DE2816608A1 - Antibiotisches n-acetyl-dehydro- thienamycin - Google Patents
Antibiotisches n-acetyl-dehydro- thienamycinInfo
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Description
DB.-ING. WALTSB Α3ΪΤΖ
DE, DISTEB F. MOBF · 3
DIPL.-PHY8. M. GBIT3CHNSDEB
Patentanwälte
Müpche
η. 17. APRIL 1978
Postanschrift / Postal Address
Fo.stfach SSO 1Ο9, 80OO M3ach.»a
Pienzanauarstraila Telefon 98 3222 Telegramme: Chemindua München
Telex: CO) 523992
7BT6608
MERCK & CO. INC.
Rahway, New Jersey 07065
V. St.A.
16022
Antibiotisches N-Acety1-dehydro-thienamycin
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Die Erfindung betrifft N-Acetyl-dehydro-thienamycin, das sowohl
gegen grampositive als auch gegen gramnegative Bakterien wirksam ist. Das Antibiotikum stellt man durch Kultur einer Streptomyces-Species
in einem geeigneten Fermantationsmedium her.
Die Entdeckung der wertvollen antibiotischen Eigenschaften des
Penicillins führte zu einem bedeutenden Interesse an diesem Gebiet, was dazu führte, dass viele andere wertvolle antibiotische
Substanzen gefunden wurden, wie Streptomycin, Bacitracin, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin und dgl. Im allgemeinen ist
die Aktivität derartiger Antibiotika entweder auf die grarnpositiven oder die gramnegativen bakteriellen Pathogene begrenzt.
Selbst in Fällen, wo ein breiteres Spektrum einer antibiotischen Wirksamkeit erzielt wird, bleiben gewisse pathogene Species entweder
von sich aus unempfindlich oder weisen eine erworbene Resistenz im Verlaufe der intensiven Anwendung der gegenwärtigen
Antibiotika bei der Behandlung verschiedener Krankheiten auf.·
Daher führten die Unzulänglichkeiten der bekannten Antibiotika zu weiteren Forschungen, um andere Antibiotika zu finden, die
über einen weiteren Bereich an Pathogenen bzw. Krankheitserregern wie gegenüber resistenten Stämmen spezieller Mikroorganismen
wirksam sind.
Die Erfindung betrifft ein neues antibiotisches Mittel. Insbesondere
betrifft sie eine neue antibiotische Substanz, die hier als antibiotisches N-Acetyl-dehydro-thienamycin bezeichnet wird.
Die Erfindung umfasst das Antibiotikum in verdünnten Formen, als rohe Konzentrate und in reinen Formen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen und nützlichen Antibiotikums, das bei der Inhibierung
des Wachstums verschiedener gramnegativer und grampositiver Mikro-
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Organismen höchst wirksam ist. Ein weiterer Gegenstand ist die Bereitstellung eines Verfahrens zurHerstellung dieser neuen antibiotischen
Substanz durch Fermentation von Nährmedien mit dem hier beschriebenen Mikroorganismus. Andere Gegenstände und Ziele
der Erfindung sind aus der folgenden genaueren Beschreibung ersichtlich.
Die neue erfindungsgemasse antibiotische Substanz wird erzeugt
durch das Wachstum des Mikroorganismus Streptomyces cattleya unter gesteuerten Bedingungen.
Auf der Basis ausgedehnter taxonomischer Untersuchungen wurde aus einer Erdprobe isolierter Streptomyces cattleya in der Kultursammlung
der Merck & Co. Inc., Rahway, New Jersey mit der Nummer MA-4297 bezeichnet. Eine Probe hiervon wurde permanent
in der Kultursammlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division,
Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und mit der Nummer NRRL 8057 bezeichnet.
Es ist bekannt, dass Streptomyces cattleya (NRRL 8057) das Antibiotikum
Thienamycin produziert. Die Erzeugung, Isolierung und die Charakteristika des Antibiotikums Thienamycin, sowie die
morphologischen und Kulturcharakteristika von Streptomyces cattleya sind in der US-PS 3 950 357 beschrieben. Der Inhalt der
US-PS 3 950 357 soll von der vorliegenden Beschreibung umfasst werden.
Das neue erfindungsgemasse Antibiotikum N-Acetyl-dehydro-thienamycin
wird bei der aeroben Fermentation geeigneter wässriger Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch Inokulieren mit
dem Organismus Streptomyces cattleya produziert. Zur Herstellung des Antibiotkums N-Acetyl-dehydro- thienamycin sind wässrige Medien,
wie die für die Herstellung anderer Antibiotika verwendeten geeignet. Derartige Medien enthalten Quellen für Kohlen-
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stoff, Stickstoff und anorganische Salze, die durch den Mikroorganismus
assimilierbar sind.
Im allgemeinen können Kohlenhydrate wie Zucker, beispielsweise
Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose bzw. Sucrose, Xylose, Mannit und dgl. sowie Stärken wie Getreidekörner, beispielsweise
Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dgl., entweder allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff
in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der verwendeten Quelle oder Quellen für Kohlenhydrate in dem Medium hängt
teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums ab, jedoch variiert im allgemeinen die Menge an Kohlenhydraten zwischen
etwa 1 Gew.-% und 6 Gew.-% des Mediums. Diese Kohlenstoffquellen
können entweder einzeln verwendet werden oder können mehrere derartiger Kohlenstoffquellen in dam Medium kombiniert werden, Im
allgemeinen können viele proteinhaltige Materialien als Stickstoffquellen
bei dem Fermantationsverfahren verwendet v/erden. Geeignete
Stickstoffquellen umfassen beispielsweise Hefe-Hydrolysate,
primäre Hefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate
von Casein, Maisquellflüssigkeit, lösliche, bzw. aufschlämmbare
Schlempenanteile (Distillers solubles) oder Tomatenpaste und dgl. Die Stickstoffquellen werden entweder allein oder in Kombination
in Mengen verwendet, die von etwa 0,2 Gew.-% bis 6 Gew.-% des
wässrigen Mediums betragen.
Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingearbeitet
werden können, befinden sich die üblichen Salze, die geeignet sind zur Lieferung von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium,
Phosphat, Sulfat, Chlorid, Carbonat und ähnlichen Ionen. Umfasst werden auch Spurenmetalle wie Coblat, Mangan, Eisen und
Magnesium.
Es sei festgestellt, dass die in den Beispielen beschriebenen
Medien lediglich Beispiele für die Vielzahl von verwendbaren
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Medien sind und keine Einschränkung darstellen sollen.
Man führt die Fermentation bei Temperaturen von etwa 20 C bis 37°C durc'nj jedoch ist es für optimale Ergebnisse bevorzugt, die
Fermentation bei Temperaturen von etv/a 22°C bis 300C durchzuführen.
Der pH-Wert der Nährmedien der für das Wachstum der Streptomyces
cattleya Kultur und die Produktion des Antibiotikums N-Acetyl-dehydro-thienarnycin
geeignet ist, kann von etwa 6,0 bis 8,0 variieren.
Zwar wird das Antibiotikum N-Acetyl-dehydro-thienatnycin sowohl
durch Oberflächenkultur als auch durch submerge Kultur bzw. Tauchkultur
erzeugt, jedoch ist es bevorzugt, die Fermentation im submergen Zustand durchzuführen.
Fermentation des Antibiotikums in geringem Masstab führt man zweckmässig durch, durch Animpfen eines geeigneten Nährmediums
mit der, das Antibiotikum produzierenden Kultur und nach Übertragen auf ein Produktionsmedium die Fermentation bei einer konstanten
Temperatur von etwa 25 C in einer Schüttelvorrichtung während mehrere Tage fortschreiten zu lassen.
Man führt die Fermentation in einem sterilisierten Kolben durch, mittels einer ein-, zwei-, drei- oder vierstufigen Animpfungsentwicklung.
Das Nährmedium für die Animpfungsstufe kann aus jeglicher geeigneten Kombination von Quellen für Kohlenstoff
und Stickstoff bestehen. Der Animpfungskolben wird in einer Kammer
mit konstanter Temperatur von etwa 28 C während zwei Tagen oder bis zu einem zufriedenstellenden Wachstum geschüttelt und
ein Anteil des resultierenden Wachstums wird zur Inokulation von entweder einer zweiten Animpfungsstufe oder des Produktionsmediums verwendet. Gegebenenfalls verwendete Zwischenstufen-Animpfungskolben
werden in im wesentlichen gleicher Weise entwikkelt;
d. h. ein Teil des Inhalts der letzten Animpfungskolben
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wird zur Inokulation des Produktionsmediums verwendet. Die inokulierten
Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt und am Ende der Inkubationszeit wird der Inhalt der
Kolben zentrifugiert oder filtriert.
Für Arbeiten im grossen Masstab ist es bevorzugt, die Fermentation
in geeigneten Behältern durchzuführen, die mit einem Rührer
und Einrichtungen zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgerüstet
sind. Nach dieser Verfahrensweise wird das Nährmedium in
dem Tank bereitet und durch Erwärmen auf Temperaturen bis zu etwa 1200C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte
Medium mit einer vorher gezogenen Animpfung der Produktionskultur inokuliert und man lässt die Fermentation während eines
Zeitraums von wie beispielsweise 3 bis 5 Tagen unter Rühren und/oder Belüften des Nährmediums fortschreiten, wobei man die
Temperatur bei etwa 25°C hält. Diese Verfahrenweise zur Herstellung
des Antibiotikums N-Acetyl-dehydro-thienamycin ist besonders geeignet zur Herstellung grosser Mengen des Antibiotikums.
In folgenden werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften
des Antibiotikums M-Acetyl-dehydro-thienamycin angegeben.
N-Acetyl-dehydro-thienamycin weist die empirische Formel C. -H-^-NpO1-S auf. Die berechnete elementare Zusammensetzung, die
dieser Formel entspricht ist: 49,99 % Kohlenstoff, 5,16 % Wasserstoff, 8,97 % Stickstoff, 25,61 % Sauerstoff und 10,26%Schwefel.
Das Kernmagnetische-Resonanz-Spektrum (NMR-Spektrum) des N-Acetyl-dehydro-thienamycins
zeigt bei 300 MHz in D5O folgende
charakteristische Signale, in denen die chemischen Verschiebungen in Teilen pro Million (ppm) bezogen auf den internen Standard
Natrium-2,2-dimethyl-2~silapentan-5-sulfonat (DSS) und die Kopplungskonstanten
in Hz angegeben sind:
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1,29 (d, J = 6, CH3); 2,08 (S, CH3C°);
3,10 (d,d, J = 12,5, 8,7, IH von CH2O;
3.21 (d,d, J = 12,5, 9,5, IH von CH2O;
3,39 (d,d, J = 6,0, 2,5, Hg);
4.22 (m, H5 und H7);
6,07 (d, J = 13,5, HC=);
6,07 (d, J = 13,5, HC=);
7,19 (d, J = 13,5, HC=).
Wurde das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von N-Acetyl-dehydrothienamycin
beim pH-Wert 7 in wässrigen Lösungen gemessen, so zeigte es einen Peak bei 307,5 nm und ein Wellental bei 262 nm.
N-Aceytl-dehydro-thienamycin weist folgende Molekülstruktur auf
CH-J-CH(OH) 1 f \ ti
3 I ^S-CH=CH-NHC-CH3
Das Antibiotikum N-Acetyl-dehydro-thienamycin ist weiter durch
das folgende antibiotische-profilspektrum gekennzeichnet. Die
Untersuchung wurde unter Anwendung der Bauer-Kirby-Scheibendiffusionsmethode
durchgeführt, die lediglich in bezug auf die hier verwendete Agar—Tiefe von 2 mm modifiziert war. Die Ergebnisse,
ausgedrückt als Durchmesser in Millimeter der Inhibierungszone sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Staphylococcus aureus 2985 15,5
Staphylococcus aureus 2314 13,0
Escherichia coli 2884 13,0
Escherichia coli 2891 10,5
Enterobacter cloacae 2646 8,5
Enterobacter cloacae 2647 11,0
+ HEAU wird nachstehend als durch "Hydroxylamin-Auslöschbare
Absorptionseinheiten" definiert.
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N-Aceytl-dehydro-thienarnycin stellt ein wertvolles Antibiotikum
dar, das wirksam ist gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien und dementsprechend Anwendung in der Human-
und Veterinär-Medizin findet. Die erfindungsgemässe Verbindung
kann als antibakterielles Mittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch grampositive oder gramnegative Bakterien
hervorgerufen werden, beispielsweise zur Bekämpfung von Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae und Enterobacter cloacae. Das erfindungs gemässe
antibakterielle Material kann weiter als Zusatz zu Tierfuttermitteln, zur Konservierung von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel
verwendet werden. Beispielsweise kann es in wässrigen
Zusammensetzungen in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Teile Antibiotikum pro Million Teile Lösung verwendet werden, um das
Wachstum schädlicher Bakterien auf medizinischen und zahnmedizinischen Ausrüstungen zu zerstören und zu inhibieren und es
kann auch als Bakterizid für industrielle Anwendungszwecke verwendet werden, beispielsweise in Anstrichmitteln bzw. —farben
auf Wasserbasis und im Siebwasser von Papiermühlen zur Inhibierung des Wachstums schädlicher Bakterien.
Das erfindungsgemässe Antibiotikum kann verwendet weden in einer
Vielzahl von pharmazeutischen Präparaten als einziger aktiver Bestandteil oder in Kombination entweder mit einem oder mehreren
anderen Antibiotika oder mit einer oder mehreren pharmakologisch aktiven Substanzen. Als Beispiel für die erstgenannten kann ein
Aminocyclitol-Antibiotikum wie Gentamicin mit verabreicht werden, um'jegliche Möglichkeit, dass -resistente Organismen auftreten
auf ein Minimum herabzusetzen. Als ein Beispiel für die letztgenannten können Diphenoxylat und Atropin in Dosierungsformen kombiniert werden,- die zur'Therapie der Gastroenteritis bestimmt
sind. Das Antibiotikum kann in Form von Kapseln oder von Tabletten, Pulvern ' , flüssigen Lösungen oder in Form von Suspensionen
oder ΈΙΐχΐεΓβη verwendet werden. Es kann oral, topisch,
intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.
— 7 —
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Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in Dosiseinheitsformen vorliegen und können übliche Excipienten
enthalten,wie Bindemittel, beispielsweise Sirup, Gummiarabicum,
Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat,
Sorbit oder Glycin; Gleitmittel, beispielsweise Magnesiumstearat,
Talkum,Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; desintegrierende Mittel,
z. B. Kartoffelstärke oder verträgliche Benetzungsmittel wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können in üblicher Weise
überzogen sein. Orale flüssige Präparate können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups,
Elixieren usw. vorliegen oder können als trockene Produkte zur Wiederaufbereitung mit Wasser oder anderen geeigneten Vehikeln
vor der Anwendung dargeboten werden. Derartige flüssige Präparate können übliche Zusätze enthalten, wie Suspendiermittel, beispielsweise
Sorbit-Sirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, •Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Alumi—
niumstearatgel oder hydrierte essbare Fette; Emulgiermittel, beispielsweise. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummiarabikum;
nichtwässrige Vehikel, die einschliessen können, essbare Öle, beispielsweise Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölige Ester,
Propylenglykol oder Äthylalkohol; Konserviermittel, beispielsweise Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure.
Suppösitorien enthalten zweckmässig Suppositorien-Grundlagen, z. B. Kakaobutter oder andere Glyceride.
Zusammensetzungen zur Injektion können in Dosiseinheitsform in
Ampullen vorliegen oder in Multidosis-Behältern, bei Zusatz eines Konservierungsmittels. Die Zusammensetzungen können Formen
annehmen wie Supensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln bzw. Medien und können Formulierungsmittel
enthalten wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulverform
vorliegen zur Wiederaufbereitung in einem geeigneten Medium, z. B. sterilem, pyrogen-freiem Wasser, vor der Anwendung.
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Die Zusammensetzungen können auch in geeigneten Formen zur Absorption
durch die mucösen Membranen der Nase, des Rachens oder der Bronchialgewebe hergestellt werden und können zweckmässig
die Form von pulverförmigen oder flüssigen Sprays oder Inhalaten, Pastillen, Rachenpinselungen usw.einnehmen. Zur Medikation
der .Augen oder Ohren können die Präparate als Einzelkapseln in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen oder können sie als
Tropfen usw. verwendet werden. Für die topische Anwendung kann in hydrophoben oder hydrophilen Grundlagen formuliert werden, wie
Salben, Cremes, Lotionen, Pinselungen, Pulver usw.
Zusätzlich zu einem Träger können die vorliegenden Zusammensetzungen
auch andere Bestandteile enthalten, wie Stabilisatoren, Bindemitttel, Antioxidantien, Konserviermittel, Gleitmittel,
Suspendiermittel, Viskositätsmittel oder Aromamittel und dgl.
In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Küken, Kühen, Schafen, Schweinen und dgl. können die Zusammensetzung beispielsweise
als intramammare Präparate formuliert werden, entweder in langwirksamen oder schnell freisetzenden Grundlagen.
Die zu verabreichende Dosis hängt bis zu einem grossen Ausmass von den Bedingungen des zu behandelnden Patienten, dem Gewicht
des Patienten und der Art der Infektion, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung ab, wobei der parenterale Weg für allgemeine
Infektionen und der orale Weg für intestinale Infektionen bevorzugt sind.
Von der Erfindung umfasst werden die nichttoxischen pharmazeutisch
brauchbaren bzw. verträglichen Salze von N-Acetyl-dehydrothienamycin,
beispielsweise die pharmazeutisch verträglichen Salze, die mit anorganischen oder organischen Basen gebildet
werden; einschliesslich beispielsweise Metallsalzen, die sich ableiten von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxiden,
-carbonaten oder -bicarbonaten, wie die sich von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium herleitenden, sowie die Salze, die von pri-
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mären,sekundären oder tertiären Aminen stammen, wie Monoalkylaminen
, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niedrig-Alkanolaminen, Diniedrig-Alkanolaminen,
niedrig-Alkylendiaminen, Ν,Ν-Diaralkylniedrig-alkylendianiinen,
Aralkylaminen, aminosubstituierten niedrig-Alkanolen, Ν,Ν-Di-niedrig-Alkylamino-substituierten
-niedrig-Alkanolen, Aminopolyamino- und Guanidino-substituierten niedrig-Alkansäurenund Stickstoff enthaltenden heterocyclischen
Aminen.
Bei der Behandlung von Bakterieninfektionen beim Menschen wird
die erfindungsgemässe Verbindung oral oder parenteral nach üblichen
Verfahrensweisen für die Verabreichung von Antibiotika
in einer Menge von etwa 2 bis 600 mg/kg/Tag und vorzugsweise etwa 2 bis 50 mg/kg/Tag in vorzugsweise aufgeteilten Dosierungen,
z. B. während drei oder vier Malen am Tag verabreicht. Sie können in Dosiseinheitsformen verabreicht werden, die beispielsweise
25, 250, 500 oder 1000 mg aktiven Bestandteil enthalten, zusammen mit geeigneten physiologisch brauchbaren Trägem oder
Excipienten. Die Dosiseinheiten liegen in Form von flüssigen
Präparaten vor, wie Lösungen oder Suspensioen oder als Feststoffe in Tabletten oder Kapseln. Es versteht sich, dass die optimale
Dosis in jedem Einzelfall von der Art und der Stärke der zu behandelnden
Infektion abhängt und dass für pädiatrische Zwecke geringere Dosierungen angewendet werden, wobei derartige Änderungen
sich im Bereich des fachmännischen Könnens bewegen.
Die Antibiotika enthaltenden Fermentationsbruhen, die nach dem
erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden, weisen geschätzte
Aktivitäten im Bereich von etwa 0,1 bis. 2 ,ug pro ml auf. Antibiotische
Präparate können gereinigt werden und das Antibiotikum kann gemäss verschiedenen Verfahrensweisen gewonnen werden.
Eine derartige Verfahrensweise besteht darin, die angesäuerten
(z.B. HCl, HpSO4, Essigsäure) Fermentafcionsbrühen mit Äthylacetat,
Isobutylketon, Amylacetat oder ähnlichen Lösungsmitteln zu extrahieren und die isolierte Lösungsmittelphase in eine wasser 10 -
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rige Lösung rückzuextrahieren, die bei einem pH-Wert von 5,5 bis
7,5 gehalten wird.
Die weitere Reinigung kann dadurch erzielt werden, dass man einen derartigen Extrakt durch eine Säule mit Siliciumdioxidgelteilchen
leitet, die eine gebundene Kohlenwasserstoffoberfläche,
vorzugsweise C^g tragen. Wird eine weitere Reinigung gewünscht,
so kann das Eluat durch eine Säule geleitet werden, die mit einem Polystyrol, nichtpolaren , hydrophoben, quervernetzten Divinylbenzol-Polymeren,
wie XAD-I, 2 und 4, vorzugsweise XAD 2 (Handelsprodukt der Rohm & Haas, Washington Square, Philadelphia 5,
Pennsylvalnien)., gefüllt ist.
Eine Verfahrensweise zur Erzielung einer weiteren Reinigung besteht
darin, das vorstehende Eluat in 50 % Methanol durch eine Säule zu leiten, die ein stark basisches Anionenaustauscher-Harz
enthält. Beispiele für derartige Harze sind Harze mit einer Styrol-Divinylbenzol-Matrix,
beispielsweise das Polystyrol-nukleare quaternäre Ammonium-Harz Dowex 1x4 (Handelsprodukt der Dow Chemical
Cq., Midland, Michigan), in der Chlorid-Form. Andere Beispiele
für diese Klasse starkbasischer Ionenaustauscher-Harze umfassen: Düolite A-40, A-42, A-IOl, A-102 und A-114 (Handelsprodukte
der Chemical Process Co., Redwood City, Kalifornien); Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-410 (Handelsprodukte der Rohm & Haas,
Washington Square, Philadelphia 5, Pennsylvanien).
Das in dem Eluat enthaltene Antibiotikum kann weiter gereinigt werden, durch Gelfiltration, durch ein Polyacrylamidgel mit
einer Porengrösse, die Moleküle ausschliesst, die ein Molekulargewicht über 1800 aufweisen. Ein bevorzugtes Gel ist das Bio-Gel
P-2 (Handelsprodukt der Bio Red, Richmond, Kalifornien).
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung von reinem N-Acetyldehydro-thienamycin
besteht darin, es aus angesäuerter Brühe zu extrahieren unter Anwendung von Äthylacetat, die abgetrennte
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/Hf.
Lösungsmittelphase rückzuextrahieren mit einer neutralen wässrigen
Lösung und das wässrige Rückextraktionsmittel durch eine Säule mit Siliciumdioxidgelteilchen, die eine gebundene C^g-Oberflache
tragen, zu leiten. Das gewonnene Eluat kann weiter durch Chromatographie in 50 % Methanol an Anionenaustauscher-Harzen
des Polystyrol-Trimethylammonium-Typs (z. "B. Dowex 1x4
Cl bis etwa 0,037 mm - 400 mesh) und Gelpermeations-Harzen (z. B. Bio Gel P-2, etwa 0,074 bis etwa 0,037 mm, 200-400 mesh)
gereinigt werden.
Die Untersuchung der biologischen Aktivität führt man nach der folgenden Scheibendiffusionsmethode durch unter Anwendung von
entweder Staphylococcus aureus ATCC 6538P oder Vibro percolans ATCC 8461 als Testorganismus.
Ein Übernacht-Wachstum bei 37°C von Staphylococcus aureus ATCC
6538P in einer N.ährbrühe plus 0,2 % Hafeextrakt (MBYE) verdünnt
man mit NBYE auf eine Suspension mit einer 40 %igen Durchlässigkeit
bei einer Wellenlänge von 660 nm. Ein Anteil von 33,2 ml dieser verdünnten Suspension wird zu einem Liter NBYE gefügt,
der 15 g Agar enthält und bei 47-48 C gehalten wird. 10 ml Anteile dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser
gegossen und diese Platten werden gekühlt und bis zur Anwendung (maximal 5 Tage)bei 4 C gehalten.
Ein Übernacht^Wachstum bei 28°C von Vibrio percolans ATCC 8461
in einer Nährbrühe plus 0,2 % Hefeextrakt (NBYE) verdünnt man mit NBYE auf eine Suspension mit einer 50 %igen Durchlässigkeit
bei 660 nm. Ein Anteil von 33,2 ml dieser verdünnten Kultur wird zu 1 1 NBYE gefügt, der 15 g Agar enthält und bei
46°C gehalten wird. 5 ml Anteile dieser Suspension giesst man in Petrischalen von 85 mm Durchmesser und diese . Platten werden
<
ten.
ten.
den gekühlt und bei 4°C bis zur Anwendung (maximal 5 Tage) gehal-
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Proben des zu untersuchenden Antibiotikums werden auf eine geeignete
Konzentration verdünnt und in Scheiben von 6,25 mm (1/4 inch) oder 12,5 mm (1/2 inch) aufgebracht, wobei 25,ul auf eine
6,25 mm (1/4 inch) Scheibe und 100,ul auf eine 12,5 mm (1/2 inch)
Scheibe angewendet werden. Die Scheiben werden auf die Oberfläche der Untersuchungsplatte aufgelegt. Staphylococcus aureus-Platten
werden über Nacht bei 37°C inkubiert; Vibrio percolans-Platten
werden über Nacht bei 28 C inkubiert. Die Inhibierungszone wird als mm-Durchmesser gemessen und bestimmt den Antibiotika-Gehalt.
Mit Hydroxylamin auslöschbare Absorptions-Einheiten (HEAU):
Der Anteil der Absorption . der nahe oder am UV-Absorptionsmaximum
gemessen wird, der dem Antibiotika-Gehalt der Proben zugeordnet werden kann, wird durch die selektive Extinktion dieser
Absorption (bei gleichzeitiger Inaktivierung der Aktivität des Antibiotikums) nach Reaktion mit verdünntem Hydroxylamin gemessen.
Frisch bereitetes, neutralisiertes Hydroxylamin (NHpOH.HCl plus
NaOH auf einen endgültigen pH-Wert von 7) wird zu nichtgepufferten proben des zu untersuchenden Antibiotikums gefügt; im Falle
von gutgepufferten Lösungen mit neutralem pH-Wert wird nichtneutralisiertes
NH2OH-HCl verwendet. Hydroxylamin wird auf eine
Endkonzentration von 10 mMol zugesetzt und man lässt die Reaktion
während mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur fortschreiten. Die resultierende Absorption in der umgesetzten Probe ergibt bei
Subtraktion von der einer nicht umgesetzten Probe (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagenz) die durch
Hydroxylamin auslöschbare Absorption. Eine HEAU an Antibiotikum, vorhanden in 1 ml weist eine durch Hydroxylamin auslöschbare Absorption
von 1,0 auf.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Verfahrensweisen,
durch die die erfindungsgemässen Produkte erhalten werden können. Diese Beispiele dienen lediglich zur Veranschaulichung
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und sollen die Erfindung nicht beschränken. Beispiel 1
Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces catt
leya MA-4297 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in einem 250 ml-Erlenrneyer-Kolben mit Prallwänden suspendiert r der 50 ml
des sterilen Mediums A der folgenden Zusammensetzung enthält:
| Medzum A | 10,0 g |
| HereautoIysat | 10,0 g |
| Glucose | 2,0 ml |
| Phosphatpuffer+ | 0,05 g |
| MgSO4.7H2O | 2,0 g |
| CaCO3 ++ | 1000 ml |
| destilliertes Wasser | |
pH-Wert eingestellt mit NaOH auf 6,5
+Phosphatpufferlösung
KH3PO4 91,0 g
Na2HPO4 95,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
++ zugesetzt nach Einstellung des pH-Wertes
Der inokulierte Kolben wird 30 Stunden bei 28 C mit 220 Upm geschüttelt
(5,08 cm, 2-inch-Schwingweite). 40 ml der vorstehenden 30-stündigen Brühe werden aseptisch entfernt und mit 40 ml sterilem
Glycerin ( 20 % Vol/Vol) vermischt. Mengen von 2 ml des GIycerin-Gemischs
werden in sterile Fläschchen zum Einmal-Gebrauch pipetüert, die anschliessendgefrohren und in der Dampfphase eines
Gefriergerätes mit flüssigem Stickstoff gelagert werden.
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Der Inhalt einesgefrohrenen Fläschchens wird zur Animpfung eines
250 ml-Erlenmeyer-Kolbens mit Prallwänden verwendet, der 50 ml
Medium B der folgenden Zusammensetzung enthält:
| Medium B | 10,0 g |
| HefeautoIysat | 10,0 g |
| Glucose | 2,0 ml |
| Phosphatpuffer+ | 0,05 g |
| MgSO4-7HpO | 1000 ml |
| destilliertes HpO | |
pH-Wert mit NaOH eingestellt auf 6,5
+ Phosphatpufferlösung :
KH2P04 91,0 g.
Na3HPO4 95,0 g
destilliertes HpO 1000 ml
Dieser Animpfungskolben wird während 48 Stunden bei 28 C mit
220 Upm (5,08cm, 2-ich-Schwingweite) geschüttelt. Aliquote Teile von 0,8 ml dieses Animpfungskolbens werden zur Inokulierung
von 6 mit Prallwänden versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 40 ml Medium B der gleichen Zusammensetzung wie das
vorstehende Medium B enthalten. Diese 6 mit Prallwänden versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben werden 24 Stunden bei 28°C mit
220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 40 ml steriles Glycerin (20 % Vol/Vol) werden in jeden Kolben gefügt. Aliquote
Teile von 2,5 ml der resultierenden Gemische werden in sterile Einwegfläschchen pipettiert, die zur Identifizierung
beschriftet werden und bei -87°C gelagert werden.
Eines der vorstehendengefrohrenen', beschriebenen Fläschchen wird
bei 37°C aufgetaut und 1 ml des Inhalts wird zur Inokulierung
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eines mit Prallwänden versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolbens verwendet,
der 40 ml Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium C
Saccharose (Sucrose) 30,0 g
lösliche und suspendierbare Schlempenanteile (Distillers Solubles) 15,0 g
Hefeextrakt 5,0 g
destilliertes H2O 1000 ml
pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt
Dieser Animpfungskolben wir"d 48 Stunden bei 28°C mit 220 Upm
(5,08 cm,2inch , Schwingweite) geschüttelt. 1 ml Anteile aus diesem Animpfungskolben werden zur Animpfung von 4 mit Prallwänden
versehenen 250 ml—Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 40 ml der vorstehenden Medium C-Zusamrnensetzung enthalten. Diese
Anxmpfingskolben der zweiten Stufe werden 24 Stunden bei 48 C
mit 220 Upm (5,08 cm, 2-ich-Schwingweite) geschüttelt.
ml Anteile dieser Animpfungskolben der zweiten Stufe werden
verwendet zur Animpfung von 12 2-1-Erlenmeyer-Kolben, die 160 ml
Medium D der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium D
Glycerin 15,0 g
Maisquellflüssigkeit 15,0 g Geflügelmehl 10,0 g
lösliche und suspendierbare Schlempenanteile (Distillers Solubles) 15,0 g
CoCl2-6H2O 0,01 g
CaCO3 3,0 g
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■/Ifl.
Polyglykol 2000 0,25 % VoI destilliertes H3O 1000 ml
pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt
Diese Produktionskolben werden 5 Tage lang bei 25°C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt.
1 ml Anteile des Mediums C der Animpfungskolben der zweiten
Stufe werden zur Animpfung von 250 ml-Erlenmeyer-Kolben mit
Prallwänden verwendet, die 40 ml des vorstehend beschriebenen Mediums C enthalten. Diese Animpfungskolben der dritten Stufe
werden 24 Stunden
weite) verwendet.
weite) verwendet.
werden 24 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwing-
8 ml Anteile dieser dritten Animpfungskolben werden zur Animpfung von 7 2-1-Erlenmeyer-Kolben verwendet, die 160 ml des vorstehend
beschriebenen Mediums D enthalten. Diese Produktionskolben werden 4 Tage bei 25°C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite)
verwendet.
Die Brühen von 8 Kolben einer 5-tägigen Fermentation werden vereint
und der pH-Wert beträgt 6,75. Die vereinten Brühen werden auf 5-100C gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit Hilfe von Super-Cel filtriert
und das Filtrah wird bei 00C gehalten.
Die Brühen von 6 Kolben der 4-tägigen Fermentation werden vereint und der pH-Wert beträgt 6,35. Diese vereinten Brühen werden
auf 5-100C gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit Super-Cel filtriert. 780 ml der filtrierten 4-tägigen Fermentationsbrühe werden mit
966 ml der filtrierten 5-tägigen Fermentationsbrühe vereint. Das vereinte Filtrat wird in 7 Teile von 250 ml aufgeteilt und
jeder Teil wird mit 2,5 n-HCl auf den pH-Wert 5 gebracht und
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bei 5°C mit 250 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase
wird abgetrennt und mit 6,65 ml 0,Im-MES [2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure]
rückextrahiert, der pH-Wert 7 wird mit einer ausreichenden Menge mit 2,5n-NaOH ergänzt, um den pH-Wert
des wässrigen Rückextrakts auf 6,8-7,2 zu bringen. Der wässrige Rückextrakt wird abgetrennt und verbleibende Spuren
von Äthylacetat v/erden entfernt durch Leiten eines Stickstoffstromes über die Oberfläche.
Die vereinten Rückextrakte weisen ein Gesamtvolumen von 42,5 ml, einen pH-Wert von 7,03 auf und enthalten 12,75 HEAU, gemessen
bei 307 nm.
Die vereinten Rückextrakte werden durch Rotationsverdampfen auf 7,65 ml konzentriert. Ein Anteil von 0,1 ml wird zur Untersuchung
entfernt und der Rest wird auf ein flüssiges Chromatographie-System aufgebracht, das wie folgt hergestellt wurde:
2 Säulen aus rostfreiem Stahl von 2,54 χ 91,44 cm (1 inch x 36
inch), gefüllt mit Bondapak C,g/Porasil B,\R} mit einem Teilchengrössenbereich
von 3 7-75,um (Mikron) werden in Reihe über ein 0,076 cm (0,03-inch)-Rohr aus rostfreiem Stahl von 15,24 cm
(6inch) Länge gekoppelt. Die Säulen werden in einen Wassermantel eingesetzt und auf 40 C erwärmtes Wasser wird kontinuierlich
durch den Mantel zirkuliert. Die Säule wird vor der Anwendung mit 0,01 m-Kaliurnphosphatpuffer vom pH-Wert 5,6: Acetonitril,
95:5(Vol/Vol) equilibriert . Die Probe wird unter Anwendung eines Altex Scientific, Inc. Model 202-00-Rotationseinspritzventils,
ausgerüstet mit einer 10 ml-Schleife eines Teflon-Schlauches
aufgetragen.
Die Säule wird mit dem vorstehenden Puffer mit einer Geschwindigkeit
von 8 ml pro 3 Minunten entwickelt und bei 307 nm überwacht unter Anwendung eines Ultraviolett-Absorptions-Monitors,
ausgerüstet mit einer Fließzelle von 1 cm Fließweg (Laboratoy Data Control Constametric II (R)). Man sammelt Fraktionen von
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ml und fügt einen Anteil von 20 ul von 0,ImKpPO, zu jeder
Fraktion. Die Fraktionen werden auf 00C gekühlt und auf ihre
biologische Aktivität an Untersuchungsplatten mit Staphylococcus aureus bewertet.
Die Aktivität des N-Acetyl-dehydro-thienamycins tritt bei
624 ml bis 688 ml Eluat auf. Diese Fraktionen werden vereint, mit 2,5 n-NaOH auf den pH-Wert 6,85 eingestellt und es zeigt
sich, dass sie bei 307 nm 9,2 HEAU enthalten. Die vereinten Fraktionen werden durch Rotationsverdampfen auf 1 ml konzentriert,
den man auf eine Säule von 1,3 χ 8 cm mit vorgeivaschenem
XAD-2 aufträgt. Das XAD-2 ist säulenweise nacheinander vorgewaschen mit 4 Säulenvolumina von: 1) 0,001m EDTA; 2)
In-NaOH; 3) entionisiertem H3O; 4) In-HCl; 5) entionisiertem
HpO; 6) Methanol; 7) Aceton; und 8) entionisiertem Wasser. Nach Auftrag der Proben werden 1 ml destilliertes Wasser aufgetragen,
bevor die Säule mit destilliertem Wasser entwickelt wird. Die Fraktionen 1-5 enthalten 5,56 ml ; die restlichen
Fraktionen 1 ml, gesammelt bei etwa 1 ml/Minute. Die Fraktionen werden auf die biologische Wirksamkeit auf Vibrio percolans-Untersuchungsplatten
untersucht. Der Hauptanteil des N-Acetyl-dehydro-thienamycins befindet sich in den Fraktionen 9-30.
Diese Fraktionen enthalten 2,57 HEAU, gemessen bei 307 nm»
Ein gemäss Beispiel 1 hergestelltes, gefrohrenes MA-4297-Fläschchen,
das markiert ist, um anzuzeigen, dass es Streptomyces cattleya enthält, wird bei 37°C aufgetaut und 1 ml des Inhalts
wird zur Animpfung eines mit Trennwänden versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolbens
verwendet, der 40 ml Medium C der folgenden Zusammensetzung enthält:
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16022 Λ
Medium C
Saccharose (Sucrose) 30,0 g
lösliche und suspendierbare Schlempenanteile (Destillers Solubles) 15,0 g
Hefeextrakt 5,0 g
destilliertes Wasser 1000 ml
pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt
Dieser Animfpungskolben wird 48 Stunden bei 28°C mit 220 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 1 ml Anteile aus
diesem Animfpungskolben werden zur Animpfung von 5 mit Prallwänden
versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verwandet, die
40 ml des vorstehend beschriebenen Mediums C enthalten. Diese Animpfungskolben werden 24 Stunden bei 28 C mit 22 Upm (5,03
cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 8 ml Anteile dieser 24-stündigen Impfkolben werden zur Animpfung von 16 2-1-Erlenmeyer-Xolben
verwendet die 160 ml Medium D der folgenden Zusammensetzung enthalten:
Medium D
Glycerin
Maisquellflüssigkeit
Geflügelmehl
lösliche und suspendierbare Schlempenanfceile (Destillers
Solubules
CoCl2-6H2O
CaCO3
CaCO3
Polyglykol 2000 destilliertes Wasser
pH-Wert mit NaOH auf 7,5 eingestellt
- 20 809842/1107
| 15,0 | g | g | g | % VoI |
| 15,0 | g | ml | ||
| 10,0 | g | |||
| 15,0 | g | |||
| 0,01 | ||||
| 3,0 | ||||
| 0,25 | ||||
| 1000 |
16022 53
Diese Produktionskolben werden 5 Tage bei 25°C und 150 Upm
(5,08 cm, 2-inch-Schwingweite ) inkubiert.
Die Brühen aus den 16 Produktionskolben werden vereint, auf
5-100C gekühlt und 15 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Die
überstehende Flüssigkeit wird entfernt und mit Hilfe von Super-CeI
filtriert. Die filtrierte Brühe wird in 250 ml Anteile aufgeteilt,von
denen jeder mit 2r5nHCl auf den pH-Wert 2,5 eingestellt
wird und bei 5 C mit zwei aufeinanderfolgenden 250 ml
Anteilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase wird mit 6,65 ml 0,1 m-MES rückextrahiert, pH 7 plus ausreichend 2,5 n-NaOH
(etwa 0,3 ml) um den pH-Wert des wässrigen Rückextrakts auf 6,8-7,2 zu bringen. Die wässrigen Rückextrakte von der ersten
Extraktion jedes Brühenanteils mit Äthylacetat werden als "erste Extrakte" markiert; die der zweiten Lösungsmittelextrak—
'tion werden als "zweite Extrakte!! bezeichnet. Restlieches Äthylacetat in den Extrakten wird entfernt durch Leiten eines Stickstoff
stromes über die Flüssigkeitsoberfläche. Die "ersten Extrakte" werden vereint, wobei man ein Volumen von 67 ml, einen
pH-Wert von 7,05 und insgesamt 45,6 HEAU, gemessen bei 307 nm enthält. Die "zweiten Extrakte" werden vereint, wobei man ein
Volumen von 62 ml, einen pH-Wert von 7,05 und insgesamt 23,6 HEAU, gemessen bei 307 nm erhält.
Die vereinten "ersten Extrakte" werden durch Rotationsverdampfung auf 7 ml konzentriert. Ein Anteil von 50 ,ul wird zur Untersuchung
entnommen und die restlichen 6,95 ml werden auf das flüssigkeits-
R chromatographische Bondpak C-o/PorasilB System aufgebracht,
das in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Säule wird vor der Anwendung mit 0,01 m-Kaliumphosphatpuffer, pH 5,6 : Acetonitril,
95:5 (Vol/Vol) equilibriert und die Säule wird mit dem gleichen
Puffer entwickelt.
Man gewinnt alle 3 Minuten Fraktionen von 10,5 ml,bis 640 ml
Eluat gewonnen sind, wonach 5,25 ml Fraktionen alle 1,5 Minuten
107
• angesammelt werden. Ein Anteil von 20 .ul 0,Im-KpHPO- wird jeder
Fraktion zugesetzt und die Fraktionen werden auf 00C gekühlt
und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten untersucht. Der Hauptanteil an N-Acetyldehydro-thienamycin
ist in dem Elutionsvolumen .597-655 ml enthalten. Diese Fraktionen werden vereint,, mit 2,5 n-NaOH auf
den pH-Wert 7 gebracht und bei 00C gehalten.
Die vereinten "zweiten Extrakte" wurden durch Rotationsverdampfen
auf 6,3 ml konzentriert. Man entnimmt zur Untersuchung einen Anteil von 50,ul und die restlichen 6,25 ml werden auf
R das flüssigkeits-chromatographische Bondpak C^/Porasil B
System aufgebracht, das in Beispiel 1 beschrieben wurde. Vor der Anwendung wird die Säule mit 0,01 m-Kalxumphosphatpuffer,
pH 5,6: Acetonitril, 95:5 (Vol/Vol) equilibriert und die Säule
wird mit dem gleichen Puffer entwickelt.
Man entnimmt Fraktionen von etwa 9 ml alle 3 Minuten. Ein Anteil
von 20.ul 0,Im-KpHPO. wird jeder Fraktion zugesetzt und
die Fraktionen werden auf 00C gekühlt und auf die biologische
Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten bewertet. Die aktiven Fraktionen, die eine N-Acetyl-dehydro-thienamycin-Aktivität
zeigen, werden vereint und mit NaOH auf den pH-Wert 7 gebracht. Diese vereinten Fraktionen enthalten 3,74
HEAU, gemessen bei 307 nm.
Die vereinten Fraktionen werden durch Rotationsverdampfen auf
0,5 ml konzentriert. 0,5 ml Methanol werden zugesetzt. Das Gemisch wird 2 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert,um eine gebildete
Ausfällung abzutrennen. Die Ausfällung bildet eine untere Phase von 0,05-0,1 ml. Die obere Phase wird entfernt und auf
eine Altex-Säule von 25 χ 100 mm, gefüllt mit Bio-Gel P-2,
bis 0,037 mm (-400 mesh) in 50 % Methanol auf ein endgültiges Füllvolumen von 25 χ 75 mm aufgebracht. Die P.robe wird aufgebracht
unter Anwendung eines Rotatxonsinjektionsventxls (Altex
8 0 9%24 2 /1107
Model 202-00) ausgerüstet mit einer 3 ml-Schleife eines Teflon-Rohres.
Die Säule wird mit 50 % Methanol in einer Geschwindigkeit von 3,3 ml/Minute entwickelt und Fraktionen von etwa 0,55 ml werden
gewonnen. Die Fraktionen werden auf 0 C gekühlt und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten
bewertet. Man findet eine N-Acetyl-dehydro-thienamycin-Aktivität zwischen 65 ml und 100 ml Eluat. Die Fraktionen zwischen
65 ml Eluat und 67 ml Eluat werden mit den Fraktionen zwischen 90 ml Eluat und 100 ml Eluat vereint und durch Rotationsverdampf
en auf 3,4 ml konzentriert. Diese Fraktionen enthalten 0,4 HEAU bei 307 nm. Bio-Gel-Fraktionen von 67 ml Eluat bis
90 ml Eluat werden vereint und durch Rotationsverdampfen auf 11,5 ml konzentriert. Diese Fraktionen enthalten 1,4 HEAU, gemessen
bei 307 nm.
Die beiden Bio-Gel P-2-Fraktions-Kombinationen werden vereint .und zu den kombinierten Fraktionen von N-Acetyl-thienamycin
aus der Bondpak C.„/Porasil B -Chromatographie der "ersten
Extrakte" gefügt. Diese Lösung enthält 7,89 HEAU, gemessen bei 307 nm und weist ein Volumen von 68 ml auf. 68 ml Methanol werden
zugesetzt und das resultierende Gemisch wird auf eine präparierte Dowex 1x4 Cl", bis 0,037 mm (-400 mesh) von 1,55 cm χ
21 cm aufgebracht. Die Kolonne wird vor der Anwendung wie folgt präpariert: Das Harz wird durch Abdekantieren von Wasser abgegrenzt,
in die Säule in 50 % Methanol gefüllt und anschliessend mit 7-8 Säulenvolumina an 0,5 m-NaCl in 50 % Methanol, gefolgt
von 7-8 Säulenvolumina 50 % Methanol gewaschen. Die vorstehende
50 % Methanol-Lösung von N-Acetyl-dehydro-thienamycin wird auf
die Säule in einer Geschwindigkeit von lml/Minute aufgebracht, gefolgt von 2-3 ml 50 % Methanol. Die Säule wird in einer Geschwindigkeit
von 1 ml/Minute mit 0,09 m-NaCl plus 0,005 [Ti-NH4Cl
plus 0,0003 m-NH40H in 50 % Methanol; pH = 7,5; entwickelt.
Fraktionen von etwa 5 ml werden gewonnen und auf die biologische Aktivität an Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatten bewertet.
Das N-Acetyl-dehydro-thienataycin findet sich in dem
Elutionvolumen von 505-607 ml. Die Elutionsvolumina von 519-579 ml werden -vereint und sie enthalten 4,4 HEAU, gemessen bei
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307 nm. Diese Fraktionen werden durch Rotationsverdampfen auf
0,6 ml konzentriert. Ein Volumen von 0,6 ml Methanol wird zugefügt und das Gemisch wird 2 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird von dem Salzpellet entfernt. Das Salzpellet wird mit 0,2 ml 50 % Methanol gewaschen und das
Gemisch wird 2 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert. Diese überstehende
Flüssigkeit wird zu der ersten überstehenden Flüssigkeit gefügt. Diese Lösung, die, gemessen bei 307 nm, 3,2 HEAU
enthält, wird auf eine 1,65 χ 37 cm-Säule von Bio-Gel P-2,
etwa 0,074 bis etwa 0,037 mm (200-400 mesh) aufgetragen, die vorher unter Anwendung von 5 ml gesättigter NaCl in 50 % Methanol,
gefolgt von 2-3 Säulenvolumina 50 % Methanol gewaschen worden war. Auf die Probe folgen 2-3 ml 50 % Methanol. Die Säule
wird mit 50 % Methanol entwickelt und Fraktionen von 1,2 ml werden jede Minute entnommen. Die Fraktionen werden auf die
Ultraviolett—Absorption bei 300 nm überwacht und man beobachtet
einen Peak bei den Fraktionen 26-41. Die Fraktionen 28-37, mit einem Verhältnis von 307 nm/262 nm,das grosser als
1 ist, werden vereint und 10 ,ul Im-KaIiumphosphatpuffer, pH 7,
werden zugesetzt. Diese vereinten Fraktionen werden durch Rotationsverdampf en auf etwa 1 ml konzentriert und anschliessend
lyophilisiert und enthalten einen geschätzten HEAU-Wert von 2,28, gemessen bei 307 nm.
Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur eines Isolats von
Streptomyces cattleya MA-4297 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in einem mit Prallwänden versehenen 250 ml-Erlenmeyer-Kolben
suspendiert, der 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung enthält:
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&U984 2/1107
c 2816B08
16022 f
Medium B
Hefeautolysat 10,0 g
Glucose 10,0g
Phosphatpuffer+ 2,0 ml
MgSO4.7H2O 0,05 g
destilliertes H„0 1000 ml
pH-Wert mit NaOH auf 6,5 eingestellt
+ Phosphatpuffer-Lösung
KH2PO4 91,0 g
Na3HPO4 95,0 g
.destilliertes Wasser 1000 ml
Der inokulierte Kolben wird 48 Stunden bei 28°C mit 150 Upm (5,08 cm, 2-inch-Schwingweite) geschüttelt. 10 ml Anteile,
dieser angeimpften Kolbens werden zur Animpfung von 3 2-1-Erlenmeyer-Kolben
mit Prallwänden verwendet, die 500 ml Medium B der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehende Medium B
enthalten. Diese Kolben werden 24 Stunden bei 28°C mit 150 Uprn (5,08 cm, 2-inch-Schwdngweite) geschüttelt. Das Wachstum dieser
2 1—Animpfungskolben wird zur Animpfung eines 756 1-Fermentiergefässes
aus rostfreiem. Stahl verwendet, das 467 1 Medium E der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium E
Glycerin 10,0 g
Pharmamedia 5,0 g
lösliche und suspendierbare Schlempenanteile
(Distillers Solubles) "10»0 g
.6H3O 0,01 g
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CaCO3 3,0 g
Polyglykol 2000 0,25 % VoI Leitungswasser 1000 ml
pH-Wert mit NaOH auf 7,3 eingestellt
Dieser Fermentiertank aus rostfreiem Stahl wird bei 28°C betrieben
unter Anwendung einer Rotationsgeschwindigkeit von
Upm und eines Luftstromes von 0,28 m (10 cubic feet)pro
Minute. Nach 48 Stunden, werden 454 1 dieses Mediums verwendet zur Animfpung eines 5670 1-Fermentiergefässes aus rostfreiem
Stahl, das 4082 1 Medium F der folgenden Zusammensetzung enthält:
Medium F
Maisquellflüssigkeit 15,0 g
Glycerin " 10,0 g
Pharmamedia 5,0 g
lösliche und suspendierbare
Schlempenanteile
(Distillers Solubles) 10,0 g
CoCl2.6H2O 0,01 g
CaCO3 3,0 g
Polyglykol 2000 0,25 % VoI-
Leitungswasser 1000 ml
pH mit NaOH auf 7,3 eingestellt
Dieser Tank wird bei 25°C betrieben unter Anwendung einer Rotationsgeschwindigkeit
von 70 Upm und eines Luftstromes von
1,54 m3 (54,3 cubic feet) pro Minute. Nach 100 Stunden wird ein Anteil von 100 ml entnommen, auf 5-100C gekühlt und
Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit
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809842/1 107
wird mit Hilfe von Super-Cel filtriert. Ein Anteil von 25 ml
des Filtrats wird mit 5 n-HCl auf den pH-Wert 2,2-2,4 eingestellt und bei 5°C mit 25 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatphase
wird abgetrennt und mit 2,5 ml 0,075m -Kaliumphosphatpuffer
vom pH-Wert 7,0 extrahiert. Die wässrige Phase, die 925Ajenthält,
wird abgetrennt und restliche Spuren Äthylacetat v/erden durch Leiten eines Stickstoffstroms über die Flüssigkeitsoberfläche entfernt. Eine 1,27 cm-Scheibe, die 100,ul Rückextrakt
enthält, ergibt auf einer Staphylococcus aureus-Untersuchungsplatte
eine Zone von 24,3 mm.
Ende der Beschreibung
- 27 -
ORiGiNAL INSPECTED 809842/1107
Claims (4)
1. N-Acetyl-dehydro-thienamycin oder seine pharmazeutisch
brauchbaren Salze.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums N-Acetyl-dehydro-thienamycin,
dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces
cattleya in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische
Salze enthält, unter submergen aeroben Bedingungen kultiviert und das Antibiotikum gewinnt.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Organismus Streptomyces cattleya NRRL 8057 kultiviert.
4. Zusammensetzung, enthaltend eine antibakteriell wirksame Menge von N-Acetyl-dehydro-thienamycin und einen nichttoxischen
pharmazeutisch brauchbaren Träger dafür.
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