DE69208494T2

DE69208494T2 - Neue Verbindungen, "Leusstroducsins" gennant, ihre Herstellung und therapeutische Verwendungen

Info

Publication number: DE69208494T2
Application number: DE69208494T
Authority: DE
Inventors: Ryuzo Enokita; Takeshi Kagasaki; Isao Kaneko; Takafumi Komaha; Keiichi Matsuda; Takemichi Nakamura
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1991-03-27
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 1996-10-24
Anticipated expiration: 2012-03-28
Also published as: HUT60521A; EP0506463A2; KR0145680B1; CZ279299B6; NO921158L; CA2064126A1; FI101978B1; TW212182B; KR920018215A; AU649116B2; GR3019996T3; US5443972A; IE74389B1; FI101978B; RU2082760C1; NZ242155A; HU9201005D0; FI921339A; CZ91592A3; HU216875B

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine Reihe neuer Verbindungen bereit, die "Leustroducsin A", "Leustroducsin B" und Leustroducsin C" genannt werden. Diese Verbindungen haben die Formel (I), die weiter unten gezeigt wird. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen durch Fermentation unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, und insbesondere eines Stammes der Spezies Streptomyces platensis, welcher ebenfalls neu ist und Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben verschiedene therapeutische Wirkungen, weshalb die Erfindung auch Zusammensetzungen und Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe unter Verwendung dieser Verbindungen betrifft.
Die Leustroducsine der vorliegenden Erfindung sind neue Verbindungen, die die Herstellung von hämatopoietischen (d. h. "blutbildenden") Faktoren stimulieren, z. B. des Granolocytenkolonie-stimulierenden Faktors (im folgenden als "G-CSF" abgekürzt) und des Granolocyten-Makrophagenkoloniestimulierenden Faktors (im folgenden als "GM-CSF" abgekürzt). Sie stimulieren ebenfalls die Bildung des Nervenwachstumsfaktors (im folgenden als "NGF" abgekürzt). Überdies zeigen sie pilzbekämpfende Wirkungen, z. B. gegen Trichophyton mentagrophytes.
Verschiedene Arten von Cytokinen mit hämatopoietischer Aktivität, wie z. B. die Kolonie-stimulierenden Faktoren (im folgenden als "CSF" abgekürzt), und verschiedene Arten von Glycoproteinen (im allgemeinen als "Interleukine" bezeichnet) sind bis heute mit den Techniken der Genmanipulation hergestellt worden. Diese Substanzen haben auf verschiedene Arten klinische Verwendung gefunden, um die negativen Nebeneffekte, die von der Krebschemotherapie und der Strahlentherapie verursacht werden, zu unterdrücken und Infektionen zu blockieren. Die Effektivität dieser Substanzen ist kürzlich erkannt worden (Br. J. Cancer 59, 2-5 (1989)).
Es wurde gefunden, daß diese über verschiedene Wege dem Menschen verabreichten Faktoren an sich klare pharmakologische Wirkungen haben, was zu einer möglichen Verwendung dieser Faktoren in der Therapie führt. Man glaubt jedoch, daß diese Faktoren in vivo im wesentlichen durch bestimmte Arten von Zellen (z. B. Lymphocyten, Monocyten, Fibroplasten, vasculäre endotheliale Zellen und Stromazellen) über ein kompliziertes Regulationssystem gebildet werden, und daß sie bei der Bildung von verschiedenen Arten von Blutzellen eine homeostatische Wirkung haben. Demgemäß können mehrere Nebeneffekte beobachtet werden, wenn diese Faktoren ohne Beachtung des empfindlichen Gleichgewichts dieser regulatorischen Mechanismen verabreicht werden, wobei diese Nebeneffekte durch das Ungleichgewicht dieses Regulationsmechanismus verursacht werden. Beispielhaft für solche Nebenwirkungen sind Entzündungen an den Injektionsstellen, Gliederschmerzen, Fieber und Schüttelfrost.
Statt der Verabreichung der hämatopoietischen Faktoren an sich könnte es auf der anderen Seite möglich sein, bestimmte Substanzen, welche bekanntlich die Bildung dieser hämatopoietische Faktoren im Körper stimulieren, zu verabreichen. Beispielsweise ist bekannt, daß Interleucin 1 (im folgenden als IL-1 abgekürzt) und der Tumornekrosefaktor (im folgenden als TNF abgekürzt) die Bildung von CSF etc. durch verschiedene Arten von Zellen induzieren können. Diese Faktoren können jedoch nicht immer als spezifische Induktoren von hämatopoietischen Faktoren wirken, weil sie auch verschiedene andere biologische Aktivitäten haben.
Es ist bekannt, daß verschiedene Arten von Immunoaktivatoren von geringem Molekulargewicht, wie z. B. Lipopolysaccharide (im folgenden als LPS abgekürzt) und Muramyldipeptide (im folgenden als MDP abgekürzt), verschiedene Arten von CSF durch Aktivierung von Monocyten und Makrophagen herstellen können. Es ist jedoch auch bekannt, daß andere physiologische Wirkungen, die durch die Aktivierung von Makrophagen, wie z. B. die Bildung von Monokinen wie IL-1 und TNF, verursacht werden, zur selben Zeit auftreten, was zu verschiedenen Nebenwirkungen führen kann, wie z. B. Fieber (Nippon Acta Radiologica 48, (4), 514 (1988)).
Phorbolester und Calciumionophoren induzieren bekanntlich die CSF-Bildung synergistisch (Kohama et al.: Experimental Haematology 16, 603-608 (1988)), man weiß jedoch auch, daß sie nicht nur die Bildung von hämatopoietischen Faktoren stimulieren, sondern auch die Bildung und Sekretion aller sekretorischen Proteine stimulieren, eingeschlossen Hormone wie Insulin (Y. Nishizuka: Science 225, 1365 (1984))
Obwohl der genaue Mechanismus noch nicht aufgeklärt ist, glaubt man, daß während der Bildung von Blutzellen verschiedene Arten von reifen Blutzellen aus allgemeinen Zellvorläufern, die "hämatopoietische Stammzellen" genannt werden, durch die Wirkung von verschiedenen hämatopoietischen Faktoren und durch Zell-Zell-Wechselwirkung gebildet werden können. Es ist gezeigt worden, daß die Stelle, an der Blutzellen in normalen Erwachsenen gebildet werden, auf das Innere des Knochenmarks beschränkt ist, daß die Stromazellen genannten Zellen, die im Knochenmark vorkommen, eine wichtige Rolle bei der Bildung von Blutzellen spielen (Dexter et al.; J. Cell. Physiol. 91, 335 (1977)), und daß die Stromazellen im Knochenmark verschiedene hämatopoietische Faktoren bilden (Harigaya et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3477 (1985); Kohama et al.: Experimental Haematology 16, 603-608 (1988)).
Deshalb kann, wenn eine die Bildung von hämatopoietischen Faktoren durch Stromazellen stimulierende Substanz gefunden werden kann, diese Substanz nicht nur eine außerordentliche Hilfe in der Analyse der Wirkung des hämatopoietischen Mechanismus unter physiologischen Bedingungen und in der Pathologie von hämatopoietischen Krankheiten sein, sondern sie kann auch von beträchtlichem klinischen Nutzen sein.
Die europäische Patentveröffentlichung Nr. 329 361 offenbart bestimmte, neue 2-Pyranonderivate, die den erfindungsgemäßen Verbindungen ähneln, außer daß sie in der Beschaffenheit der Gruppe "R", die im folgenden definiert wird, unterschiedlich sind. Diese Verbindungen werden im Stand der Technik außerdem nur als Biozide in der Landwirtschaft bezeichnet, und es ist im veröffentlichten Stand der Technik nicht gezeigt worden, daß diese Verbindungen die wertvollen und unerwarteten therapeutischen und prophylaktischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen haben. Des weiteren geht man davon aus, daß der Stamm, der in dem älteren Dokument beschrieben ist, von dem hier beschriebenen Stamm deutlich verschieden ist, obwohl die Verbindungen des Standes der Technik wie die erfindungsgemäßen Verbindungen durch einen Mikroorganismus der Spezies Streptomyces platensis gebildet werden.
Sehr ähnliche Verbindungen und Mikroorganismen, die im wesentlichen die gleiche offenbarte Verwendbarkeit wie die in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 329 361 haben, sind in der japanischen Patentanmeldung Kokai Hei 2-186 beschrieben, wobei man hier ebenfalls davon ausgeht, daß sie von den hier beschriebenen Verbindungen und Mikroorganismen deutlich verschieden sind.
Das Journal of Antibiotics, Vol. XLII, Nr. 9, S. 1339-1343 offenbart eine neue Antitumorverbindung, die die Autoren als "Phospholin" bezeichnen, und die durch einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, der damals neu isoliert wurde, gebildet wird. Dieser Mikroorganismus wird jedoch eindeutig als Streptomyces hygroscopicus bezeichnet und ist von der erfindungsgemäßen Spezies Streptomyces platensis verschieden. Überdies hat diese Verbindung eine andere molekulare Struktur und ist deshalb klar zu unterscheiden, obwohl die Phospholine des Standes der Technik wie die erfindungsgemäßen Verbindungen sowohl eine Aminogruppe als auch eine Phosphorgruppe aufweisen.
Insbesondere geht man davon aus, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen folgende Aktivitäten haben: Sie verringern die schädlichen Reaktionen, die sich aus der Krebschemotherapie oder Strahlentherapie ergeben, sie schützen gegen Infektionen, sie aktivieren Makrophagen und haben deshalb krebsbekämpfende Wirkung, sie verbessern die zerebrale Funktion und wirken zudem als pilzbekämpfende Mittel.
Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen der Formel (I) bereit:
worin R eine 5-Methylhexanoyloxygruppe, eine 6-Methyloctanoyloxygruppe oder eine 7-Methyloctanoyloxygruppe darstellt, und Salze dieser Verbindungen. Diese Verbindungen wurden "Leustroducsin A", "Leustroducsin B" bzw. "Leustroducsin C" genannt.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Leustroducsinen bereit, welches das Kultivieren eines Leustroducsin-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces und das Gewinnen von mindestens einem Leustroducsin aus der Kultur umfaßt.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die mindestens ein Leustroducsin oder ein Salz davon als Beimengung zu einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Lösungsmittel enthält.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) und deren pharmazeutisch geeigneten Salze in der Therapie, insbesondere zur Behandlung oder Prophylaxe von: schädlichen Reaktionen, die sich aus der Krebschemotherapie oder Strahlentherapie ergeben, Infektionen, Krebs, zerebralen Funktionsstörungen und Pilzinfektionen.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von Verbindungen der Formel (I) und deren pharmazeutisch geeigneten Salze bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung oder Prophylaxe von: schädlichen Reaktionen, die sich aus der Krebschemotherapie oder Strahlentherapie ergeben, Infektionen, Krebs, zerebralen Funktionsstörungen und Pilzinfektionen.
Die drei Leustroducsine der vorliegenden Erfindung haben folgende Struktur: Leustroducsin A R ist 5-Methylhexanoyloxy Leustroducsin B R ist 6-Methyloctanoyloxy Leustroducsin C R ist 7-Methyloctannoyloxy
Aus den obigen Formeln geht deutlich hervor, daß die Leustroducsine der vorliegenden Erfindung eine Anzahl von asymmetrischen Kohlenstoffatomen und mehrere Doppelbindungen enthalten. Sie können deshalb verschiedene optische und geometrische Isomere bilden. Obwohl sie alle durch eine einzige molekulare Formel dargestellt werden, umfaßt die vorliegende Erfindung sowohl die einzelnen isolierten Isomeren als auch deren Gemische, einschließlich deren Racemate. Wo stereospezifische Synthesetechniken oder optisch aktive Verbindungen als Ausgangsmaterial verwendet werden, können die einzelnen Isomeren direkt hergestellt werden. Auf der anderen Seite können die einzelnen Isomeren durch herkömmliche Trenntechniken erhalten werden, wenn ein Isomerengemisch hergestellt wird.
Die Leustroducsine der vorliegenden Erfindung können durch Kultivieren eines Leustroducsin-produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces und anschließendes Gewinnen eines oder mehrerer Leustroducsine aus dem Kulturmedium hergestellt werden.
Im besonderen wird bevorzugt, als Mikroorganismus einen neu isolierten Stamm der Gattung Streptomyces, der zur Spezies Streptomyces platensis gehört und der die Bezeichnung SANK 60191 (FERM BP-3288) erhielt, zu verwenden.
Dieser Mikroorganismus wurde nach den Bestimmungen des Budapester Abkommens am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology am 20. Februar 1991 unter der Nummer FERM BP-3288 hinterlegt.
Details der mikrobiologischen Eigenschaften von Streptomyces platensis SANK 60191 (FERM BP-3288) werden im folgenden beschrieben.

1. Morphologische Eigenschaften

Streptomyces platensis SANK 60191 (FERM BP-3288) wurde 14 Tage bei 28ºC auf jeweils einem der Agar-Medien, wie sie durch das ISP (International Streptomyces Project) definiert sind, kultiviert. Die mikroskopische Beobachtung nach 14- tägiger Kultivierung zeigte, daß sich das Substratmyzel dieses Stammes gut verlängerte und verzweigte und gelblichgrau oder blaßgelb-orange gefärbt war. Es wurde jedoch weder die Fragmentierung noch die Zickzack-Verlängerung, wie sie bei nocardioformen Actinomyceten zu finden sind, beobachtet. Die Verzweigung der Luftmyzelien war einfach. Die Sporenketten wiesen eine lockere Spiralform auf, wobei 10 bis 50 oder mehr Sporen eine Kette bildeten. Die Betrachtung unter einem Scanning-Elektronenmikroskop zeigte, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt war. Die Sporen waren eiförmig oder oval und wiesen eine Größe von 0,5-0,6 · 0,6- 1,3 µm auf. Wirbel aus Luftmyzel, Dauermyzel, Fragmentierung von Hyphen und spezifische Organe, wie z. B. Sporenbehälter, konnten nicht gefunden werden.

2. Eigenschaften auf verschiedenen Arten von Kulturmedien

Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften des Mikroorganismus nach 14-tägiger Kultivierung bei 28ºC auf verschiedenen Arten von Kulturmedien. Die Farben werden durch die Farbennummern, wie sie in "Guide to Colour Standard", herausgegeben von Nippon Shikisai Kenkuyusho, angegeben werden, angezeigt. Der Stamm wird feucht und seine Farbe wechselt mit der Zeit nach schwarz.
In der Tabelle werden folgenden Abkürzungen verwendet: G: Wachstum; AM: Luftmyzel; R: Rückseite; SP: lösliches Pigment; SC: spezifische Eigenschaft. Tabelle 1 Medium Merkmal Eigenschaft von SANK 60191 Sucrosenitratagar gut, glatt, blaßgelblich-orange gut, samtig, hellbräunlich-grau Glucoseasparaginagar Glycerinasparaginagar anorganischer Salz-Stärkeagar Tyrosinagar blaßbraun keine Bildung gut, glatt, blaßgelblich-orange mäßig, samtig, weiß sehr gut, glatt, blaßgelblichorange bräunlich-grau bräunlich-weiß Lufthyphen ziehen Wasser und ihre Farbe wechselt nach schwarz gut, samtig, weiß, hell bräunlichgraue Punkte glaßgelblich-braun Nähragar Hefeextrat-Malzextraktagar Haferschrotagar Wasseragar gut, glatt blaßgelblich-orange mäßig, samtig, weiß blaßgelblich-braun keine Bildung sehr gut starke Bildung, samtig, hellbräunlich-weiß blaßgelblich-braun Lufthyphen ziehen Wasser und ihre Farbe wechselt nach schwarz dunkelbräunlich-grau gelblich-braun gelblich-grau bräunlich-grau hellbräunlich grau Kartoffelextrat-Karottenextraktagar mäßig, glatt, gelblich-grau mäßig, samtig, bräunlich-grau hellbräunlich-grau keine Bildung

3. Physiologische Eigenschaften

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes SANK 60191, die über einen Zeitraum von Tag 2 bis Tag 21 nach dem Starten der Kultivierung bei 28ºC beobachtet wurden, sind in folgender Tabelle 2 aufgelistet.

Tabelle 2

Hydrolyse von Stärke positiv
Verflüssigung von Gelatine negativ
Reduzierung von Nitrat negativ
Koagulierung von Milch negativ
Peptonisierung von Milch negativ
Bildung von Melanoidpigmenten
(Medium 1)* negativ
(Medium 2) negativ
(Medium 3) negativ
Zersetzung von Substrat
Casein negativ
Tyrosin positiv
Xanthin positiv
Temperaturbereich des Wachstums (Medium 4) 9 bis 35ºC
Optimale Temperatur des Wachstums (Medium 4) 20 bis 26ºC
Natriumchloridtoleranz 10%
* Medium 1; Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP 1)
2; Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar (ISP 6)
3; Tyrosinagar (ISP 7)
4; Hefeextrakt-Malzextraktagar (ISP 2)
Stamm SANK 60191 wurde auch unter Verwendung von Pridham- Gottlieb Agar (ISP 9) als Kulturmedium bei 28ºC kultiviert. Das Verwendungsmuster von Kohlenstoffquellen, die nach 14- tägiger Kultivierung beobachtet wurde, ist in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

D-Glucose + D-Fructose +
L-Arabinose - L-Rhamnose -
D-Xylose - Sucrose +
Inositol + Raffinose +
D-Mannitol + Kontrolle -
+ Verwendung positiv
- Verwendung negativ

4. Zelluläre Komponenten

Die Zellwände von Stamm SANK 60191 wurden nach der Methode von B. Becker et al. (Applied Microbiology, 12, 421-423 (1984)) analysiert. Da LL-Diaminopimelinsäure nachgewiesen wurde, wurde bestätigt, daß die Zellwände vom Typ I sind. Desweitern wurden die gesamten Zuckerkomponenten der Zelle von Stamm SANK 60191 nach der Methode von M.P. Lechevalier (Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)) analysiert. Es wurde kein besonderes Muster beobachtet.
Durch diese mikrobiologischen Eigenschaften wurde bestätigt, daß dieser Stamm zur Gattung Streptomyces der Actinomyceten gehört. Im Vergleich zu den Stämmen, die im ISP durch E. B. Shirling and D. Gottlieb (International Journal of Systematic Bacteriology 18, 68-189 (1968); 18, 279-392 (1968); 19, 391-512 (1969); 22, 265-394 (1972)) beschrieben wurden, und zu den Stämmen, die in der übrigen Literatur, wie z. B. in "The Actinomycetes, Vol. 2" von S. A. Waksman, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition (1974)" herausgegeben von R. E. Buchanan und N. E. Gibbons, "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4 (1989)" und in der anderen neueren Literatur über Actinomyceten beschrieben wurden, wird der vorliegende Stamm als sehr ähnlich zu Streptomyces plantensis erachtet.
Des weiteren produzierte der Stamm SANK 60191 nach Flüssigkultivierung unter Verwendung eines Hefedextrosemediums ein lösliches Pigment mit frischer, rötlich-brauner Farbe. Nach Zugabe von 0,05 N wäßrigem HCl wechselte seine Farbe nach gelb, nach Zugabe von 0,05 N wäßrigem NaOH wurde keine Änderung beobachtet.
Streptomyces platensis produziert ein rötliches oder gelbliches Pigment nach Kultivierung auf Medien von Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, Haferschrotagar, anorganischem Salz-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar. Auf der anderen Seite produzierte der Stamm SANK 60191 kaum eines dieser Pigmente, was auf einen Unterschied zwischen diesem Stamm und dem bekannten Stamm Streptomyces platensis hinweist. Da jedoch der neue Stamm und die bekannten Stämme nur über die Unterschiede in der Produktion von löslichen Pigmenten unterschieden werden konnten, wurde Stamm SANK 60191 als neuer Stamm von Streptomyces platensis identifiziert.
Es wurde gezeigt, daß der Stamm SANK 60191 Leustroducsine produziert. Es ist jedoch allgemein bekannt, daß die Eigenschaften von Pilzen im allgemeinen, und von Actinomyceten-ähnlichen Mikroorganismen im besonderen, beträchtlich variieren können und solche Pilze leicht mutieren können, sowohl infolge natürlicher Ursachen als auch als Ergebnis der Induktion durch künstliche Mittel (z. B. ultraviolette Strahlung, radioaktive Strahlung, chemische Behandlung etc.). Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung irgendeines Mikroorganismus, der in die Gattung Streptomyces eingeordnet werden kann und der mit dem Stamm SANK 60191 dessen charakteristische Fähigkeit, Leustroducsine zu bilden, teilt. Es ist zu erwarten, daß der neue Stamm SANK 60191 keine Ausnahme ist, und daher wird die Bezeichnung "SAND 60191" dahingehend verwendet, alle Mutanten dieses Stammes zu umfassen, die mit dem Stamm SANK 60191 die charakteristische Fähigkeit zur Bildung von Leustroducsinen teilen. Überdies umfassen diese Mutanten diejenigen, die mittels gentechnischer Techniken erhalten werden, z. B. durch Rekombination, Transduktion, Transformation oder ähnlichen. Auf der Grundlage der hier bereitgestellten Information, die die Eigenschaften der Leustroducsine betreffen, bedarf es nur leichter experimenteller Tätigkeit, um zu bestimmen, ob irgendein gegebener Stamm diese Verbindungen produziert oder sie in ausreichender Menge produziert, um den Stamm möglicherweise von kommerziellem Interesse werden zu lassen.
Zusätzlich zu dem oben beschriebenen neuen Stamm Streptomyces platensis wurde gefunden, daß ein bekannter Stamm, nämlich Streptomyces platensis SAM-0654 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Zugangsnummer FERM BP- 1668 am 22. Januar 1988), der vor dem frühesten Prioritätsdatum dieser Anmeldung bekannt war, auch die erfindungsgemäßen Leustroducsine produziert. Dieser Stamm ist im europäischen Patent Nr. 329 361, das bereits oben erwähnt wurde, vollständig beschrieben, wobei aus diesem Patent die gesamte Information über die Verfügbarkeit und die Eigenschaften dieses Stammes erhalten werden kann.
Die erfindungsgemäßen Leustroducsine können durch Kultivierung dieser Pilzstämme in Kulturmedien, die herkömmlicherweise für die Produktion von anderen Fermentationsprodukten aus ähnlichen Mikroorganismen verwendet werden, hergestellt werden. Solche Medien enthalten notwendigerweise mikrobiologisch assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, was dem Fachmann bekannt ist.
Bevorzugte Beispiele von Kohlenstoffquellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen: Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Hafer, Roggen, Maisstärke, Kartoffelstärke, Maismehl, Sojabohnenschrot, Futtermittel, Baumwollsamenöl, Melasse, Zitronensäure, Weinsäure und ähnliches. Solche Verbindungen können allein oder in jeder geeigneten Kombination verwendet werden. Im allgemeinen kann die verwendete Menge in einem Bereich von 1 bis 10 Gew.-% des Kulturmediums variieren.
Bevorzugte Stickstoffquellen sind normalerweise proteinhaltige Materialien, wie sie üblicherweise in Fermentationsverfahren verwendet werden. Beispiele für solche Stickstoffquellen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen: Sojabohnenschrot, Weizenkleie, Erdnußschrot, Futtermittel, Baumwollsamenöl, Baumwollsamenschrot, Caseinhydrolysate, Fermamine, Fischschrot, Maissirup, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Malzextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat oder ähnliches.
Diese Stickstoffquellen können allein oder in jeder geeigneten Kombination verwendet werden. Im allgemeinen wird es bevorzugt, sie in einer Konzentration zwischen 0,2 und 6 Gew.-% des Kulturmediums zu verwenden.
Die nährstoffhaltigen anorganischen Salze, die in das Kulturmedium der vorliegenden Erfindung gegeben werden können, sind herkömmliche Salze, die verschiedene Ionen, die für das Wachstum von Mikroorganismen notwendig sind, bereitstellen können, wie z. B. Natrium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen. Zusätzlich sollte das Medium geringe Mengen an essentiellen Spurenelementen, wie z. B. Kalium, Calcium, Cobalt, Mangan, Eisen und Magnesium enthalten.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren mit Hilfe einer Flüssigkulturtechnik durchgeführt wird, wird im Kulturmedium vorzugsweise ein Antischaummittel wie z. B. Silikonöl, Pflanzenöl oder oberflächenaktive Mittel verwendet. Der pH des Kulturmediums zur Herstellung der Leustroducsine durch Kultivieren von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, insbesondere des Stammes SANK 60191, variiert vorzugsweise in einem Bereich von 5,0 bis 8,0, stärker bevorzugt von 5,0 bis 7,0.
Die Kultivierung kann bei jeder Temperatur im Bereich von 9ºC bis 37ºC durchgeführt werden. Das Wachstum verläuft jedoch gut bei einer Temperatur im Bereich von 20ºC bis 35ºC, weshalb eine solche Temperatur bevorzugt wird. Eine Temperatur von 22ºC bis 30ºC wird bevorzugt, um die Produktion von Leustroducsinen zu optimieren.
Die Verbindungen werden unter aeroben Kulturbedingungen hergestellt, wobei konventionelle aerobe Kulturverfahren, wie z. B. Festkultur-, Schüttelkultur- und Rührkulturmethoden unter Luftzufuhr, verwendet werden können. Im Fall der Kultivierung im kleinen Maßstab wird typischerweise eine Schüttelkultur über wenige Tage bei 28ºC verwendet. Bei solch einem Kulturverfahren in kleinem Maßstab kann die Kultur gestartet werden durch 1 oder 2 Proliferationsschritte, die Starterkulturen z. B. in Erlenmeyerkolben, die mit Schikanen ausgestattet sind, die als Strömungsregulatoren dienen, bilden. Das Medium für die Starterkulturschritte enthält vorzugsweise sowohl Kohlenstoff- als auch Stickstoffquellen. Beim bevorzugten Ablauf der Durchführung einer solchen Kultivierung im kleinen Maßstab werden die Starterkulturkolben in einem Inkubator, der die Temperatur konstant hält, bei 28ºC 3 Tage oder solange geschüttelt, bis ausreichendes Wachstum erreicht ist. Die gewachsene Starterkultur wird dann in ein zweites Startermedium oder in das Produktionsmedium gegeben. Wenn eine Übergangs- Wachstumsphase verwendet wird, werden für das Wachstum im wesentlichen die selben Methoden angewandt, und das Produktionsmedium wird mit einem Aliquot des erhaltenen Zwischenprodukts angeimpft. Der angeimpfte Kolben kann mehrere Tage unter Rühren inkubiert werden, wobei nach Abschluß der Inkubation der Inhalt des Kolbens zentrifugiert oder filtriert werden kann.
Wenn die Herstellung im großen Maßstab durchgeführt wird, ist die Verwendung eines geeigneten Fermenters, der mit einem Rührer und einer Belüftungsvorrichtung ausgestattet ist, bevorzugt. In diesem Fall kann das Nährmedium im Inneren des Fermenters hergestellt werden. Das Medium wir vorzugsweise dadurch sterilisiert, daß die Temperatur bis zu einer geeigneten Temperatur erhöht wird, z. B. auf 120 bis 125ºC. Nach dem Abkühlen kann das sterilisierte Medium mit einer vorher hergestellten Starterkultur angeimpft werden. Die Kultivierung wird dann unter Rühren und Belüftung bei einer geeigneten Temperatur, z. B. 28ºC, fortgesetzt. Diese Verfahren ist dazu geeignet, große Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen zu erhalten.
Die Veränderung der im Verlauf der Kultivierung gebildeten Menge an Leustroducsinen kann mit Hilfe geeigneter Vorrichtungen, wie sie in der Fermentationstechnik bekannt sind, verfolgt werden, indem z. B. ihre physiko-chemischen oder biologischen Eigenschaften ausgenutzt werden, z. B. bei der Hochleistungsflüssigchromatographie. Üblicherweise erreicht die Menge an gebildeten Leustroducsinen ein Maximum nach 48- bis 96-stündiger Kultivierung.
Nach Abschluß der Kultivierung können die im flüssigen Anteil des Mediums und in den Bakterienzellen verbleibenden Leustroducsine mit Hilfe herkömmlicher Mittel extrahiert und gereinigt werden, wobei die physiko-chemischen Eigenschaften der Leustroducsine ausgenutzt werden. Beispielsweise können die im Filtrat oder im Überstand vorhandenen Leustroducsine mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel, wie z. B. Ethylacetat, Chloroform, Ethylenchlorid, Methylenchlorid oder Butanol (oder mit einem Gemisch von zwei beliebigen oder mehreren dieser Lösungsmittel) unter sauren Bedingungen extrahiert werden. Danach können sie mit herkömmlichen Methoden weiter gereinigt werden. Es ist ebenso möglich, irgendwelche Verunreinigungen mit einem oder mehreren der oben genannten Lösungsmitteln unter basischen Bedingungen zu entfernen, und danach können die Leustroducsine mit herkömmlichen Mitteln weiter gereinigt werden. Als Alternative können die Verunreinigungen mittels Adsorption durch Durchleiten einer die Leustroducsine enthaltenden Flüssigkeit durch eine Schicht eines geeigneten Adsorbens entfernt werden oder die Leustroducsine können an ein geeignetes Adsorbens adsorbiert und danach unter Verwendung geeigneter Elutionsmittel, wie z. B. wäßriges Methanol, wäßriges Aceton oder wäßriges Butanol, eluiert werden. Beispiele für geeignete Adsorbenzien, die in diesem Verfahren verwendet werden können, umfassen Aktivkohle und adsorbierende Harze, wie z. B. Amberlite XAD-4 (ein Markenname für ein Produkt von Rohm & Haas) oder Diaion HP- 10, HP-20, CHP-20 und HP-50 (Produktnamen von Mitsubishi Chemical Industries Co.). In den Zellen vorhandene Leustroducsine können durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. mit 50 bis 90 Vol.-% wäßrigem Aceton oder wäßrigem Methanol, gefolgt von der Entfernung des organischen Lösungsmittels, erhalten werden. Das so erhaltene Produkt kann danach ähnlichen Extraktions- und Reinigungsverfahren wie dem oben für das Filtrat beschriebenen Verfahren unterworfen werden.
Die so erhaltenen Leustroducsine können mit bekannten Techniken weiter gereinigt werden, z. B. durch: Adsorptionssäulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers wie z. B. Silicagel oder Magnesiumsilicagel, wie z. B. dem mit dem Markennamen "Florisil"; Gelfiltrationssäulenchromatographie unter Verwendung eines Adsorbens wie Sephadexy LH-20 (ein Produktname von Pharmacia); oder Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung einer normalen oder einer reversen Phase. Wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, können diese Isolations- und Reinigungsverfahren allein oder in jeder geeigneten Kombination und, wenn gewünscht, wiederholt durchgeführt werden, um die gewünschten Leustroducsine zu isolieren und zu reinigen.
Die erfindungsgemäßen Leustroducsine sind neue Verbindungen, die vorher in der Literatur nicht beschrieben wurden. Sie stimulieren die Bildung von hämatopoietischen Faktoren, wie z. B. G-CSF und GM-CSF, in Tieren (wie z. B. Menschen, Hunden, Katzen und Kaninchen), und sind daher als therapeutische Agenzien für die Verminderung von Nebeneffekten, die durch Krebschemotherapie oder Strahlentherapie verursacht werden, nützlich. Ebenso verhindern sie Infektionen und zeigen krebsbekämpfende Wirkungen durch die Aktivierung von Makrophagen. Zudem geht man davon aus, daß Leustroducsine bei der Verbesserung des zerebralen Metabolismus durch Stimulierung der Bildung von NGF nützlich sind. Des weiteren sind sie als pilzbekämpfende Agenzien nützlich, und es wurde gezeigt, daß sie pilzbekämpfende Wirkungen gegen Trichophyton mentagrophytes besitzen.
Die Fähigkeit der Leustroducsine, die Bildung von hämatopoietischen Faktoren gemäß der vorliegenden Erfindung zu stimulieren, kann prinzipiell durch die Methode von Kohama et al. (Experimental Haematology 16, 603-608 (1988)) gemessen werden. In diesem Verfahren werden ein Produktionssystem für verschiedene hämatopoietische Faktoren und ein Assaysystem für verschiedene hämatopoietische Faktoren kombiniert. Verschiedene hämatopoietische Faktoren können beispielsweise von KM-102-Zellen, die ursprünglich aus Stromazellen von menschlichem Knochenmark erhalten wurden, gebildet werden. Es kann ,jedoch statt dessen jede Zelle verwendet werden, die verschiedene hämatopoietische Faktoren bilden kann, z. B. primär kultivierte Stromazellen aus Knochenmark, vasculäre endotheliale Zellen, Lymphocyten oder Makrophagen, die im Knochenmark vorhanden sind. Im Assay wird eine Probe der Verbindung, deren Aktivität ermittelt werden soll, auf eine geeignete Konzentration verdünnt und zum Kultursystem gegeben, das die Zellen enthält, die verschiedene hämatopoietische Faktoren bilden (im folgenden als "HF-bildende Zellen" bezeichnet). Nach einer gewissen Zeit, üblicherweise 24 Stunden, wird ein Teil des Überstandes des Kulturmediums, das HF-bildende Zellen enthält, entnommen und in einer geeigneten Konzentration in ein Kultursystem aus Zellen gegeben, die von verschiedenen hämatopoietischen Faktoren abhängig sind, z. B. TF-1-Zellen und NFS-60-Zellen (im folgenden als "HF-abhängige Zellen" bezeichnet). Nach einer gewissen Zeit kann die Menge an hämatopoietischen Faktoren durch Messung des Wachstums der HF-abhängigen Zellen gemessen und so die Fähigkeit der Verbindung, die Bildung von verschiedenen hämatopoietischen Faktoren zu stimulieren, bestimmt werden. Das Wachstum der HF-abhängigen Zellen kann durch jede herkömmliche Methode bestimmt werden, wie z. B. durch Einbau von Tritium-Thymidin durch die Zellen oder durch Verwendung einer MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid]-Assaymethode (Chemicon International Inc., USA). Die Bestimmung von verschiedenen hämatopoietischen Faktoren kann mit jeder konventionellen Methode durchgeführt werden, wie z. B. der Kolonie-Bildungsmethode oder der ELISA- Methode.
Die erfindungsgemäßen Leustroducsine enthalten sowohl eine saure Gruppe (die Phosphorsäuregruppe) als auch eine basische Gruppe (die Aminogruppe) und können deshalb Salze bilden. Bezüglich der Beschaffenheit dieser Salze gibt es keine besonderen Beschränkungen, vorausgesetzt, daß sie pharmazeutisch geeignet sind, wenn sie für die therapeutische Verwendung bestimmt sind. Wenn sie für nicht therapeutische Verwendungen bestimmt sind, z. B. als Zwischenprodukte bei der Herstellung von anderen, möglicherweise aktiveren Verbindungen, ist sogar diese Beschränkung nicht gegeben. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit Basen Salze bilden. Beispiele für solche Salze umfassen: Salze mit einem Alkalimetall, wie z. B. Natrium, Kalium oder Lithium; Salze mit einem Erdalkalimetall, wie z. B. Barium oder Calcium; Salze mit einem anderen Metall, wie z. B. Magnesium oder Aluminium; Salze mit organischen Basen, wie z. B. ein Salz mit Dicyclohexylamin; und Salze mit einer basischen Aminosäure, wie z. B. Lysin oder Arginin. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch Säureadditionssalze bilden. Beispiele für solche Säureadditionssalze umfassen: Salze mit Mineralsäuren, insbesondere Halogenwasserstoffsäuren (wie Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure), Salpetersäure, Perchlorsäure, Kohlensäure, Schwefelsäure oder Phosporsäure; Salze mit kürzeren Alkyl-schwefligen Säuren, wie z. B. Methan-schweflige Säure, Trifluormethan-schweflige Säure oder Ethan-schweflige Säure; Salze mit Aryl-schwefligen Säuren, wie z. B. Benzol-schweflige Säure oder p-Toluolschweflige Säure; Salze mit organischen Carbonsäuren, wie z. B. Essigsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Oxalessigsäure oder Zitronensäure; und Salze mit Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure oder Asparaginsäure.
Wenn diese Verbindungen für therapeutische Verwendungen bestimmt sind, können sie allein oder in geeigneten pharmazeutischen Formulierungen, die zusätzlich zu der aktiven Verbindung ein oder mehrere herkömmliche Lösungsmittel, Träger oder Adjuvanzien enthalten. Die Beschaffenheit dieser Formulierungen wird natürlich vom beabsichtigten Verabreichungsweg abhängen. Die Verbindung ist jedoch bei oraler Verabreichung bevorzugt als Pulver, Granulate, Tabletten, Kapseln oder Sirup zubereitet. Für die parenterale Verabreichung ist sie vorzugsweise als Injektion (welche intravenös, intramusculär oder subcutan sein kann) oder als Tropfen oder Zäpfchen zubereitet. Diese Präparationen können auf bekannte Weise durch Zugabe solcher Additive wie Träger, Bindemittel, Desintegratoren, Gleitmittel, Stabilisierer, Korrigenzien, Lösungsvermittlern, suspendierenden Mitteln oder beschichtenden Mitteln hergestellt werden. Obwohl die Dosierung in Abhängigkeit von den Symptomen und dem Alter des Patienten der Art der Krankheit und dem Weg und der Art der Verabreichung unterschiedlich sein kann, können die erfindungsgemäßen Verbindungen im Fall der oralen Verabreichung an einen erwachsenen menschlichen Patienten in einer täglichen Dosis von 1 mg bis 1000 mg gegeben werden.
Die Verbindungen können in einer einzigen Dosis oder in aufgeteilten Dosen, z. B. 2 oder 3 mal täglich, verabreicht werden.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.

BEISPIEL 1

Kultivierung und Isolierung der Leustroducsine

1(A) Kultivierung

Sporen von Streptomyces platensis SANK 60191 wurden mit einer Impföse in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben, der mit Schikanen ausgestattet war und 100 ml eines vorher sterilisierten Kulturmediums (mit der unten beschriebenen Zusammensetzung) enthielt, inokuliert und der Mikroorganismus 3 Tage bei 28ºC unter Verwendung eines Rotationsschüttlers bei 200 Upm (Rotationsradius von 7 cm) kultiviert.
Kulturmedium:
lösliche Stärke 30 g
rohe Hefe 10 g
Sojabohnenmehl 7 g
Fischschrot 5 g
Maissirup 2 g
Fleischextrakt 1 g
Calciumcarbonat 1 g
mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.,
pH 7 (vor der Sterilisierung).
15 Liter des selben Kulturmediums, wie es für die Starterkultur verwendet wurde, wurden in je einen von 4 rostfreien 30- Liter-Fermentern gefüllt und durch 30-minütiges Erhitzen bei 120ºC sterilisiert. 150 ml der Starterkulturflüssigkeit, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurden dann zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Tage bei 28ºC unter Belüftung bei einer Luftzuflußrate von 15 l/min unter Rühren kultiviert. Um die Sauerstoffkonzentration in der Flüssigkeit bei 5 ppm zu halten, wurde die Rührgeschwindigkeit automatisch innerhalb eines Bereichs von 100 bis 300 Upm kontrolliert.

1(B) Isolierung

2,4 kg Celite 545 (ein Produktname von Johns & Manville Project Corporation, USA) wurden als Filterhilfsmittel zu 60 Litern der Kulturflüssigkeit, die wie in 1(A) beschrieben erhalten wurde, gegeben und das Gemisch filtriert. Nach Filtrierung der Kulturflüssigkeit wurden 7,2 kg Bakterienzellen erhalten. Die Zellen wurden 1 mal mit 30 Litern 50 %igem (v/v) wäßrigem Aceton und 2 mal mit jeweils 20 Litern 80%-igem (v/v) wäßrigem Aceton extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und das organische Lösungsmittel wurde mittels eines Rotationsverdampfers abdestilliert. Zum Rückstand wurde ausreichend wäßrige Salzsäure gegeben, um seinen pH auf 2,0 einzustellen, und dann wurde das Gemisch 2 mal mit je 10 Litern Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, und 10 Liter einer 1%-igen (w/v) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat wurden zu den vereinten Extrakten gegeben. Die aktiven Fraktionen wurden in die wäßrige Schicht überführt, und die Ethylacetatschicht wurde entfernt. Die Ethylacetatschicht wurde wieder mit 5 Litern einer 1%-igen (w/v) wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat extrahiert. Die Natriumhydrogencarbonatlösungen wurden vereint und der pH der vereinten Lösung wurde durch Zugabe von wäßriger Salzsäure auf 2,0 eingestellt. Die Lösung wurde 2 mal mit jeweils 10 Litern Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereint, mit Wasser und dann mit einer gesättigten wäßrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde dann unter kontinuierlicher Zugabe von Methanol durch Verdampfung unter reduziertem Druck mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert, wobei 10 ml einer öligen Substanz erhalten wurden. Diese ölige Substanz wurde in 100 ml 60%-igem (v/v) wäßrigem Methanol gelöst, und die erhaltene Lösung wurde an Sep-Pak Vac 20 cc C&sub1;&sub8; Cartridges (ein Produktname von Waters Co., USA) adsorbiert. Verunreinigungen wurden mit 30 ml 60%-igem (v/v) wäßrigem Methanol eluiert. Die Leustroducsine wurden dann mit 15 ml 100%-igem Methanol eluiert, und das Eluat wurde konzentriert, wobei 800 mg einer öligen Substanz erhalten wurden. Diese ölige Substanz wurde in 10 ml Methanol gelöst und einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterzogen. Die Fraktionen, die Peaks bei 13 Minuten und bei 24 Minuten ergaben, wurden gesammelt und wurden als "Rohfraktion A" bzw. "Rohfraktion B" bezeichnet. Die Bedingungen für die Chromatographie sind im folgenden gezeigt.
Präparative Flüssigchromatographie
Säule: Radial-Pak 25 · 10 (Waters, USA)
Elutionsmittel: 5 Vol.-% wäßriges Acetonitril, enthaltend 0,5% Triethylaminphosphatpuffer, pH 3,0
Flußrate: 9 ml/min
Wellenlänge: 230 nm.
Nach Einengung aller Peaks wurden die erhaltenen Fraktionen einer präparativen Hochleistungsflüssigchromatographie unterzogen. Rohfraktion A wurde der präparativen Chromatographie unterzogen, wobei der Peak bei 56 Minuten unter den folgenden Bedingungen gesammelt wurde. Danach wurden die Elutionsfraktionen entsalzt und unter Verwendung von Sep-Pak eingeengt, wobei 11,66 mg Leustroducsin A erhalten wurden.

Präparative Bedingungen für Rohfraktion A

Säule: Cosmosil 5C 18-AR 20 · 250 mm (Nakaraitesque Inc.)
Elutionsmittel: 42%-iges (v/v) wäßriges Acetonitril, enthaltend 0,5% Triethylaminphosphatpuffer, pH 3,0
Flußrate: 9 ml/min
Wellenlänge: 230 nm.
Rohfraktion B wurde einer präparativen Chromatographie unterzogen, wobei die Peaks bei 47 und 51 Minuten unter den folgenden Bedingungen gesammelt wurden. Sie wurden dann entsalzt und unter Verwendung von Sep-Pak eingeengt, wobei 9,83 mg Leustroducsin B und 5,22 mg Leustroducsin C erhalten wurden.
Präparative Bedingungen für Rohfraktion B
Säule: Cosmosil 5C 18-AR 20 · 250 mm (Nakaraitesque Inc.)
Elutionsmittel: 47%-iges (v/v) wäßriges Acetonitril, enthaltend 0,5% Triethylaminphosphatpuffer, pH 3,0
Flußrate: 9 m/min
Wellenlänge: 230 nm.
Die so erhaltenen Leustroducsine hatten die folgenden Eigenschaften:

Leustroducsin A

1. Chemische Struktur: Formel (Ia), wie oben gezeigt.
2. Beschaffenheit: Sauer und fettlöslich.
3. Farbe: Blaßgelbes Öl.
4. Molekulare Formel: C&sub3;&sub2;H&sub5;&sub2;O&sub1;&sub0;NP.
5. Molekulargewicht: 641, bestimmt mittels der FAB-MS- Methode ("FAB-MS" bedeutet Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry).
6. UV-Absorptionsspektrum: 234 nm (Maximum der Absorption in Methanol).
7. Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotspektrum zeigte die folgenden Absorptionsmaxima (Flüssigfilm, νmaxcm&supmin;¹): 2933, 2867, 1768, 1464, 1383, 1248, 1176, 1056, 969.
8. ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: das Kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in schwerem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als internen Standard ist im folgenden gezeigt:
7,08 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,8 & 4,9 Hz);
6,21-6,35 (2H, Multiplet);
6,06 (1H, Dublett von Dubletts, J = 15,6 & 6,1 Hz);
6,02 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,8 & 1,4 Hz);
5,94 (1H, Dublett, J = 15,6 Hz);
5,46 (1H, Multiplet);
5,31 (1H, Multiplet
5,10 (1H, Dublett von Dubletts, J = 6,1 & 4,4 Hz);
4,94 (1H, Multiplet);
4,72 (1H, Multiplet);
4,29 (1H, Triplet von Dubletts, J = 10,1, 10,1 & 2,4 Hz);
2,93-3,15 (2H, Multiplet);
2,50-2,71 (2H, Multiplet);
2,25 (2H, Triplet, J = 7,6 Hz);
2,16 (1H, Multiplet);
0,99-2,01 (18H, Multiplet);
0,95 (3H, Triplet, J = 7,6 Hz);
0,89 (6H, Dublett, J = 6,8 Hz).
9. ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: (δ: ppm): das kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in schwerem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als internen Standard ist im folgenden gezeigt:
11,4 (Quartet), 22,7 (Triplet), 22,9 (Quartet),
22,9 (Quartet), 24,0 (Triplet), 24,7 (Triplet),
28,9 (Dublett), 32,4 (Triplet), 33,1 (Triplet),
34,3 (Triplet), 35,7 (Triplet), 36,1 (Dublett),
37,1 (Triplet), 39,4 (Triplet), 39,5 (Triplet),
40,6 (Dublett), 40,6 (Triplet), 64,7 (Dublett),
73,9 (Dublett), 77,8 (Singulett), 78,5 (Dublett),
82,3 (Dublett), 121,1 (Dublett), 123,7 (Dublett),
124,3 (Dublett), 127,7 (Dublett), 135,3 (Dublett),
137,3 (Dublett), 138,2 (Dublett), 152,7 (Dublett),
166,3 (Singulett), 175,0 (Singulett).
10. Löslichkeit:
Löslich in Alkoholen, wie z. B. Methanol, Ethanol oder Butanol; löslich in Aceton, Chloroform, Ethylacetat und Dimethylsulfoxid; begrenzte Löslichkeit in Wasser; unlöslich in Hexan.
11. Farbreaktionen:
Positiv mit Schwefelsäure-, Iod-, Ninhydrin- und mit Ammoniummolybdat-Perchloressigsäure-Reaktionen.
12. Hochleistungsflüssigchromatographie:
Trennsäule: Cosmosil 5C 18-AR (Säulengröße 4,6 · 250 mm, ein Produkt von Nakaraitesque Inc.)
Lösungsmittel: 45%-iges (v/v) wäßriges Acetonitril, enthaltend 0,5% Triethylaminphosphatpuffer (pH 3)
Flußrate: 1 ml/min
Wellenlänge: 230 nm
Retentionszeit: 9,06 Minuten und 9,16 Minuten.

Leustroducsin B

1. Chemische Struktur: Formel (Ib), wie oben gezeigt.
2. Beschaffenheit: Sauer und Fettlöslich.
3. Farbe: Blaßgelbes Öl.
4. Molekulare Formel: C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub6;O&sub1;&sub0;NP.
5. Molekulargewicht: 669, bestimmt mittels FAB-MS.
6. UV-Absorptionsspektrum: 234 nm (Maximum der Absorption in Methanol).
7. Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotspektrum zeigte die folgenden Absorptionsmaxima (Flüssigfilm, νmaxcm&supmin;¹): 2927, 2855, 1729, 1463, 1380, 1250, 1172, 1056, 968.
8. ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: das Kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in schwerem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als internen Standard ist im folgenden gezeigt:
7,09 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,8 & 4,9 Hz);
6,21-6,35 (2H, Multiplet);
6,07 (1H, Dublett von Dubletts, J = 15,6 & 6,1 Hz);
6,02 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,8 & 1,5 Hz);
5.94 (1H, Doublett, J = 15,6 Hz);
5,46 (1H, Multiplet);
5,31 (1H, Multiplet);
5,10 (1H, Dublett von Dubletts, J = 6,1 & 4,4 Hz);
4,94 (1H, Multiplet);
4,72 (1H, Multiplet);
4,29 (1H, Triplet von Dubletts, J = 9,9, 9,9 & 2,6 Hz);
2,93-3,15 (2H, Multiplet);
2,50-2,71 (2H, Multiplet);
2,27 (2H, Triplet, J = 7,3 Hz);
2,17 (1H, Multiplet);
1,00-2,01 (22H, Multiplet);
0,95 (3H, Triplet, J = 7,5);
0,87 (3H, Triplet, J = 6,8 Hz);
0,86 (3H, Dublett, J = 6,6 Hz).
9. ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: (δ: ppm): das kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in schwerem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als internen Standard ist im folgenden gezeigt:
11,4 (Quartet), 11,7 (Quartet), 19,6 (Quartet),
22,7 (Triplet), 24,7 (Triplet), 26,4 (Triplet),
27,6 (Triplet), 30,6 (Triplet), 32,4 (Triplet),
33,1 (Triplet), 34,1 (Triplet), 35,5 (Triplet),
35,5 (Dublett), 36,1 (Dublett), 37,1 (Triplet),
37,3 (Triplett), 39,4 (Triplet), 40,6 (Dublett),
40,6 (Triplet), 64,7 (Dublett), 73,9 (Dublett),
77,8 (Singulett), 78,5 (Dublett), 82,3 (Dublett),
121,0 (Dublett), 123,7 (Dublett), 124,3 (Dublett),
127,7 (Dublett), 135,2 (Dublett), 137,4 (Dublett),
138,2 (Dublett), 152,7 (Dublett), 166,4 (Singulett),
175,1 (Singulett).
10. Löslichkeit:
Löslich in Alkoholen, wie z. B. Methanol, Ethanol oder Butanol; löslich in Aceton, Chloroform, Ethylacetat und Dimethylsulfoxid; begrenzte Löslichkeit in Wasser; unlöslich in Hexan.
11. Farbreaktionen:
Positiv mit Schwefelsäure-, Iod-, Ninhydrin- und mit Ammoniummolybdat-Perchloressigsäure-Reaktionen.
12. Hochleistungsflüssigchromatographie:
Trennsäule: Cosmosil 5C 18-AR (Säulengröße 4,6 · 250 mm, ein Produkt von Nakaraitesque Inc.)
Lösungsmittel: 45%-iges (v/v) wäßriges Acetonitril, enthaltend 0,5% Triethylaminphosphatpuffer (pH 3)
Flußrate: 1 ml/min
Wellenlänge: 230 nm
Retentionszeit: 20,62 Minuten und 20,87 Minuten.

Leustroducsin C

1. Chemische Struktur: Formel (Ic), wie oben gezeigt.
2. Beschaffenheit: Sauer und fettlöslich.
3. Farbe: Blaßgelbes Öl.
4. Molekulare Formel: C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub6;O&sub1;&sub0;NP.
5. Molekulargewicht: 669, bestimmt mittels FAB-MS.
6. UV-Absorptionsspektrum: 234 nm (Maximum der Absorption in Methanol).
7. Infrarotabsorptionsspektrum: Das Infrarotspektrum zeigte die folgenden Absoptionsmaxima (Flüssigfilm, νmaxcm&supmin;¹): 2930, 2856, 1728, 1464, 1382, 1252, 1172, 1056, 968.
8. ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: das kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in schwerem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als internen Standard ist im folgenden gezeigt:
7,08 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,8 & 4,9 Hz);
6,21-6,35 (2H, Multiplet);
6,07 (1H, Dublett von Dubletts, J = 15,6 & 6,1 Hz);
6,02 (1H, Dublett von Dubletts, J = 9,8 & 1,5 Hz);
5,94 (1H, Dublett, J = 15,6 Hz);
5,46 (1H, Multiplet);
5,31 (1H, Multiplet);
5,10 (1H, Dublett von Dubletts, J = 6,1 & 4,9 Hz);
4,94 (1H, Multiplet);
4,72 (1H, Multiplet);
4,28 (1H, Triplet von Dubletts, J = 10,1, 10,1 & 2,4 Hz);
2,93-3,15 (2H, Multiplet);
2,50-2,71 (2H, Multiplet);
2,27 (2H, Triplet, J = 7,3 Hz);
2,16 (1H, Multiplet);
1,00-2,01 (22H, Multiplet);
0,95 (3H, Triplet, J = 7,3 Hz);
0,88 (3H, Triplet, J = 6,3 Hz).
9. ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum: (δ: ppm): das kernmagnetische Resonanzspektrum (270 MHz) in schwerem Methanol unter Verwendung von Trimethylsilan als internen Standard ist im folgenden gezeigt:
11,4 (Quartet), 22,7 (Triplet), 23,1 (Quartet),
23,1 (Quartet), 24,7 (Triplet), 26,2 (Triplet),
28,2 (Triplet), 29,1 (Dublett), 30,4 (Triplet),
32,4 (Triplet), 33,1 (Triplet), 34,2 (Triplet),
35,4 (Triplet), 36,1 (Dublett), 37,1 (Triplet),
39,4 (Triplet), 40,0 (Triplet), 40,6 (Dublett),
40,6 (Triplet), 64,6 (Dublett), 73,9 (Dublett),
77,8 (Singulett), 78,4 (Dublett), 82,3 (Dublett),
121.1 (Dublett), 123,7 (Dublett), 124,3 (Dublett),
127,7 (Dublett), 135,2 (Dublett), 137,3 (Dublett),
138,2 (Dublett), 152,7 (Dublett), 166,4 (Singulett),
175,0 (Singulett).
10. Löslichkeit:
Löslich in Alkoholen, wie z. B. Methanol, Ethanol oder Butanol; löslich in Aceton, Chloroform, Ethylacetat und Dimethylsulfoxid; begrenzte Löslichkeit in Wasser; unlöslich in Hexan.
11. Farbreaktionen:
Positiv mit Schwefelsäure-, Iod-, Ninhydrin- und mit Ammoniummolybdat-Perchloressigsäure-Reaktionen.
12. Hochleistungsflüssigchromatographie:
Trennsäule: Cosmosil 5C 18-AR (Säulengröße, 4,6 · 250 mm, ein Produkt von Nakaraitesque Inc.)
Lösungsmittel: 45%-iges (v/v) wäßriges Acetonitril, enthaltend 0,5% Triethylaminphosphatpuffer (pH 3)
Flußrate: 1 ml/min
Wellenlänge: 230 nm
Retentionszeit: 21,90 Minuten und 22,19 Minuten.

BIOLOGISCHE AKTIVITÄT

Die folgenden Testbeispiele werden die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen genauer erklären.

TESTBEISPIEL 1

Stimulation der GM-CSF-Bildung

Die Bestimmung der Stimulierung der GM-CSF-Bildung durch die erfindungsgemäßen Verbindungen wurde im Prinzip unter Verwendung einer Kombination der Methode von Kohama et al. (Experimental Haematology 16, 603-608 (1988)) und der Methode von Kitamura et al. (Journal of Cellular Physiology 140, 323-334 (1989)) durchgeführt. Genauer gesagt wurden KM-102 Zellen, die aus Stromazellen von menschlichem Knochenmark stammen und als Produzenten von GM-CSF dienten, mit einer Probenlösung gemischt, welche auf eine geeignete Konzentration verdünnt war (das "GM-CSF-bildende System").
Nach 24-stündiger Inkubation wurde ein Teil des Kulturüberstandes entnommen und zu einem Kultursystem aus GM-CSF- abhängigen menschlichen TF-1 Zellen gegeben. Nach zwischen 48 und 72 Stunden wurde die Menge an GM-CSF über das Wachstum von TF-1 Zellen gemessen (das "GM-CSF-Assaysystem"), wobei ein Meßwert für die Stimulierung der GM-CSF-Bildung erhalten wurde. Das Wachstum der TF-1 Zellen wurde mit einer Tritium- Thymidin-Pulsmarkierung über 4 Stunden bestimmt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit einem MTT-Kit (Chemicon International Inc., USA), welches das Wachstum von TF-1 Zellen bestimmt, und mit einem ELISA-Kit (Genzyme Inc., USA), welches GM-CSF bestimmt, erhalten. Ob das Induktionssystem zur Bildung von GM-CSF normal funktionierte, wurde mit Hilfe von rekombinantem Interleucin 1β (IL-1β, Genzyme Inc., USA) bestimmt. IL-1β induzierte die Bildung von GM-CSF in einer dosisabhängigen Weise innerhalb eines Bereichs von 1 bis 100 units/ml, und die maximale Bildung von induziertem GM-CSF war 10 bis 20 mal höher als die Bildung ohne IL-1β, was eine normale Funktionsweise des experimentellen Systems zeigte.
Nach der jeweiligen Zugabe einer bestimmten Konzentration von Leustroducsin A, B oder C zu den KM-102 Zellen zeigte sich, daß die GM-CSF-Bildung dosisabhängig induziert wurde. Die Menge an produziertem GM-CSF war maximal 10- bis 20-mal höher als die Menge, die ohne Zugabe produziert wurde. Die ED&sub5;&sub0;- Werte wurden mit 180+50, 50+15 und 50+15 ng/ml für Leustroducsin A, B bzw. C bestimmt.

TESTBEISPIEL 2

Stimulation der G-CSF-Bildung

Die Stimulierung der G-CSF-Bildung wurde mit einem System bestimmt, in welchem das GM-CSF-Assaysystem aus Testbeispiel 1 durch ein G-CSF-Assaysystem (wie von Shirafuji et al.: Experimental Haematology 17, 116-119 (1989) beschrieben) ersetzt war. Genauer gesagt wurden KM-102 Zellen, die aus Stromazellen von menschlichem Knochenmark stammten und als Produzenten von G-CSF dienten, zu einer Leustroducsinlösung gegeben, die auf eine geeignete Konzentration (das "G-CSF- bildende System") gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurde ein Teil des Kulturüberstandes entnommen und zu einem Kultursystem von G-CSF-abhängigen NFS-60 Zellen gegeben. Nach zwischen 24 und 48 Stunden wurde die Menge an G-CSF über das Wachstum von NFS-60 Zellen (das "G-CSF-Assaysystem") bestimmt, wobei Meßwerte für die Stimulation der G-CSF Bildung erhalten wurden. Das Wachstum von NFS-60 Zellen wurde mit Tritium-Thymidin-Pulsmarkierung über 4 Stunden bestimmt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit einem MTT-Kit, welches das Wachstum der NFS-60 Zellen bestimmt, und mit einem ELISA- Kit, welches G-CSF bestimmt, erhalten (Motojima et al.: Journal of Immunological Methods 118, 187-192 (1989)). Ob das induzierende System der G-CSF Bildung normal funktionierte, wurde mit rekombinantem Interleucin 1β (IL-1β, Genzyme Inc., USA) untersucht. IL-1β induzierte die Bildung von GM- CSF in dosisabhängiger Weise innerhalb eines Bereichs von 1 bis 100 units/ml, und die Bildung von induziertem G-CSF war maximal 10- bis 20-mal höher als die Bildung ohne IL-1β, was die normale Funktionsweise des experimentellen Systems zeigte.
Nach der jeweiligen Zugabe von bestimmten Konzentrationen an Leustroducsin A, B und C zu den KM-102 Zellen zeigte sich, daß die G-CSF-Bildung dosisabhängig induziert wird. Die Menge an gebildetem G-CSF war maximal 10- bis 20-mal höher als die Menge, die ohne Zugabe gebildet wurde. Die ED&sub5;&sub0;-Werte wurden mit 200+50, 50+15 und 50+15 ng/ml für Leustroducsin A, B bzw. C ermittelt.

TESTBEISPIEL 3

Stimulierung der NGF-Bildung

Furukawa et al. berichteten, daß Fibroplasten-bildende L-M Zellen, die von konnektivem Gewebe der Maus stammten, verhältnismäßig große Mengen von NGF produzieren und sekretieren, und daß Katecholamine diese Bildung und Sekretion stimulieren (J. Biol. Chem. 261, 6039-6047 (1986)). Es wurde untersucht, ob die Leustroducsine die Bildung und die Sekretion von NGF stimulieren.
L-M Zellen wurden unter Verwendung von Medium 199, das 0,5% Pepton enthielt, kultiviert. In jedes Loch einer 24-Loch Kulturplatte wurden 5 · 10&sup4; L-M Zellen inoculiert und in einem CO&sub2;-Inkubator (37ºC, 5% CO&sub2;) bis zur konfluenten Bewachsung kultiviert. Die Kulturflüssigkeit wurde entfernt, und die Zellen wurden einmal mit Medium 199, das 0,5% Rinderserumalbumin (Sigma) enthielt, gewaschen. Eines der Leustroducsine wurde in einer bestimmten Konzentration zu Medium 199, das 0,5% Rinderserumalbumin enthielt, gegeben, und dann wurden die L-M Zellen mit diesem Gemisch behandelt. Die L-M Zellen wurden dann in einem CO&sub2;-Inkubator 24 Stunden kultiviert. Nach dem Gewinnen der Kulturflüssigkeit wurde NGF in der Flüssigkeit bestimmt.
NGF wurde durch einen Enzymimmunoassay untersucht (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3513-3516 (1983)). In jedes Loch einer 96-Loch Platte aus Polystyrol wurden 75 µl Anti-Maus-β- NGF-Antikörper-Lösung (Boehringer) (0,3 µg/ml, pH 9,6) gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Entfernung des Antikörpers wurden alle Löcher 3 mal mit einer Waschlösung gewaschen. 50 µl von βNGF-Standard (Wako Pure Chem. Ind.) oder von der Standardlösung wurden in jedes Loch gegeben, und das Gemisch wurde 6 bis 8 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde der βNGF-Standard oder die Standardlösung entfernt, und alle Löcher wurden 3 mal gewaschen. 50 µl einer Lösung (100 mU/ml, pH 7,0) eines markierten monoclonalen Anti-βNGF-Antikörpers (Boehringer) wurden in jedes Loch gegeben und die Lösung wurde 15 bis 18 Stunden bei 4ºC stehengelassen. Danach wurde der Enzymmarkierte Antiköper entfernt, und die Löcher wurden 3 mal gewaschen. 100 µl einer Lösung (1 mg/ml, pH 7,3 von Chlorphenol-β-D-galactosid (Boehringer) wurden in jedes Loch gegeben. Nachdem sich eine satte Farbe entwickelt hatte (nach 2 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur) wurde die Absorption bei 570 nm bestimmt. Die Menge an NGF wurde aus der Standardkurve berechnet, und dieser Wert wurde mit der Menge an produziertem und aus der Zelle ohne die Leustroducsinbehandlung sekretiertem NGF in Beziehung gesetzt.
Es zeigte sich, daß alle Leustroducsine die Bildung von NGF dosisabhängig stimulieren. Bei einer Konzentration von 5 µ/ml eines der Leustroducsine wurde, verglichen mit der in Zellen ohne Behandlung, eine zwei- oder mehrfach höhere Bildung von NGF induziert.

TESTBEISPIEL 4

Pilzbekämpfende Aktivität

Um die pilzbekämpfende Aktivität von Leustroducsinen gegen für Tiere pathogene Pilze zu untersuchen, wurde die Aktivität gegen Trichophyton mentagrophytes untersucht. Für jedes der Leustroducsine wurde ein inhibitorischer Kreis bei einer Konzentration von 1 µg/disc beobachtet.

TESTBEISPIEL 5

Akute Toxizität

Gemäß der herkömmlichen Verfahren wurde die akute Toxizität in 5 ddY-Mäusen (männlich) getestet. Nach intraperitonealer Verabreichung einer Dosis von 0,2 mg/kg von Leustroducsin A wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen keine Toxizität beobachtet. Ebenso wurde nach Verabreichung von Leustroducsin B, Leustroducsin C und deren verwandten Derivate keine Toxizität beobachtet.
Aufgrund der oben beschriebenen Ergebnisse ist es offensichtlich, daß die Leustroducsin A, B und C die Bildung von hämatopoietischen Faktoren, wie z. B. des Granolozytenkolonie-stimulierenden Faktors oder des Granolozyten-Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors stimulieren. Dementsprechend sind die Leustroducsine als therapeutische Mittel nützlich, um die Nebeneffekte der Krebschemotherapie und Strahlentherapie zu vermindern. Ebenso schützen sie gegen Infektionen und besitzen Antikrebswirkung über die Aktivierung von Makrophagen. Zusätzlich sind die Leustroducsine nützlich bei der Verbesserung des cerebralen Metabolismus durch die Stimulierung der NGF-Bildung. Des weiteren sind Leustroducsine als pilzbekämpfende Mittel nützlich, was durch ihre pilzbekämpfende Wirkung gegen Trichophyton mentagrophytes gezeigt wurde.

Claims

1. Verbindungen der Formel (I):

worin R eine 5-Methylhexanoyloxygruppe, eine 6-Methyloctanoyloxygruppe oder eine 7-Methyloctanoyloxygruppe bedeutet, und Salze dieser Verbindungen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, welche die Formel (Ia) aufweist:

und Salze dieser Verbindung.

3. Verbindung nach Anspruch 1, welche die Formel (Ib) aufweist:

und Salze dieser Verbindung.

4. Verbindung nach Anspruch 1, welche die Formel (Ic) aufweist:

und Salze dieser Verbindung.

5. Verfahren zur Herstellung mindestens eines Leustroducins der Formel (I)

worin R eine 5-Methylhexanoyloxygruppe, eine 6-Methyloctanoyloxygruppe oder eine 7-Methyloctanoyloxygruppe bedeutet, oder ein Salz davon, welches das Züchten eines Leustroducsin-bildenden Mikroorganismus des Genus Streptomyces und das Gewinnen mindestens eines Leustroducsins aus der Kultur umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Leustroducsin die Formel (Ia) hat:

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Leustroducsin die Formel (Ib) hat:

8. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Leustroducsin die Formel (Ic) hat:

9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ein Leustroducsin-bildender Stamm der Species Streptomyces platensis ist.

10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus Streptomyces platensis SANK 60191 (FERM BP-3288) ist.

11. isolierte Kultur von Streptomyces platensis SANK 60191 (FERM BP-3288).

12. Arzneimittelzusammensetzung, die mindestens ein Leustroducsin oder ein Salz davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 im Gemisch mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägermaterial oder Verdünnungsmittel enthält.

13. Verbindungen der Formel (I) und deren pharmazeutisch geeignete Salze gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung für die Therapie.

14. Verbindungen nach Anspruch 13, wobei die Verwendung zur Behandlung oder Prophylaxe von nachteiligen Reaktionen als Resultat der Chemotherapie oder Radiotherapie von Krebs, Infektionen, Krebs, zerebraler Fehlfunktion und Pilzinfektionen ist.

15. Verwendung von Verbindungen der Formel (I) und pharmazeutisch geeigneten Salzen davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von nachteiligen Reaktionen als Resultat der Chemotherapie oder Radiotherapie von Krebs, Infektionen, Krebs, zerebraler Fehlfunktion und Pilzinfektionen.