DE2737491A1

DE2737491A1 - Verfahren zur bestimmung eines immunologisch aktiven materials und system zu seiner durchfuehrung

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Publication number: DE2737491A1
Application number: DE19772737491
Authority: DE
Inventors: Charles Wadsworth
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-08-20
Filing date: 1977-08-19
Publication date: 1978-02-23
Also published as: ES462029A1; SE7609263L; FR2366568A1; AU2790377A; US4198389A; JPS5326321A

Description

PAT ENTANWÄLTE

DR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDEP.ER REINER F. MEYER DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MÜNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDER O TELEGR.: LEDERERPATENT

11. August 1977 IiW 4093/33

Charles Wadsworth, Marklandsgaten 57, Göteborg, Schweden

Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch

aktiven Materials und System zu seiner

Durchführung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials sowie ein System zu seiner Durchführung, insbesondere auf ein rasches und empfindliches Verfahren zur Bestimmung immunologisch aktiven Materials in einer biologischen Flüssigkeit durch Beobachtung einer Antigen-Antikörper-Reaktion nach dem Aufbringen der Reaktionskomponenten auf die Oberfläche eines Gels.

Diagnostische Methoden, die auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Gel beruhen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt· In den letzten Jahren haben sich die Methoden, die radiale Immunodiffu3ion, wie die, die von Mancini et al (Protides biol. Fluids 11, 370, 1964) beschrieben wurde, und Methoden, die den Elektroimmuntest von Laurell (Anal. Bioehem. 15, 45, 1966) anwenden, so verbreitet, daß gebrauchs-

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fertige Platten und Standards zur Messung menschlicher Serumproteine, insbesondere der Immunoglobuline A, G und 'M, im Handel erhältlich sind. Leider haben diese Methoden den Nachteil, große Fehler bei der Mengenbestimmung zu ergeben, die nachgewiesen wurden, wenn die untersuchten Proben und Standards ihrer Art nach auseinander fallen, z.B. im Hinblick auf die Molekülgröße.

Bei der Methode nach Mancini bleiben die Unterschiede in der Diffusionsfähigkeit zu beanstanden, während bei der Methode nach Laurell u.a. Änderungen der Elektromobil!tat und des Diffusionsvermögens als für die Abweichungen bei der Msngenbestimmung verantwortlich angesehen werden.

Die Erfindung, die auf der Tatsache beruht, daß Antigene sov/ie ihre spezifischen Antikörper in einer wässrigen Lösung löslich sind, während die Produkte der Immunfällung unlöslich sind, vermeidet den Einfluß von Diffusion und Elektromobil!tat. Tatsächlich überwindet die Erfindung die Nachteile der früheren Verfahren und bietet ein neues Verfahren, das rasch, genau, einfach durchzuführen und billig ist.

Inbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Flüssigkeit, bei dem eine inerte Gelmatrix auf einem nicht-reaktiven Träger verwendet, eine Probenmenge der Flüssigkeit auf das Gel aufgebracht, der Bereich der aufgebrachten Flüssigkeit mit einer Lösung, die ein spezifisches Material für eine Gegenreaktion enthält, belegt, die nicht umgesetzten löslichen Materialien entfernt und das Ergebnis der Immunreaktion beobachtet wird.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Gesamtprotein in einer Flüssigkeit, bei dem

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eine inerte Gelmatrix auf einem nicht-reaktiven Träger verwendet, eine Probenmenge der Flüssigkeit auf das Gel gebracht wird, die Proteine chemisch fixiert und die Ergebnisse der Reaktion beobachtet werden.

Der Ausdruck "immunologisch aktives Material" bezieht sich auf Bestandteile physiologischer Flüssigkeiten, ZeIl- und Gevrebeextrakte, für die eine immunologische Gegenreaktion zur Verfügung steht oder hervorgerufen werden kann. Typische immunologische Materialien sind primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Sterine, Steroide, Lipoide, Nucleinsäuren, Enzyme, Hormone, Vitamine, Polysaccharide und Alkaloide.

Beispiele für solche immunologisch aktiven Substanzen sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Tabelle I

I. Mikroorganismen Bakterien

1. Gram-positive Kokken

Streptokokken (pyogenes, faecalis und viridans) Staphylokokken (aureus und albus) Pneumokokken (D. pneumoniae)

2. Gram-negative Kokken

Neisseria (gonorrhoeae und meningitidis)

3. Gram-positive aerobe Bazillen
Bacillus anthracis
Corynebacteriura diphtheriae
Erysipelothrix

Listeria monocytogenes

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- X-

4. Gram-positive anaerobe Bazillen

Clostridia (botulinum, perfringens, welchii und tetani)

5. Gram-negative anaerobe Bazillen Bacteroides

6. Gram-negative intestinale Bazillen Eccherichia Klebsiella Enterobacter Proteus Pseudomonas Salmonella Shigella

7. Gram-negative nicht-intestinale Bazillen Pasteurella (pestis und tularensis) Haemophilus influenzae Bruceila (melitensis, abortus und suis) Bordetella pertussis Malleomyces

8. Spirochäten Treponema pallidum Leptospira Borrelia

9. Mycoplasma

10. Mycobakterien

11. Vibrio

12. Actinomyces

Protozoa

1. Intestinale Protozoa Amöben

2. Plagellaten Trichomonaden leishmania

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- sr -

Trypanosomen Toxoplasma

3. Sporozoen

Plasmodien (vivax, falciparuin, malariae und ovale)

4. Eingeweidewürmer (Nematoden) Maden- oder Springwürmer Hakenwürmer Peibschenwürmer

5. Gewebewürmer (Nematoden) Trichinella Pilaria (Wuchereria bancroftii) Dracunculus

6. Trematoden Schistosomen Eingeweide-Saugwürmer Gewebe-Saugwürraer

7. Cestoden Bandwürmer

8. Toxoplasma (T. gondii)

1. Sporotrichum

2. Cryptoccccus

3. Blastomyces

4. Histoplasma

5. Coccidioides

6. Candida

Viren und Rickettsien

1. Rickettsien

2. Viren
Hunde-Hepatitis Shope-Papillom

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10 2737A91

Influenza A & B Hühnerpest Herpes simplex Adenoviren PoIyoma Rous-Sarkom Vaccinia Poliovirus Finnen, Blasenwürmer Hundestaupe Leukämie Mumps

Newcas tle-Krankheit Sendai

ECHO

Maul- und Klauenseuche Psittacose Rabies

Extromelia Baumviren

II. Gewebe-Antigene, einschließlich organspezifische Antigene

Polysaccharide Hyaluronidase Tetanus-Toxin Eialbumin Eiserumalbumin Niere

Leber

Haut

Herz

Verdauungstrakt Prostata Embryo-Antigene (t\'-1 -Fetoprotein)

Tumor-Antigene (carcinoembryonales Antigen) Muskel Collagen Amyloid

III. Hormone

Pituitäre Hormone Insulin Glucagon Thyroidhormon Choriongonadotropin choriones Wachstumshormon - Prolactin

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IV. Enzyme

Pancreas-Chymotrypsinogen Procarboxypeptidase Desoxyribonuclease IJibonuclease Glyceraldehyd-^-phosphat-Dehydrogenase Katalase

Peroxidase

V. Blutzellen-Antigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene

Blutplättchen Megakaryozyten Leukozyten Erythrozyten Blutgruppensubstanzen Forssman-Antigen Gewebeverträglichkeits-Antigene

VI. Plasmaproteine

Fibrin und Fibrinogen Plasminogen und Plasmin Albumin

Immunoglobuline oC-1 -Anti chymotrypsin of-1 -Antitrypsin Komplement-Falctoren Ceruloplasmin Gc-Globulin Haptoglobin of-2-Makroglobulin ^-2-Mikroglobulin

Orosomucoid Präalbumin Transferrin

VII. Milchproteine

Lactoferrin Lysozym

Sekretions-IgA Sekretions-IgM Sekretions-Komponente

VIII. Speichelproteine

Sekretions-IgA Sekretions-IgM Sekretions-Komponente

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IX. Urin-Proteine

X. Pathologische Proteine

Mye1oma-Prο t e in
Makroglobulinaemische Proteine •Dysglobulinaemische Proteine Bence Jones I, Il-Proteine C-reaktives Protein Kryoglobuline

XI. Antikörper einschließlich Autoantikörper

Antikernfaktor

Thyroidautoantikörper Anti-Tamm-Horsfall-Protein Kait-Agglut inine

Rheumatoid-Faktor

Adrenal-Autoantikörper Autoantikörper zu Verdauungstrakt-Wandzellen bei perniziöser Anämie

Anti-Colon

Anti-Leber

Anti-Niere

Autoantikörper zu Spermatozoen Anti-Herz

Muskel-Autoantikörper bei Myasthenia gravis Autoantikörper zu Nervengewebe Autoartikörper gegen Fasergewebe und Gefäßkomponenten Autoantikörper gegen Blutplättchen und Megakaryozyten Antikörper gegen Trophoblasten Antikörper zu Mikroorganismen Antikörper zu tierischen Antigenen Antikörper zu Arzneimitteln

Besonders bevorzugte immunologisch aktive Materialien sind IgA, IgG, IgM» CRP (C-reaktives Protein) in Serum, und sekretorische IgA und IgK in Milch.

Das erfindungsgemäß verwendete Gel kann unter den zahlreichen gelbildenden, immunologisch inerten Materialien wie Agar, Agarose, Celluloseacetat, Stärkegel, Gelatine, Polyacrylamid oder deren Kombinationen ausgewählt werden.

Das Gel kann zusätzlich einen Elektrolyten und/oder ein die Oberflächenspannung herabsetzendes Tensid enthalten.

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Im Zusammenhang mit der Erfindung umfaßt der Begriff "Flüssigkeit" biologische Flüssigkeiten, z.B. Serum, Plasma, Milch, Urin, Speichel oder Rückenmarksflüssigkeit, Fruchtv/asser, Gelenkflüssigkeit, extravaskuläre Flüssigkeit und andere Sekrete und Ausscheidungen von Mensch und Tier sov/ie wässrige Extrakte jeder lebenden Quelle.

Alle Arten nicht-reaktiver Träger sind erfindungsgemäß geeignet, z.B. Platten, Scheiben oder Filme, die auf medizinischem Gebiet oder in den Laboratorien verwendet werden. Der Träger kann aus jedem geeigneten Material bestehen, wie z.B. aus Glas oder synthetischem Material, und ist vorzugsweise transparent.

Der Ausdruck "Probenmenge" oder "Tropfen", wie er im Zusammenhang mit der Erfindung gebraucht wird, bedeutet μΐ-Mengen bis zu etwa 10 μΐ, gewöhnlich 1 - 4 μΐ der zu untersuchenden Flüssigkeit. Diese μΙ-Mengen der zu untersuchenden Flüssigkeit werden vorzugsweise mit Hilfe eines Mikroapplikators, v/ie einer Mikropipette, aufgebracht.

Die Lösung des gegenreaktiven Materials, die aufgebracht wird, um den Bereich der Aufbringung der Probenmenge der zu analysierenden Flüssigkeit zu bedecken, enthält jede Substanz, die E?it dem zu bestimmenden Material immunologisch zu reagieren vermag.

Obgleich andere immunologische Systeme, z.B. auf der Grundlage einer Doppelantikörper-Methode oder Konkurrenzreaktion unter Einsatz markierter oder konjugierter Reaktionskomponenten in Betracht gezogen werden können, besteht die am meisten bevorzugte Ausführungsform der Erfindung in der Verwendung einer Lösung gegenreaktiven Materials, das zur Bestimmung eines Antigens einen für dieses Antigen spezifischen Antikörper und zur Bestimmung des Antikörpers das entsprechende Antigen enthält.

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'.vährend die Meng3 der das gegenreaktive Material enthaltenden Lösung nicht v/irklich kritisch ist, ist es entscheidend, da3 sie die zuerst aufgebrachte Menge volumenmäßig übertrifft, so daß alle immunologisch aktiven Materialien in der Probe Gelegenheit haben, mit dem jeweiligen Gegenstück zu reagieren.

Die das immunologisch gegenreaktive Material enthaltende Lösung ist vorzugsweise eine wässrige Lösung, die üblicherweise bei immunologischen Untersuchungen verwendete Zusätze enthalten kann, z.B. phosphatgepufferte Salzlösung.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren sollte der pH-Wert vorzugsweise zwischen 5 und 9 gehalten v/erden, um eine Denaturierung immunologisch aktiver Materialien zu vermeiden, die an der Reaktion beteiligt sind. Dies kann mit geeigneten herköEinlichen Pu ff er systemen geschehen, wie z.B. Phosphat- oder 3arbital-Puffern,

Die Erfassung der Ergebnisse der immunologischen Reaktionen hängt von der Natur der Untersuchung und der Art und V/eise der angewandten Sichtbarmachung ab. Methoden der Sichtbaroder Erkennbarmachung, die im Zusammenhang mit der Erfindung angewandt werden können, sind z.B. Strahlennachweis, Fluoreszenznachweis, enzymati3cher Nachweis, spektrophotometriseher Nachweis, visuelle Beobachtung.

3ei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Ergebnisse spektrophotometrisch oder nach Anfärben visuell erfai3t.

27ach einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird ein der Untersuchung unterworfener Flüssigkeitstropfen, der das Antigen enthält, möglicherweise verdünnt und/oder behandelt, 2.3. durch Erwärmen, so daß die interessierende Komponente nachweisbar wird, auf eine Gelmatrix gegeben. Der

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Tropfen wird mit einem Überschuß Antikörper bedeckt, die nicht-reaktiven Antigene und der Überschuß an Antikörpern werden weggewaschen, die Produkte der Immunfällung eingefärbt und das Ergebnis mit einer bekannten Farbskala verglichen. Wenn die Menge eines bestimmten Antikörpers in einem.Serum zu bestimmen ist, ist die Reihenfolge der Aufbringung umgekehrt, und zunächst wird ein Tropfen Serum und darauf ein Tropfen Antigen aufgebracht. Die Gelmatrix, vorzugsweise auf einer Glasplatte oder dergleichen, und eine Reihe von Paralleltests werden hergestellt bzw. durchgeführt, um sichere Werte zu erzielen.

Es ist auch möglich, die Menge verschiedener Antigene oder Antikörper gleichzeitig zu bestimmen. Hierzu v/erden Tropfen der zu analysierenden Flüssigkeit (Primärflüssigkeit) in einem Muster über die Gelmatrix verteilt und die Tropfen in den einzelnen Bereichen mit verschiedenen gegenreaktiven Flüssigkeiten (Sekundärflüssigkeiten) bedeckt, die verschiedene Arten von Antikörpern oder Antigenen enthalten, die spezifisch mit den Antigenen oder Antikörpern in der Primärflüssigkeit reagieren.

In bestimmten Fällen mag es von Interesse sein, die Gesamtmenge an Protein in einer bestimmten Flüssigkeit zusätzlich zur Menge eines oder mehrerer bestimmter spezieller Antigene zu bestimmen. Hierzu kann man nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung in einigen der Tropfen die Gesamtproteine chemisch fixieren, die anderen Tropfen mit Antikörpern behandeln, so daß man auf der gleichen Matrix einerseits den Wert für Gesamtprotein und andererseits einen oder mehrere Teilergebnisse erhält.

Um ein gleichmäßiges Eindringen der Tropfen in die Gelmatrix zu erzielen, ist es angebracht, daß letztere eine bestimmte Menge an die Oberflächenspannung herabsetzender

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Lösung enthalten. Die Aufnahme erfolgt verhältnismäßig langsam, und man kann eine gewisse Ausbreitung erwarten.

Um die gleichmäßige Verteilung der Tropfen zu gewährleisten, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenigstens v/ährend der Anfängsphase der Reaktionszeit einen Wechselstrom durch die Gelmatrix zu leiten. So werden die verschiedenen Moleküle im Tropfen zusammengehalten. Eine Spannung zwischen 1 und V/1 cm Matrix zwischen den Pilterpapierbrücken an den Plattenkanten liefert befriedigende Ergebnisse, wobei eine Spannung von 2,5 V bevorzugt wird.

In bestimmten Fällen kann das Antigen an ein anderes Molekül, z.B. Albumin, gebunden sein. Wenn sich das Antigen mit dem Antikörper verbindet und unlöslich wird, bleibt das andere Molekül zurück. Es kann von Interesse sein, die Menge an Antigen plus dem anderen Molekül, z.B. dem Albumin, zu bestimmen. Bei einer bestimmten Ausführungsform geht man wie oben beschrieben vor, d.h., man bringt auf die Matrix ein Paar Tropfen der Priraärflüssigkeit auf, die den Antigen-Albumin-Komplex enthält, bringt eine geeignete Menge der Sekundärflüssigkeit, die den für das Antigen spezifischen Antikörper enthält, auf die Tropfen der Primärflüssigkeit auf und läßt die Komponenten reagieren, worauf die löslichen Komponenten weggewaschen v/erden. Das an das Antigen gebundene Albumin bleibt zurück.

Dann bringt man eine bestimmte Menge einer Flüssigkeit, die einen für Albumin spezifischen Antikörper enthält, auf da3 umgesetzte Material eines der Tropfen auf, und nach einer angemessenen Reaktionszeit wird das für Albumin nicht-spezifische Material \^eggev/aschen. Dann werden die Endprodukte der Immunfällung eingefärbt.

Zu Zwecken der Mengenbestimmung kann man eine früher hergestellte Farbskala verwenden, aber noch geeigneter ist die

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Herstellung von wenigstens drei Standards, die verschiedene bekannte Mengen der untersuchten Verbindung enthalten, und zwar direkt auf der Matrix. So vermeidet man jeden Fehler bei Nuancen aufgrund unterschiedlicher Versuchsdurchführung.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Figuren nachfolgend noch weiter im einzelnen beschrieben:

Fig. 1 zeigt schematisch eine spezielle Ausführungsform einer für die Durchführung des erfindungsgeinäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung und

Fig. 2 zeigt schematisch die wichtigeren Stufen einer speziellen Ausführungsform einer Arbeitsv/eise zur gleichzeitigen Bestimmung von drei verschiedenen Komponenten (IgA, IgG und IgM).

In Fig. 1 bedeutet die Bezugsziffer 10 eine Glasplatte oder eine Platte auo einem transparenten, nicht-reaktiven Material. Auf dieser Platte befindet sich eine Gelmatrix 11, die Agar oder Agarose und eine kleinere Menge eines die Oberflächenspannung herabsetzenden Lösungsmittels enthält. In diesem besonderen Falle enthält das Gel auch einen Elektrolyten.

Die Platte 10 liegt horizontal auf zwei Behältern 12 und 13 mit einer Flüssigkeit 14, gewöhnlich der gleichen wie der Elektrolyt in dem Gel. Die Gelmatrix 11 ist mit der Flüssigkeit 14 in den Behältern 12 und 13 über Brücken 15 aus Filterpapier oder dergleichen verbunden. Kontakte 16, die mit einer Wechselstromquelle 17 in Verbindung stehen, tauchen ebenfalls in die Flüssigkeit 14.

Beim Betrieb werden kleine Tropfen der zu untersuchenden biologischen Primärflüssigkeit auf die Ge!matrix aufgebracht, und jeder Tropfen wird mit einem größeren Volumen einer Sekundärflüssigkeit bedeckt, die die Komponente der Gegenreaktion für die untersuchte Komponente enthält, d.h. monospezi-

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fische Antikörper, wenn die Aufgabe darin besteht, ein bestimmtes Antigen zu bestimmen, oder ein geeignetes Antigen, wenn die Aufgabe darin besteht, die Menge eines bestimmten Antikörpers in Serum oder einer anderen Körperflüssigkeit zu bestimmen.

Die einschlägige Arbeits\/eise ergibt sich noch besser aus Pig, 2, die eine Matrix mit aufgebrachten Plussigkeitstropfen und Reaktionsprodukten zeigt.

Die zu untersuchende Flüssigkeit soll Antigene IgA, IgG und IgIi (und möglicherweise andere lösliche Komponenten) enthalten. Die fraglichen Antigene sind oben an der Matrix mit verschiedenen Symbolen markiert, um unterscheidbar zu sein.

Die Matrix ist symbolisch in drei senkrechte Felder unterteilt, und in jedes bringt man zwei Tropfen der Primärflüssigkeit zu Zwecken der Veranschaulichung, der Tropfen rechts in jedem Feld soll sich auf einen Satz mit einem höheren Gehalt an Antigenen als der linke Tropfen beziehen.

Weiter ist die Matrix symbolisch waagrecht unterteilt, und am linken Rand findet sich eine Beschriftung, die sich auf bestimmte Verfahrensstufen bezieht.

Das oberste waagrechte, mit b) bezeichnete Querband zeigt das Aufbringen kleiner Tropfen Primärflüssigkeit. Das folgende, mit c) bezeichnete Querband zeigt das Aufbringen größerer Tropfen der Sekundärflüssigkeiten.

Ferner wird unterstellt, daß im linken, senkrechten Bereich die Menge an IgA bestimmt werden soll, in dem mittleren Bereich die Menge an IgG und im rechten Bereich die Menge an IgM. So werden in diesem Falle drei verschiedene Sekundärflüssigkeiten verwendet, deren jede monospezifische Anti-

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körper zu IgA, IgG oder IgM enthält.

Im folgenden waagrechten Querband sind die unlöslichen Produkte der Imraunfällung dargestellt. Ein Teil (Klammer d) dieses Querbandes zeigt die überschüssigen löslichen Antikörper und die nicht-umgesetzten löslichen Antigene in jedem senkrechten Feld. Diese löslichen Komponenten werden wenigstens einmal mit einer Pufferlösung weggewaschen. Dann wird ein absorptionsfähiges Papier gegen die Matrix gedrückt, so daß lösliche Komponenten, die an der Reaktion nicht teilgenommen haben und löslich bleiben, entfernt werden·

Dann werden die Reaktionskomponenten eingefärbt und die Gelmatrix um diese Reaktionskomponenten herum entfärbt. Auf Mengen an ausgefällten Reaktionskomponenten hinweisende Nuancenunterschiede zeigen sich in dem Querband e) und sind mit einer Farbskala zu vergleichen. Dies kann mit einer gesonderten, zuvor hergestellten Skala geschehen, um aber mögliche Abweichungen zu vermeiden, die aufgrund der Arbeitsweise eintreten könnten, ist es ratsam, jedesmal eine Standard-Farbskala direkt auf der Matrix aufzubauen, wie in dem Querband f) dargestellt.

In diesem Falle verwendet man Lösungen mit bekannten Mengen der einschlägigen Antigene und bringt sie in Reihen auf der Matrix auf. Entweder hat man eine Vorratslösung hoher Konzentration und verdünnt sie oder man hat verschiedene Lösungen mit bekannten, stufenweise unterschiedlichen Konzentrationen. Im vorliegenden Falle liegen sechs verschiedene Farbabstufungen vor, und die Konzentration steigt in Richtung von links nach rechts.

Die Arbeitsweise folgt dem gleichen Muster, wie oben beschrieben, d.h., man bringt die nötige Zahl von Tropfen der Primärflüssigkeit, dann die entsprechende Zahl von

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Tropfen der Selcundärflüssigkeiten auf, v/äscht, trocknet und färbt konkurrierend mit der Weiterverarbeitung in dem entsprechenden senkrechten Feld. Die Skatei für IgA und IgG sind annähernd identisch, während die für IgM etwas schwächer als die -anderen beiden ist.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung noch weiter.

Beispiel 1

Bestimmung der Menge eines beliebigen Protein-Antigens.

Man wählt ein Gel, z.B. mit 1 % Agarose und 0,01 % Tween 80, zu 1 mm Dicke auf einer Glasplatte verteilt. Das Gel enthält auch eine elektrisch leitende Komponente, z.B, 37,5 mMol Veronal/1 bei einem pH von 8,6. Die Gelschicht wird durch Pilterpapxerbrücken mit einen Veronalpuffer zu 75 mKol/1 enthaltenden Behältern verbunden. Die Behälter sind so ausgestattet, daß sie mit einer Wechselstromquelle einer Spannung von 2,5 V/cm Matrix zu verbinden sind.

Der Strom ist beim Aufbringen der Primärflüssigkeit und für 15 min nach dem Aufbringen der Sekundärflüssigkeit eingeschaltet. Dann wird die Platte etwa 10 min ohne Strom gelassen.

Die nicht-umgesetzten Proteine sind noch löslich, und die Platte mit der Gelmatrix wird mehrmals in eine phosphatgepufferte Salzlösung getaucht und nach jedem Eintauchen unter einem Gewicht von etwa 1 kg mit einem dicken Absorptionspapier gepreßt, das die unlöslichen Proteine und Salzlösungen aufnimmt. Die Behandlung wird wiederholt, bis man sicher ist, daß alle löslichen Komponenten entfernt sind.

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Das Einfärben erfolgt in diesem Falle mit einer "Coomassie Blue R"-Lösving.

Danach entfärbt man die Gelmatrix, um einen klaren Untergrund als Kontrast zu der Immunfällung zu erhalten.

Wie bereits ausgeführt, kann man separate Standard-Farbskalen verwenden oder solche direkt auf der Matrix herstellen.

Beispiel 2

Gleichzeitige Mengenbestimmung mehrerer Antigene, z.B. IgA, IgG und IgM (Fig. 2).

In regelmäßigem Muster bringt man mehrfach auf und bedeckt die Bereiche innerhalb der einzelnen Abschnitte des Musters mit den verschiedenen Antigenen entsprechenden Antiseren, darauf wäscht, preßt, trocknet, färbt man und beobachtet die erhaltenen Farbtönungen wie in Beispiel 1.

Beispiel 3

Bestimmung der Menge komplexierter Antigene, z.B. IgG-Albumin, IgG-IgA oder IgG-IgM in menschlichem Serum.

Man geht wie oben in Beispiel 1 beschrieben vor, d.h. man bringt einen oder mehrere Tropfen der zu untersuchenden Flüssigkeit auf die Matrix und bedeckt sie zunächst mit der Lösung, die für eine Komponente im Komplex spezifische Antikörper enthält, und wäscht dann die Matrix. Dann bedeckt man die Bereiche der Aufbringung mit einer anderen Lösung, die für die andere Komponente in dem Komplex spezifische Antikörper enthält, und arbeitet schließlich nach den Stufen in den vorhergehenden Beispielen.

Will man zusätzlich zur Gesamtmenge der komplexierten Antigene die Menge einer der Komponenten in dem Komplex bestimmen, bringt man zwei Tropfen oder zwei Reihen von Tropfen

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- tff-

auf und behandelt den einen Tropfen oder die eine Reihe von Tropfen gemäß Beispiel 1 zur Mengenbestimmung einer Einzelkomponente und den anderen Tropfen oder die andere Reihe von Tropfen nach der Vorschrift im vorhergehenden Absatz. Eine geeignete Farbskala oder die Komponenten einzeln oder als komplexierte Antigene darstellende Bereiche sollten auf der Matrix vorhanden sein.

Beispiel 4

Charakterisierung und Mengenbestimmung von menschlichem IgA.

Eine Gellösung v/ird durch Lösen (Sieden) von 0,5 g Agarose (Bio-Rad) in 25 ml destilliertem HpO hergestellt und bei 55-6O⁰C gehalten. 10 ml dieser Lösung werden mit 10 ml Puffer, d.h. Barbital-Barbital-Na (Merck), 75 mMol/l, NaN, 6 mMol/l, pH 8,6 mit einem Zusatz von Tween 20 zu 0,01 %_t ebenfalls bei 55-6O⁰C, gemischt. Das Gemisch wird auf eine ebene Glasplatte (12 χ 16 χ 0,1 cm) gegossen und in HpO-gesättigtem Milieu gelieren gelassen, was zu einer Gelmatrix mit einer Dicke von etwa 1 mm führt.

Antigenlösungen werden aus einem Vorrat von Blutspenderseren (HS St) hergestellt, der auf seine Konzentration an Immunoglobulin A, G und M nach dem World Health Orgajiization-Bezugsstandard 67/97 bemessen ist. Das Verdünnungsmittel ist PPS (phosphat-gepufferte Salzlösung), pH 7,1. Die Immunoglobulin-?raktion von Kaninchen-Antihuman-IgA, für oC-Ketten spezifisch (Dakopatts, Brostex A/S, Kopenhagen) wird mit PPS auf eine Stärke von 133 ug/rnl verdünnt, d.h. 1 ml Antiserum kann 133 V-g spezifisches Antigen binden (nach Herstellerangaben).

Die Platte (Glasträger und Gelmatrix) wird horizontal auf ein geeignetes Elektrophorese-Gerät mit zwei Behältern gebracht, die den vorgenannten Barbital-Puffer ohne das Tween enthalten. Brücken aus Filterpapier (Whatman Nr. 3) werden

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angeordnet, tun etwa 0,5 cm der Langkanten der Gelmatrix abzudecken und in den Puffer in den Behältern einzutauchen, die mit Elektroden ausgestattet sind, die mit einem Veriac-Transformer verbunden sind, der mit gewöhnlichem Netzstrom, 220 V, 50 Hz gespeist wird.

Der Strom wird eingeschaltet, und ein Potential von 2,5 V/cm über die Platte wird aufgebaut. Innerhalb von 10 min wird mit dem Aufbringen von 4 μΙ-Proben des Antigens begonnen. Sobald die Proben vom Gel aufgenommen sind (etwa 5 min), v/erden die Antiserum-Tropfen (10 μΐ) überlagert. Die Reaktionskomponenten \irerden innerhalb 15 min aufgebracht. Die Vorrichtung wird abgedeckt, um die Platte gegen Verdunstung und Staub zu schützen. 40 min nach dem letzten Belegen von Antigentropfen mit Antiserum wird der Strom unterbrochen, und die Platte kann sich 10 min lang stabilisieren.

Die Platte wird vom Gerät entfernt, mit PPS gespült und mit Filterpapier, einer 0,5-1,0 cm dicken Schicht von absorbierendem Papier, einer Glasplatte und einem Gewicht von 1-2 kg abgedeckt. Etwa 15 min später, wenn die Flüssigkeit und lösliche Komponenten in der Agarose durch das absorbierende Papier eluiert worden sind, werden dieses und das Filterpapier entfernt. Der Agarosefilm wird 5 min mit frischem PPS unter einem neuen Filterpapierstück gequollen. 10 min später wird wieder mit frischem Filterpapier, absorbierendem Papier, Glas und Gewicht gepreßt. Dieses Pressen erfolgt ein drittes Mal, aber danach wird das Filterpapier an Ort und Stelle gelassen und der Agarosefilm kann trocknen.

Die Antigen-Antikörper-Fällungen in dem trockenen Agarosefilm werden 10 min in einem Coomassie Brilliant Blue R (Sigma)-Färbebad eingefärbt: 2,5 g Farbstoff/l Eisessig, 95 % Äthanol, destilliertes V/asser (je 1 + 3,5 + 5,5 Teile). Nach Spülen mit fließendem Leitungswasser erfolgt das Ent-

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färben in einem Bad der vorerwähnten Lösungsmittel (jeweils 1 + 2,5 + 6,5 Teile), bis der Untergrund der eingefärbten Stellen klar ist.

Die Farbintensität der Fällung wird mit einem Chromatogramm-Spektralphotometer KK3 registriert. Die Platte wird durch einen Lichtstrahl von 0,1 mm χ 10 mm mit 30 mm/min geführt. Die Extinktion bei 558 nm wird mit einem Hitachi-Perkin-Elmer-Recorder 165 bei 5 mV und einer Papierbahngeschwindigkeit von 60 mm/min aufgezeichnet. Die Fläche der die Menge der Fällung darstellenden, aufgezeichneten Peaks errechnet sich als Höhe mal Breite in halber Höhe de3 Peaks.

Die Konzentration an IgA in den Verdünnungen von HS St und

die Flächen in mm dividiert durch 40 der aufgezeichneten Kurven-Peaks sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1

IgA-Konzentration, g/l	Peakflache, min²/40
0,0085	4,4
0,0085	4,9
0,0143	8,8
0,0215	14,7
0,0285	17,5
0,0285	17,6
0,0343	20,3
0,0428	22,4 '
0,0428	22,4
0,0573	30,5

Die berechneten Peakflächen zeigen, daß mit zunehmender Antigen-Konzentration die Fläche des aufgezeichneten Peaks zunimmt, d.h., es entsteht mehr .Fällung, die dazu führt, daß mehr Farbstoff aufgenommen und als proportionaler Anstieg der Fläche der aufgezeichneten Peaks aufgezeichnet wird. So hängt die Menge der Einfärbung von der Antigen-Konzentration ab, und dieser Parameter kann zur Mengenbe-

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Stimmung von IgA herangezogen werden.

Beispiel 5

Charakterisierung und Mengenbestimmung von menschlichem IgG.

Die Platte wird hergestellt und die Arbeitsweise durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Immunglobulinfraktion von Kaninchen-Antiseruni zu menschlichem IgG (y-Ketten-spezifisch, Dakopatts) für Anti-IgA eingesetzt wird. Es wird auf eine Konzentration von 200 μg/ ml verdünnt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2.

Tabelle 2

IgG-Konzentration, g/l	Peakflache, mm²/40
0,0100	5,9
0,0163	10,2
0,0250	14,4
0,0333	22,9
0,0400	24,6
0,0500	29,4

Es ist zu erkennen, daß die Flächen der aufgezeichneten Peaks den Antigen-Konzentrationen proportional sind, was anzeigt, daß das Verfahren zur MengenbeStimmung von IgG herangezogen v/erden kann.

Beispiel 6

Charakterisierung und Kengenbestimmung von menschlichem IgM.

Die Platte wird hergestellt und das Verfahren durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Imiaunglobulin-Fraktion von Kaninchen'-Anti serum zu menschlichem IgH (μ-Ketten-speaifisch, Dakopatts) anstelle von Anti-IgA verwendet wird. Es wird auf 200 μg/ml verdünnt. Die beobachteten Ergebnisse finden sich in Tabelle 3.

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Tabelle 3

IglT-Konzentration, g/l	ο Peakflache, nun /40
0,0158 0,0263 • 0,0395 0,0528 0,0633 0,0790	3,0 6,0 9,1 11,6 14,2 17,2

Es ist zu erkennen, daß die Flächen der aufgezeichneten Peaks den Antigen-Konzentrationen proportional sind, daher kann das Verfahren zur KengenbeStimmung von IgW herangezogen werden.

Beispiel 7

Mengenbestimmung von menschlichem IgG in Gegenwart und Abwesenheit eine3 V/echselstrompotentials während verschiedener Zeitspannen.

Zwei Platten werden hergestellt, wie in Beispiel 4 und 5 beschrieben, mit der Ausnahme, daß eine Platte horizontal unterstützt ist und keine Verbindung mit einer Wechselstromquelle hat. Mit beiden Platten wird wie in Beispiel 4 gearbeitet, mit der Ausnahme, daß die Antigen- und Antiserum-Lösungen, IgG und Anti-IgG, wie in Beispiel 5, in Abständen aufgebracht v/erden, um jeweils Reaktionszeiten von 20, 40, 60 oder 80 min zuzulassen. Die beobachteten Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.

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av

Tabelle 4

	Peakfläche	-	, mm	-	/40	60 min	-	80 min	-
IgG-Konzen-	20 min	8,8	40 min	9,8		V/cm	13,5	V/cm	11,9
tration	V/cm	19,2	V/cm	20,9	2,5	24,6	2,5	24,5
g/1	2,5	26,3	2,5	23,0		24,8	13,5	26,8
0,010	10,0	26,7	12,7	33,0		28,6	26,3	32,9
0,024	19,5	35,5	23,2	39,2		43,2	30,3	44,5
0,025	25,2	40,1	27,6	41,8		45,3	41,3	46,2
0,033	29,4	56,6	34,2	62,3		67,9	47,6	68,8
0,045	39,1	46,5			48,5
0,050	42,7	48,3			72,5
0,083	59,1	74,4	13,2
	25,8
27,6
34,5
45,6
48,5
67,3

Die ausgefälltes IgG darstellenden Peakflächen nehmen bei allen Antigen-Konzentrationen relativ zu längeren Reaktionszeiten zu. Außer in drei Fällen sind die in Gegenwart von Wechselstrom gemessenen Flächen größer als die ohne Wechselstrom aufgezeichneten Flächen. Unter Strom nimmt die Menge an Fällung im Durchschnitt um 18,6 % zwischen 20 und 40 min zu, ändert sich kaum während 40 bis 60 min und steigt um 6,6 % von 60 bis 80 min Reaktionszeit. Ohne Strom sind die durchschnittlichen prozentualen Zunahmen an Fällung für diese Zeitspannen 8,0 %, 8,0 % bzw. 2,4 %. So wird IgG, innerhalb 20 min aufgebracht und mit Anti-IgG für 40 bis 60 min umgesetzt, am besten unter V/echselstrom als ohne diesen mengenmäßig bestimmt.

Beispiel 8

Charakterisierung und Mengenbestimmung von menschlichen Imraunglobulinen A, G und M und die mit einer Alternativmethode analysierten photoinetrischen Ergebnisse.

Eine Platte wird hergestellt und das Verfahren durchgeführt gemäß den Beispielen 4, 5 und 6, d.h. Verdünnungen menschlichen Serums werden mengenmäßig auf Immunglobuline A, G

809808/100?

oder M analysiert. Verwendet werden drei Mikroliter Antigen und 6 Mikroliter Antiserum. Nach photometrischer Aufzeichnung des Ausmaßes der Einfärbung wird die Höhe der aufgezeichneten Peaks in mm mit der Konzentration des analysierten Immunglobulins in Beziehung gesetzt; vgl. Tabelle 5 A, B und C.

	Tabelle 5
Immunglobulin	Peakhöhe,
und Konzentration,	mm
g/l
A. IqA
0.0033	14.0
0.0085	17.0
O.0143	29.0
0.0215	46.0
0.0285	57.5
O.O205	56.0
0.0343	66.5
O.0428	74.5
0.0428	70.0
0.0573	100.0

B. IgG

0.0100 21.5

0.0168 35.5

O.O25O 50.0

0.0333 72.5

O.0400 82.O

0.0500 99.0

C. IgM

0.0158 3.O

O.0263 6.0

0.0395 9.1

0.0528 11.6

0.0633 14.2

0.0790 17.2

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Die aufgezeichneten Peaks sind in Beziehung zu steigender Immiinglobulin-Konzentration proportional höher. Daher kann die Peakhöhe in ma, die die Intensität der eingefärbten Fällung darstellt, als Maß für die Menge analysierten Antigens in der eingeiärbten Stelle verwendet werden.

Beispiel 9

Charakterisierung vnd Mengenbestimmung menschlicher Immunglobuline A, G und M nach visueller Begutachtung.

Eine Platte wird hergestellt und das Verfahren wie in Beispiel 8 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Ergebnisse visuell sowie photometrisch registriert werden. Standard-Bezugsflecken, die bekannte Antigeninengen für jede Klasse von Irnmunglobulin darstellen, befinden sich auf der Platte. Die gemessenen Peakhöhen in mm werden gegen die bekannten μg an Antigen für IgA, IgG oder IgK aufgetragen. Aus diesen Kurven wird die Menge an IgA, IgG oder IgM in den Testflekken bestimmt und mit dem Verdünnungsfaktor und dem Volumen der aufgebrachten Probe umgewandelt, um die Konzentration an Immunglobulin in dem untersuchten Serum zu ermitteln.

Die visuelle Art der Mengenbestimmung erfolgt mit der Platte, Gelseite nach unten, auf einem weißen, matten Grund. Die Färbintensität in einem Testflecken wird mit den unterschiedlichen Farbgraden verglichen, die für entsprechende Standard-Bezugsflecken festzustellen sind, und die Menge an den Testflecken bildendem Antigen wird ermittelt.

Die Konzentration an Immunglobulin in dem untersuchten Serum wird wie zuvor unter Verwendung des Verdünnungsfaktors und der Probengröße berechnet. Die mit diesen Bestiramungsmethoden beobachteten Ergebnisse sind in der Tabelle 6A, B und C enthalten.

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Tabelle 6

Menge des Immunglobulins im Fleck, in μg

Photometrie, visuell Höhe der Kurve

Immunglobulin-Konzentration im untersuchten Serum, in g/l

Photometrie,
Höhe der Kurve

visuell

0.204	0.230
0.182	0.200
0.132	0.139
0.126	0.139
0.113	0.116
O.O59	O.O5O
B. IgG
O.23Ü	0.225
0.203	O.2O5
0.198	0.193
0.174	0.193
0.072	0.070
O.O69	0.064
O.O62	0.050
0.032	0.030
C. IgM
0.300	0.291
0.219	0.245
0.178	0.161
0.145	0.148
0.027	0.035

2.14	2.42
1.91	2.10
1.39	1.40
1.32	; 1.46
1.18	', 1.22
0.62	0.53
24.99	i 23.63
10.63	1O.66
10.4O	1O.O4
9.14	10.04
7.46	7.35
7.25	6.72
6.46	5.25
3.36	3.15
1.58	¹ 1.53
1.15	1.29
0.93	0.85
0.77	0.78
0.14	0.18

Die Tabelle zeigt, daß die visuelle Bestimmung der Menge
an Immunglobulin in den Flecken auf der Platte den Bestimmungen aus den jeweiligen, photometrisch erhaltenen Peakhöhenkurven sehr nahe kommen. Ferner stimmen die berechneten Konzentrationen der Immunglobuline A, G oder M in den untersuchten Seren ebenfalls gut überein.

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Beispiel 10

Charakterisierung und MengenbeStimmung von menschlichem C-reaktivem Protein.

Die Platte wird wie in Beispiel 4 hergestellt, mit der Ausnahme, daß 8 ml 2 %ige Agarose mit 12 ml des durch Calciumlactat-Zusatz modifizierten Barbital-Puffers, 12,3 mHol/1 und pH 8,2, gemischt wurde. Der analysierte Bezug besteht aus einer Reihe von Seren mit hohen Konsentrationen an C-reaktivem Protein, auf dieses eingestellt im Diagnostic Laboratory, Dept of Immunology, Göteborg, Schweden. Verdünnt wird mit dem genannten Puffer ohne Tween, um Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen an C-reaktivem Protein zu erhalten.

Die Immunglobulinfraktion von Kaninchen-Antiserum zu menschlichem C-reaktivem Protein (Dakopatts) wird mit PPS 1/3 verdünnt.

Die angewandte Arbeitsweise ist im wesentlichen die gleiche v/ie in Beispiel 4, mit der Ausnahme, daß 3 μΙ-Mengen Antigen aufgebracht und 5 μΙ-Volumina Antiserum überlagert werden. An die Platte wird ein elektrisches Potential von 2,0 V/cm gelegt. Bei photometrischer Registrierung werden 2 mV angewandt .

Die Ergebnisse enthält Tabelle 7.

Tabelle 7

Konzentration an C-reaktivem Peakflache, Protein, mg/1 mm²/40

__ —

3,3 15,0

6,7 27,0

12,0 46,6

15,0 56,0

20,0 66,6

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3%

Die Fläche der aufgezeichneten Peaks nimmt im Verhältnis sui* ansteigenden Antigen-Konzentration zu, was proportional ansteigende liengen an eingefärbter Fällung anzeigt. Daher ist dieses Verfahren auf die Mengenbestimmung von menschlichem C-reaktivem Protein heranzuziehen.

Beispiel 11

Rasche Charakterisierung und Mengenbestimmung von C-reaktivem Protein in Patientenseren.

Die Platte wird v/ie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt, und die Bezugs-Standards sind die gleichen. Patientenseren, die zuvor auf C-reaktives Protein eingestellt worden sind, werden mit bekannten Mengen des unverdünnten Standards an C-reaktiveni Protein angereichert und (1/5 und 1/15) mit dem Barbital-Puffer verdünnt. Ähnliche Verdünnungen erfolgen mit HS St, einem Blutspendervorrat mit negativem Wert für C-reaktives Protein. Beide HS St-Verdünnungen werden sowohl ohne als auch mit der Antiserum-Reaktionskomponente getestet, während nur die 1/5-Verdünnungen der Patientenseren ohne Antiserum getestet v/erden.

Die Arbeitsv/eise erfolgt wie in Beispiel 10 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Ergebnisse visuell und photometrisch, wie in Beispiel 9, bestimmt vrerden. Die Wertermittlungen für die Testseren werden durch Vergleich mit den Farbabstufungen der negativen HS St-Kontrolle eingestellt. Die Tabellen 8A und B geben die Farbreaktion des untersuchten HS St mit und ohne Antiserum und die des Standards mit C-reaktivem Protein mit aufgebrachtem Antiserum bei einigen ähnlichen Konzentrationen und Verdünnungen an, unter Verwendung der Peakhöhe als Kriterium.

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31

Tabelle 8

Konzentration an C-reaktivem Protein, mg/1

Serum-Verdünnung

Peakhöhe, mm

Anti-C-reak- kein Antitives Protein C-reaktives Protein

A. HS 3t.

0,07 0,20

1/15 1/5

B. Standard für C-reaktives Protein

1.1 4,0

10,0 20,0

1/54 1/15

5,0 7,4

7,8 17,0 32,0+ 59,2

2,3 4,3

⁺obere normale Grenze bei diesem Versuch.

In Tabelle 8 ist zu sehen, daß menschliches Serum mit sehr geringer Konzentration an C-reaktivem Protein bei den angewandten Verdünnungen zur Registrierung niedriger Peakhöhen führen kann, aber diese sind viel niedriger als die für den oberen normalen Grenzwert für C-reaktives Protein in Serum, sowie solcher für ähnliche Verdünnungen des C-reaktiven Protein-Standards .

Ergebnisse der Mengenbestimmung an C-reaktivem Protein in den angereicherten Seren von Patienten, die auf visuellem Wege durchgeführt wurde, sind zusammen mit den berechneten Konzentrationen für C-reaktives Protein in Tabelle 9 angegeben.

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-JO-

	ion	an	Tabelle	9	ermittelt
Konzentrat			C-reaktivein Protein, mg/1
berechnet		visuell

16,8 16,2

33,0 35,5

47,0 42,0

50,0 49,0

51,0 . 51,0

99,0 99,0

101,0 97,5

107,0 105,0

Die visuelle Ermittlung liegt nahe bei den berechneten Konzentrationen, was anzeigt, daß dieses visuell abgelesene Verfahren für die Mengenbestiminung von C-reaktivem Protein geeignet ist.

Beispiel 12

Charakterisierung und Mengenbestiminung von Sekret-IgA sowie Bestimmung des Anteils am Genamtprotein in menschlicher Milch.

Zwei Platten werden hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben, und für eine Platte ist die Arbeitsweise die gleiche, wie in Beispiel 8 beschrieben. Die gleiche Art von Standardkurve, wie in Beispiel 9 für IgA beschrieben, wird angewandt, um die Konzentration an Sekret-IgA in Proben menschlicher Milch und gereinigtem Sekret-IgA festzustellen.

Die Arbeitsweise mit der zweiten Platte wird nach dein Aufbringen von Antigen abgewandelt. Geeignete Verdünnungen von HS St (mit PPS) v/erden angewandt, um eine Standardkurve gemäß dem Gehalt an Gesamtprotein zu erhalten. Geeignete Verdünnungen menschlicher Milch mit PPS und gereinigtes Sekret-IgA werden ebenfalls aufgebracht. 10 min lang läßt man das Gel das Antigen aufnehmen, und dann wird die Platte vom Ge-

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rät entfernt. Sie wird 15 min in ein Picrinsäurebad (5 Teile gesättigte Picrinsäure + 1 Teil Eisessig) gebracht, um die Proteine chemisch zu fixieren. Die Platte wird in 95 /oiges Äthanol gebracht, und ein Stück Filterpapier wird auf das Gel gebracht. Dann wird es mit absorbierendem Papiergepreßt usw., dem sich die grundlegende Arbeitsweise anschließt.

Ergebnisse solcher Parallelanalysen auf Sekret-IgA und Gesamtprotein in menschlicher Milch sind in den Tabellen 1OA und B enthalten. Zum Vergleich finden sich einige Bezugsdaten für Gesamtprotein (Mikro-Kjeldahl, Spectrophotometrie und Lowry-Test sowie Aminosäureanalyse).

Tabelle 10

Konzentration an Sekret-IgA,	Gesamt-Protein	Verhältnis IgA/Protein	Bezugswert Gesamt-Protein,
g/l	g/l		g/l
A. menschl. Milch			Mikro- Kjeldahl
1,47 1,20 1,10 0,37 0,75	11,82 11,20 10,54 6,58 7,83	0,124 0,107 0,104 0,132 0,096	10,36 12,55 10,90 7,90 7,95
B. gereinigtes Sekret-IgA			Spectrophoto metrie
10,89 7,54 3,90 1,10	10,59 8,13 3,80 1,30	1,03 0,927 1,026 0,850	12,00 Lowry 6,00 3,00 nicht durchge führt
0,350	0,440	0,795	Aminosäure analyse 0,449

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Die rabelle zeigt eine gute Übereinstimmung der Gesamt-Proteinraessungen für menschliche Milch und gereinigtes Sekret-IgA mit den mit Hilfe von Standard-Techniken erhaltenen Daten. Das Verhältnis von Sekret-IgA zu Gesamt-Prctein liegt sehr nahe bei 1,0 für die gereinigten Proben, was anzeigt, daß das erfindungsgemäße Grundverfahren auf die Bestimmung von Sekret-IgA als solchem oder als Gesant-Protein Anwendung finden kann.

Beispiel 15

Auswertung von Standards sowie Antiseren für die Bestimmung von Sekret-IgA in menschlichen Brustsekreten.

Die Platte wird hergestellt und die Arbeitsweise durchgeführt, wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Testproben des Antigens haben hohe oder geringe Konzentrationen an Sekret-IgA, d.h. sie sind menschliche Kolostralproben nahe dem GeturtsZeitpunkt oder menschliche Milchproben au3 der späteren Stillzeit. Die Standard-Proben sind HS St und ein Sannnelvorrat an menschlicher Milch (mM). Letztere wird nach dem IgA-Gehalt in Bezug auf gereinigtes Sekret-IgA bewertet. Zusätzlich zu dem Antiserum (Anti-IgA, Dako), das in Beispiel angewandt wurde, wird die Immunglobulinfraktion von Anti-IgA, oC-Ketten-spezifisch, erzeugt in Kaninchen von den Hyland-Labs, verwendet.

Die Konzentrationen an Sekret-IgA in verschiedenen Proben menschlicher Brustsekrete unter Verwendung von HS St oder ΐώΊ als Standard und der beiden handelsüblichen Antiseren sind in Tabelle 11A und B angegeben.

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Tabelle 11

Tag der Proben-	Konzentration an Sekret-IgA,	B. menschl. Milch	6,37	g/1	I'LL Ich	Anti-IgA (Hyland)	Verhältnis
nahine ab Geburt		+3	2,46	menschl.	als Standard		mit menschl.
	HS St als	+3	1,72				Milch als C* J- *·» J3 -w. J3
	Standard, Anti—I^0-A	+3	1,60	Anti-IgA (Dako)	51,60	Standard (Dako/Hyland)
	(Dako)	+3		61,12
			25,01
A. menschl.		42,00	15,97
Colostrum	45,65	50,24	13,20	0,79
-1	43,36	27,43	12,95	0,82
0	26,48	15,04	12,26	1,10
+1	15,15	10,80		0,94
+2	12,22	11,98	5,48	0,82
+1	12,00	12,75	3,02	0,93
+1	11,90		1,58	1,04
+2	6,98	1,29
2,50	1,27
1,64	0,83
1,42	1,04
	1,10

Die Tabelle zeigt die Übereinstimmung in der Menge an Sekret-IgA bei verschiedenen Konsentrationen in Brustsekreten, erhalten mit Serum-IgA (HS St) oder Sekret-IgA (mM) als Standard. Die mit Anti-IgA von verschiedenen Firmen ermittelten Konzentrationen ergaben beim Vergleich Verhältnisse relativ nahe 1,0. So eignet sich dieses Verfahren zur Analyse der Leistungsfähigkeit verschiedener Standards und Antisera für die Mengenbestimmung von menschlichem Sekret-IgA in Brustsekreten.

Beispiel 14

Charakterisierung von Antiseren hinsichtlich des Gehalts an Antikörpern, die spezifisch sind für verschiedene Antigen-Determinanten der Sekretkomponente (SK) in menschlichen

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Brustsekreten.

Die Platte v/ird hergestellt und die Arbeitsweise durchgeführt, wie in Beispiel 13 beschrieben. Die Antigentestprooen sind Colostrum und menschliche Milch und der Standard ist niM. Die Sekretkomponente findet sich in menschlichen Sekreten in freier Form und gebunden an das dimere IgA-Molekül, und der Komplex ist bekannt als Sekret-IgA. Da Colostrum eine hohe Konzentration an Sekret-IgA im Vergleich zu Milch aufweist, besitzt es auch einen hohen Anteil an gebundener SK, die eine Antigendeterminante trägt, die sich auf freier SK nicht findet. Immunglobulinfraktionen zwei verschiedener Antiseren werden verwendet. Eine (Anti-SK-gebunden) wurde gegen SK in normalem Colostrum gebildet (Dakopatts), die andere (Anti-SK-frei) wurde von einer Frau gegen Colostrum gebildet, der Serum und Sekret-IgA fehlte.

Die Analysenergebnisse gleicher Verdünnungen von Colostrum und menschlicher Milch für SK mit "Anti-SK-gebunden" und "Anti-SK-frei" finden sich in Tabelle 12. Die Konzentrationen an Sekret-IgA in den Proben sind zu Vergleichszwecken angegeben.

Tabelle 12

Tag der Proben-	Konzentration an Sekret-IgA,	.Anti-SK-frei,	Anti-SE-ge-
nahme ab Geburt	g/l	verdünnt (1+2)	bunden, un
	Anti-IgA, ver		verdünnt
	dünnt (1+2)

A. menschl.		21,96	zu niedrig
Colostrum			zum Ablesen
-1	42,00	20,32
		11,70	ir
0	50,24	9,20	Il
+ 1	27,43	9,20	ti
+2	15,04	8,16	Il
+1	11,98
+2	10,80

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- ϊί -

B. menschl. Milch.

+3 +3 +3 +3

6,98
2,50
1,64
1,42

5,49 3,04 1,50 1,77

2737A91

6,13 2,65

1,51

Der Tabelle ist zu entnehmen, daß die Werte für Sekret-IgA in Colostrum unter Verwendung von mM als Standard mit beiden Antiseren niedrig sind. Wird "Anti-SK-frei" verwendet, finden sich keine Antikörper zur gebundenen Determinante, gebildet durch die Bindung der SK an IgA. Hit dem Antiserum zur gebundenen SK liegen die Antigendeterminanten im Überschuß vor, und wenig oder keine Fällung bildet sich, d.h., zu wenig für eine Ablesung. Andererseits enthalten beide Antiseren Antikörper zu Determinanten an freier SK, die auch reaktiv sind, wenn die SK an IgA gebunden ist, daher sind die ermittelten Werte für Sekret-IgA in menschlicher Milch über SK-froi oder SK-gebunden recht vernünftig. So läßt dieses Verfahren die Analyse "spezifischer" Antiseren auf ihren Gehalt an Antikörpern zu verschiedenen Antigendeterminanten auf der gleichen Art von Molekülen, in diesem Beispiel aus SK-gebunden und -frei, in menschlichen Brustsekreten zu«

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, W.

L e e r s e ι t

Claims

Patentansprüche

1./Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven ^Materials in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß.eine inerte Gelmatrix auf einem nicht-reaktiven Träger verwendet, eine Probenmettge der FlÜ88l[&eit clUl

äfl (!öl äUi£OÖ1?äoU, der Bereich der Aufbringung mit einer Lösung, die ein gegen-reaktives Material enthält, bedeckt, die nicht umgesetzten löslichen Materialien entfernt und das Ergebnis der Immunreaktion erfaßt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material ein Antigen oder ein Antikörper und als gegen-reaktives Material ein für dieses Antigen oder diesen Antikörper spezifischer Antikörper verwendet wird,

3» Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material ein Antikörper und als gegen-reaktives Material ein entsprechendes Antigen verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als nicht-reaktiver Träger eine Platte verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Ergebnisse der Immunreaktion nach dem Einfärben beobachtet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß

a) auf einer Platte aus nicht-reaktivem Material eine Gelmatrix gebildet,

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- 3-7 -

b) auf diesem Gel ein kleines Volumen der zu analysierenden biologischen Flüssigkeit aufgebracht wird, das man vom Gel aufnehmen läßt,

c) der Bereich der Aufbringung mit einer Lösung, die eine geeignete Konzentration an einem gegen-reaktiven Material für die zu bestimmende Komponente in größerer Menge als der der zuerst aufgebrachten Flüssigkeit enthält, bedeckt v/ird, so daß in einer genügend längen Zeitspanne ein Überschuß an Material vorliegt, um die Komponenten miteinander unter Bildung einer unlöslichen Immunfällung reagieren zu lassen,

d) die Gelmatrix wenigstens einmal mit einer Pufferlösung gewaschen und dann ein absorbierendes Papier gegen die Matrix gedrückt wird, so daß die Komponenten, die an der Reaktion nicht teilgenommen haben, und noch löslich bleiben, entfernt werden,

e) nach dem Spülen das Gel zu einer dünnen Schicht gepreßt und mit dem letzten absorbierenden Papier an seinem Platz das Gel getrocknet wird,

f) das Papier entfernt und die Platte in einer von der Immunfällung absorbierbaren Färbelösung untergetaucht und das Gel so entfärbt wird, daß der Untergrund der eingefärbten Bereiche klar v/ird, und

g) die eingefärbten Bereiche mit einer bekannten Farbskala zur Anzeige der Farbintensität als Funktion der Menge der Fällung verglichen werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als nicht-reaktiver Träger ein transparenter Träger verwendet v/ird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein einen die Oberflächenspannung herab-

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setzenden Zusatz enthaltendes Gel verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein einen Elektrolyten enthaltendes Gel und eine Gelmatrix, deren zwei gegenüberliegende Seiten mit einer V/echselstromquelle verbunden sind, verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bij 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine eine Anzahl verschiedener Komponenten enthaltende Flüssigkeit auf die Gelmatrix in mehreren Bereichen in bestimmtem Muster aufgebracht, bestimmte Teile dieses Musters mit Lösungen, die die gewünschten spezifischen Gegenreaktionskomponenten enthalten, bedeckt v/erden und die Gelmatrix dann gemäß den Stufen d) bis g) des Anspruchs 6 behandelt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Teile einer Farbskala, die v/enigstens drei verschiedene Nuancen deckt, auf der Gelmatrix nach der Arbeitsweise der Ansprüche 1 bis 6 mit Lösungen, die bekannte Kengen an Komponenten und ihren Reaktionskomponenten enthalten, erzeugt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und A bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material IgA verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material IgG verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material IgM verwendet wird.

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15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives Material C-reaktives Protein verwendet v;ird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als immunologisch aktives material eine Komponente eines Komplexes verwendet wird.

17» Verfahren zur Bestimmung des Gehalts einer Flüssigkeit an Gesamt-Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine inerte Gelmatrix auf einem nicht-reaktiven 'Träger verwendet, eine Probenmenge der Flüssigkeit auf das Gel gebracht, die Proteine chemisch fixiert und die Ergebnisse der Reaktion beobachtet v/erden.

18. System zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17_f gekennzeichnet durch

a) eine inerte Gelmatrix mit einem Elektrolyten auf einem nicht-reaktiven Träger,

b) eine Einrichtung zum Verbinden der Matrix mit einer Wechselstromquelle und

c) eine Wechselstromquelle.

19. System nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der nicht-reaktive Träger eine Platte ist.

20. System nach einem der Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die inerte Gelmatrix einen die Oberflächenspannung herabsetzenden Zusatz enthält.

21. System nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte horizontal gehalten und die Matrix über poröse Brücken mit zwei Behältern verbunden ist, die den Elektrolyt enthalten, und mit der Wechselstromquelle über in die Behälter eingetauchte Elektroden in Kontakt ist,

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