinase folgendermassen aus:

Die «Bio-Gel»-Fraktionen Nr. 63 wird mit den Fraktionen Nr. 61,66 und 67 aus der «Bio-Gel»-Kolonne vereinigt. Diese vier vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 235 Extinktionseinheiten bei 300 nm auf. Man setzt 0,2 ml einer 1-molaren Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,5) und 0,2 ml Penicillinase zu [«Difco» «Bacto-Penase», enthaltend 500 000 Einheiten je ml (1000 LU/ml), wobei der Ausdruck LU sich auf Levy-Einheiten bezieht; 1000 LU inaktivieren 500 000 Einheiten Penicillin G]. Nach 113 Minuten bei 23 °C setzt man weitere 0,2 ml Penicillinase zu. Nach weiteren 7 Stunden bei Zimmertemperatur werden nochmals 0,2 ml Penicillinase zugesetzt, und nach 2 weiteren Stunden bei Zimmertemperatur wird das Reaktionsgemisch im Eisbad gekühlt. Das Gemisch wird dann durch Zusatz von 5 ml entmineralisiertem Wasser auf 15 ml verdünnt. Die Extinktion des verdünnten umgesetzten Präparats beträgt 6,3 bei 300 nm, wovon 2,64 Einheiten durch Umsetzung mit Cystein auslöschbar sind.

Das Reaktionsgemisch wird an eine Kolonne mit «Dowex»-l x4 (Cl-), Teilchengrösse unter 37 (i, Bettabmessungen 2,15x40 cm, adsorbiert. Die Verbindung 890A3 wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min mit einer an Kochsalz 0,07-molaren, an NH4CI 0,005-molaren und an NH3 0,0001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen zu je 13,8 ml aufgefangen.

Das Hauptmaximum der Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 185 bis 203. Die Fraktionen Nr. 187 bis 200 haben die höchsten Verhältnisse A300/A245 und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 31 A3oo-Einheiten auf.

Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 4 ml eingeengt, und das Konzentrat wird in eine Kolonne (2,2 x 70 cm) von «Bio-Gel» P-2 (37-74 |i) eingegeben. Die Verbindung 890A3 wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden 30 Fraktionen zu je 3,3 ml und sodann 50 Fraktionen zu je 2,65 ml aufgefangen.

Der Hauptgipfel der Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 64 bis 74 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 70. Die Fraktionen Nr. 66 bis 70 werden vereinigt; sie enthalten 19 A3oo-Einheiten oder 61% der aufgegebenen Einheiten. Die vereinigten Proben werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 1,5 ml eingeengt, und das Konzentrat wird gefroren und gefriergetrocknet. Man erhält 5,4 mg Feststoffe, die die Verbindung 890A3 und restliche Salze enthalten.

Beispiel 8

Herstellung der Verbindungen 890Ai und 890A3

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA 4434a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 0,8 ml sterile Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salze

Natriumeitrat 0,5 g

K2HPO4 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625553

22

(NH4)2SC>4

MgSCWHzO destilliertes Wasser

1,0 g 0,1g 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A zu beimpfen, welches die folgende Zusammensetzung hat:

Medium A

Glycerin 20,0 g

Primärhefe 5,0 g

Fischmehl 15,0g destilliertes Wasser 1000 ml

Agar 20,0 g pH-Wert mit NaOH auf 7,2 eingestellt.

Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche lang bei 27 bis 28 °C inkubiert und dann bis zur Verwendung bei 4 bis 6 °C aufgehoben (nicht länger als 21 Tage).

10 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung:

Medium B

Hefeautolysat («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0g Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04.7H20 50 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation

**Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

N32HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml kolben zu beimpfen, der 500 ml Medium B enthält. Dieser Impfkolben wird 36 Stunden lang bei 28 °C in einer mit 160 U/min arbeitenden Schüttelmaschine (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf die Kultur sich zufriedenstellend entwickelt hat.

5 Die Kultur aus diesem Impfkolben wird verwendet, um einen 1891 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, der 1601 Medium B enthält. Dieser Fermenter wird 24 Stunden lang bei 28 °C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 150 U/min bei einer Luftströmung von 851/min betrie-

10 ben. Ein Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000 der Dow Chemical Corp.) wird nach Bedarf verwendet, aber nicht in grösserer Konzentration als 0,1%. Die pH-Werte sind die folgenden:

Alter, h

0

12

pH-Wert

6,3

6,35

431 der Kultur dieses Impffermenters werden verwendet, 20 um einen 7561 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen, der 4671 Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium C

25 Tomatenbrei 20,0 g

Primärhefe 10,0g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoClz-ôHîO 5,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml 30 pH-Wert mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.

werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertra gen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension geschabt, und 3,3 ml dieser Suspension werden verwendet, um einen 21 fassenden, mit Umlenkorgan versehenen Erlenmeyer

Dieser Fermenter wird 92 Stunden lang bei 25 °C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 146 U/min bei einer Luftströmung von 2551/min betrieben. Nach Bedarf wird weite-- 35 res Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht mehr als 0,1%, zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen gegen Salmonella gallinarum MB 1287 und Vibrio percoians ATCC 8461 mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:

Alter, h

0

12

24

36

48

60

72

84

92

pH-Wert

6,6

6,7

6,65

6,3

6,0

6,4

6,15

6,5

6,5

MB 1287, mm

-

-

-

S

-

19

26

28

32

ATCC 8461, mm (1-10)

-

-

-

S

-

21

24

26

30

890A-Einheiten/ml

NA

NA

6,8

13,5

24,9

24,3

Die 890A-Einheiten/ml werden, wie oben in dem Abschnitt «II. Analysenmethode zur Bestimmung der 890-Analysenein-heiten» beschrieben, bestimmt.

4731 Fermentationsflüssigkeit werden auf 5 °C gekühlt und in einer Zentrifuge (Titan P-9) zentrifugiert. 22,7 kg «Celite» werden zu 378,51 der überstehenden Flüssigkeit zugesetzt, und die Suspension wird durch eine 45,7-cm-Filterpresse (Shriver) filtriert. Die 344,41 Filtrat werden an eine Kolonne adsorbiert, die 26,51 «Dowex»-l x 2 (Cl~) mit T eilchengrössen von 150 bis 300 n enthält, und die Kolonne wird mit 37,851 entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Gemisch der Verbindungen 890Ai und 890A3 wird mit 113,515%iger Kochsalzlösung, die 0,01-molar an Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 25-ja.molar an neutraler EDTA ist, in entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 18,91 aufgefangen. Das Gemisch der Verbindungen 890Ai und 890A3 erscheint in den Fraktionen Nr. 3 bis 6 mit einer maximalen Stärke in den Fraktionen Nr. 4 und 5. Die Fraktionen Nr. 4,5 und 6, die 8% der Aktivität der filtrierten Fermentationsflüssigkeit enthalten, werden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck zu 7,61 eingeengt.

Die 7,61 Konzentrat werden in eine Kolonne eingegeben, die 37,851 XAD-2 enthält und zuvor mit 189160vol-%igen wässrigen Acetons, dann mit 1891 entmineralisiertem Wasser und

50

60

65

schliesslich mit 18915%iger Kochsalzlösung gewaschen worden ist. Das Adsorbat dieses Konzentrats wird mit 1421 entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden drei Fraktionen zu 9,51 und sechs Fraktionen zu 18,91 aufgefangen. Die Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 1 bis 6 mit einer maximalen Stärke in der Fraktion Nr. 3. Die Fraktionen Nr. 4 und 5, die 64% der in die XAD-Kolonne aufgegebenen Aktivität oder 370 000 Einheiten enthalten, werden vereinigt.

Die Fraktionen Nr. 4 und 5 werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck zu 120 ml eingeengt. Der pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat in eine Kolonne (7 x 50 cm) von XAD-2 aufgegeben, die zuvor mit 8160vol.-%iger wässriger Acetonlösung, dann mit 41 entmineralisiertem Wasser und schliesslich mit 815-%iger Kochsalzlösung in entmineralisiertem Wasser gewaschen worden ist. Die Probe wird bis zur Höhe des Adsorptionsmittelbettes ablaufen gelassen und die Kolonne dreimal mit je 20 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und jedesmal bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen. Dann wird das Antibioticum mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 401/min mit 71 entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden acht Fraktionen zu je 200 ml und dann 14 Fraktionen zu je 400 ml aufgefangen. Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 4 bis 19, die 77% der in die Kolonne eingege

23

625553

benen Bioaktivität (bestimmt gegen Salmonella gallinarum MB 1287) enthalten; ein Maximum der Aktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 6 bis 8.

Man bestimmt das Verhältnis der Bioaktivität der Fraktionen gegen Vibrio percoians ATCC 8461 zu dem HAEAsoo-Wert dieser Fraktionen. Diejenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis etwa 250 beträgt, enthalten die Verbindung 890Ai, und diejenigen Fraktionen, bei denen das Verhältnis etwa 31 beträgt, enthalten die Verbindung 890A3. Demgemäss werden die Fraktionen Nr. 7,8 und 9, die grösstenteils die Verbindung 890Ai enthalten, für die weitere Verarbeitung vereinigt, die nachstehend unter der Überschrift «a) Reinigung der Verbindung 890Ai» beschrieben ist. Die Fraktionen Nr. 10,11,12 und 13, die hauptsächlich die Verbindung 890A3 enthalten, werden ihrerseits vereinigt und weiter verarbeitet, wie es nachstehend unter der Überschrift «b) Reinigung der Verbindung 890A3» beschrieben ist.

a) Reinigung der Verbindung 890Ai

Die vereinigten Fraktionen Nr. 7,8 und 9 aus der zweiten X AD-2-Kolonne, die 480 durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden unter vermindertem Druck auf 100 ml eingeengt. Die Probe wird in eine Kolonne mit «Dowex»-l x4 (CI~) (Teilchengrösse des Harzes weniger als 37 p., Bettabmessungen 2,15x40 cm) eingegeben und mit 41 einer an NH4CI 0,075-molaren und an NH3 0,001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu 12 ml mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min aufgefangen.

Die antibiotische Aktivität, bestimmt durch Analyse gegen Salmonella gallinarum MB 1287, erscheint in den Fraktionen Nr. 119 bis 146 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 134 bis 140. An jeder dritten Fraktion im Bereich der Bioaktivität werden die Ultraviolettextinktionen bei 300 nm, 245 nm und 220 nm bestimmt, und an mehreren Fraktionen zu beiden Seiten des Maximums wird die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion bei 300 nm gemessen. Die Fraktionen Nr. 129 bis 141, die die höchsten Verhältnisse von durch Hydroxylamin auslöschbarer 300-nm-Extinktion zu UV-Extinktion bei 220 nm aufweisen, werden miteinander vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen Nr. 129 bis 141 werden zu 4 ml eingeengt und mit 0,1 ml 1-molarer Ammoniaklösung versetzt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne von «Bio-Gel» P-2 (37-74 (i, Bettabmessungen 2,2x70 cm) eingegeben und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 3,1 ml aufgefangen.

Das Hauptmaximum der UV-Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 40 bis 47. Die Fraktionen Nr. 42, 43 und 44 haben die höchsten Verhältnisse von durch Hydroxylamin auslöschbarer 300 nm-Extinktion zu UV-Extinktion bei 220 nm und werden vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 207 Extinktionseinheiten bei 300 nm, von denen 133,4 durch Hydroxylamin auslsöchbar sind, was einer Gewinnung von 44% der in die Kolonne aufgegebenen, durch Hydroxylamin auslöschbaren Extinktion entspricht.

Die vereinigten «Bio-Gel» P-2-Fraktionen werden mit dem gleichen Volumen Methanol verdünnt und in eine Kolonne mit «Dowex»-l x2 (Cl~) (Teilchengrössen unter 37 jx, Bettabmessungen 2,15x40 cm) aufgegeben, die zuvor mit 50-vol.%igem Methanol ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Das Antibioticum wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min mit 21 einer an NH4CI 0,065-molaren und an NH3 0,001-molaren Lösung in 50%igem Methanol eluiert. Es werden Fraktionen zu je 12,5 ml aufgefangen.

Das Hauptmaximum der Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 59 bis 72. Die Fraktionen Nr. 62 bis 68, die die höchsten A3oo/A245-Verhältnisse aufweisen, werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen enthalten 93,7 Extinktionseinheiten bei 300 nm, von denen 76,3 durch Hydroxylamin auslöschbar sind. Dies entspricht einer Gewinnung von 57% der aufgegebenen, durch Hydroxylamin auslöschbaren Absorption in derfMaximumfraktionen.

Diese vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 3,4 ml eingeengt und mit 100 [il 1-molarer NH3-Lösung versetzt. Das so eingestellte Konzentrat wird in eine Kolonne (2,15x70 cm) von «Sephadex» G-10 eingegeben, die zuvor mit 20 ml gesättigter Kochsalzlösung und 20 ml 12%iger Ammoniumchloridlösung und hierauf mit 500 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen worden ist. Die Probe wird mit entmineralisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,15 ml/min eluiert. Es werden vier Fraktionen zu 10,3 ml und dann 56 Fraktionen zu 3,23 ml aufgefangen. Das erste Maximum der Ultraviolettabsorption bei 300 nm, das die entsalzte Verbindung 890Ai enthält, erscheint in den Fraktionen Nr. 25 bis 47. Die Fraktionen Nr. 28 bis 41 werden vereinigt und weisen einen pH-Wert von 3,5 auf. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 8 jil 1-molarer NH3-Lösung auf 7,3 eingestellt. Die vereinigten Fraktionen enthalten 28 Absorptionseinheiten bei 300 nm, von denen 18 durch Hydroxylamin auslöschbar sind.

2 ml dieser vereinigten Fraktionen werden als Bezugsproben abgenommen, und der Rest wird zu 2,0 ml eingeengt. Der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zusatz von 0,7 p.1 1-molarer NH3-Lösung auf 7,4 eingestellt.

50 |il des Konzentrats werden entfernt, und der Rest wird in einer 14-ml-Glasampulle eingefroren und zu 4,32 mg Feststoffen gefriergetrocknet, die die Verbindung 890Ai und restliche Salze enthalten.

b) Reinigung der Verbindung 890A3

Die aus der zweiten XAD-2-Kolonne erhaltenen vereinigten Fraktionen Nr. 10 bis 13 werden zu 40 ml eingeengt und in eine Kolonne (Bettabmessungen 2,15x40 cm) von «Dowex»-l x4 (Cl~) mit Teilchengrössen unter 37 |i eingegeben. Das Antibioticum wird mit 31 einer an NH4CI 0,075-molaren und an NH3 0,001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/min eluiert. Es werden Fraktionen zu je 9 ml aufgefangen. Die gegen Vibrio percoians ATCC 8461 bestimmte antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 165 bis 234 mit einer maximalen Aktivität in den Fraktionen Nr. 195 bis 201.

Die Fraktionen Nr. 186 bis 213 werden vereinigt; sie enthalten insgesamt 472 A3oo-Einheiten, von denen 312 durch Umsetzung mit Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen werden im rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 4,2 ml eingeengt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne mit «Bio-Gel» P-2 (37-74 |i; Bettabmessungen 2,15x60 cm) eingegeben. Die Probe wird bis zur Höhe des Bettes ablaufen gelassen, zweimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und dabei jedesmal bis zur Betthöhe ablaufen gelassen. Dann wird die Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert, wobei man Fraktionen zu je 2,6 ml auffängt.

Die Verbindung 890A3 wird in den Fraktionen Nr. 38 bis 48 eluiert; die maximale Aktivität, bestimmt durch die durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion bei 300 nm, tritt in der Fraktion 41 auf. Die Fraktionen Nr. 40 bis 43 werden vereinigt; sie enthalten 260 A3oo-Einheiten, von denen 173 mit Hydroxylamin auslöschbar sind.

Um die restliche Verunreinigung der Verbindung 890A3 durch die Verbindung 890Ai zu entfernen, werden die vereinigten entsalzten Fraktionen Nr. 40 bis 43 mit 50 jj.1 Penicillinase [«Difco» «Bacto-Penase», enthaltend 500 000 Einheiten je ml (1000 LU/ml, wobei der Ausdruck LU sich auf Levy-Einheiten bezieht; 1000 LU inaktivieren 500 000 Einheiten Penicillin G)]

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

625 553

24

und 0,1 ml 1-molarer Tris-HCl-Pufferlösung (pH-Wert 7,5) versetzt.

Man lässt das Reaktionsgemisch 6 Stunden lang bei 23 °C stehen und setzt dann 3 ml entmineralisiertes Wasser und 15 ml Methanol zu. Dieses Gemisch wird in eine Kolonne (2,15x44 cm Bettabmessungen) von «Dowex»-l x2 (Cl-) (Teilchen-grösse unter 37 p.) eingegeben, die in 50-vol.%igem Methanol gefüllt und mit 2150-vol.%igem Methanol gewaschen worden ist. Die Verbindung 890A3 wird mit 2150-vol.%igem Methanol eruiert, das an Kochsalz 0,05-molar, an NH4CI 0,005-molar und an NH3 0,0001-molar ist. Es werden Fraktionen zu je 9,2 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum der UV-Extinktion, gemessen bei 300 nm, tritt in den Fraktionen Nr. 74 bis 88 auf. Die Fraktio nen Nr. 78 bis 85 werden vereinigt. Nach dem Abtreiben des Methanols unter vermindertem Druck beträgt der Gesamtwert an Extinktionseinheiten dieser Fraktionen bei 300 nm 97,6, wovon 87,5 durch Reaktion mit Hydroxylamin auslöschbar sind.

Die vereinigten Fraktionen Nr. 70 bis 85 werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 3,92 ml eingeengt, und das Konzentrat wird in eine Kolonne von «Sephadex»-G-10 (Bettabmessungen 2,15x70 cm) eingegeben, die mit 4 ml 4-molarer Ammoniaklösung gewaschen und dann mit 0,15-mmoIarer Ammoniaklösung in entmineralisiertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach zweimaligem Waschen mit je 1 ml 0,02-mmolarer NH3-Lösung wird die Verbindung 890A3 mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,8 ml/min mit 0,02-mmolarer NH3-Lösung eluiert. Es werden zunächst 49 Fraktionen zu je 2,45 ml und dann 20 Fraktionen zu je 3,33 ml aufgefangen. Das Hauptmaximum der Extinktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 35 bis 53. Die Fraktionen Nr. 38 bis 46, die die höchsten A3oo/A245-Werte aufweisen, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Die vereinigten Fraktionen weisen insgesamt 65 Extinktionseinheiten bei 300 nm auf. Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck zu 2,84 ml eingeengt, in zwei gleiche Teile geteilt und gesondert in 14-ml-Glasampullen schnellgefroren und gefriergetrocknet. So erhält man die Verbindung 890A3. Eine Probe enthält 32,0 A3oo-Einhei-ten in 0,88 mg, die andere Probe enthält 31,9 Aîoo-Einheiten in 0,82 mg. Die erstgenannte Probe, die 32,0 A3oo-Einheiten enthält, zeigt bei der NMR-Analyse die folgenden Peaks:

13 (d, J = 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d von d, J = 5 und j = 2,4); ~4,01-4,28 (m); 3,14 (d von d, J = 5 und J = 9); 3,39 (t, J = 6,5); 3,92 (d von t, J = —4 und J = 6).

In der obigen Tabelle sind die 100-MHz-NMR-Signale für das Natriumsalz von 890A3 in D2O im Verhältnis zu DSS als innerer Standard angegeben; die chemischen Verschiebungen sind in ppm und die Kupplungskonstanten in Hz angegeben, ferner sind auch Mehrfachwerte angegeben.

Beispiel 9

Schüttelkolbenproduktion der Verbindung 890Ai

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA 4600a wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem Rohr suspendiert, das 1,5 ml steriles Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium A

Hefeextrakt 10,0g

Glucose 10,0g

MgSC>4.7H20 0,05 g

Phosphatpuffer 2 ml destilliertes Wasser 1000 ml

'Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um einen 250 ml fassenden, mit drei Umlenkorganen versehenen Erlenmeyer-Impfkol-ben zu beimpfen, der 54 ml Impfmedium B der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium B

Autolysierte Hefe («Ardamine»*) 10,0 g

Glucose 10,0g

MgS04-7H20 0,05 g

Phosphatpuffer** 2 ml destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

*«Ardamine»: Yeast Products Corporation **Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91.0g

NazHP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Der Impfkolben wird mit einem Wattepfropfen verschlossen und 30 Stunden lang bei 28+1 °C in einer Drehschüttelma-schine (Hub 5,1 cm) bei 220 U/min geschüttelt.

50 Erlenmeyer-Produktionskolben ohne Umlenkorgane, die je 250 ml Inhalt haben und je 40 ml Produktionsmedium C enthalten, werden mit je 1 ml der aus dem Impfkolben gewonnenen Fermentationsflüssigkeit beimpft. Die Produktionskolben werden mit Wattepfropfen verschlossen.

Medium C

Tomatenbrei 20,0 g

Primärhefe 10,0g

Dextrin («Amidex») 20,0 g

CoCl2-6H20 5,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH-Wert mit NaOH auf 7,2-7,4 eingestellt.

Nach dem Beimpfen werden die Produktionskolben 3 Tage lang bei 28± 1 °C unter Schütteln in einer mit 220 U/min arbeitenden Drehschüttelmaschine (Hub 5,1 cm) inkubiert. Die Kolben werden auf ihre Aktivität gegen Standardanalysenplatten mit Vibrio percoians ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27-cm-Scheiben analysiert, die in zentrifugierte Fermentationsflüs-sigkeitsproben getaucht werden. Die Proben werden mit 0,05-molarer Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4) verdünnt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

Kulturalter, h 72

pH-Wert 6,4 Vibrio percoians,

Verdünnung '/ioo,

Hemmzone, mm 23

890-Analyseneinehiten/ml 103

Die 890A-Einheiten/ml werden bestimmt, wie es im Abschnitt «II. Analysenverfahren zur Bestimmung der 890-Analyseneinehiten» beschrieben ist.

Die gesamte Fermentationsflüssigkeit wird in Anteilen von 200 ml in Polycarbonatflaschen je 15 Minuten lang mit 9000 U/min zentrifugiert, wobei man 1600 ml vereinigte überstehende Flüssigkeiten mit einer Stärke von 104 Einheiten/ml erhält. Hierzu werden 0,5 ml neutrale EDTA-Lösung zugesetzt.

Die zentrifugierte Fermentationsflüssigkeit wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 bis 20 ml/min an einer Kolonne mit «Dowex»-l x 2 (CI") (150-300 |i, Bettabmessungen 3,8x22 cm) adsorbiert. Die Kolonne wird mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/min mit 11 entmineralisiertem Wasser eluiert, welches 50 g Kochsalz enthält und 0,02-moIar an Tris-HCl-Puf-fer (pH-Wert 7,0) sowie 25-(imolar an neutraler EDTA ist. Es werden Fraktionen zuje 10 ml aufgefangen.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

25

625553

Die Verbindung 890Ai erscheint in den Fraktionen Nr. 13 bis 81 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 25 bis 33, gerechnet von dem ersten Aufguss des Salzeluats. Die Fraktionen Nr. 24 bis 41, die die höchsten Verhältnisse von Bioaktivität zu A220 haben, werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. 5 Die vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 29 000 Einheiten oder 17% der aufgegebenen Bioaktivität.

Das «Dowex»-Elut wird zu 10 ml eingeengt, der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 6,5 eingestellt und das Konzentrat in eine Kolonne mit XAD-2 (Bettabmessungen 3,3x36 cm) ein- 10 gegeben, die zuvor mit je 2160-vol.%igem wässrigem Aceton, entmineralisiertem Wasser und einer Lösung von 5 Gewichtsteilen Kochsalz in 100 Raumteilen entmineralisiertem Wasser gewaschen worden ist. Die Probe wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser 15 eluiert, wobei Fraktionen von 40 bis 260 ml aufgefangen werden.

Die antibiotische Aktivität erscheint in den Fraktionen Nr. 6 bis 14, die von 220 bis 2560 ml des eluierten Volumens reichen. Das Maximum ist in den Fraktionen Nr. 9 und 10 enthal- 20 ten, die sich von 370 bis 590 ml des eluierten Volumens erstrek-ken. Die Fraktionen Nr. 9 bis 12, die 370 bis 1060 ml des eluierten Volumens umfassen, weisen die höchsten Verhältnisse HAEA300/A220 auf und werden für die weitere Verarbeitung vereinigt. Diese Fraktionen haben 36 600 Einheiten, was 126% der 25 scheinbaren aufgegebenen Aktivität entspricht.

Die vereinigten Fraktionen Nr. 9 bis 12 werden zu 100 ml eingeengt, und das Konzentrat wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min in eine Kolonne mit «Dowex»-l x4 (Cl-) eingegeben, in der das Adsorptionsmittel Teilchengrös- 30 sen unter 37 n und Bettabmessungen von 2,2x41 cm aufweist. Die Kolonne wird mit 50 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit 31 einer an Kochsalz 0,07-molaren, an NH4CI 0,005-molaren und an NH3 0,0001-molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert. 35 Beginnend mit der ersten Aufgabe des Eluierungsmittels, werden Fraktionen zu 10,8 ml aufgefangen.

Der Hauptgipfel der Aktivität der Verbindung 890Ai erscheint in den Fraktionen Nr. 181 bis 217 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 198. Die Fraktionen Nr. 186 bis 210, die 40 insgesamt 114 Absorptionseinheiten bei 300 nm enthalten, werden vereinigt.

Die vereinigten Fraktionen werden zu 4,0 ml eingeengt, und der pH-Wert wird durch Zusatz von 16 p.11-molarer Natronlauge auf 7,3 eingestellt. Das Konzentrat wird in eine Kolonne mit «Bio-Gel» P-2 (37-74 |i; Bettabmessungen 2,15x70 cm) eingegeben und dreimal mit je 1 ml entmineralisiertem Wasser hineingewaschen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 0,96 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden Fraktionen zu je 3,85 ml aufgefangen.

Der Hauptgipfel der Aktivität der Verbindung 890Ai erscheint in den Fraktionen Nr. 24 bis 44 mit einem Maximum in den Fraktionen Nr. 33 und 34. Die Fraktionen Nr. 27 bis 38, die die höchsten A3oo/A245-Verhältnisse aufweisen, werden für die Gefriertrocknung vereinigt. Diese vereinigten Fraktionen enthalten insgesamt 72 A3oo-Einheiten.

Um die Gefriertrocknung durchzuführen, werden die vereinigten Fraktionen zu 3,0 ml eingeengt, und der pH-Wert des Konzentrats wird durch Zusatz von 10 ml 0,1-molarer Natronlauge auf 7,5 eingestellt. Die Probe wird in zwei Teile zu je 1,50 ml geteilt, die dann gesondert aus 14-ml-Glasampullen mit Schraubkapseln schnellgefroren und gefriergetrocknet werden. Jede Probe enthält 1,73 mg 890Ai, entsprechend 35,8 A300-Einheiten.

Mittel, die erfindungsgemäss hergestellte Antibiotica enthalten, können in verschiedenen Dosisformen, z. B. in fester oder flüssiger oraler Dosisform dargereicht werden. Die Verbindungen 890Ai und 890A3 können gesondert oder in Kombination miteinander verwendet werden. Die nachstehend beschriebenen Mittel können in gleicher Weise entweder mit der Verbindung 890Ai oder 890A3 für sich allein oder mit beiden dieser Verbindungen gemeinsam hergestellt werden. Die Mittel können, gleich ob sie flüssig oder fest sind, je Einheitsdosis 0,1 bis 99% Wirkstoff enthalten; der bevorzugte Bereich beträgt 10 bis 60%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels. Das Mittel enthält im allgemeinen 25 bis 1000 mg Wirkstoff, im allgemeinen verwendet man jedoch Dosismengen im Bereich von 250 bis 1000 mg. Für die parenterale Darreichung besteht die Einheitsdosis gewöhnlich aus der reinen Verbindung in steriler wässriger Lösung oder in Form eines zum Lösen bestimmten Pulvers.

Claims (5)

625 553

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums in Form der Verbindung 890Ai oder der Verbindung 890A3 oder eines Gemischs dieser beiden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man unter submersen aeroben Bedingungen einen Stamm von Streptomyces flavogriseus in einem assimilierbare C- und N-Quellen sowie anorganische Salze enthaltenden wässrigen Nährmedium züchtet und das gebildete Antibioticum isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung der Verbindung 890Ai den Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 oder 8140 züchtet.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung der Verbindung 890A3 den Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 züchtet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung eines Gemischs des Verbindungen 890Ai und 890A.1 den Mikroorganismus Streptomyces flavogriseus N RRL 8139 züchtet.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung von nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salzen der Verbindung(en) 890Ai und/oder 890A3 durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Basen.

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat grosses Interesse auf diesem Gebiet wachgerufen, das zur Auffindung vieler anderer wertvoller antibiotischer Stoffe geführt hat; solche Antibiotica sind z. B. andere Penicilline, Cephalosporine, Streptomycin, Bacitra-cin, Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine und dergleichen. Im allgemeinen erstreckt sich die antibakterielle Aktivität eines jeden dieser Antibiotica nicht auf gewisse klinisch wichtige pathogene Bakterien. So wirken einige hauptsächlich nur gegen gram-positive Arten von Bakterien. Im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung bisher bekannter Antibiotica zur Behandlung von bakteriellen Infektionen hat die erworbene Resistenz zum Auftauchen schwieriger Resistenzprobleme geführt.

Daher haben die Mängel der bekannten Antibiotica eine weitere Forschung zur Auffindung anderer Antibiotica angeregt, die gegen einen weiteren Bereich von Krankheitserregern sowie auch gegen resistente Stämme besonderer Mikroorganismen aktiv sind.