DK143712B - Fremgangsmaade til fremstilling af de antibiotiske stoffer 890a1 og 890a3 - Google Patents

Description

(19) DANMARK V£S/ (sIm

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 143712 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 4971/76 (51) int.Cf.3 C 12 P 17/18 (22) Indleveringsdag 3 · nov. 1976 C 07 D 487/04 (24) Løbedag 3. nov. 1976 (41) Aim. tilgængelig 22. maj 1977 (44) Fremlagt 28. s ep. 1 981 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 21. nov. 1975i 634^00, US

(71) Ansøger MERCK & CO. INC., Rahway, US.

(72) Opfinder Patrick Joseph _Cassidy, US: Robert Thomas Goegelman, US: Edward Olley Stapley, US: Sebastian Hernandez, ES.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Hofman-Bang & Boutard.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af de antibiotiske stoffer 89OAI og 89ΟA3-

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte antibiotiske stoffer, benævnt 8904^ og 890A^, som er isomere forbindelser med den i krav 1 angivne formel.

Opdagelsen af penicillinets bemærkelsesværdige antibiotiske egenskaber har i høj grad stimuleret interessen for dette område, hvilket har resulteret i fremkomsten af andre værdifulde antibio- ® tiske stoffer, såsom andre penicilliner, cephalosporiner, strep- >4 _ tomycin, bacitracin, tetracycliner, chloramphenicol og erythro- ^ myciner. I almindelighed er ingen af de nævnte antibiotiske stof- ;j. fer aktive over for samtlige klinisk vigtige pathogene bakterier.

For eksempel er nogle af stofferne i det væsentlige kun aktive over for Gram-positive bakterier. Den almindelige anvendelse ^ af tilgængelige antibiotiske stoffer til behandling af bakterie- 2 143712 infektioner har endvidere resulteret i fremkomsten af resistente bakteriearter, hvilket er blevet et meget alvorligt problem.

Som følge heraf er der stadig interesse for at finde nye antibiotiske stoffer, som er aktive over for et større område af patho-gener samt over for resistente stammer af særlige mikroorganismer. Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe ovennævnte hidtil ukendte antibiotiske stoffer, som er meget effektive til at inhibere væksten af forskellige Gram-positive og Gram-negative mikroorganismer. Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte.

En kultur af produktionsdygtige stammer af arten Streptomyces flavo-griseus er optaget i kultursamlingen tilhørende Northern Regional Laboratories, Northern Utilization Reasearch and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111., under betegnelserne NRRL 8139 og 8140.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 producerer begge antibiotika 89OA-^ og 890A-3J, der er isoleret i ren tilstand ud fra fermenteringsvæsker. Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 giver det antibiotiske 890A-^ uden nogen påviselig mængde 890A^.

De morphologiske og kulturelle egenskaber for Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 fremgår af følgende tabel.

Morphologl - Sporophorer er forgrenede, lige eller buede kæder af sporer, som danner totter. Kæderne indeholder mere end 10 sporer. Sporerne er sfæriske til ovale - 0,9/1 x 1,2μ (970x).

Dyrkningsmæssige egenskaber Havremelagar

Vegetativ vækst - Bagside gullig tan, pergamentagtig vækst;

Luftmycelium - Lysegråt kantet med mediumgråt Opløseligt pigment - Intet.

3 T43712

Czapek Dox-agar (saccharose-nitrat-agar)

Vegetativ vækst - Bagside brun kantet med mørkebrunt·.;

Luftmycelium - Mediumgråt, fløjlsagtig;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium, Ægalbumin-agar .

Vegetativ vækst - Bagside gullig' tan kantet med brunt;

Luftmycelium - Mediumgråt blandet med gulliggråt (2dc) og grå-gult (2db);

Opløseligt pigment - Lysegullig tan.

Glycerol-asparagin-agar

Vegetativ vækst - Bagside gullig tan, flad, udbredt;

Luftmycelium - Fløjlsagtig, lysegråt med en kraftig gullig tone til grå (2dc);

Opløseligt pigment - Intet.

Uorganiske salte-stivelseagar

Vegetativ vækst - Bagside - brun;

Luftmycelium - Mediumgråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Lysegulligt tan.

Gærekstrakt-dextrose + saltagar

Vegetativ vækst - Bagside - brun kantet med meget mørkebrunt; Luftmycelium - Mørkegråt blandet med lysegråt, fløjlsagtigt; Opløseligt pigment - Intet.

Gærekstrakt-maltekstrakt-agar

Vegetativ vækst - Bagside - mørkebrun;

Luftmycelium - Mørkegråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Skummetmælk-agar

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Sparsom, grålig;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium;

Hydrolyse af casein - God.

Lakmusmælk

Vegetativ vækst - Moderat vækstring, mørk tan;

Luftmycelium - Intet;

Farve - Purpur;

Koagulation og/eller peptonisation - Fuldstændig peptonisation; bliver alkalisk, pH = 8,2.

4 143712

Skummetmælk

Vegetativ vækst - Moderat vækstring, tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Tan;

Koagulation og/eller peptonisation - Fuldstændig peptonisation; bliver alkalisk, pH = 8,0.

Tyrosin-agar

Vegetativ vækst - Bagside - mørkebrun;

Luftmycelium - Mørkegråt;

Opløseligt pigment - svag brunfarvning af medium;

Dekomponering af tyrosin - Ingen.

Pepton-jern-gærekstrakt-agar Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Sparsomt, gråligt;

Opløseligt pigment - Intet;

Melanin - Intet; ^S-produktion - Ingen.

Næringsagar

Vegetativ vækst - Bagside - lysegråligt brun kantet med mørk gråbrun;

Luftmycelium - Lysegråt kantet med mørkegråt;

Opløseligt pigment - Intet.

Næringsstivelsesagar

Vegetativ vækst - Tan kantet med gråt;

Luftmycelium - Mediumgråt kantet med mørkegråt;

Opløseligt pigment - Intet; . Hydrolyse af stivelse - God.

Næringsgelatine-agar

Vegetativ vækst - Farveløs kantet med mørkegrå;

Luftmycelium - Grålighvidt;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - God.

Kartoffelstykfeer * Vegetativ vækst - God vækst, kraftig" rynket; Luftmycelium - Gråt til grønliggråt;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium.

Loeffler's blodserum

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning - Ingen.

5 143712

Gelatinestik

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - God.

Alle ovennævnte data blev bestemt efter tre ugers dyrkning ved 28°C, med mindre andet er anført. pH-værdien af de under disse studier anvendte medier var tilnærmelsesvis neutral, nemlig pH = 6,8 - 7,2. Farveangivelserne i beskrivelsen er i overensstemmelse med definitionerne i Color Harmony Manual, 4. udgave (1958), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 blev også testet for dens evne til at udnytte eller assimilere forskellige carbonhydrater. Til dette formål blev mikororganismen dyrket på et syntetisk grundmedium (Pridham and Gottlieb) indeholdende 1 % af carbonhydratet ved 28°C i tre uger. pH-værdien af de under studiet anvendte medier var tilnærmelsesvis neutral (6,8 - 7,2). Tabel I viser udnyttelsen af disse carbonhydratkilder ved hjælp af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139, idet + angiver god vækst, - dårlig vækst og - ingen vækst på det pågældende carbonhydrat. ·

TABEL I

Glucose + Maltose +

Arabinose + Mannitol +

Cellulose - Mannose +

Fructose + Raffinose

Inositol - Rhamnose +

Lactose + Saccharose -

Xylose + Mængden af vækst i afhængighed af temperaturen og oxygenbehovet af mikroorganismen er følgende:

Temperaturområde (Gærekstrakt-dextrose + salt-agar); 28°C - God 37°C - God vegetativ vækst; ingen lufthypher 50°C - Ingen vækst 6 143712

Oxygen-behov (stikkultur i gærekstrakt-dextrose + salt-agar);

Aerob.

De morphologiske og dyrkningsmæssige egenskaber af Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 fremgår af efterfølgende tabel.

Morphologi - Sporophorer er forgrenede, lige bugtede kæder af sporer, som danner duske. Kæderne er mere end 10 sporer i længden. Sporerne er sfæriske til ovale - 0,9u x 1,2μ (970x).

Dyrkningsegenskaber

Havremel-agar

Vegetativ vækst - Bagside - gullig- tan kantet med mørkebrunt; Luftmycelium - Lysegråt kantet med mediumgråt;

Opløseligt pigment - Intet.

Czapek Dox-agar (saccharose-nitratagar)

Vegetativ vækst - Bagside - brun kantet med mørkebrunt;

Luftmycelium - Mellemgråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Ægalbumin-agar

Vegetativ vækst - Bagside - grålig tan med sektioner af kraftig gullig tan

Luftmycelium - Sektioner af mellemgråt, grålighvidt og gullig-gråt (2dc);

Opløseligt pigment - Meget lyst tan.

Glycerolasparagin-agar

Vegetativ vækst - Gullig tan;

Luftmycelium - Sparsom, grålig;

Opløseligt pigment - Intet.

Uorganiske salte-stivelseagar

Vegetativ vækst - Bagside - gråligcreme;

Luftmycelium - Mellemgråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Gærekstrakt-dextrose + saltagar

Vegetativ vækst - Bagside - mørkebrun;

Luftmycelium - Mørkegråt blandet med lysegråt, fløjlsagtigt; Opløseligt pigment - Intet Gærekstrakt-maltekstrakt-agar

Vegetativ vækst - Bagside - mørkebrun; 7 143712

Luftmycelium - Mørkegråt, fløjlsagtigt;

Opløseligt pigment - Intet.

Pepton-jern-gærekstrakt-agar Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Melanin - Intet; E^S-produktion - Ingen.

Næringsagar

Vegetativ vækst - Lys tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet.

Næringsstivelsesagar

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Hydrolyse af stivelse - God.

Næringsgelatineagar

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - God.

Gelatinestik

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning af gelatine - Fuldstændig.

Skummetmælkagar

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Hydrolyse af casein - God.

Lakmusmælk

Vegetativ vækst - Tan vækstring;

Luftmycelium - Intet;

Farve - Brunlig-purpur;

Koagulation og/eller peptonisation - Fuldstændig peptonisation, bliver alkalisk, pH = 8,0.

8 163712

Skummetmælk

Vegatativ vækst - Tan, moderat vækstring;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Lysebrunt;

Koagulation og/eller peptonisation - Fuldstændig peptonisation, bliver alkalisk, pH = 8,5.

Kartoffelstykker

Vegetativ vækst - God, tanfarvet;

Luftmycelium - Meget sparsomt, hvidligt;

Opløseligt pigment - Intet.

Loeffler's blodserum

Vegetativ vækst - Cremefarvet;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Intet;

Smeltning - Ingen.

Tyrosin-agar

Vegetativ vækst - Tan;

Luftmycelium - Intet;

Opløseligt pigment - Svag brunfarvning af medium;

Dekomponering af tyrosin - Meget svag.

Alle ovennævnte data blev bestemt efter tre ugers dyrkning ved 28°C, med mindre andet er anført. pH-værdien af de ved disse undersøgelser benyttede medier var tilnærmelsesvis neutral, nemlig pH = 6,8 - 7,2. Farveangivelserne i beskrivelsen er i overensstemmelse med definitionerne i Color Harmony Manual, 4. udgave (1958),

Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 blev også testet for sin evne til at udnytte eller assimilere forskellige carbonhydrater.

Til dette formål blev mikroorganismen dyrket på et syntetisk grundmedium (Pridham and Gottlieb) indeholdende 1 % af carbonhydratet ved 28°C i tre uger. pH-værdien af det anvendte medium var tilnærmelsesvis neutral (6,8 - 7,2). Tabel II viser udnyttelsen af disse carbonhydratkilder ved hjælp af Streptomyces flavogriseus NRRL 8140, idet + angiver god vækst, - dårlig vækst og - ingen vækst på det pågældende carbonhydrat.

9 143712

TABEL II

Glucose + Maltose +

Arabinose + Mannitol +

Cellulose - Mannose + -f

Fructose + Raffinose - J.

Inositol - Rhamnose +

Lactose + Saccharose -

Xylose + Mængden af vækst i afhængighed af temperaturen og oxygenbehovet for mikroorganismen er følgende:

Temperaturområde (gærekstrakt-dextrose + saltagar); 28°C - God 37°C - Moderat vegetativ vækst; ingen lufthypher 50°C - Ingen vækst

Oxygen-behov (stikkultur i gærekstrakt-dextrose + saltagar);

Aerob.

De omhandlede antibiotiske stoffer, 890A^ og 890A^, fremstilles ved aerob gæring under kontrollerede betingelser af egnede næringsmedier, der podes med stammer af organismen Streptomyces flavo-griseus. Vandige medier af samme art, som anvendes til fremstilling af andre antibiotiske stoffer, er velegnede til fremstilling af 890A^ og 890A^. Sådanne medier indeholder kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte, der er assimilerbare af mikroorganismen .

I almindelighed anvendes de sædvanlige carbonhydrater, såsom sukkerstoffer, f.eks. dextrose, glucose, fructose, maltose, saccharose, xylose eller mannitol, samt stivelser, såsom dextrin eller korn, f.eks. havre, rug, majsstivelse, ma^jsmel og lignende, enten alene eller i kombination som kilder for assimilerbart carbon i næringsmediet. Den nøjagtige mængde af carbonhydratet, der anvendes i mediet, afhænger delvis af de andre bestanddele i mediet, men sædvanligvis benyttes mellem 1 og 6 vægtprocent car-bonhydrat i mediet. De nævnte carbonkilder kan anvendes individuelt, eller flere sådanne carbonkilder kan forenes i mediet. Sædvanligvis kan mange proteinholdige materialer anvendes som 143712 nitrogenkilde i gæringsprocessen. Egnede nitrogenkilder omfatter for eksempel gærhydrolysater, primær gær, sojabønnemel, bomuldsfrømel, hydrolysater for casein, majsstivelsesvæske, bærme eller tomatpasta. Nitrogenkilderne kan anvendes enten alene eller i kombination, idet de anvendes i mængder mellem 0,2 og 6 pot. efter vægt af det vandige medium. Blandt uorganiske næringssalte, der kan indføres i dyrkningsmediet, er de sædvanlige salte, som kan frigive ioner af natrium, kalium, ammonium, calcium, magnesium, phosphat, sulfat, chlorid og carbonat. Også spormetaller, såsom cobalt, mangan og jern, bør være til stede.

Gæringen kan udføres ved temperaturer mellem 20 og 37°C, men optimale dyrkningsresultater opnås mellem 23 og 28°C. Næringsmediets pH-værdi bør i begyndelsen ligge mellem 6,0 og 8,0.

Selv om de antibiotiske stoffer 890A^ og 890A^ dannes både ved overflade- og neddykkede kulturer, foretrækkes det at udføre gæringen i neddykket tilstand.

Gæring af det antibiotiske stof i lille målestok udføres hensigtsmæssigt ved dyrkning i et egnet næringsmedium med den antibiotikum-producerende kultur, og efter overførsel til et produktionsmedium gennemføres gæringen ved en konstant temperatur på ca. 28°C i et rysteapparat i flere dage.

Gæringen startes i en steriliseret kolbe indeholdende næringsmedium over et eller flere trin for udvikling af podekulturer. Næringsmediet for podekultur kan bestå af en kombination af de ovennævnte carbon- og nitrogenkilder. Podekolben rystes ved konstant temperatur på 28°C i løbet af en dag, eller indtil væksten er tilfredsstillende, og en del af den dannede vækst anvendes til podning enten af et næste trin af podekultur eller produktionsmediet. Mellemliggende trin af eventuelt anvendte podekolber udvikles på sædvanlig måde, dvs. en del af kolbeindholdet fra sidste podetrin anvendes til podning af produktionsmediet. De podede kolber rystes ved konstant temperatur i flere dage, og efter inkubationstidens afslutning centrifugeres kolbeindholdet, eller det filtreres.

Ved produktion i stor målestok foretrækkes det at udføre gæringen i egnede tanke, der er udstyret med omrører og luftningsorganer 11 143712 for gæringsmediet. Ved denne metode oparbejdes næringsmediet i tanken, og det steriliseres ved opvarmning til temperaturer på op til 120°C. Efter afkøling podes det steriliserede medium med en foruddyrket portion af produktionskulturen, og gæringen gennemføres i et tidsrum på for eksempel 1-6 dage under omrøring og/eller luftning af næringsmediet, medens temperaturen holdes på 24 - 28°C. Denne produktionsmetode for antibiotikum 890A^ og 890A^ er særlig egnet til fremstilling af store mængder antibiotikum.

Fysiske og kemiske egenskaber for antibioticum 89(^ og 890A^ Egenskaber for antibiotikum 890A-^

Antibiotikum S90A-^ er et surt stof, som bevæger sig mod den po-.....

sitive pol ved elektroforese ved neutralt pH.

Natriumsaltet af antibiotikum 89(^ er et hvidt pulver, når det lyofiliseres af en vandig opløsning, og det er meget letopløseligt i vand.

Det ultraviolette absorptionsspektrum har et A.max på 299,5 nm og et p.min på 242 nm. E% ved 300 nm for en opløsning af natriumsaltet af antibiotikum 890A-^ i vand ved neutralt pH er 208 for en ren prøve; forholdet mellem absorptionsværdier ved 300 nm og 245 nm er 4,25, og forholdet er Mere end 92 % af absorptionen ved 300 nm kan fjernes ved omsætning med hydroxylamin, og en tilsvarende formindskelse er observeret ved reaktion med cystein.

Det cirkulære dikro isme-spektrum for 890A^ udviser et positivt maksimum ved 290,5 nm med en specifik ellipticitet ved 5270 gra-der-ml pr. decimeter-gram, et nulpunkt for ellipticitet ved 250 nm og et negativt minimum ved 214 nm, med specifik ellipticitet På -10.910 grader-ml pr. decimeter-gram.

Efterfølgende tabel angiver 100 MHz-NMR-signalerne for QSOk^ natriumsalt i i forhold til den interne standard, natrium-2, 2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat, her omtalt som DSS; kemisk skift er givet i ppm, og koblingskonstanter er i Hz; den tilsyneladende multiplicitet er indikeret.

12 143712 1,35 (d, J= 6,5) 1,98 (d); 3,63 (d af d, J= 5,2 og J= 9,8); ^4,02-4,26 (m); 3,18 (d af d, J= ^11 og J= 10); 3,41 (t, J= 6); 2,97 (d af t, J= 3,5 og J= 6).

Den antibiotiske potens af 890A1, målt på Vibrio percolans ATCC 8461, er defineret som 250 enheder pr. HAEA^00 enhed.

Egenskaber for antibiotikum 890A^

Antibiotikum 890A^ er et surt stof, der bevæger sig mod den positive pol ved elektroforese ved neutralt pH.

Natriumsaltet er et hvidt pulver, når det lyofiliseres af en vandig opløsning.

Det ultraviolette absorptionsspektrum har et maksimum ved 300,5 nm og et minimum ved 243 nm. E% ved 300 nm af en opløsning af natriumsaltet af antibiotikum 89OA^ ved neutralt pH er 375 for en ren prøve; forholdet mellem absorption ved 300 nm og 245 nm er 3,54. Mere end 90 % af absorptionen ved 300 nm kan fjernes ved omsætning med hydroxylamin; og en tilsvarende formindskelse er observeret ved reaktion med cystein.

Det cirkulære dikroisme-spektrum for 890A^ har et positivt maksimum ved 294 nm med en specifik ellipticitet på 9127 grader-ml pr. decimeter-gram, et nulpunkt for ellipticiteten ved 249 nm, og en specifik ellipticitet på -15.053 grader-ml pr. decimeter-gram ved 220 nm.

Følgende tabel angiver 100 MHz-NMR signaler for 890A^ natriumsalt i D20 i forhold til den interne standard DSS; kemisk skift er givet i ppm, og koblingskonstanter i Hz; den tilsyneladende multiplicitet er indikeret.

13 1437 12 1,29 (J= 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d af d, J= 5 og J= 2,4); <'4,01-4,28 (m); 3,14 (d af d, J= 5 og J= 9); 3,39 (t, J= 6,5); 2,92 (d af t, J= ^4 og J= 6).

Den antibiotiske potens af 890Α^, målt på Vibrio percolans ATCC 8461, er 31 enheder pr. HAEA^qq enhed.

Massespektralanalyse af 890A^ og 890A^

Massespektraldata for 890A-^ og 890A^ er opnået ved trimethylsilyl-derivater fremstillet af ammoniumsalte af de antibiotiske stoffer med bis-trimethylsilyltrifluor-acetamid i dimethylformamid. Omdannelse af natriumsalte af de antibiotiske stoffer til ammoniumsalte udføres med ammoniumsaltet af en sur ionbytterharpiks.

Trimethyl-silylation af 890A^ og 890A^ resulterer i tre forskellige derivater: et di- og et tri-trimethylsilyl-derivat (molvægt henholdsvis 458 og 530) og en lille mængde tetra-trimethylsilyl-derivat af et hydrolyseret produkt (molvægt 620), hvori β-lactam-ringen er åben.

Værdierne for de vigtigste masse-spektralfragmenter er givet i det efterfølgende: di-trimethylsilyl-derivat: 443,1495; 301,1034; 300,0962; 241,0590 og 86,0610.

tri-trimethylsilyl-derivat: 515,1931; 373,1422 og 158,1000.

tetra-trimethylsilyl-derivat (kun lav-resolutionssignal observeret) : 620 og 605.

143712 14

Antibiotika 890A^ og 890A^ er isomere og har en molekylstruktur som følger: ch3-ch(oh) --0 I γ-s-ch2-ch2-nh-c-ch3 0^Ηγ

COOH

Antibiotika 89OA-^ og 89 OA^ har endvidere følgende antibiotiske spektrumsprofiler.

Prøven til bestemmelse af det antibiotiske spektrum-profil er udført ved anvendelse af en dråbe på 0,015 ml på overfladen af 100 x 15 mm petri-skål indeholdende 5 ml podet næringsagar og 0,2 % gærekstrakt. Antibiotikum 890A-^ er prøvet i en koncentration på 33 pg/ml, og antibiotikum 890A3 er prøvet i en koncentration på 182 pg/ml. Resultaterne i form af diametrene i millimeter for zoneinhibering fremgår af efterfølgende tabel III.

15 143712 ro < 00 K> OJ C\lfri<f<finHI^Wt^<rWK^K^I^I^ e ΝΛ <! g o Λ CT\ Ή

CO TJ

bo φ o 3 o

Η N H

< . o §, p oHocomooooooiNtNCMiO-j-vp-d-iNOiN-

CO P CO <rc\l t\IK\fr\ni\lrlNNtOfONtONHN

CO c!

O H

•H

P

o

•H

P

•H

P

3 CO ίπ 3 1¾ _ .

ch o IN

m o I I ΙΟΟΟΙΌΗΙ I l-ft IN I Η I O I O I

o i i i cn to rp <f- I ihhivdihivdi ^ |p in CO cvi VO <1" H H

1¾ c P UD CT\ <f 00 CM H

H CO

H <

H W

J H

m p ^ o eh 3 ft

CQ

s o 3 o

Jj og cm in co <r jsl rftHCh oo ip oo ip h ud cd m o is CTiin cm h -i cm & g ^ 1 ^ \ \ \ \ ^ ^ \ \ 1 \ ^ \ 1 \ Ί H I S S S g g aggg φ

•H

3 Φ

P

CO CO CO

p CO CQ O P

•H CQ CQ CQ P ·Η S 3 Φ

p> 03 3 H cq p 3 o pcO

rj 3 CQ φ Φ CO P ft 3 P fi Ή CO P 3 3 3 O Η Φ Cd CO ©3

Μ ο O ίο 3 <0 cd cq 3 O NO

O tQ 3 O CO ·Η CO CO O ·Η P CQ ·Η CQ ·Η P S

3 Ή Jn CQ Η <H©,3H3tQPH33 -p 3 © Φ CQ P CQ CdOHC0©3OP© •H c0c0O3Pc03cqP3c0H>c0Ocq3 s · bo 3 O p Φ O 3 O bø O bO ft

ftHCQc0O3POOCQp O CQ i—I CO CQ

3 C03(flSOCQ3OOCDPCd3Cd3PCdCd η Φ > 3 o H o o 3 h © 3 i> ,3 3 h S cq ocOoca o o © co H ft o ooh cq 3cQøPH3cdHObøH© fi ca p g ©

P H 3 OP >>H 3 >> P P H 3 O O 3 30 P

3 ΗΦ'ΰΦΡΙΗΡΡίΛΗΦΟΡΡίΦΦ'ϋΕΙ

CO PP 3 i-ι ftP O ft© CO O 8 3 P P p! 3 P

bC 00©3cd03cd303HP300©©

3 c03cQ©PcdcdPPH3CdPc03tQCQH

O pqftaiCOCocqcococo<:fflco>XftiiPftW

16 143712 i to <j

. O

• σ> o o cm uo σ <f o <1-000 10 gao to ko ia m cm cm 10 m to to to

OtJ

•H

'd

CD

£ o

N

£ H

•H < ej σ o o o <f t>- co uo in w to o

H00 CM CM to CM Η IO H tO W H

CQ

-p d i-ι d

o VO C\J t-- H

ch o i ud 1 <f ro i i 1 1 i uo o I -ej- I Er— UO I I III <f E-t <f σ σ oo <d

H

H

H

H

pq

PQ

C

&h • o o

cS <f O 10 UO CM UO

LO CM CM t>- UO ri CM

X roco 00 00 to η h

o 00 I CM I I CM CM CM CM tO I

d I I I I III III I

£ Si sssss Δ -p ^

ft d ω LO

•d cd cd H O

•H cd -P o H cd

cd o -h w w CQ

CQ -d S -P -Η -Η M cd CQ Od SdOCQ ft d cd cd d <d d -h cd cd cd cm -h

d O ·Η CQ ·Η O H d + H

CD-HtiOftdCDcd CQ H

tO ^ d -HCDCd&OCQ CQ-HCQ-H

OftdSHS'HCdd -HHdO d CD CD d O Cd d H Cd H

CD cq cd H O Pd CQ WHO CddHd cdo d w d d O bo cd o cd dWCDCd-HOOO*HdOft d-P Cd -P ·Η -P O O ded d -H d

CD CDCddOd<DOOCDftf>S<IlH

S -P O Cd O-P O O ft CD ft S

w o cd Sd-Hd O o oww \ H Cd Ή O CD dt>)-P-P O ddo· d ,Q d ti d <DW ft ft -HH CD <DH,d cd O -H d >. Λ CD CD dH-P-P dd

b0 d Ϊ3 CD d OH d d il-P O O ,Ω <D

d CDdWOW -P -P -H d d ·Η o <: h ft u H coao> ft ft t> 17 143712

Antibiotikum 890A-^ udviser in vivo en aktivitet over for Gram-negative og Gram-positive organismer og er derfor velegnede til bekæmpelse af bakterieinfektioner på dyr og mennesker. Til bestemmelse af aktiviteten in vivo opløses antibiotikum 890A^ under fortynding med 0,15M NaCl, 0,01M natriumphosphat, pH = 7,0, til opnåelse af fem firedobbelte koncentrationer af lægemidlet for afprøvning. Hvide schweiziske hunmus med en middelvægt på 21 g blev inficeret intraperitonealt med prøveorganismen, suspenderet i væsken. Antallet af injicerede organismer blev bestemt ved standard-plade-tælleteknik. På infektionstidspunktet og igen seks timer senere blev nogle af musene behandlet intraperitonealt med det antibiotiske stof. Fem mus blev anvendt for hver koncentration af det afprøvede lægemiddel. Yderligere to mus, der ikke var inficeret, blev prøvet med det antibiotiske stof til bestemmelse af, om mængden af det injicerede middel var giftigt. Fem kontrolmus for hver af flere fortyndinger af den inficerende kultur blev medtaget i hver prøve for at kunne beregne antallet af organismer, som var lethale over for 50 % af de inficerede, ubehandlede nrus (LD^q).

Denne beregning blev udført under anvendelse af overlevelsesdata på den syvende dag efter infektion, på hvilken tid mængden af lægemiddel, som kan beskytte 50 % af de inficerede mus (ED^q) også blev beregnet.

Alle sådanne inficerede dyr, som ikke blev behandlet med antibiotikum, døde inden for 48 timer efter infektionen. Effektiviteten af antibiotikum sgOA^ med en aktivitet på 5,5 enheder pr. pg over for Salmonella schottmuellari MB-2837 fremgår af følgende tabel: ED^q x 2 dosis

Enh./mla^ Rute Fortynding Enh./ml pgb^ ........ 11 ............ ...... —....."I .................Ill I·™· I.. I H I. , ........

908 ip 1:32 14 3 ^ 1 enh./ml = den koncentration, som medfører en 25 mm zone af inhibering over for Vibrio percolans ATCC 8461.

pg-værdien er beregnet ud fra en renhed af 890A^ på 5500 enh./mg, 18 143712

Antibiotikum 89 OA^ og 89 O A^ er værdifulde antibiotiske stoffer, der er aktive over for forskellige Gram-positive og Gram-negative bakterier og derfor kan anvendes i den humane og veterinære medicin. De omhandlede forbindelser kan anvendes alene eller i kombination med hverandre som antibakterielle lægemidler til behandlinger af infektioner, som er forårsaget af Gram-positive eller Gram-negative bakterier, f.eks. over for Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae og Enterobacter cloacae. De antibiotiske stoffer kan yderligere anvendes som tilsætningsmidler til dyriske foderstoffer, til præservering af næringsmidler og som desinfektionsmidler. For eksempel kan de anvendes i vandige præparater i koncentrationer fra 0,1 til 100 dele antibiotisk stof pr. millinondel opløsning eller fortrinsvis i koncentrationer fra 1 til 10 dele antibiotisk stof pr. milliondel opløsning for at tilintetgøre og inhibere væksten af skadelige bakterier på medicinske og dentale instrumenter og som baktericider til industriel anvendelse, f.eks. i vandbaserede malinger og i papirmøllevand til inhibering af væksten af skadelige bakterier.

De omhandlede antibiotiske stoffer kan anvendes i forskellige farmaceutiske præparater som eneste bestanddel eller i kombination enten med en eller flere andre antibiotiske stoffer eller et eller flere farmaceutisk aktive stoffer. Som eksempel på den første mulighed kan nævnes, at et aminocyclitol-antibiotisk stof, såsom gentamycin, kan indgives samtidigt for at opnå størst sikkerhed imod udvikling af resistente organismer. Som eksempel på sidstnævnte mulighed skal nævnes, at diphenoxylat og atropin kan tilsættes i dosisform for helbredelse af gastroenteritis. Det antibiotiske stof kan anvendes i kapselform eller som tabletter, pulvere eller væskeopløsninger eller som suspensioner eller elixirer. Det kan indgives oralt, topisk, intravenøst eller in-tramusculært. Endvidere kan antibiotikum 890A^ og 89OA^ anvendes i kombination.

Der kar fremstilles ugiftige farmaceutisk acceptable salte af 89(^ og 890A3, f.eks. metalsalte af alkalimetal- eller jordal ka i ime-haihydroxi der, carbonater eller bicarbonater, såsom afledt af natrium-, kalium-, ammonium- og calciumsalte og salte af primære, sekundære eller tertiære aminer, såsom monoalkylaminer, 19 143712 dialkylaminer, trialkylaminer, lavere alkanolaminer, di-lavere-alkanolaminer, lavere-alkylendiaminer, N,N-diaralkyl-lave-re-alkylendiaminer, aralkylaminer, amino-substituerede lavere alkanoler, N,N-di-lavere-alkylamino-substituerede lavere alkanoler, amino-, polyamino- og guanidin-substituerede lavere alkansyrer og nitrogenholdige heterocycliske aminer. Repræsentative eksempler omfatter salte afledt af natriumhydroxid, ammoniumhydroxid, natri-umcarbonat, natriumbicarbonat, kaliumcarbonat, kaliumhydroxid, calciumcarbonat, trimethylamin, triethylamin, piperidin, N-ethyl-piperidin, morpholin, quinin, lysin, protamin, arginin, procain, ethanolamin, morphin, benzylamin, ethylendiamin, Ν,Ν'-dibenzyl-ethylendiamin, diethanolamin, piperazin, dimethylaminoethanol, 2-amino-2-methyl-l-propanol, theophyllin og N-methylglucamin.

De omhandlede salte kan fremstilles på i og for sig kendt måde.

For eksempel kan monosaltene, såsom mononatriumsaltet, fås ved behandling af et ækvivalent natriumhydroxid med et ækvivalent af et af de antibiotiske stoffer i et egnet opløsningsmiddel. Også blandede salte med divalente kationer kan fremstilles ved kombination af et mol af en divalent base med et mol af et af de antibiotiske stoffer plus et ækvivalent af en anden syre. I stedet kan saltene fås ved behandling af et ækvivalent af en base med en divalent kation, såsom calciumhydroxid, med et ækvivalent af et af de antibiotiske stoffer.

De gæringsvæsker, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indeholder de antibiotiske stoffer 890A-L og 890A^ i en koncentration svarende til 2 - 170 enheder pr. ml, når de prøves ved diffusions-prøvemetoden ved h^ælp af Vibrio percolans (ATCC 8461). Antibiotiske præparater med mindst 5 enheder pr. mg aktivitet af 890A^ og 890A^ kan renses, og det antibiotiske stof kan udvindes på flere måder. En sådan procedure består i at ad-sorbere det antibiotiske stof 890A-^ og 890A^ på en stærk basisk anionbytterharpiks. Typiske eksempler på sådanne stærkt basiske anionbytterharpikser er sådanne harpikser, som har en styren-divinylbenzen-matrix, f.eks. polystyrenharpiks med nucleært kvaternært ammonium af typen Dowex 1x2 (fremstillet af Dow Chemical Co., Midland, Michigan), på chlorid-cyclus. Andre repræsentative medlemmer af denne klasse af basiske ionbytterharpikser er følgende: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 og A-114 (fremstillet 20 143712 af Chemical Process Co., Redwood City, California). Amberlite IRA-400, IRA 401 og IRA-410. I stedet kan anvendes en svag basisk anionbytterharpiks, såsom Amberlite IRA-68. (Amberlite-harpiks fremstilles af Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania).

Det adsorberede antibiotiske stof elueres let af anionbytterharpiksen med en vandig saltopløsning. ' Det således dannede eluat kan om ønsket renses yderligere ved andre rensningsprocedurer. Således kan eluatet renses ved gennemledning gennem en kolonne, der er pakket med acrylesterpolymer med intermediær polaritet, såsom XAD-7 eller 8, eller gennem en kolonne pakket med en ikke-polær polystyrenpolymer, tværbundet hydrophobisk med divinylbenzen, såsom XAD-1, 2 og 4, fortrinsvis XAD-2. (XAD-1, 2, 4, 7 og 8 fremstilles af Rohm and Haas, Washington Square, Philadelphia 5, Penssylvania). Ved denne proces sker en delvis adskillelse af antibiotikum 890A^ og 89OA^. Fraktioner med højt indhold af 89OA-^ og med højt indhold af 890A^ opsamles hver for sig. Disse opsam-lede fraktioner renses yderligere.

En metode til at opnå yderligere rensede antibiotikum. 89OA·^ og 89OA·^ består i at anvende filtrering gennem polyacrylamid med en porestørrelse, som udelukker molekyler med en molekylvægt større end 1800, såsom Bio-Gel-P-2 (fremstillet af Bio*Rad, Richmond, California). Andre geler, såsom Sephadex G-10, kan også anvendes til afsaltning.

Den foretrukne procedure til opnåelse af antibiotikum 890A-^ og 890A^ i høj renhed ud fra gæringsvæsker består i en centrifugering af filtratet til fjernelse af faste stoffer, en adsorption og eluering af en ionbytterharpiks, såsom Dowex 1 x 2 på chlorid-cyclus med NaCl ved 3 til 5 %, hvorved der sker en samtidig koncentration og delvis rensning af det antibiotiske stof; passage over en kolonne af særlig præpareret XAD-2 tilbageholder det antibiotiske stof og renser og afsalter derved Dowex 1 x 2-eluatet. Antibiotikum 890A^ tilbageholdes mere end antibiotikum 890A1, således at de to antibiotiske stoffer adskilles delvis. Fraktioner indeholdende 890A·^ og 890A^ opsamles og renses yderligere. Kromatografi på Dowex 1x2 minus 400 mesh og eluering med NaCl og/eller NH^Cl giver et produkt, der er fri for de fleste UV-absorbe- 1437 12 21 rende urenheder (NH^Cl anvendes til at opnå nogen pufringskapacitet i elueringsmidlet); og en afsaltning på Bio-Gel-P-2 eller Sephadex G-10 fjerner salt indført ved Dowex 1x2 kromatografi og reducerer yderligere mængden af andre urenheder i det antibiotiske præparat.

Når væske med lav aktivitet behandles ved ovennævnte procedure, kan slutmaterialet indeholde betydelige mængder (mere end 50 %) af fremmede urenheder. Disse urenheder kan reduceres ved gentagelse af kromatografi på Dowex 1x2 minus 400 mesh, ved eluering med en opløsning indeholdende natriumchlorid og 50% methanol. Det er også tilrådeligt ved isolering af antibiotikum fra væske med lav aktivitet at gennemføre endnu et trin af XAD-2 kromatografi.

Dette medfører yderligere rensning, fjerner resterende salt og delvis adskiller antibiotikum 890A·^ fra 890A^. Således elueres 890A^ senere end 890A^, og de to kan adskilles ved deres forskellige forhold af bioaktivitet til HAEA^qq (se nedenfor)-De fraktioner, som udviser et forhold for bioaktivitet på Vibrio percolans ATCC 8461 til HAEA^qq på 250, indeholder antibiotikum 890Α^, og de frak-; tioner, som viser et forhold for bioaktivitet på Vibrio percolans ATCC 8461 til HAEA^qq på 31» indeholder antibiotikum 890A^.

Fraktioner med højt indhold af antioiotikum 890A^ kan behandles med penicillinase til fjernelse af resterende spor af antibiotikum 890A1 og yderligere renses ved kromatografi på Dowex 1 x 2 og Sephadex G-10.

Ved drift i laboratoriemålestok (mindre end 20 liter af prøverumfang) udføres alle kromatografiske trin med undtagelse af kromatografi på XAD-2 i et koldt lokale ved 2-5°C. XAD-2-kromatogra-fi udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er anført. pH-værdien af de antibiotiske opløsninger, som skal opbevares, indstilles på 7-8 ved forsigtig tilsætning af fortyndet natriumhydroxid- eller HCl-opløsninger. Vandige opløsninger opbevares i køleskab, fortrinsvis i isvand, og 50% methanol-opløsninger opbevares ved -20°C.

Et diagram for rensningsproceduren til opnåelse af antibiotikum 890A^ og 890A·^ fremgår af efterfølgende figurer 1 og 2.

?+ 143712 φ 22

S Η Ο OK

Ο I _ Η Μ I η m ο ρ C--ι m-p ο ι w cn ι g co-p cm ι CM H 0) !

O Φ Pi Η _ I

X « pi K +W I

o da oh o i

Η Φ O 0) I H 0) I

I + τΙ ω S X OS I

x H CM Φ I

φη o - ρ ^ i

£ O p Μ P S) O ii 2 2 O I

o co φ φ p SpcQin mi pg H ra So pi cd o g (Dl ρ ρ h HH a -ιη·Η -μι

HcR ·Η ΦΗ Ο ·Η Ο Ο oil Η Hin Ρ Ει>ΡΟ Ο ΙΛΕίΙ < -PC PH CDOti-Kl ο Η Η (DW)cO ΡΗΡ-Ρ-ΦΟΡ >1 σ> ρ φ ρ sdo -ρω0 ·Ηΐ co φ an ο ρ Ρ-ρρφ + g -Pi

Ρ Η CQo(0 Φ 8 Ρ Ρ P H COI

S Eh Eh g -P CD tiO OMOflffiHO dl

3 O CD 3- ΛΗ S PHM-HpOO PI

X rap cd a φ OHpJancO ·> ©l

•Η HHm Eh CO Eh X -P ¢0^ Φ S O -PI

-PcOCDCM pq ra H HI

O _ ^-S Cl

•H HCMIC\ <f I

P H CM w I

•H t \ I

-P I

P „_ ι

© 4J I

Φ CM I

Eh Eh CM Pi IV I

o cd m __ (¾ _ ι

H &o cd X ω -Ρ I

Ρ ,Χ a-PCM-P HcOCM I

ra H ra Η Φ I cO H (D p IEh

ΗΦ H ffi . lOf PiPP H OH X,, EhKD

O Eh > -> XOd EdCH - -Ρ I Pd Ρ ©IW

HO-P CD Η P <1 X © CD HO EhIH

p Eh Ed £ I H _ H + Η I ω -PH

Oft Φ OOH C m XS-P PM

h m o Pm OH ___I © Φ ΦΙΡ! 1¾ tiO _ ^ OD O £ cR P Olft

p CO C" Λ OOH PlO

•ha A æ A pmp qix

Ed φ a _ rX ih <a ·ΰ „ !

Ed Ed g

φ ram HKM

Eh Pi^O O '-'l·-' h pd o m η ι

p cm cm ora «κ cm I I

Φ I I Pi Φ02 I O I

> p p φ a ft ι

o < C Pi +g Μ I

EhC X X Ed Ο Η Η Φ I

-ρ ΦΕη Ο Ο -ΗΟΗΟΦ Pi V

ω &0P H CM H CM COOO CO

H PH -Η K -H|3d Eh CO - I Pi ra H Eh-P P-P Φ [»SO op/ h\

P -H-p raplrapi d p H ra C

Φ Pi P 8 ΡΡΦ Eh Eh Φ O P _ Pd CO O

> CD-pra -Ρ Φ a -Ρ Φ a Η-Hg O O <T\

O HPH dd dfl -P a IN H CM H CM l CD I

HCD-H (DPP ΦΡΡ M'-'O -H Pd -H Pd X.

COO-P ΟΟΦ O O CD CO ~ P-P P-P X/

Ed ra p Ed ω Ρ P40 ra pi φ p) O Pi Η O Pi Η Η ΡΡΦ ΡΡΦ Λ h cm m m co © μ in φ xpi -p cd a -ρ φ a w P CD P ,Q dp φ h a φρρφρρ ρ H cm m h cm m ρ ι οοφ oocd ρφ ____ PXP p m p P ra Ρ © ra

O CD CD OPiH OPiH PH

/Φ ι X m^p Xiira ,ϋΙκΗ) -PH

/ ra ra \ P oh pH

/ P pi \ ©Ρ φ ra^l / ra p ra bo \ H cm m H cm m oft

Ρ Ρ H cm q X

Irararaml — — MH

\ a-xpicc /_ r~—--

\ Pranoo / M

\ CD80O\Ch / cm-p _ Φ H cm X ft !> ϋ 00 CO / I CO _____ Γ p)

S P p XC-P cO -P

----^ C H CD (0 id Ο P

XP ^.X P ftH P _

I 0 Η Φ I H

- P> PHP COOP

ra H ra -P -P -P H (0 p C P P

-*3 143712

m S ο in cd ο S

- ο ™ S (Μ θ’Ο * §χ Η -Ρ .η Η CD CO Η Η Η ΰ3 Η I ο κ\ ι η -η X co æ ο Ρ υ ® S § •ρ η ^ "η- Μ Μ

pq α ο Λ S S

ø o iQ in ι—( m a 2 0 0

gH a -o d ·Η Ο O

0 H O ·> g a o d o H . P -d- 0 Ο Η CD β + o dfl æ o Ρ P d Ρ h m xj- cdofiDo < wo w t! 2 <t- O 0 ® d B H ffi

cn a + p co ø S

00 O rH > % c oo HIM tn a <t- <r ^ 3 æ cm

5 MSI

o Be

. *h in H

n SO ® •H 9

fi -*o O

CO ,r^ x + cq l O _r

O HH Η (M

(Ml·) I O H K <M

X CO P H J

CC W 0g ® d X

hø is p ρ ø S s' o® oS-pøøho-p m

ho pin Pd ι ®S C

a p o 0 Ρ Ρ X S d o ft H ·> O O 0 Φ H Q\ m -ho d w d i? P Loo..

fctO -P OdH OO / d d ^coojQinm .x •H Ρ Φ Eg d o H *-> s to x h cm m _. Λ CD P P Ww''—/ s

P -p o CD B

Ρ οι H W 3 CM

^ Φ »Cd d H O

0 d Ρ P CO 0 > > o ad o Ο Η Ο &0 -Ρ η HCM + .¾ +3 ,¾ m<n w·— P ® to co<: _L_ oo ® w

•Η Ρ Ο · ^ Η H CM PH

W H Cd hO H i pq -P H

Ρ I GO H j p -Ρ O pH

<D QH X (Dd ® X! > ς 0)'H PPXCD oa o ><; d HH H CD CD S P <? d w ico PHd O |>,

0 CD CD _ X d (DpeOP .X H

d d O -> CD H O Od ID

id η o is p pwad

HOP O O d 0 H H CM

BiJ a P .X cO CO 0

co cd L__L

cQ d d -f" a p cd h cm m Ο η j> ----' ^ if

X

0

d O H CO H cO

xj ι d _

ftO H CD W CO

24 143712

Forsøgsprocedure for antibiotikum 890A^ og 890A^ I. Bioforsøg

Ved en agarplade-skive-diffusionsmetode anvendes enten Vibrio perco-lans ATCC 8461 eller Salmonella gallinarum MB-1287 som prøveorganisme. En renset prøve af antibiotikum 890Α^ anvendes som standard.

Plader indeholdende Vibrio percolans ATCC 8461 fremstilles på følgende måde:

En lyophiliseret kultur af Vibrio percolans ATCC 8461 suspenderes i 15 ml af et steriliseret medium indeholdende 8 g/liter Difco næringsvæske og 2 g/liter gærekstrakt i destilleret vand "Næringsvæske-gær-ekstrakt" (i det efterfølgende omtalt som NBYE). Kulturen dyrkes i 16 timer i et roterende rysteapparat ved 28°C. Denne kultur anvendes til podning af overfladen af skråkulturer indeholdende 1,5% agar i NBYE, og de podede skråkulturer dyrkes i 16 timer ved 28°C og opbevares herefter i et køleskab.

De afkølede skråkulturer, der er fremstillet af en enkelt lyophiliseret kultur, anvendes i op til fire uger fra deres fremstilling på følgende måde: Med en podenål optages podemateriale fra skråkulturen, som dispergeres i 50 ml NBYE i en 250 ml konisk kolbe. Kulturen dyrkes i 16 timer i et roterende rysteapparat ved 28°C og fortyndes herefter til en koncentration med 50 % transmission ved 660 nm. En 53,2 ml portion af denne fortyndede kultur sættes til 1 liter NBYE indeholdende 15 g agar og opretholdes ved 46°C. Det podede agarholdige medium hældes i 100 x 15 mm Petri-skåle af plast, 5 ml pr. skål, afkøles og opretholdes ved 2-4°C i 1 - 5 dage før anvendelsen.

Plader indeholdende Salmonella gallinarum MB-1287 fremstilles på følgende måde:

Et tilsmeltet rør indeholdende Salmonella gallinarum MB-1287 celler i skummetmælk, som er frosset og lyophiliseret og tilsmeltet under vakuum, åbnes og podes i 15 ml hjerne-hjerte-infusionsvæske. Cellerne henstilles til vækst uden rystning ved 37°C i 16 timer, og kul- 25 143712 turen podes på skråkulturer med 0,8% BBL næringsvæske +0,2% Difco-gærekstrakt +1,5% agar. Efter vækst i 16 timer ved 37°C overføres en podning af kulturen fra skråkulturen til en kolbe indeholdende 50 ml 0,8% næringsvæske + 0,2% gærekstrakt. Kolben rystes i 16 timer, og 20 ml af denne kultur podes i en liter 0,8% næringsvæske +0,2% gærekstrakt +1,5% agar, som er steriliseret og afkølet til 48°C. Den podede NBYE-agar hældes straks i 100 x 15 mm Petri-skåle af plast, 5 ml pr. skål, og pladerne opretholdes ved 0-3°C indtil anvendelsen.

Skiver af filtrerpapir på 13 mm diameter dyppes i opløsningen, som skal prøves, og anbringes på agar. I stedet kan skiverne fyldes ved pipettering af en tiendedel ml af opløsning på en tør skive, hvorefter denne anbringes på agar. Diameteren af inhibe-ringszonen måles efter en passende dyrkning (9-18 timer ved 37°C for Salmonella gallinarum MB-1287 eller 12-24 timer ved 25T for Vibrio percolans ATCC 8461). Om fornødent gennemføres fortyndinger af opløsningerne, som skal afprøves, med 0,05M kaliumphos-phatpuffer, pH = 7,4 "kaliumphosphatpuffer" (i det efterfølgende omtalt som KPB), eller i afioniseret vand.

Kalkulationer af aktiviteterne forløber på følgende måde: En hældning bestemmes ved måling af zonediametrene for en opløsning af det antibiotiske stof 8904-^ eller 890A^ og for en firedobbelt fortynding (i KPB) af denne opløsning. To skiver af hver koncentration prøves på en enkelt plade, og middelzonestørrelsen af hver koncentration bestemmes. Hældningen er lig med halvdelen af forskellen mellem de gennemsnitlige zonestørrelser. Styrken beregnes dernæst af formlen:

Styrke (enh./ml) = (styrke af Standard) / rn n -i _ \

x fortynding , XO

hvor D er middeldiameteren af zonerne dannet af den ukendte, D

5 er middeldiameteren af standardzonerne, og "fortynding" er fortynding s gr a den af den ukendte før prøven. Hvis der ikke anvendes standard, antages D at være 25 mm, og (aktiviteten af standard)

O

sættes til 1 enh./ml, målt på Vibrio percolans ATCC 8461. Rent 890A^ er defineret som en aktivitet på 250 enheder pr. hydroxyl-amin-udslukkelig absorptionsenhed ved 300 nm, anvendt som standard.

26 143712 I overensstemmelse hermed er aktiviteten af antibiotikum 890A^ 31 enheder pr. hydroxylamin-udslukkelig absorptionsenhed ved 300 nm.

For prøvning med Salmonella gallinarum MB-1287-plader bestemmes en hældning på samme måde som med Vibrio percolans ATCC 8461-plader. Når ingen standard anvendes, beregnes kun de relative aktiviteter. Hvis ingen hældning er målt, antages en værdi på 2,3 mm. Aktivitetsberegningerne forløber som med Vibrio percolans ATCC 8461-prøver. Hvis ingen 890A^-standard anvendes, kan der benyttes en kontrol af penicillin G ved 250 ^ig/ml for at verificere, at følsomheden af organismen ligger i det normale område.

II. Prøveprocedure for bestemmelse af ”890 prøve enheder11

Den konventionelle skive-plade-prøvemetode anvendes, og skiverne har en diameter på 12,7 mm. De rutinemæssigt udstøbte 10 ml plader podes med Vibrio percolans (ATCC 8461) og anvendes med cephaloridin som standard. Fire koncentrationer af cephalori-din udgør standard — 3,12, 6,25, 12,5 og 25 mcg pr. ml med 12,5 mcg pr. ml som referenceopløsning. Zonediametrene på en 5 ml plade for standard er følgende:

Kone, (mcg/ml) Zone-diameter (mm) 3,12 16,8 6,25 22,3 12,5 25,0 25 29,6

En enhed er defineret som mængden af antibiotikum, der producerer en 25 mm zone for inhibering på en 5 ml plade. Ved denne prøve er en koncentration på 12,5 mcg pr. ml cephaloridin derfor anset som ækvivalent med 1 enhed 890A. Da hældningen af linien for cephaloridin er 4,0, udføres beregninger for aktiviteten af en prøve med en hældning på 4,0.

III. Hydroxylamin-reaktion Både antibiotikum 890A^ og 890A^ reagerer med hydroxylamin og giver et stof med betydelig formindsket absorption ved 300 nm.

27 143712

Dette muliggør en kvantitativ prøve for antibiotikum 890A-^ og 890A3.

Opløsningen, som skal prøves, indstilles på 0,05M i kaliumphos-phat, pH = 7,4 ved tilsætning af 1/20 rumfang af en opløsning indeholdende 0,8M KgHPO^ og 0,2M KH2P0^. Derpå tilsættes en hundredel rumfang 1M hydroxylamin-hydrochlorid, og absorptionen ved 300 nm måles med intervaller på et halvt til to minutter. Reaktionen udføres ved 22-28°C. Der antages en reaktion af første orden og en halveringstid bestemt fra adsorptionsformindskelsen under de første ti minutter. Ud fra denne halveringstid beregnes den tid, efter hvilken ingen yderligere absorptionsformindskelse kan iagttages, og iagttagelserne fortsættes ud over denne tid. Hvis ingen yderligere formindskelse iagttages ud over den tid, betragtes den totale absorptionsformindskelse (korrigeret for fortyndingseffekt og absorption af hydroxylamin) som "Hydroxylamin-udslukkelig absorption ved 300 nm (HAEA^qq)”. Hvis en absorptionsformindskelse iagttages ud over den tid, beregnes størrelsen af baggrunds-absorptionsformindskelse, og den iagttagne absorption på tidspunktet korrigeres for baggrundsformindskelse, idet man antager, at baggrundsformindskelsen er lineær med tiden. Den korrigerede værdi noteres derefter som HAEA^qq.

Antallet af HAEA^qq-enheder er lig med HAEA^qq multipliceret med rumfanget i ml.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle udførelseseksempler.

EKSEMPEL 1

Rystekolbe-produktion af en blanding af antibiotikum 890A^ og 890A^

En portion af en skråkultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 anvendes til podning af en 200 ml luftet konisk podekolbe indeholdende 50 ml medium A med følgende sammensætning: 28 143712

Medium A

Dextrose 10,0 g Gærautolysat (+Ardamin type pH) 10,0 g

MgSty 7H20 0,05 g ^Phosphatpuffer 2,0 ml

Destilleret H20, pH = 6,5 1000 ml +Ardamin: Yeast Products Corporation APhosphatpufferopløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne podekolbe rystes ved 28°C på en ryster med 220 omdrejninger pr. minut (slaglængde 5 cm) i 2 dage, indtil væksten er tilfredsstillende.

Tre 250 ml koniske kolber, hver indeholdende 40 ml Medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Tomatpasta 20,0 g

Euldhavre (formalet) 20,0 g

Destilleret H90, 1000 ml

pH indstillesT)å 7,0 med NaOH

podes med 2 ml (5¾ pr. kolbe af vækstmediet fra podekolben. Disse tre produktionskolber rystes ved 28°C i et rysteapparat med en hastighed på 220 omdrejninger pr. minut (slaglængde 5 cm) i op til 4 dage. Efter tre dage giver den fracentrifugerede væske en 22 mm inhiberingszone over for Proteus vulgaris, MB838 og en 15 mm zone over for Salmonella gallinarum MB1287 under anvendelse af en 6,35 mm forsøgsskive på standardforsøgsplader.

29 143712 EKSEMPEL 2

Rystekolbe-produktion af en blanding af antibiotikum 890A^ og 890A^

En portion af en skråkultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 anvendes til podning af en 250 ml luftet konisk podekolbe indeholdende 50 ml medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Dextrose 10,0 g Gærautolysat (+Ardamin type pH) 10,0 g

MgS04-7H20 0,05 g ^Phosphatpuffer 2,0 ml

Destilleret H20, pH = 6,5 1000 ml +Ardamin: Yeast Products Corporation

Jr ‘

Phosphatpuffer-opløsning kh2po 91,0 g

Na2HP04 95,0 g '

Destilleret H20 1000 ml

Denne podekolbe rystes ved 28°C i et rysteapparat på 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i en dag, indtil væksten er tilfredsstillende. Kolben holdes ved 4°C i 2 dage, indtil den anvendes.

Tre 2000 ml Erlenmeyer-kolber, hver indeholdende 200 ml af Medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Tomatpasta 20,0 g '

Euldhavre (formalet) 20,0 g

Destilleret H20, 1000 ml

pH: indstiller på 7,0 med NaOH

podes med 7 ml pr. kolbe (3>5$) af væksten fra podekolben. De tre produktionskolber rystes ved 28°0 og 220 omdrejninger pr. minut i et rysteapparat (5 cm slaglængde) i fire dage.

30 143712

Forsøg udført på centrifugeret væske under anvendelse af 6,35 mm skiver på standardforsøgsplader, og de angivne pH-værdier giver følgende resultater:

V. percolans S. gallinarum Alder AJCC 8461 MB 1287 pH

3 dage 22 mm 16 mm 6,1 4 dage 26 mm 18 mm 7,5

Efter fire dage indhøstes kolberne.

EKSEMPEL· 3

Rystekolbe-produktion af en blanding af antibiotikum 890A^ og 890A^

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril Davis-saltopløsning med følgende sammensætning:

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g k2hpo4 7,0 g KH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04-7H20 0,1 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af skråkulturer og plader af forskellige medier. Et naturligt isolat udvælges af en af disse plader og streges på en skråkultur af medium A med følgende sammensætning: 51 143712

Medium A

Dextrose 10,0 g

Pepton 5,0 g Gærekstrakt 3,0 g

NaCl 12,705 g EC1 0,72 g

PeS04(NH4)2S04-6H20 0,0351 g

MgCl2*6H20 5,52 g

CaCl2*2H20 0,728 g

Destilleret H20 1000 ml pH = 7,4 (før sterilisation)

Agar 25,0 g

Denne podede skråkultur dyrkes i 7 dage, og efter sporedannelsen fremstilles en sporesuspension med 0,8 ml steril Davis-saltopløs-ning. Pire skråkulturer af anden generation af Medium A podes fra denne suspension. De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 28°C og opbevares derefter ved 4 - 6°C indtil 14 dage senere.

Halvdelen af overfladevæksten af en af disse anden generations skråkulturer anvendes til dyrkning af luftede 250 ml koniske kolber indeholdende 50 ml af Medium B med følgende sammensætning;

Medium B

Gærautolysat (+Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g A Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04*7H20 50 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstillet på 6,5 med HCl eller NaOH

+Ardamin: Yeast Products Corporation 32 143712 ~*Phospha tpuf fer-opløsning eh2po4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Tre podekolber dyrkes til opnåelse af tilstrækkeligt podemateriale for tolv 2-liters produktionskolber. Podekolberne rystes en dag ved 28°C og 220 omdrejninger pr. minut i en ryster (5 cm slaglængde). Kolberne fjernes fra rysteren og opbevares i en dag ved 4°C. Indholdet af disse podekolber anvendes til podning af tolv 2-liters ikke-luftede koniske produktionskolber (8 ml podemateriale pr. kolbe) indeholdende 250 ml af produktionsmedium C med følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Hel formalet havre 20,0 g

Destilleret Hr>0 1000 ml pH-værdien indstilles på 7,0 med NaOH.

Efter podning dyrkes produktionskolbeme ved 28°C og omrystning i en 220 omdrejninger pr. minut-ryster (5 cm slaglængde) i 4 dage.

Efter dette tidsrum indhøstes kolberne, og materialet prøves for aktivitet ved hjælp af standard Salmonella gallinarum MB1287 og Yibrio percolans ATCC 8461 forsøgsplader, idet der anvendes 12,7 mm prøveskiver, dyppet i den centrifugerede væske.

Indhøstningsforsøg

Indhøstningsalder (timer) 96 pH 7,4

Salmonella gallinarum (mm zone) 23

Yibrio percolans ATCC 8461 (mm zone) 29 33 143712 Gæringsvæsken filtreres, og pH-værdien af filtratet indstilles på 7,7 - 7,0 med fortyndet saltsyre. 2,65 liter af dette filtrat adsorberes på en 135 ml IRA68 harpiks på chlorid-cyclus (en svagt "basisk tværbundet acrylpolymer-anionbytterharpiks, fremstillet af Rohm and Haas Co., Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvania) ved 20 ml/min., idet afløbet opsamles som en fraktion. Adsorbatet vaskes med 250 ml vand og elueres med 5# natriumchlorid, idet der opsamles 6 x 100 ml fraktioner. Alle fraktioner prøves over for Vibrio percolans ATCC 8461 og Salmonella gallinarum MB 1287, idet der anvendes skive-plade-metoden. Disse prøver viser, at eluatfraktioneme 1-3 indeholder 45$ af bioaktiviteten, som er påført harpiksen.

Eluatfraktioner 1-3 forenes til opnåelse af 310 ml opløsning.

Til denne opløsning sættes 15 g natriumchlorid, og opløsningen afkøles til 2°C, Den kolde opløsning indstilles på pH = 3,0 med saltsyre og ekstraheres umiddelbart med 150 ml n-butanol. Ekstraktionen gentages med yderligere to 150 ml portioner n-butanol. n-butanol-ekstrakteme ekstraheres tilbage i serie med 3 x 75 ml portioner vand. Under ekstraktionen opretholdes de vandige faser ved pH = 7 ved tilsætning af fortyndet natriumhydroxid. Alle fraktioner prøves over for Vibrio percolans ATCC 8461 og Salmonella gallinarum MB 1287, og resultaterne er angivet i efterfølgende som procent af udgangs-bioaktivitet:

Eraktion Udbytte

Tilførsel 100$

Forbrugt vand 12$

Forbrugt n-butylalkohol nr. 1 0 nr. 2 0 nr. 3 0

Vandig tilbage-ekstrakt nr. 1 25$ nr. 2 37$ nr. 3 5$

Den første og anden ekstrakt ved tilbageekstraktion frysetørres hver for sig. De frysetørrede stoffer forenes til opnåelse af 984 mg produkt.

34 143712 EKSEMPEL 4

Produktion af en blanding af antibiotikum 890A^ og 890A^

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril DaYis-saltopløsning med følgende sammensætning:

Pavis-salte

Natriumcitrat 0,5 g k2hpo4 7,0 g kh2po4 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04-7H20 0,1 g

Destilleret HgO 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af 4 skråkulturer af medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Dextrose 10,0 g

Pepton 5,0 g Gærekstrakt 3,0 g

NaOl 12,705 g KOI 0,72 g

PeS04(NH4)2S04-6H20 0,0351 g

MgCl2-6H20 5,32 g

CaCl2.2H20 0,728 g

Destilleret HgO 1000 ml pH = 7,4 (før sterilisation)

Agar 25,0 g

De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 27-28°C og opbevares ved 4-6°C, indtil de anvendes 10 dage senere. Halvdelen af overfladevæksten af en af disse skråkulturer anvendes til podning af 35 143712 luftede 25O ml koniske kolber indeholdende 50 ml medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Gærautolysat (+Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g A Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04-7H20 50 mg

Destilleret HgO 1000 ml

pH: indstillet på 6,5 med HC1 eller NaOH

+ Ardamin: Yeast Products Corporation i

Phosphatpuffer-opløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret HgO 1000 ml

Tre podekolher podes til opnåelse af tilstrækkeligt podemateriale for 12 to liter produktionskolher. Podekolherne rystes i en dag ved 28°0 i en ryster ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde). Kolberne fjernes fra rysteapparatet og opbevares i en dag ved 4°C. Indholdet af disse podekolber anvendes til podning af 12 to liter ikke-luftede koniske produktionskolber (7 ml podemateriale pr. kolbe) indeholdende 250 ml af produktionsmedium C med følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

Afioniseret H20 1000 ml pH indstilles på 7,5 med NaOH.

Efter podning dyrkes produktionskolbeme ved 24°C under omrystning i et rysteapparat ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i fire dage og fem timer. Efter dette tidsrum indhøstes 36 163712 kolberne, og materialet prøves for aktivitet ved anvendelse af Salmonella gallinarum. MB1287 og Vibrio percolans ATCC 8461 prøveplader med 12,7 mm prøveskiver, der er dyppet i den centrifugerede væske. Resultaterne fremgår af følgende tabel:

Prøver efter indhøstning

Indhøstningsalder (timer) 101 pH 7,1

Salmonella gallinarum (mm zone) 31

Vibrio pereolans (mm zone) 43

Permenteringsvæsken centrifugeres. Til det klare centrifugat på 2,2 liter ved pH = 6,8 sættes 22 mg (ethylendinitrilo)tetra-eddikesyre, og pH-værdien indstilles på 7,2. Dette centrifugat adsorberes på 150 ml Dowex 1x2 harpiks i Cl--cyclus ved 15 ml/min., idet afløbsstrømmen opsamles som én fraktion. Adsorbatet vaskes med 150 ml afionosieret vand indeholdende 10 yig/ml (ethylendini-trilo)tetraeddikesyre, og der elueres med 5$ NaCl indeholdende 10 pg/ml (ethylendinitrilo)tetraeddikesyre, idet der opsamles 5 x 75 ml fraktioner. Alle fraktioner prøves over for Vibrio pereolans, ATCC 8461, og resultaterne fremgår af efterfølgende tabel, angivet som procent af den oprindelige bioaktivitet:

Praktion Udbytte Pødeblanding 100$

Afløb 0 5$ NaCl-eluater fraktioner 2 til 4 75$

Vaskevand 1$

Halvtres ml af fraktion 3 af det 5$ NaCl-eluat indstilles på pH = 5,2 med fortyndet saltsyre og percoleres gennem en 100 ml kolonne af XAD-2, som er blevet vasket med fem kolonnerumfang 60$ vandig acetone (v/v), fem kolonnerumfang afioniseret vand og fem kolonnerumfang 5$ (w/v) NaCl-opløsning indeholdende 25 uM neutralt EDTA i afioniseret vand, og vasket med 5 kolonnerumfang afioniseret vand. Harpiksen udvikles med afioniseret vand indeholdende 10 pg/ml (ethyldinitrilo)tetraeddikesyre, idet der opsamles 2 x 25 37 143712 ml og 5 x 10 ml fraktioner, idet afløbet kontrolleres, Indtil det er negativt over for surt sølvnitrat. En negativ sølvnitrat-reaktion opnås efter opnåelse af den femte 10 ml fraktion. Udvikling med afioniseret vand fortsættes, indtil 4 x 100 ml fraktioner er opsamlet. Harpiksen udvikles med 60$ acetone-vand indeholdende 4 ^ig/ml (ethylendinitrilo)tetraeddikesyre, indtil 2 x 50 ml fraktioner er opsamlet. Alle fraktionerne prøves over for Vibrio percolans ATCC 8461, og resultaterne fremgår af det efterfølgende:

Prøve tilført Volumen, 50 ml Udbytte, 100$

Praktion 1 25 0 2 25 0 3 10 0 4 10 0 5 10 1 6 10 4,5 7 10 7 8 100 60 9 100 6 10 100 1 11 100 0 12 50 1 13 50 0

Praktion otte inddampes til 10 ml og frysetørres til opnåelse af 34,2 mg faste stoffer.

En 33,2 mg portion af de frysetørrede stoffer optages i 1,5 ml 1$ n-butanol-vand og påføres en kolonne af Bio-Gel P-2 (200 - 400 mesh) 1,4 x 81,5 cm, som forud er indstillet på ligevægt med 1$ n-butanol i vand. Gelen udvikles med samme opløsningsmiddel ved 1 ml/min., idet der opsamles 2 ml fraktioner. Hver fraktion 29 -46 prøves over for Vibrio percolans ATCC 8461. Bioaktiviteten forekommer i fraktionerne 36 til 44, idet der iagttages et maksimum i fraktion 39. Praktioneme 38 til 41 forenes og frysetør-res til opnåelse af 4,0 mg antibiotikum.

38 143712 EKSEMPEL 5

Rystekolbe-produktion af en blanding af antibiotikum 890A^ og 890A^

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flaTOgriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril Davis-saltopløsning med følgende sammensætning:

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g

KgHPO^ 7,0 g KH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04.7H20 0,1 g

Destilleret HgO 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Eiskemel 15,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: indstilles på 7,2 med NaOH

De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 27-28°C og opbevares derefter ved 4-6°C indtil anvendelsen.

En tredjedel af overfladevæksten fra to skråkulturer anvendes til podning af 6 luftede 250 ml koniske kolber indeholdende 50 ml medium B med følgende sammensætning:

Medium B

39 143712

Geerautolysat (+Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g A Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS0^-7H20 50 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles på 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamin: Yeast Products Corporation ^Phosphatpuffer-opløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret HgO 1000 ml

Kolben rystes i en dag ved 27-28°C i et rysteapparat ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde). Kolben og indholdet opbevares stationært i en dag ved 4°C.

22 to liter koniske produktionskolber, hver indeholdende 300 ml medium C, podes med 8 ml pr, kolbe af væksten fra podekolben.

Medium C har følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

Co012*6H20 5,0 mg

Destilleret H20 1000 ml pH: indstilles på 7,2 - 7,4 med NaOH,

Efter podning dyrkes produktionskolben ved 24°C under omrystning i et rysteapparat ved 212 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i fire dage og fem timer. Kolberne indhøstes og afprøves for aktivitet med Salmonella gallinarum MB1287 og Vibrio percolans ATCC 8461 med standardprøveplader under anvendelse af 12,7 mm 40 143712 prøveskiver dyppet i centrifugeret væske Prøverne fortyndes om fornødent med 0,02M phosphatpuffer, pH = 7,0. Resultaterne er angivet i efterfølgende tabel:

Indhøstningsalder timer 101 pH 7,1

Salmonella gallinarum (mm zone) 31

Yibrio percolans 1/10 fort.

(mm zone) 24,5 890 prøveenheder 46

Fire liter af den totale gæringsvæske, indeholdende 23 enh./ml afkøles til 3°0 og centrifugeres i 200 ml portioner ved 9000 om-drejninger pr. minut i 15 minutter hver. Til de forenede fracentrifugerede væsker (3,6 liter) sættes 1 ml 0,1M neutral EDTA og 10 ml Tris-HCl-puffer, pH = 7,5. Opløsningen af 0,1 OM neutral EDTA fremstilles ved opløsning af 0,1 mol dinatriumethylendiamin-tetraeddikesyre i 1 liter afioniseret vand, idet pH-værdien indstilles til 7 ved tilsætning af natriumhydroxid.

Den centrifugerede væske adsoberes på en kolonne af Dowex-1 x 2 (Cl-), 50-100 mesh, 5,1 cm x 20 cm dimensioner af laget, som forud er vasket med 1 liter afioniseret vand. Strømningshastigheden under påføringen er 50 - 80 ml pr. minut. Efter afslutning' af påføringen vaskes kolonnen med 500 ml afioniseret vand indeholdende 25 μΜ neutral EDTA, og derefter elueres med 1300 ml 5$

NaCl i afioniseret vand indeholdende 25 pM neutral EDTA. Ni fraktioner opsamles, idet der tælles fra første påføring af natrium-chloridopløsning. Fraktionerne 1 - 4 indeholder 100 - 115 ml pr. fraktion, og fraktionerne 5-9 indeholder 170 til 185 ml pr. fraktion. Fraktionerne prøves for bioaktivitet på plader af Salmonella gallinarum MB1287. Bioaktiviteten fremkommer i fraktioner 2 til 9 med et maksimum i fraktion 4 og 5.

Den ultraviolette absorption af passende fortyndinger af hver fraktion måles i et spektrofotometer af Gilford-model 2000, og forholdet mellem bioaktivitet til absorption ved 220 nm (-A^q) er beregnet for hver fraktion. Sådanne fraktioner med forhold mellem bio-aktivitet/A22Q større end halvdelen af maksimumværdien opsamles for yderligere behandling. På denne måde opsamles fraktionerne 41 143712 4 til 7, indeholdende 30# af den påførte bioaktivitet.

Det opsamlede natriumchlorideluat Inddampes til 100 ml under reduceret tryk, medens temperaturen holdes under 35°C under fordampningen.

Koncentratets pH-værdi indstilles på 5,2 ved tilsætning af 3 ml 1 molær saltsyre, og koncentratet påføres en kolonne af XAD-2 (3,5 cm i diameter og 57 em lang), som er vasket med 3 liter 60# vandig acetone (v/v), 3 liter afioniseret vand, 3 liter 5# (w/v) natrium-chloridopløsning indeholdende 25 pM neutral EDTA i afioniseret vand, og 1 liter mættet natriumchloridopløsning. Efter vaskningen overføres kolonnen til et koldt kammer, der opretholdes på 3°C, før koncentratet påføres.

Det påførte koncentrat henstilles til afdrypning, og de aktive fraktioner elueres med 1,3 liter 25 ^iM neutral EDTA afioniseret vand. Fraktioner på hver 10 ml opsamles, idet man tæller fra første påføring af koncentratet på kolonnen.

t

Hver femte fraktion prøves for bioaktivitet på plader af Salmonella gallinarum MB1287, og værdier for un^er anven delse af passende fortyndinger. Sådanne fraktioner med bioakti-vitet/A^ø forhold større end halvdelen af den maksimale værdi opsamles. Således opsamles fraktionerne 48 til 95, indeholdende 50# af den påførte aktivitet, hvilket repræsenterer 17# af aktiviteten af den filtrerede væske.

De opsamlede XAD-2 fraktioner inddampes til 50 ml og påføres en kolonne af Dowex-1 x 4 (Cl""), minus 400 mesh, med dimensioner af harpikslaget på 1,3 x 13 cm. Kolonnen skylles med 15 ml afioniseret vand og elueres med 400 ml 0,08M natriumchlorid plus 0,005M ammo-niumchlorid plus 0,0001M ammoniak i afioniseret vand. Eraktioner på hver 10 ml opsamles ved en strømningshastighed på 0,6 ml pr. minut. Aktivitet svarende til 100# af den påførte aktivitet elueres i fraktionerne 23 til 30, idet maksimum af aktivitet fås i fraktion 26. Fraktionerne 26 og 27 har det højeste forhold af absorption ved 300 nm til absorption ved 220 nm (A^Q/Ag^), og disse to fraktioner opsamles for afsaltning. Den totale aktivitet i 26 og 27 er 7390 enheder eller 59# af den påførte aktivitet.

42 143712

Til de opsamlede fraktioner 26 og 27 sættes 5 jfL 0,01M neutral EDTA.

De afkølede fraktioner inddampes ved roterende fordampning under reduceret tryk til 1,95 ml, og koncentratet påføres en kolonne af Bio-Gel P-2, 200 til 400 mesh med dimensioner af laget på 2,2 x 80 cm. Prøven vaskes med skylleportioner på 1 ml og 2 ml afioniseret vand og elueres derefter med afioniseret vand med en strømningshastighed på 0,7 ml pr. minut. Praktioner på 2,1 - 2,2 ml opsamles. Hovedtoppen af TJV-absorption findes i rørene 89 til 100 indeholdende 74$ af de påførte enheder, målt ved 300 nm (A^oo"en^e<3-er) · Fraktionerne 92 til 98 opsamles, koncentreres til 2 ml og lyophiliseres til opnåelse af produktet. Penne prøve indeholder 18,6 A^qq-enheder, der repræsenterer 5,8$ af bioaktiviteten indeholdt i udgangsvæsken. Fraktionerne 89 til 91 og 99 til 100 renses yderligere som angivet i eksempel 6.

EKSEMPEL· 6

Rystekolbe-produktion af antibiotikum 890A^

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril Davis-saltopløsning med følgende sammensætning:

Pavis-salte

Natriumcitrat 0,5 g k2hpo4 7,0 g EH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04.7H20 0,1 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af medium A med følgende sammensætning:

Medium A

43 143712

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Fiskemel 15,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: indstilles på 7,2 med NaOH

De podede skråkulturer inkuberes i en uge ved 27-28°C og opbevares derefter ved 4-6°C indtil anvendelsen.

En tredjedel af væksten fra tre skråkulturer anvendes til podning af 9 250 ml Erlenmeyer-kolber med bløde plader indeholdende 50 ml medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Gærautolysat (+Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g A Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04*7H20 50 mg

Destilleret Hr,0 1000 ml

pH: indstilles på 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamin: Yeast Products Corporation Él.

Phosphatpuffer-opløsning kh2po4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret HgO 1000 ml

Podekolben rystes 1 dag ved 27-28°C i et rysteapparat ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde). Kolbeindholdet opbevares stationært 1 dag ved 4°C.

33 to liter koniske produktionskolber, hver indeholdende 250 ml Medium C podes med 8 ml pr. kolbe af væksten fra podekolben.

Medium C

44 143712

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

OoClg'fiHgO 5,0 mg

Destilleret R^O 1000 ml

pH: indstilles på 7,2 - 7,4 med NaOH

Efter podning dyrkes produktionskorben ved 24°C under omrystning på et rysteapparat med 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i 4 dage. Kolberne indhøstes og prøves for aktivitet under anvendelse af standardprøveplader med Salmonella gallinarum MB1287 og Vibrio percolans ATCC 8461 ved hjælp af 12,7 mm prøveskiver, der er dyppet i den centrifugerede væske. Prøverne fortyndes om fornødent med 0,02M phosphatpuffer, pH = 7,0. Resultaterne fremgår af efterfølgende tabel:

Indhøstningsaider, timer 96 pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm zone) 29,5

Vibrio percolans 1/10 fort.

(mm zone) 31 890 prøveenheder 40

Syv liter af den totale gæringsvæske afkøles til 3°C og centrifugeres i 200 ml portioner ved 9000 omdrejninger pr. minut i 15 minutter hver.

Til de forenede fracentrifugerede væsker sættes 7 ml 0,1M neutral EDTA, og hele prøven adsorberes på en Dowex-1 x 2 (Cl”), 50-100 mesh kolonne, lag-dimensioner 5,1 x 25 cm, ved en strømningshastighed på 40 ml pr. minut. Kolonnen vaskes med 500 ml afioniseret vand indeholdende 5 ml 1M tris-HCl-puffer, pH = 7,0, og 25 jaM neutral EDTA. Det antibiotiske stof elueres med 1 liter afioniseret vand indeholdende 50 g natriumchlorid, og kolonnen vaskes 45 T43712 derefter med 300 ml afioniseret vand. Der opsamles fraktioner på 100 ml, idet man går ud fra den førBte fremkomst af salt i afløbet fra kolonnen. Bioaktiviteten viser sig i fraktionerne 1 til 10 med et maksimum i fraktion 2. Fraktionerne med højeste forhold for hioåktivitet/Aggo forenes. Således forenes fraktionerne 2 til 5 indeholdende 17$ af den påførte aktivitet.

De forenede fraktioner inddampes til 110 ml ved hjælp af en roterende fordamper under reduceret tryk, og pH-værdien indstilles på 5,8 ved tilsætning af 4,2 ml 1M saltsyre. Det indstillede koncentrat påføres en kolonne af XAD-2, lag-dimensioner 3,8 x 50 cm, som forud er "blevet vasket med 3 liter 60$ vandig acetone (v/v), efterfulgt af 3 liter afioniseret vand, 3 liter 5$ (w/v) natrium-chlorid og 1 liter 25$ (w/v) natriumchlorid i afioniseret vand.

Det påførte koncentrat afdryppes, det antibiotiske stof elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 15 ml/min.

22 fraktioner på hver 100 ml opsamles, idet der tælles fra første påføring af prøven. Bioaktiviteten viser sig i fraktionerne 6 til 22 med et maksimum i fraktionerne 9 og 10. Fraktioner med forhold mellem bioaktivitet/Aggg større end 0,3 gange maksimumværdien opsamles. Således forenes fraktionerne 9-20 til fortsat behandling. Til disse fraktioner sættes fraktionerne 89, 90, 91, 99 og 100 fra Bio-G-el P-2-kolonnen fra eksempel 5. Den opsamlede portion inddampes til 70 ml ved roterende fordampning under reduceret tryk.

Koncentratet adsorberes på en Dowex-1 x 4 (Cl“) minus 400 mesh kolonne med lag-dimensioner 2,2 x 27 cm. Kolonnen vaskes med 50 ml afioniseret vand, og det antibiotiske stof elueres med 2 liter 0,070M natriumchlorid + 0,005M ammoniumchlorid + 0,0001M ammoniak i afioniseret vand med en strømningshastighed på 2 ml pr. minut.

Der opsamles fraktioner på 9,5 ml.

Hovedtoppen af det antibiotiske stof elueres i fraktionerne 142 til 163. Fraktionerne 146 til 157 indeholdt stof med de største forhold A^Qg/Ag^Q, og disse forenedes til yderligere behandling.

De forenede fraktioner 146-157 inddampes til 3 ml ved roterende fordampning under reduceret tryk, og koncentratet indstilles på en 46 143712 pH-værdi på 6,5 ved tilsætning af 5 p. 1 1M ammoniak. Koncentratet påføres en kolonne (2,2 x 70 cm) af Bio-Gel P-2 (200-400 mesh), som er blevet vasket med 20 ml 5M natriumchlorid og 500 ml af ioniseret vand. Efter at koncentratet er afdryppet til niveau, påføres to skyllevæsker hver på 1 ml af afioniseret vand, og der henstilles til afdrypning. Kolonnen elueres derefter med afioniseret vand med en strømningshastighed på 0,6 ml pr, minut. Der opsamles fraktioner på 2,9 ml.

Hovedtoppen af det antibiotiske stof elueres i fraktionerne 63 til 70. Eraktionerne 64 og 65 har det højeste forhold A^qq/A^q og opsamles for yderligere oparbejdning. Disse to fraktioner indeholder 44$ af UY-absorptionen ved 300 nm, som er påført Bio-Gel P-2 kolonnen.

De forenede fraktioner 64 og 65 underkastes roterende fordampning under reduceret tryk til 2 ml og bliver derefter frosset og lyo-philiseret i en 14 ml med skruelåg forsynet ampul i 8 timer til opnåelse af 2,25 mg i det væsentlige rent antibiotikum 890A^ (45,5 A500-enheder).

EKSEMPEL· 7

Rystekolbeproduktion af antibiotikum 890A^

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril Davis-saltopløsning med følgende sammensætning:

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g K2HP04 7,0 g KH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04-7H20 0,1 g

Destilleret H20 1000 ml 47 143712

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Piskemel 15,0 g

Destilleret B^O 1000 ml

Agar 20,0 g

pH: indstilles på 7,2 med NaOH

De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 27-28°C og opbevares derefter ved 4-6 °C inden anvendelsestidspunktet (ikke længere end 21 dage).

En tredjedel af væksten fra fire skråkulturer anvendes til podning af 12 luftede 250 ml koniske kolber indeholdende 50 medium B med følgende sammensætning:

Medium B

Gærautolysat (+Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g k Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04-7H20 50 mg

Destilleret H20 1000 ml

pH: indstilles på 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamin: Yeast Products Corporation ^Phosphatpuffer-opløsning KH2P04 , 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret Hr>0 1000 ml 48 H8712

Podekolberne rystes i en dag ved 27-28°C i et rysteapparat med 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde). Kolben og indholdet op bevares stationært i en dag ved 4°C.

44 2-liter koniske produktionskolber, hver indeholdende 200 ml medium C, podes med 8 ml pr. kolbe af væksten fra podekolben.

Medium C har følgende sammensætning:

Medium 0

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl2*6H20 5,0 mg

Destilleret HgO 1000 ml pH: indstilles på 7,2 - 7,4 med NaOH.

Efter podning dyrkes produktionskolbeme ved 24°0 under omrystning i et rysteapparat med 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i 4 dage og 5 timer. Kolberne indhøstes og afprøves for aktivitet ved hjælp af Salmonella gallinarum MB1287 og Vibrio percolans ATGO 8461 på forsøgsplader med 12,7 mm prøveskiver, der er dyppet i centrifugeret væske. Prøverne fortyndes om fornødent med 0,02M phosphatpuffer, pH = 7,0. Resultaterne er anført i efterfølgende tabel:

Indhøstningsalder, timer 101 pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm zone) 55

Vibrio percolans 1/10 fort.

(mm zone) 54 890 prøveenheder 121 I alt 7,0 liter af den ved denne gæring opnåede gæringsvæske afkøles til 3°C og centrifugeres i 200 ml portioner ved 9.000 omdrejninger i 15 minutter hver for sig. Til den forenede fracentrifugerede væske sættes 1,7 ml 0,1M neutral EDTA, og portionen opretholdes ved 3°C.

49 143712

Ovennævnte gæring gentages under samme "betingelser med undtagelse af, at 44 2-liter koniske produktionskolber dyrkes med 7 ml pr. kolbe af væsken fra podekolben. pH-værdien og forsøgsresultaterne er anført i det efterfølgende:

Indhøstningsalder, timer 101 pH 7,3

Salmonella gallinarum (mm zone) 38

Vibrio percolans 1/10 fort.

(mm zone) 39 890 prøveenbeder 92,8 I alt 7,4 liter af den således dannede gæringsvæske afkøles til 3°C og centrifugeres i 200 ml portioner ved 9000 omdrejninger pr. minut i hver 15 minutter. Til den forenede ovenstående væske sættes 1,8 ml 0,1M neutral EDTA.

Den ovenstående væske fra centrifugeret gæringsvæske fra de to ovennævnte gæringer i dette eksempel kombineres til et totalt rumfang på 13 liter, og en aktivitet på 80 enheder pr. ml ved prøve på Vibrio percolans ATCC 8461.

Den forenede ovenstående væske føres gennem en kolonne af Dowex-1 x 2 (01"), 50-100 mesh, med lag-dimensioner 4,7 cm x 50 cm og en strømningshastighed på 60 ml pr. minut. Kolonnen vaskes med 1 liter afioniseret vand, og det antibiotiske stof elueres med 5 liter 5# (w/v) natriumchloridopløsning indeholdende 0,1M tris-HCl-puffer, pH = 7,0, og 25 uM neutral EDTA. Eraktioner på 220 ml opsamles ved en strømningshastighed på 60 ml pr. minut, og fraktionerne prøves på plader med Salmonella gallinarum MB1287.

Antibiotisk aktivitet påvises i fraktionerne 3 til 26 med et maksimum i fraktionerne 5 og 6. Fraktionerne 5 til 9 har det højeste forhold for bioaktivitet/A22o> °& disse fraktioner forenes til fortsat behandling. pH-værdien af de opsamlede fraktioner er 7,8, og de indeholder 24# af den oprindelige bioaktivitet, målt på plader med Salmonella gallinarum MB1287.

50 143712

De forenede fraktioner 5 til 9 koncentreres til 150 ml Ted roterende afdampning under reduceret tryk og påføres en kolonne (4»9 cm x 47 cm lag-dimensioner) af XAD-2, som er blevet vasket med 5 liter 60$ (v/v) vandig acetone efterfulgt af 5 liter afioniseret vand og 5 liter 50 g/liter natriumchlorid i afioniseret vand.

Prøven påføres i 20 ml portioner, idet kolonnen henstilles til afdrypning hver gang. Efter at tilførselen er afsluttet, indføres tre 20 ml portioner afioniseret vand under afdrypning til laget hver gang. Prøven elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 20 ml pr. minut. Alle operationerne med XAD-kolonnen udføres ved stuetemperatur (24°0), og de eluerede fraktioner afkøles hurtigt på isbad straks efter opsamlingen. Praktioner på 95 til 230 ml opsamles.

Den antibiotiske aktivitet viser sig i fraktionerne 2 til 21, målt ved prøve på plader med Salmonella gallinarum MB1287, med et maksimum i fraktionerne 5 til 7 (omfattende 510 til 895 ml elueret rumfang, beregnet fra første tilførsel af afioniseret vand). Fraktionerne 6 til 21 opsamles, hvilke fraktioner har et forhold af bioaktivitet/AggQ inden for 50$ af den observerede maksimumværdi.

Den totale bioaktivitet, som blev udvundet, er 280.000 enheder, hvilket er 112$ af den tilsyneladende påførte aktivitet.

De opsamlede fraktioner 6 til 21 inddampes til 68 ml véd roterende inddampning under reduceret tryk, og derefter fortyndes de til 112 ml ved tilsætning af afioniseret vand. Koncentratet påføres en kolonne (2,2 cm x 21 cm lag-dimensioner) af Dowex-1 x 4 (Cl”) minus 400 mesh. Kolonnen vaskes med 20 ml afioniseret vand, og det antibiotiske stof elueres med 2 liter 0,07M natriumchlorid + 0,005M ammoniumchlorid + 0,0001M ammoniak i afioniseret vand, ved en strømningshastighed på 1,6 ml pr. minut. Fraktioner på hver 8 ml opsamles.

Hovedtoppen for absorption ved 300 nm viser sig i fraktionerne 155 til 182 med et maksimum ved fraktion 162. Fraktionerne 157 til 179 med største forhold for absorption ved 300 nm til absorption ved 245 nm forenes for yderligere behandling. De forenede fraktioner har totalt 780 absorptionsenheder ved 300 nm.

5i 143712

Oisse opsamlede fraktioner inddampes ved roterende inddampning under reduceret tryk til 7 ml, og pH-værdien indstilles til 7,5 ved tilsætning af 20 ul 1M natriumhydroxid. Opløsningen inddampes yderligere til 5 mm og påføres en kolonne (2,2 x 75 cm) af Bio-Gel P-2, 200-400 mesh. Prøven vaskes i kolonelaget med to skylninger på hver 1 ml afioniseret vand, hvorefter der elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 0,6 ml pr. minut.

Ti fraktioner på 3,3 ml efterfulgt af 60 fraktioner på 2,65 ml og ti fraktioner på 2,0 ml opsamles.

Hovedtoppen for absorption ved 500 nm fremkommer i fraktionerne 60 til 68. pH-værdien af disse fraktioner indstilles på 7,5 til 8,0 ved tilsætning af 1,5 til 2,5 pi 0,1M natriumhydroxid.

Praktionerne 62, 63, 64 og 65 fryses og lyophiliseres hver for sig i 14 ml glasampuller og opbevares ved -20°C under vakuum. Disse fire fraktioner indeholder i alt 606 absorptionsenheder ved 300 nm.

Por at isolere antibiotikum 890A^befriet for QQOk·^ udnyttes den forholdsvis højere bestandighed af antibiotikum 890A^ mod nedbrydning med penicillinase på følgende måde:

Bio-Gel-fraktionen 63 forenes med fraktionerne 61, 66 og 67 fra Bio-Gel-kolonnen. Disse fire forenede fraktioner indeholder i alt 235 absorptionsenheder ved 300 nm. Hertil sættes 0,2 ml 1M tris-HCl-puffer, pH = 7,5, og 0,2 ml penicillinase [Difco "Bacto-Penase", indeholdende 500.000 enheder pr. ml (1000 LTJ/ml), hvor udtrykket LU referer til levy-enheder; 1.000 LU vil inaktivere 500.000 enheder penicillin G]. Efter 113 minutter ved 23°C tilsættes yderligere 0,2 ml penicillinase. Efter yderligere 7 timer ved stuetemperatur tilsættes yderligere 0,2 ml penicilinase, og efter yderligere 2 timer ved stuetemperatur afkøles reaktionsblandingen på isbad. Den afbrudte reaktionsblanding fortyndes til 15 ml ved tilsætning af 0,5 ml afioniseret vand. Absorptionen af det fortyndede omsatte præparat er 6,3 ved 300 nm, hvoraf 2,64 er ud-slukkelig ved omsætning med cystein.

Reaktionsblandingen adsorberes på en kolonne af Dowex-1 x 4 (Cl-) minus 400 mesh, lag-dimensioner 2,15 x 40 cm. Antibiotikum 890A7) 52 143712 elueres med 0,07M natriumchlorid + 0,005M ammoniumchlorid + 0,0001M ammoniak i afioniseret vand ved en strømningshastighed på 3 ml pr. minut. Der opsamles fraktioner på hver 13,8 ml.

Hovedtoppen med absorption ved 300 nm påvises i fraktionerne 185 til 203. Fraktionerne 187 til 200 har det højeste forhold Å300^245 kombineres for yderligere behandling. De forenede fraktioner har i alt 31 Å^QQ-enheder.

De forenede fraktioner koncentreres til 4 ml ved roterende fordampning under reduceret tryk, og koncentratet påføres en kolonne (2,2 x 70 cm) af Bio-Gel P-2, 200-400 mesh. Det antibiotiske stof 890A^ elueres med afioniseret vand ved en strømningshastighed på 0,6 ml pr. minut. Tredive fraktioner 3,3 ml efterfulgt af 50 fraktioner 2,65 ml opsamles.

Hovedtoppen for absorption ved 300 nm påvises i fraktionerne 64 til 74 med et maksimum i fraktion 70. Fraktionerne 66 til 70 forenes, og disse indeholder 19 A^QQ-enheder eller 61 fy> af de påførte enheder. De samlede prøver inddampes til 1,5 ml ved roterende afdampning under reduceret tryk, og koncentratet fryses og lyophiliseres til dannelse af 5,4 mg fast stof indeholdende antibiotikum 890A^ plus resterende salte.

EKSEMPEL· 8

Præparation af antibiotikum 890A^ og 890A^

Et rør med lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8139 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 0,8 ml steril Davis-saltopløsning med følgende sammensætning:

Davis-salte

Natriumcitrat 0,5 g K2HP04 7,0 g KH2P04 3,0 g (nh4)2so4 1,0 g

MgS04*7H20 0,1 g

Destilleret ftp 1000 ml 53 143712

Denne suspension anvendes til podning af fire skråkulturer af medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Glycerol 20,0 g

Primær gær 5,0 g

Piskemel 15,0 g

Destilleret HgO 1000 ml

Agar 20,0 g pH: indstilles på 7,2 med NaOH.

De podede skråkulturer dyrkes i en uge ved 27-28°C og opbevares herefter ved 4-6°C, indtil de anvendes (ikke mere end 21 dage).

Ti ml medium B med sammensætningen:

Medium B

Gærautolysat (+Ardamin) 10,0 g

Glucose 10,0 g A Phosphatpuffer 2,0 ml

MgS04»7H20 50 mg

Destilleret H2o 1000 ml

pH: indstilles på 6,5 med HC1 eller NaOH

+Ardamin: Yeast Products Corporation *Phosphatpuffer-opløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret HgO 1000 ml overføres aseptisk til en af disse skråkulturer, sporer og luftmycelium skrabes til suspension, og 3,5 ml af denne suspension anvendes til podning af 2 liter koniske luftede kolber indeholdende 500 ml medium B. Denne podekolbe rystes ved 28°C i et rysteapparat med 160 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i 36 timer, 54 U3712 hvorved der fremkommer en tilfredsstillende vækst.

Væksten fra denne podekolbe anvendes til podning af en 189 liter podetank af rustfrit stål indeholdende 160 liter medium B. Denne tank drives ved 28°C, idet der omrøres med en hastighed på 150 omdrejninger pr. minut og en luftgennemstrømning på 85 liter pr. minut i 24 timer. Om fornødent tilsættes antiskummemiddel, Polyglyeol 2000 (Dow Chemical Corp.), som ikke må overskride 0,1$. pH-værdierne er som følger:

Alder, timer 0 12 pH 6,3 6,55 43 liter af væksten fra denne podetank anvendes til podning af en 756 liter gæringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 467 liter medium C med følgende sammensætning:

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

CoCl2*6H20 5,0 mg

Destilleret H20 1000 ml pH: indstilles på 7,2 - 7,4 med NaOH.

Denne tank drives ved 25°C, idet der omrøres med en hastighed af 146 omdrejninger pr. minut og en luftgennemstrømning på 254 liter pr. minut i 92 timer. Om fornødent tilsættes yderligere antiskummemiddel, Polyglyeol 2000, dog ikke over 0,1 $. Der udføres anti-bakterielle prøver på Salmonella gallinarum MB1287, Vibrio percolans ATCC 8461,og data er følgende:

Alder, timer 0 12 24 56 48 60 72 84 92 pH 6,6 6,7 6,65 6,3 6,0 6,4 6,15 6,5 6,5 MB-1287 mm — — — S — 19 26 28 32 ATCC 8461 mm (1-10) — — — S — 21 24 26 30 890A enh./ml NA NA 6,8 13,5 24,9 24,3 55 143712

De 890A enh./ml er "bestemt som anført i sektionen med overskriften "II. Prøveprocedure for bestemmelse af '890 prøveenheder.

475 liter gæringsvæske afkøles til 5°C og centrifugeres gennem en Titan P-9 centrifuge. 23 kg Celite sættes til 370 liter centrifugeret væske, og suspensionen filtreres gennem en Shriver 45 cm filterpresse. De 345 liter filtrat adsorberes på en kolonne indeholdende 26,5 liter Dowex-1 x 2 (Cl”), 50-100 mesh, og kolonnen vaskes med 38 liter afioniseret vand.. Blandingen af antibiotikum 890A1 og 890A^ elueres med 114 liter 5$ natriumchlorid + 0,01M tris-HCl-puffer, pH = 7,0 + 25 pM neutral EDTA i afioniseret vand. Praktioner på hver 19 liter opsamles. Blandingen af antibiotikum 890A^ og 890A^ fremkommer i fraktionerne 3 til 6 med maksimumaktivitet i fraktionerne 4 og 5. Fraktionerne 4, 5 og 6 indeholdende 8# af aktiviteten af den filtrerede væske forenes og inddampes under reduceret tryk til 7,6 liter.

De 7,6 liter koncentrat påføres en kolonne indeholdende 38 liter XAD-2, som forud er vasket med 190 liter 60# vandig acetone efterfulgt af 190 liter afioniseret vand og 190 liter 5# natriumchlorid-opløsning. Koncentratet elueres med 142 liter afioniseret vand.

Tre fraktioner på 9,5 liter efterfulgt af seks fraktioner på 19 liter opsamles. Aktiviteten fremkommer i fraktionerne 1 til 6 med maksimal aktivitet i fraktion 3. Praktionerne 4 og 5 indeholdende 64# af den på kolonnen påførte aktivitet eller 370.000 enheder opsamles.

Fraktionerne 4 og 5 inddampes til 120 ml under reduceret tryk. pH-værdien indstilles på 6,5, og koncentratet påføres en kolonne (7 x 50 cm) af XAD-2, som er vasket med 8 liter 60# vandig acetone efterfulgt af 4 liter afioniseret vand og 8 liter 5# natriumchlorid i afioniseret vand. Prøven afdryppes til lagets niveau, og kolonnen skylles med tre 20 ml portioner afioniseret vand, idet der afdryppes til lagets niveau hver gang. Det antibiotiske stof elueres derefter med 7 liter afioniseret vand med en strømningshastighed på 40 ml pr. minut. Otte fraktioner på 200 ml efterfulgt af 14 fraktioner på 400 ml opsamles. Den antibiotiske aktivitet viser sig i fraktionerne 4 til 19 indeholdende 77 # af den på kolonnen anførte bioaktivitet (målt med Salmonella gallinarum MB1287), med et maksimum af aktivitet i fraktionerne 6 til 8.

56 143712

Forholdet mellem biaaktiviteten af fraktionerne på Vibrio percolans A1CC 8461 og HAEA^qq for fraktionerne er bestemt. Fraktioner, som udviser et forhold på cirka 250, angiver tilstedeværelsen af antibiotikum 890A.J, og de fraktioner med et forhold på cirka 31 angiver tilstedeværelsen af antibiotikum 890A^. I overensstemmelse hermed bliver fraktionerne 7, 8 og 9, der hovedsagelig indeholder antibiotikum 890A^, forenet og behandlet videre som angivet i det efterfølgende under overskriften a) Rensning af antibiotikum 890Å1· Fraktionerne 10, 11, 12 og 13, der hovedsagelig indeholder antibiotikum 890A^, forenes og behandles videre som anført i det efterfølgende under overskriften b) Rensning af antibiotikum 89OA3.

a) Rensning af antibiotikum 890A^

De kombinerede fraktioner 7, 8 og 9 fra den anden ZAD-2 kolonne indeholdende 480 hydroxylamin-udslukkelige absorptionsenheder ved 300 nm inddampes til 100 ml under reduceret tryk. Prøven påføres en kolonne af Dowex-1 x 4 (Cl”) -400 mesh harpiks, lag-dimensioner 2,15 x 40 cm, og elueres med 4 liter 0,075M ammoniumchlo-rid + 0,001M ammoniak i afioniseret vand. Fraktioner på hver 12 ml opsamles med en strømningshastighed på 2 ml pr0 minut.

Den antibiotiske aktivitet, bestemt ved prøve på Salmonella galli-narum MB1287, fremkommer i fraktionerne 119 til 146, med et maksimum i fraktionerne 134 til 140. Den ultraviolette absorption ved 300 nm, 245 nm og 220 nm er målt for hver tredje fraktion i området for bioaktivitet, og hydroxylamin-udslukkelig absorption ved 300 nm er målt for flere fraktioner på hver side af toppen. Fraktionerne 129 til 141, som har det højeste forhold af hydroxylamin-udslukkelig 300 nm absorption til UV-absorption ved 220 nm, forenes.

De forenede fraktioner 129 til 141 koncentreres til 4 ml, og 0,1 ml 1M ammoniak tilsættes. Koncentratet påføres en kolonne af Bio-Gel P-2, 200-400 mesh, med lag-dimensioner 2,2 x 70 cm, og elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 1 ml pr. minut. Fraktioner på 3,1 ml hver opsamles.

57 143712

Hovedtoppen fra UY-absorption ved 300 nm fremkommer i fraktionerne 40 til 47. Fraktionerne 42, 43 og 44 har det højeste forhold af hydroxylamin-udslukkelig 300 nm absorption til UY-absorption ved 220 nm, og disse forenes. Disse kombinerede fraktioner indeholder 1 alt 207 absorptionsenheder ved 300 nm, hvoraf 133,4 er hydroxylamin-udslukkelig, svarende til et udbytte på 44$ af den påførte hydroxylamin-udslukkelig absorption.

De forenede Bio-Gel P-2 fraktioner fortyndes med samme rumfang methanol og påføres en kolonne af Dowex-1 x 2 (Cl”) minus 400 mesh, lag-dimensioner 2,15 cm x 40 cm, som forud er bragt på ligevægt med 50$ (v/v) methanol. Det antibiotiske stof elueres med 2 liter 0,065M ammoniumchlorid + 0,001M ammoniak i 50$ methanol ved en strømningshastighed på 2 ml pr. minut. Fraktioner på 12,5 ml opsamles.

Hovedtoppen for absorption ved 300 nm fremkommer i fraktionerne 59 til 72. Fraktionerne 62 til 68 har det højeste forhold -^-30(/^245 ’ og disse forenes. De kombinerede fraktioner indeholder 93,7 absorptionsenheder ved 300 nm, hvoraf, 76,3 er hydroxylamin-udslukkelig. Dette repræsenterer et udbytte på 57$ af den påførte hydroxylamin-udslukkelige absorption i maksimumfraktionerne.

De samlede fraktioner inddampes til 3,4 nil ved roterende fordampning under reduceret tryk, og 100μ11Μ ammoniak tilsættes. Det indstillede koncentrat påføres en kolonne (2,15 cm x 70 cm) Se-phadex G-10, som forud er vasket med 20 ml mættet natriumchlorid-opløsning og 20 ml 12$ ammoniumchlorid og derefter med 500 ml afioniseret vand. Prøven elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 2,15 ml pr. minut. Fire fraktioner på 10,3 ml efterfulgt af 56 fraktioner på 3,23 ml opsamles. Den første top af ultraviolet absorption ved 300 nm indeholdende det afsaltede antibiotikum 890A1 fremkommer i fraktionerne 25 til 47. Fraktionerne 28 til 41 forenes, og pH-værdien måles til 3,5. pH-værdien indstilles på 7,3 ved tilsætning af 8 μΐ 1M ammoniakopløsning. De samlede fraktioner indeholder 28 absorptionsenheder ved 300 nm, hvoraf 18 er hydroxylamin-udslukkelig.

lo ml af disse kombinerede fraktioner udtages som reference, og resten inddampes til 2,0 ml. pH-værdien af koncentratet indstilles på 7,4 ved tilsætning af 0,7 μΐ 1M ammoniakopløsning.

143712 58

Halvtres mikroliter af koncentratet udtages, og resten fryses og lyophiliseres i en 14 ml glasampul til opnåelse af 4»32 mg fast stof indelioldende antibiotikum 890Å^ plus resterende salte.

b) Rensning af antibiotikum 8901^

De kombinerede fraktioner 10 til 13 opnået fra den anden XAD-2 kolonne inddampes til 40 ml og påføres en kolonne (2,15 cm x 40 cm lag-dimensioner) af Dowex-1 x 4 (Cl”) minus 400 mesh. Det antibiotiske stof elueres med 3 liter 0,075M ammoniumchlorid og 0,001M ammoniak i afioniseret vand ved en strømningshastighed på 3 ml pr. minut. Fraktioner på 9 ml opsamles. Den antibiotiske aktivitet, prøvet med Tibrio percolans ATCC 8461, fremkommer i fraktionerne 165 til 234, idet der findes maksimal aktivitet i fraktionerne 195 "til 201.

Fraktionerne 186 til 213 forenes, indeholdende i alt 472 A^qq-enheder, hvoraf 312 er udslukkelig ved omsætning med hydroxylamin.

Disse kombinerede fraktioner inddampes til 4,2 ml ved roterende afdampning under reduceret tryk. Koncentratet påføres en kolonne af Bio-Gel P-2 (200-400 mesh) med lag-dimensioner på 2,15 x 60 cm. Prøven henstilles til afdrypning til lag-niveau, og to skylninger på hver 1 ml afioniseret vand påføres og afdryppes. Kolonnen elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 1 ml.pr. minut, idet der opsamles fraktioner på hver 2,6 ml.

Antibiotikum 890A^ elueres i fraktioner 38 til 48 med et maksimum ved fraktion 41, bestemt ved hydroxylamin-udslukkelig absorption ved 300 nm. Fraktionerne 40 til 43 opsamles, indeholdende 260 k300”enke(^er» hvoraf 173 er hydroxylamin-udslukkelig.

Til fjernelse af resterende forurening af antibiotikum 890A^ med antibiotikum 890A^ behandles de forenede afsaltede fraktioner 40 til 43 med 50 ul penicillinase [Difco "Bacto-Penase" indeholdende • 500.000 enheder pr. ml (1000 ITJ/ml, hvor udtrykket 1U refererer til Devy-enheder; 1.000 ITJ vil inaktivere 500.000 enheder peni cillin G)] og 0,1 ml 1M tris-HCl-puffer, pH = 7,5. Reaktionen 59 143712 "bringes til at forløfte ved 23°C i 6 timer, og derpå tilsættes 15 ml afioniseret vand og 15 ml methanol. Denne tlanding påføres en kolonne (2,15 x 44 cm lag-dimensioner) af Dowex-1 x 2 (Cl-) minus 400 mesh, som er pakket i 50$ methanol og vasket med to liter 50$ (v/v) methanol. Antibiotikum 890A^ elueres med to liter 0,05M natriumchlorid + 0,005M ammoniumchlorid + 0,0001M ammoniak i 50$ methanol. Fraktioner på 9,2 ml opsamles. Hovedtoppen for UY-aftsorption, målt ved 300 nm, fremkommer i fraktionerne 74 til 88. Fraktionerne 78 til 85 opsamles. De totale absorptionsenhe-der ved 300 nm i disse fraktioner efter fjernelse af methanolen ved afdampning under reduceret tryk er 97,6, hvoraf 87,5 er ud-slukkelig ved omsætning med hydroxylamin.

De samlede fraktioner 78 til 85 inddampes til 3,92 ml ved roterende afdampning under reduceret tryk, og koncentratet påføres en kolonne af Sephadex G—10 (2,15 x 70 cm lag-dimensioner), som er vasket med 4 ml 4M ammoniak, efterfulgt af ligevægt med 0,15mM ammoniak i afioniseret vand. Efter to vaskninger med hver 1 ml 0,02 mM ammoniak elueres antibiotikum 890A^ med 0,02mM ammoniak ved en strømningshastighed på 0,8 ml pr. minut. 49 fraktioner på 2,45 ml efterfulgt af 20 fraktioner på 3,33 ml opsamles. Hovedtoppen for absorption ved 300 nm fremkommer i fraktionerne 35 til 53. Fraktionerne 38 til 46 med største A^QQ/^^-værdier forenes for yderligere behandling. De forenede fraktioner har i alt 65 aftsorp-tionsenheder ved 300 nm. De opsamlede fraktioner underkastes roterende fordampning under reduceret tryk til 2,84 ml og opdeles i to lige store portioner, som hurtigt fryses og lyophiliseres separat i 14 ml glasampuller til opnåelse af antibiotikum 890A^.

Den ene prøve indeholder 32,0 A^QQ-enheder i 0,88 mg, og den anden indeholder 31,9 A^0Q-enheder i 0,82 mg. Den første prøve indeholdende 32,0 A^QQ-enheder blev underkastet NMR-analyse og udviste følgende toppe: 1,29 (d, J= 6,5); 1,98 (s); 3,42 (d af d, J= 5 og J= 2,4); /✓4,01 - 4,28 (m); 3,14 (d af d, J= 5 og J= 9); 3,39 (t, J= 6,5); 2,92 (d af t, J=^4 og J= 6).

60 143712

Ovennævnte tabel angiver 100 mHz-NMR-signaler for 890A^-natrium-saltet i D^O i forhold til den indre standard DSS; kemisk skift er givet i ppm og koblingskonstanter i Hz; tilsyneladende multi-plicitet er angivet, EKSEMPEL· 9

Rystekolbe-produktion af antibiotikum 890A.J

Et rør af lyophiliseret kultur af Streptomyces flavogriseus NRRL 8140 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i et rør indeholdende 1,5 ml steril medium A med følgende sammensætning:

Medium A

Gærekstrakt 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgS04.7H20 0,05 g A Phosphatpuffer 2 ml

Destilleret HgO 1000 ml

Ar ÆPhos~phatpuf fer-opløsning KH2P04 91,0 g

Na2HP04 95,0 g

Destilleret H20 1000 ml

Denne suspension anvendes til at pode en 250 ml tredobbelt luftet konisk podekolbe indeholdende 54 ml podemedium B med følgende sammensætning:

Medium B

Autolyseret gær (Ardamin+) 10,0 g

Glucose 10,0 g

MgS04-7H20 0,05 g A Phosphatpuffer' 2 ml

Destilleret H20 1000 ml 61 143712

Podekolben tilproppes med vat og rystes 1 30 timer ved 28°C - 1°C i et gyrotorisk rysteapparat ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde).

50 250 ml ikke-luftede koniske produktionekorber, hver indeholdende 40 ml produktionsmedium 0 podes med 1 ml pr. kolbe af væsken fra podekolben. Produktionsflaskerne tilproppes med vat.

Medium C

Tomatpasta 20,0 g

Primær gær 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g ΟοΟ^^δ^Ο 5,0 mg

Destillereet HgO 1000 ml pH: indstilles på 7,2 - 7,4 med NaOH.

Efter podning dyrkes produktionskolbeme ved 28°C - 1°C under rystning i et gyrotorisk rysteapparat ved 220 omdrejninger pr. minut (5 cm slaglængde) i 3 dage. Kolberne prøves for aktivitet over for standard Vibrio percolans ATCC 8461 prøveplader med 12,7 ml prøveskiver, der er dyppet i centrifugeret gæringsvæske. Prøverne fortyndes med 0,05M phosphatpuffer, pH = 7,4. Resultaterne er anført i efterfølgende tabel:

Indhøstet alder, timer 72 pH 6,4

Vibrio percolans (1/100 fortynding) prøve 23 mm 890 prøve, enh./ml 103

De 890A enh./ml er bestemt som angivet i sektionen med overskriften "II, Prøveprocedure for bestemmelse af '890 prøveenheder1",

Den totale gæringsvæske centrifugeres i 200 ml portioner i poly-carbonat-flasker ved 9000 omdrejninger pr. minut i 15 minutter til opnåelse af 1600 ml kombineret fracentrifugeret væske med en aktivitet på 104 enheder/ml. Hertil sættes 0,5 ml neutral EDTA.

62 143712

Den centrifugerede væske adsorberes på en kolonne af Dowex-1 x 2 (01")·, 50-100 mesh, med lag-dimensioner 3,8 x 22 cm, idet der anvendes en strømningshastighed på 6 til 20 ml/min. Kolonnen skylles med 100 ml afioniseret vand og elueres med 1 liter afioniseret vand indeholdende 50 g natriumchlorid, 0,02M tris-HCl-puf-fer, pH =7,0, og 25 μΜ neutral EDTA, ved en strømningshastighed på 6 ml/min. Der opsamles fraktioner på 10 ml.

Antibiotikum. 890A^ optræder i fraktionerne 13 til 81 med maksimum i fraktionerne 25 til 33, regnet fra første tilførsel af salt-eluat. fraktionerne 24 til 41, der har det højeste forhold bio-aktivitet/A22Q> forenes for yderligere behandling. De forenede fraktioner har i alt 29.000 enheder eller 17$ af den påførte bioaktivitet.

Dowex-eluatet inddampes til 10 ml, pH-værdien indstilles på 6,5 med fortyndet saltsyre, og koncentratet påføres en kolonne af XAD-2, lag-dimensfoner 3,3 x 36 cm, som forud e’r vasket med 2 liter hver af 60$ vandig acetone, afioniseret vand og 5$ (w/v) natriumchlorid i afioniseret vand. Prøven elueres med afioniseret vand med en strømningshastighed på 6 ml/min. Der opsamles fraktioner på 40 til 260 ml.

Antibiotisk aktivitet optræder i fraktionerne 6 til 14, der repræsenterer .fra 220 til 2560 ml af elueret rumfang. Toppen fremkommer i fraktionerne 9 og 10, svarende til 370 til 590 ml elueret rumfang« fraktionerne 9 til 12, svarende til 370 til 1060 ml elueret rumfang har det højeste forhold for ΗΑΕΑ,,φφΛΑ^ο °§ disse forenes til fortsat behandling. Disse fraktioner har 36.600 enheder, lig med 126$ af den tilsyneladende påførte aktivitet.

De forenede fraktioner 9 til 12 indampes til 100 ml, og koncentratet påføres en kolonne af Dowex-1 x 4 (01”), minus 400 mesh, lagdimensioner 2,2 x 41 cm, ved en strømningshastighed på 2 ml/min. Kolonnen skylles med 50 ml afioniseret vand og elueres med 3 liter 0,07M natriumchlorid + 0,005M ammoniumchlorid + 0,0001M ammoniak i afioniseret vand med en strømningshastighed på 2 ml/min. fraktioner på 10,8 ml opsamles, begyndende fra første påføring af eluat.

63 U3712

Hovedtoppen for antibiotikum 890A1 fremkommer i fraktionerne 181 til 217 med et maksimum i fraktion 198. Fraktionerne 186 til 210 indeholdende i alt 114 absorptionsenheder ved 300 nm opsamles.

De opsamlede fraktioner inddampes til 4,0 ml, og pH-værdien indstilles på 7,3 ved tilsætning af 16 filter 1M natriumhydroxid. Koncentratet påføres en kolonne af Bio-Gel P-2, 200-400 mesh, lag-dimension 2,15 x 70 cm, og vaskes med 3 x 1 ml portioner afioniseret vand og elueres med afioniseret vand ved 0,96 ml/min.

Der opsamles fraktioner på 3,85 ml. Hovedtoppen af antibiotikum 890A1 findes i fraktionerne 24 til 44 med et maksimum i fraktionerne 33 og 34. Fraktionerne 27 til 38 med det højeste A^gø/Ag^-for-hold forenes og lyophiliseres. Disse forenede fraktioner har i alt 72 A^QQ-enheder.

Til gennemførelse af lyophiliseringen inddampes de forenede fraktioner til 3,0 ml, og pH-værdien af koncentratet indstilles på 7,5 ved tilsætning af 10 filter 0.1M natriumhydroxid. Prøven opdeles i to portioner på 1,50 ml, og portionerne hurtigfryses og lyophiliseres i 14 ml med skruelåg forsynede glasampuller. Hver prøve indeholder 1,73 mg 890A^ svarende til 35,8 A^gg-enheder.