DE2811537A1 - Empfindlicher quantitativer assay - Google Patents

Empfindlicher quantitativer assay

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DE2811537A1 DE19782811537 DE2811537A DE2811537A1 DE 2811537 A1 DE2811537 A1 DE 2811537A1 DE 19782811537 DE19782811537 DE 19782811537 DE 2811537 A DE2811537 A DE 2811537A DE 2811537 A1 DE2811537 A1 DE 2811537A1
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Dora Sadeh
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Miles Yeda Ltd
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Description

PATE NTANWÄLTE
IR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER- DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT D[PU-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-79 7078 . TELEX O5-212156 kpat d
TELEGRAMM KRAUSPATENT
1842 WK/rm
MILES-YEDA LTD. Rehovot / Israel
Empfindlicher quantitativer Assay
809838/0951
Beschreibung
Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von niedermolekularen Substanzen, wie z.B. Hormonen und dergleichen, sind schon viele Methoden entwickelt worden. Zu den empfindlichsten Methoden gehören diejenigen, die sich auf Proteinen aufbauen, welche dazu imstande sind, sich spezifisch an die zu bestimmende Substanz zu binden. Ein sehr empfindlicher Test ist der Radioimmunoassay in seinen verschiedenen Variationen. Radioimmunoassays haben aber die Nachteile, daß das markierte Objekt eine verhältnismäßig kurze Lagerungszeit hat, daß scharfe Bestimmungen hinsichtlich der Handhabung von radioaktiven Materialien bestehen und daß hochqualifizierte Personen für die Durchführung dieser Assays benötigt werden. Es ist auch schon eine Vielzahl von Enzymimmunoassays bekannt. Ein Teil davon wird in einer zusammenfassenden Arbeit in "Clinical Chemistry", 22 (1976), 1243 bis 1255, beschrieben.
Durch die Erfindung wird nun ein empfindlicher und gut geeigneter quantitativer Assay für die Bestimmung von kleinen Molekülen (Haptenen), wie Hormonen, Vitaminen, Glycosiden etc., zur Verfugung gestellt. Haptene werden als proteinfreie Substanzen definiert, deren chemische Konfiguration so ist, daß sie sich zwar mit spezifischen Antikörpern umsetzen können, jedoch selbst nicht dazu in der Lage sind, die Bildung von Antikörpern hervorzurufen. Um Antikörper gegen spezifische Haptene zu erzeugen, müssen diese Haptene zuerst an Makromoleküle gekuppelt v/erden und das resultierende Konjugat kann dann geeigneten Testtieren injiziert werden.
Die Erfindung betrifft einen quantitativen Assay hoher Empfindlichkeit zur Bestimmung von Haptenen. Dabei wird ein spezifischer Antikörper gegen den zu bestimmenden Hapten hergestellt
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und dieser Antikörper wird auf einem festen Träger unlöslich gemacht. Es wird eine Konkurrenzreaktion zwischen der unbekannten Probe und einem Haptenkonjugat durchgeführt. Die Menge des an den festen Träger gebundenen Haptenkonjugats ist umgekehrt proportional zu der Menge des freien Haptens in der zu untersuchenden Probe. Die Bestimmung erfolgt durch Reaktion eines enzymmarkierten Antikörpers mit dem makromolekularen oder kleinen Molekülteil des Konjugats und durch anschließende Umsetzung mit einem geeigneten Substrat, die zu einer Farbreaktion führt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann schematisch wie folgt beschrieben werden:
a) Ein Hapten (wie oben definiert, vorzugsweise ein Hormon), das als "X" bezeichnet wird, soll bestimmt werden.
b) Das Hapten wird an eine Verbindung gebunden, die dazu geeignet ist, eine Antikörperbildung hervorzurufen. Das erhaltene Material wird einem Testtier injiziert, was zu der Bildung von Anti-X führt.
c) Ein Konjugat wird aus X und aus einer weiteren Substanz Y gebildet.
d) Die Substanz Y oder ein Y-Konjugat wird Tieren injiziert und Anti-Y wird erzeugt.
e) Es wird ein Konjugat aus Anti-Y und einem geeigneten Enzym erzeugt, d.h. Enzym-Anti-Y.
Der Assay wird wie folgt durchgeführt:
(1) Anti-X, d.h. der Antikörper zu der zu bestimmenden
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Substanz X, wird auf einem geeigneten festen Träger adsorbiert und auf diese Weise unlöslich gemacht. Hierzu kann unter anderem Polystyrol verwendet werden. Die bevorzugte Form sind kleine Reagensgläser, die auf der Innenseite mit dem Anti-X-Antikörper beschichtet sind.
(2) Die Probe, die eine unbekannte Menge von X und eine bekannte Menge von X-Y-Konjugat enthält, werden mit dem Feststoff und dem darauf adsorbierten Anti-X in Berührung gebracht, was zu einer Konkurrenzreaktion von X und X-Y mit dem Anti-X führt. Die Mengen von X und X-Y werden in solcher Weise ausgewählt, daß alle aktiven Anti-X-Stellen entweder durch X oder durch X von X-Y eingenommen werden.
(3) Das System wird gewaschen, um nicht-umgesetztes X und X-Y zu entfernen.
(4) Enzymmarkiertes Anti-Y wird zugesetzt und dieses setzt sich mit allen Y-Stellen des gebundenen X-Y-Konjugats um.
(5) Überschuß von enzymmarkiertem Anti-Y wird abgewaschen.
(6) Ein geeignetes Substrat wird zugegeben, das zu einer Farbreaktion führt, die die Menge des gebundenen Enzyms anzeigt.
Durch Herstellung einer Eichkurve oder durch gleichzeitige Behandlung einer Anzahl von Proben, die bekannte Mengen von X enthalten, wird die Menge von X in der Bestimmungsprobe bestimmt. Es wird ersichtlich, daß die Menge des an den festen Träger gebundenen Haptenkonjugats X-Y umgekehrt zu der Menge des freien Haptens in der Probe proportional ist.
Als Substanzen, die in sehr niedrigen Konzentrationen bestimmt werden können, können z.B. verschiedene Steroide, wie
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östrogene, Progestine etc., Prostaglandine, PGF2a, PGE2 etc., Thyroidhormone, wie Thyroxin, Trijodthyronin etc., Herzglycoside, wie Digoxin, Digitoxin etc., Vitamine, wie Vitamin B12 etc., Arzneimittel, wie Diphenylhydantoin, Morphin etc., genannt werden.
Geeignete Substanzen zur Verwendung als Y-Gruppierungen sind z.B. Trinitrophenyl-Lysin, SuIfanilsäure, p-Aminobenzoesäure, p-Azophenyl-ß-lactosid, Hippursäure, Jodacetylaminobenzolazohippursäure, 6-Carboxypurin, 5-Acetyluracil, Thymidin. und Uridin.
Die obige Beschreibung ist naturgemäß nur schematischer Natur. Die Stufen des Assays können wie folgt beschrieben werden: Inkubierung von Standards und von Haptenkonjugat in antikörperbeschichteten Röhrchen (oder anderen Formen von beschichteten Oberflächen), Dekantierung und Inkubierung mit enzymmarkiertem Antikörper, Dekantierung und Zugabe von Enzymsubstratlösung, und Bestimmung der Absorption. Die Hormonmengen, die quantitativ bestimmt werden können, liegen im Picogramm-Bereich. Die Empfindlichkeit und Genauigkeit entspricht allen Erfordernissen von solchen Bestimmungen für medizinische Zwekke.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist kein radioaktives Material und keine Einrichtung für die Handhabung eines solchen Materials erforderlich. Verschiedene Haptene können in zweckmäßiger Weise bestimmt werden. Als Beispiele hierfür können Steroide, Prostaglandine, Thyroidhormone, Peptide, Polysaccharide, Vitamine, Herzglycoside etc. genannt werden. Der erforderliche enzymmarkierte Antikörper ist leicht herstellbar und er kann für alle solche niedermolekularen Verbindungen verwendet werden. Die Reagentien sind
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stabil und sie können über verhältnismäßig lange Zeiträume ohne nennenswerte Zersetzung gelagert werden. Hierdurch kön nen Zusammenstellungen zur Durchführung des neuen Assays hergestellt und auf den Markt gebracht werden. Die erforder liche Instrumentierung ist einfach und in klinischen Labora torien leicht verfügbar.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Beispiel 1 Bestimmung von Serum-Östradiol
(Östradiol-6-e-dinitriophenyllysin) 1.- Beschreibung des Assays:
Eine Menge des Östradiol-6-e-DNP-lysin-Konjugats wird zu einer Östradiol enthaltenden Probe gegeben und das Gemisch wird in einem Polystyrolröhrchen inkubiert, das mit Anti-Östradiol beschichtet worden ist. Die Menge des an das Röhrchen gebundenen Östradiol-DNP ist umgekehrt zu der Menge des freien Östradiols in der Probe. Die tatsächlich Menge von Östradiol-DNP wird mittels mit Peroxidase markierten Anti-DNP-Antikörpern und anschließender Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrischer Ablesung bestimmt.
2. Materialien:
a) Anti-Östradiol-Antiserum wurde durch Immunisierung einer Ziege mit lyß-Östradiol-o-carboxymethyl-Rinderserumalbumin hergestellt. Der Ziege wurden intradermal 2 mg Antigen in vollständigem Freund'sehen Adjuvans inji-
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ziert. Nach 30 Tagen oder 60 Tagen wurden Wiederholungsimpfungen gegeben. Die Tiere wurden 8 Tage nach der letzten Wiederholungsimpfung geschlachtet.
b) Anti-Dinitrophenyl-Antiserum (Anti-DNP) wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit Dinitrophenyl-Rinderserumalbumin hergestellt. Den Kaninchen wurde 1 mg Antigen in vollständigem Freund'sehen Adouvans injiziert. Die Wiederholungsimpfungen und die Schlachtung erfolgte genau in der oben beschriebenen Weise.
c) Die gamma-Globulinfraktionen von Anti-DNP-RSA-Antiserum wurden durch Ammoniumsulfatausfällungen und anschließende DEAE-Cellulose-Chromatographie isoliert und von Anti-RSA-Antikörpern durch Immunoadsorption auf RSA-Agarose-(6 mg/ml)-Säulen gereinigt.
Meerrettichperoxidase (Miles Sorte 1) wurde an die IgG-Fraktion von Anti-DNP-Serum mit Glutaraldehyd angekoppelt. Das Peroxidasekonjugat wurde sodann durch Chromatographie auf Sephadex-G-200-Säulen gereinigt. Das Molverhältnis von Peroxidase zu IgG wurde durch UV-Absorption bestimmt. Die beim Assay verwendeten Konjugate hatten ein Molverhältnis von 0,8 bis 1.
d) Das Haptenkonjugat Östradiol-6-e-DNP-lysin wurden aus Östradiol-6-carboxymethyloxim und ε-Dinitrophenyllysin mit N-Hydroxysuccinimid hergestellt. Das Produkt wurde spektrophotometrisch analysiert, indem die UV-Absorptionsspektren bei 260 nm für den Steroidoximrest und bei 360 nm für das DNP-Molekül aufgenommen wurden. Es wurde gefunden, daß das Molverhältnis von Östradiol zu ε-DNP-lysin 1,0 betrug. Das Produkt wurde auch durch
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Radioimmunoassay mit Anti-Östradiol-RSA-Antiserum analysiert.
e) Die gamma-Globulinfraktion von Anti-Östradiol-6-RSA-Serum wurde durch Chromatographie auf DEAE-Cellulose isoliert und durch Immunoadsorption von Anti-RSA-Antikörpern gereinigt. Die Abwesenheit von RSA-Antikörpern wurde durch Immunoelektrophorese verifiziert. Die Aktivität des Antiserums sowie die Spezifizität gegenüber Östradiol wurde durch Radioimmunoassay ermittelt. Die gereinigte Fraktion des Anti-Östradiols wird beim Assay als Beschichtungslösung zur Herstellung der antikörperbeschichteten Polystyroloberfläche verwendet.
f) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm, Lab-Tek Cat. Nr. 4411) werden als fester Träger verwendet.
g) Östradiol (ikapharm Code Nr. 1995) wird als Standard-Antigen verwendet.
h) Das für die enzymatische Reaktion verwendete Substrat besteht aus 5-Aminosalicylsäure (120 mg) in Phosphatpuffer, 0,02 M, pH 6,5 (100 ml) und Hydroperoxidlösung, 196 (1 ml).
i) Die mit Antikörper beschichteten Röhrchen wurden wie folgt hergestellt: Die Polystyrolröhrchen wurden mit Carbonatpuffer, 0,05M, pH 9,5, gewaschen und mit der Beschichtungslösung (2 ml), die entsprechend mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung verdünnt worden war, gefüllt und sie wurden 18 h lang bei 40C gehalten. Die Röhrchen werden in 0,01M-Phosphat und 0,15M-Kochsalzlöung, pH 7,4 (PBS), bei 40C gelagert und sie können auf diese Weise mindestens 6 Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.
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./13-
3. Assay:
Zur Durchführung des Enzymimmunoassays wird 1 ml Lösung des Puffers, der Östradiol-Standards (5, 15, 50, 150, 500, 10Q0 pg/ml) und 300 pg/ml Östradiol-DNP-Konjugat enthält, 2 h bei 37°C in antikörperbeschichteten Röhrchen inkubiert. In das Röhrchen für die Blindprobe wird nur Pufferlösung eingebracht. In das "null"-Röhrchen wird kein Östradiol-Standard, sondern nur 300 pg/ml Haptenkonjugat in Pufferlösung eingegeben. Nach 2-stündiger Inkubierung werden die Lösungen dekantiert und die Röhrchen werden mit Puffer-PBS gespült. In jedes Röhrchen wird 1 ml Peroxidase-Anti-DNP-Konjugat 1:1000 verdünnt als Reagens gegeben und es wird 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert .
Die Lösungen werden durch Absaugen entfernt und die Röhrchen werden gründlich zweimal mit PBS 0,02$ Tween 20 und zweimal mit Wasser gewaschen. Sodann werden 1 ml Substratlösung in jedes Röhrchen gegeben und die enzymatische Reaktion wird 30 bis 60 min lang ablaufen gelassen. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml 0,1N-NaOH-Losung gestoppt. Die Absorption wird bei 450 nm abgelesen und die OD-Ablesungen werden auf halblogarithmischem Papier gegen ansteigende Konzentrationen von Östradiol, ausgedrückt als pg/ml, aufgetragen.
4. Ergebnisse:
Die Standardkurve umfaßt den Bereich von 5 pg/ml bis 1000 pg/ml östradiol, das mit 300 pg/ml Östradiol-DNP-Antigen um die Antikörperstellen auf der Polystyroloberfläche konkurriert.
Die Tabelle I gibt die Ergebnisse der Hemmkurve als direkte kolorimetrische Ablesung der Absorption gegen die Konzentrationen von Östradiol oder Östradioloxim in der Probe an.
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Die Tabelle II zeigt die Erozentmengen der enzymatischen Gesamtaktivität, die als Ergebnis der Hemmung durch Östradiol oder Östradioloxim an die beschichteten Röhrchen gebunden ist.
Die Neigung der Reaktion wird stark durch die Affinitätskonstanten von beiden Antigenen gegenüber dem Antiserum, das zum Beschichten der Polystyrolröhrchen verwendet wird, und durch die Qualität des spezifisch verwendeten Peroxidasereagens bestimmt.
Der Substitutionsgrad des Haptenkonjugats ist von kritischer Bedeutung für den Assay. Im Prinzip stellen die optimalen Bedingungen einen Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Erfassung des Makromolekül- oder kleinen Molekülteils des Haptenkonjugats und der Empfindlichkeit des immunologischen Systems auf der festen Phase dar.
Beispiel 2 Bestimmung von Östradiol
1. Beschreibung des Assays:
Eine Menge von Östradiol-6-CMO-Eialbuminkonjugat wird zu einer Östradiol enthaltenden Probe gegeben und das Gemisch wird in einem Polystyrolröhrchen inkubiert, das mit Anti-Östradiol beschichtet worden ist. Die an das Röhrchen gebundene Menge von Östradiol-6-CMO-Eialbumin ist umgekehrt proportional zu der Menge des Östradiols in der Probe. Die tatsächliche Menge des Östradiol-6-CMO-Eialbumins wird durch Verwendung von mit Peroxidase markierten Anti-Eialbumin-Antikörpern und anschließende Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrische Ablesungen bestimmt.
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-Al,-
Beispiel 5 Bestimmung von Östradiol
Auf der Basis von Östradiol-e-carboxymethyloxim-Lysozym
1. Beschreibung des Assays:
Eine Menge von Östradiol-6-CMO-Lysozymkonjugat wird zu einer Östradiol enthaltenden Probe gegeben und das Gemisch wird in einem Polystyrolröhrchen inkubiert, das mit Anti-Östradiol beschichtet worden ist. Die Menge des an das Röhrchen gebundenen Östradiol-6-CMO-Lysozyms ist umgekehrt proportional zu der Menge von Östradiol in der Probe. Die tatsächliche Menge von Östradiol-6-CMO-Lysozym, das an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge von Östradiol in der Probe. Die tatsächliche Menge von Östradiol-6-CMO-Lysozym wird durch Verwendung von mit Peroxidase markierten Anti-Lysozym-Antikörpern und anschließende Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrische Ablesungen bestimmt.
Beispiel 4 Bestimmung von Östradiol
Ayf_der_Basis_von_Östradiol-6^
1. Beschreibung des Assays:
Eine Menge von Östradiol-6-CMO-Arsaniltyrosinkonjugat wird zu einer Östradiol enthaltenden Probe gegeben und das Gemisch wird in Polystyrolröhrchen inkubiert, die mit Anti-Östradiol beschichtet sind. Die Menge von Östradiol-6-CMO-Arsaniltyrosin,
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die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge des Östradiols in der Probe. Die tatsächliche Menge von Östradiol-6-CMQ-Arsaniltyrosin wird mittels mit Peroxidase markierten Anti-Arsanil-Antikörpern und anschließende Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrische Ablesungen bestimmt.
Beispiel 5 Bestimmung von Serumthyroxin
1. Materialien:
a) Das Antigen T^RSA zur Erzeugung von Anti-Thyroxinserum wurde aus Thyroxinpentahydrat, Natriumsalz (Signma, . USA), 50 mg, und Rinderserumalbumin, 100 mg, hergestellt, wobei 135 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid für die Konjugation verwendet wurden. Die Charakterisierung und Bewertung des Konjugats erfolgten spektrophotometrisch durch Aufnahme der UV-Absorptionsspektren des Thyroxinrests bei 324 nm und des Proteinmoleküls bei 280 nm. Es wurde ein Verhältnis von 20 Thyroxinresten pro 1 Molekül RSA gefunden. Das Produkt wurde zur Immunisierung verwendet.
b) Das Anti-Thyroxinserum wurde durch Immunisierung von Kaninchen in folgender Weise hergestellt: 2,5 mg Antigen T^-RSA in Kochsalzlösung mit 0,5 ml Bordetella Pertusis in vollständigem Freund 'schein Adjuvans, 2,5 ml, wurden intradermal injiziert. Wiederholungsinjektionen wurden 3 1/2 Monate nach der primären Immunisierung und in Intervallen von einem Monat verabreicht, wobei die gleichen Mengen des Antigengemisches ohne Zugabe von Bordetella Pertusis verwendet wurden. Beim Hauptteil der Fälle erfolgte das Schlachten 7 bis 12 Tage nach den Injektionen.
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c) Die gamma-Globulinfraktion von Anti-Thyroxinserum wurde durch Ammoniumsulfatausfällung und anschließende DEAE-Cellulosechromatographie isoliert. Das Material wurde von Anti-RSA-Antikörpern durch Immunoadsorption auf RSA-Agarosesäulen (6 mg/ml) gereinigt. Die gereinigte Fraktion von Anti-Thyroxin wird bei dem Assay als Beschichtungslösung für die Herstellung von mit Antikörpern beschichteter Polystyroloberfläche verwendet.
d) Meerrettich-Peroxidasekonougat von Anti-RSA-Serum wurde aus der lgG-Fraktion von Anti-RSA-Serum (Miles 65-111) und Meerrettichperoxidase (Miles 36-451) durch Konjugation mit Glutaraldehyd hergestellt. Das Peroxidasekonjugat wurde auf Sephadex-G-200-Säulen gereinigt. Das Molverhältnis von gamma-Globulin zu dem Enzym wurde durch UV-Absorption ermittelt. Das bei dem Assay verwendete Konjugat hatte ein Molverhältnis von 1:1.
e) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm, Lab-Tek, Cat. Nr. 4411) werden als fester Träger verwendet.
f) Thyroxinpentahydrat, Natriumsalz (Sigma) wird als Standard-Antigen verwendet.
g) Das Substrat für die enzymatisch^ Reaktion besteht aus 5-Aminosalicylsäure (120 mg) in Phosphatpuffer, 0,02M, pH 6,5 (100 ml) und Hydroperoxid^ sung (Λ%, 1 ml).
h) Die beschichteten Röhrchen werden wie folgt hergestellt: Die Polystyrolröhrchen werden mit Carbonatpuffer, 0,05M, pH 9,5, gewaschen und mit der Beschichtungslösung (2 ml), die in der richtigen Weise mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung verdünnt worden ist, gefüllt und 18 h bei 4°c gehalten. Die Röhrchen werden in 0,01M-Phosphat und
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0,15M-KoChSaIzIoSUIIg, pH 7,4 (PBS) bei 40C gelagert» Sie können auf diese Weise mindestens 6 Monate lang ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden»
2. Beschreibung des Assays?
Eine Menge von Ihyroxin-RSA-Konjugat wird zu einer Probe gegeben, die Thyroxin enthält. Das Gemisch wird in einem Polystyrolröhrchen, das mit Anti-Thyroxin-Antikörpern beschichtet worden ist, inkubiert. Die Menge von Thyroxin-RSA, die an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge des freien Thyroxins in der Probe.. Die tatsächliche Menge von Thyroxin-RSA wird mittels mit Peroxidase markierten Anti-RSA-Antikörpern und anschließende Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrisch^ Ablesungen bestimmt,,
Beispiel 6 Bestimmung von Serumprogesteron
1. Materialien
a) Das Antigen für die Herstellung des Anti-Progesteronserums wurde in der Weise hergestellt, daß Progesteron-11a-hemisuccinat, 50 mg, mit Rinderserumalbumin, 200 mg, gekuppelt wurde, wobei 200 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid für die Konjugation verwendet wurden. Die Charakterisierung und Bewertung des Konjugats Progesteron-11 cc-RSA erfolgte spektrophotometrisch durch Aufnahme der UV-Absorptionsspektren des Progesteronrests bei 240 nm und von Rinderserumalburain bei 280 nm. Es wurde ein Verhältnis von 24 Progesteronresten pro 1 Molekül RSA gefunden. Das Produkt wurde für die Immunisierung verwendet.
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l») Das Anti-Progesteron-11α-RSA-Serum wurde durch Immunisierung, von Kaninchen in der folgenden Weise hergestellt: 2,5 mg des Antigens Progesteron-11α-RSA in Kochsalzlösung mit 0,5 ml Bordetella Pertusis in vollständigem Freund1 sehen Adjuvans, 2,5 ml, wurde intradermal injiziert. Wiederholungsinjektionen wurden 3 1/2 Monate nach der primären Immunisierung und danach in Intervallen von einem Monat verabreicht, wobei die gleichen Mengen des Antigengemisches ohne Zugabe von Bordetella Pertusis verwendet wurden. Im Hauptteil der Fälle erfolgte das Schlachten 7 bis 12 Tage nach den Injektionen.
c) Die gamma-Globulinfraktion des Anti-Progesteronserums wurde durch Ammoniumsulfatausfällung und anschließende DEAE-Cellulosechromatographie isoliert. Das Material wurde von Anti-RSA-Antikörpern durch Immunoadsorption auf RSA-Agarosesäulen (6 mg/ml) gereinigt. Die gereinigte Fraktion des Anti-Progesterons wird bei dem Assay als Beschichtungslösung für die Herstellung der antikörperbeschichteten Polystyroloberfläche verwendet.
d) Meerrettichperoxidasekonjugat von Anti-RSA-Serum wurde aus der igG-Fraktion von Anti-RSA-Serum (Miles 65-111) und Meerrettichperoxidase (Miles 36-451) durch Konjugation mit Glutaraldehyd hergestellt. Das Peroxidasekonjugat wurde auf Sephadex-G-200-Säulen gereinigt. Das Molverhältnis von gamma-Globulin zu dem Enzym wurde durch UV-Absorption bestimmt. Das beim Assay verwendete Konjugat hatte ein Molverhältnis von 1:1.
e) Polystyrolröhrchen (75 χ 12 mm, Lab-Tek, Cat. Nr. 4411) werden als fester Träger verwendet.
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811537
f) Progesteron (Xkapharms Code Nr. 2680) wird als Standard Antigen verwendet.
g) Das für die enzymatisehe Reaktion verwendete Substrat besteht aus 5-Aminosalicylsäure (120· mg) in Phosphatpufferj 0,02M9 pH 695 (100 ml) und Hydroperoxidlösung, (1 ml).
h) Beschichtete Röhrchen werden wie folgt hergestelltg Die Polystyrolröhrchen werden mit Carbonatpuffer9 Ο9Ο5ΜΡ pH 9,5, gewaschen und mit Beschichtungslösung (2 ml)9 die entsprechend mit Phosphatpuffer-Koehsalzlösung verdünnt ist, gefüllt und sie werden 18 h lang bei 4°C gelagert« Die Röhrchen werden in 0P01M-Phosphat und 0915M= Kochsalzlösung, pH 7S4 (PBS) bei 4°C gelagert und sie können auf diese Weise mindestens 6 Monate lang ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden,
2. Beschreibung des Assays?
Sine Menge von Progesteron-RSA-Konjugat wird zu einer Progesteron enthaltenden Probe gegeben und das Gemisch wird in einem Polystyrolröhrchen, das mit Anti-Progesteron-Antikörpern beschichtet worden ist, inkubiert„ Die Menge des an das Röhrchen gebundenen Progesteron-RSA ist umgekehrt proportional zu der Menge von freiem Progesteron in der Probe» Die tatsächliche Menge von Progesteron-RSA wird mittels mit Peroxidase markierten Anti-RSA-Antikörpern und anschließende Zugabe von Peroxidasesübstrat und kolorimetrische Ablesungen bestimmt,,
Beispiel 7
Bestimmung von Prostaglandin-Fg^
38/0SS1
1. Materialien:
a) Bas zur Herstellung von Anti-Prostaglandin-Fp -RSA-Serum verwendete Antigen wurde in der Weise hergestellt, daß Prostaglandin-P2a (20 mg) mit Rinderserumarbumin, 80 mg, unter Verwendung von 80 mg 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid zur Konjugierung gekuppelt wird. Das Endprodukt wurde durch UV-Absorption untersucht, wobei Spektren von RSA "bei 280 nm aufgenommen wurden. Das Konjugat wurde mit tritiiertem Prostaglandin-F2a (5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15 5H) N.E.N. HET-433» verfolgt. Es wurde gefunden, daß 15 Reste von Prostaglandin-Fgjy pro RSA-Molekül gebunden waren. Das Produkt wurde zur Immunisierung verwendet.
to) Das Anti-Prostaglandin-F2a-RSA-Serum wurde durch Immunisierung von Kaninchen in folgender Weise hergestellt: 2,5 mg des Antigens Prostaglandin-F2a-RSA in Kochsalzlösung mit 0,5 ml Bordetella Pertusis in vollständigem Freund«schem Adjuvans, 2,5 ml, wurde intradermal injiziert. Wiederholungsinjektionen erfolgten 3 1/2 Monate nach der primären Immunisierung und in Intervallen von einem Monat, wobei die gleichen Mengen des Antigengemisches ohne Zugabe von Bordetella Pertusis verwendet wurden. Beim Hauptteil der Fälle erfolgte das Schlachten 7 bis 12 Tage nach den Injektionen.
c) Die gamma-Globulinfraktion des Anti-Prostaglandin-Fg^ Serums wurde durch Ammoniumsulfatausfällung und anschließende DEAD-Celluloseehromatographie isoliert. Das Material wurde von Anti-RSA-Antikörpern durch Immunoadsorption auf RSA-Agarosesäulen (6 mg/ml) gereinigt. Die gereinigte Fraktion von Anti-Prostaglandin-Fp., wird
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"beim Assay als Beschichtungslösung für die Herstellung von mit Antikörpern beschichteter Polystyroloberflache verwendet.
d) Meerrettichperoxidasekonjugat von Anti-RSA-Serum wurde aus 1 g Fraktion von Anti-RSA~Serum (Miles 65-111) und Meerrettichperoxidase (Miles 36-451) durch Konjugation mit Glutaraldehyd hergestellt» Das Peroxidasekonjugat wurde auf Sephadex-G-200-Säulen gereinigte Das Molverhältnis von gamma-Globulin zu dem Enzym wurde durch UV-Absorption bestimmt. Das beim Assay verwendete Konjugat hatte ein Molverhältnis von 1 ; 1„
e) Polystyrolröhrchen (75 x 12 mm, Lab-Tek, Cat. Nr. 4411) wurden als fester Träger verwendet.
f) Prostaglandin-P2a (Gabe von Dr. F. Konen) wird als Stan dard-Antigen verwendet.
g) Das für die enzymatische Reaktion verwendete Substrat besteht aus 5-Aminosalicylsäure (120 mg) in Phosphatpuffer, 0,02M, pH 6,5 (100 ml) und Hydroperoxidlösung, 56 (1 ml).
h) Beschichtete Röhrchen werden wie folgt hergestellt? Die Polystyrolröhrchen werden mit Carbonatpuffer, 0,05MP pH 9»5, gewaschen und mit der Beschichtungslösung (2 ml) gefüllt, die entsprechend mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung verdünnt worden ist. Die Röhrchen werden 18 h lang bei 4°C gehalten. Die Röhrchen werden in 0,01M-Phosphat und 0,15M-Kochsalzlösung, pH 794 (PBS) bei 4°C gelagert und sie können auf diese Weise mindestens 6 Monate lang ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden»
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. aa.
2. Beschreibung des Assays:
Eine Menge von Prostaglandin-F2 -RSA-Konjugat wird zu einer Erostaglandin-Fpa enthaltenden Probe gegeben und das Gemisch wirde in einem Polystyrolröhrchen inkubiert, das mit Anti-Pro staglandin-Fp -Antikörpern beschichtet vrorden ist. Die Menge von Prostaglandin-Fp -RSA, das an das Röhrchen gebunden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge des freien Prostaglandin-Fg -RSA in der Probe. Die tatsächliche Menge von Prostaglandin-Fg -RSA wird durch Verwendung von mit Peroxidase markierten Anti-RSA-Antikörpern und anschließende Zugabe von Peroxidasesubstrat und kolorimetrisch^ Ablesung bestimmt.
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811537
TabelleJE
Die Tabelle zeigt die Ergebnisse des Enzymimmunoassays von Östradiol, der mit antikörperbeschichteten Röhrchen durchgeführt -wurde» Die angegebenen Werte stellen die direkten kolorimetrischen Ablesungen der Absorption bei 450 nm dar»
Antigenkonzentration OD 450 nm (Hintergrundwerte ab
gezogen)
Östradiol-6-CMO null 0,632
5 pg/ml 0,594
15 pg/ml 0,450
50 pg/ml 0,402
150 pg/ml 0,332
500 pg/ml 0,204
1000 pg/ml 0,152
Östradiol null 0,608
12,5 pg/ml 0,432
25 pg/ml 0,354
50 pg/ml 0,275
100 pg/ml 0,191
250 pg/ml 0,130
500 pg/ml 0,106
«Q98.3B/08S
Tabelle II
Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse des Enzymimmunoassays von Östradiol, angegeben als durchschnittliche prozentuale Werte der gefundenen gesamten enzymatischen Aktivität, die an die beschichteten Röhrchen gebunden war, als Ergebnis der Hemmung durch Östradiol oder Östradioloxim.
Antigenkonzentration Prozent der gebundenen enzymatischen Aktivität E/EQ χ
Östradiol-6-CMO null 100
5 pg/ml 94
15 pg/ml 71
50 pg/ml 64
150 pg/ml 52
500 pg/ml 32
1000 pg/ml 24
Östradiol " null 100
12,5 pg/ml 83
25 pg/ml 71
50 pg/ml 56
100 pg/ml 39
250 pg/ml 20
500 pg/ml 17
Ende der Beschreibung.
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Claims (12)

PATENTANWÄLTE DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANN EKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-79 7078 · TELEX 05-212156 kpat d TELEGRAMM KRAUSPATENT Patentansprüche
1. Empfindlicher quantitativer Assay zur Bestimmung eines Haptens "X", dadurch gekennzeichnet, daß man
a) ein Konjugat des Haptens X herstellt, welches dazu imstande ist, eine Antikörperbildung hervorzurufen; und einem Säugetier dieses Konjugat injiziert, wodurch ein spezifischer Antikörper gegen das Hapten, "Anti-X% gebildet wird,
b) ein Konjugat aus dem Hapten X und einem weiteren Gebilde "Y", das entweder ein anderes Hapten oder ein größeres Molekül ist, herstellt,
C-) einem Säugetier das Gebilde Y, wenn dieses ein größeres Molekül ist, oder ein Konjugat davon, wenn dieses ein kleines Molekül ist, welches für sich keine Antikörperbildung hervorruft, injiziert, um Anti-Y-Antikörper zu bilden,
d) ein Konjugat aus einem geeigneten Enzym und dem Antikörper gegenüber Y, d.h. ein (Enzym)-(Anti-Y)-Konjugat, herstellt,
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e) die Antikörper gegen X, d.h. Anti-X, auf einem festen Träger adsorbiert,
f) den festen Träger mit einem Gemisch in Berührung bringt, welches die unbekannte Menge von Hapten X und eine bekannte Menge des X-Y-Konjugats enthält,
g) nicht-umgesetztes X und X-Y entfernt, wobei alle Anti-X-Stellen besetzt zurückbleiben,
h) den enzymmarkierten Anti-Y-Antikörper zusetzt und
i) ein geeignetes Substrat zusetzt, das eine Farbreaktion ergibt, und die Intensität der Farbe mißt, welche die Menge des gebundenen Enzyms angibt^ und anhand von Eichkurven die Menge des Haptens X bestimmt.
2. Assay nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Hapten ein Hormon, Vitamin, Herzglycosid, Polypeptid, Arzneimittel oder dergleichen ist.
3. Assay nach Anspruch 2, dadurch geken nzeichn e t , daß das Hapten Östradiol, Progesteron, Prostaglandin, Thyroxin oder Trijodthyroxin ist.
4. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gebilde Y aus der Gruppe Trinitrophenyllysin, SuIfanilsäure, p-Aminobenzoesäure, p-Azophenyl-ß-lactosid, Hippursäure, Jodacetylaminobenzolazohippursäure, 6-Carboxypurin, 5-Acetyluracil, Thymidin, Uridin, Dinitrophenyllysin und Arsaniltyrosin auswählt.
5. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzym eine Peroxidase verwendet.
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6. Assay nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peroxidase Meerrettichperoxidase verwendet.
7. Assay nach einem der Ansprüche 1 "bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß der feste Träger eine geeignete polymere Substanz ist.
8. Assay nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Polystyrol ist.
9. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in Form eines Reagensröhrchens vorliegt, das auf seiner Innenseite mit Anti-Hapten-Antikörpern (Anti-X) beschichtet ist.
10. Assay nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Polystyrolreagensröhrchen ist.
11. Testzusammenstellung zur Durchführung des Assays nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch standardisierte Zubereitungen von Anti-Hapten-Antikörpern, Anti-X, Haptenkonjugat X-Y und mit enzymmarkiertem Anti-Y-Antikörper, wie definiert.
12. Testzusammenstellung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , daß sie einen festen Träger mit adsorbierten Anti-Hapten-Antikörpern enthält.
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