DE1954728C3

DE1954728C3 - Pufferlösung zur Verwendung in einem Hämagglutinationstest

Info

Publication number: DE1954728C3
Application number: DE19691954728
Authority: DE
Inventors: Betty Lou Waukegan Ill. Lanius (V.St.A.)
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1968-10-31
Filing date: 1969-10-30
Publication date: 1978-12-07
Also published as: JPS4946050B1; DE1954728B2; CA943066A; GB1286857A; DE1954728A1

Description

Antigene sind Stoffe, die im Blut oder Gewebe von Warmblütern die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Beispielsweise ist der Rötelvirus (Rubella-Virus) für die akute, exanthematische Fiebererkrankung verantwortlich, die gewöhnlich als Röteln bezeichnet wird. Ob ein Patient von dieser Erkrankung befallen wird oder nicht bzw. ob er in der Lage ist, den einmal durch Ansteckung erworbenen Virus zu immobilisieren, hängt von der immunologischen Reaktion ab, die der Patient hervorzurufen vermag. Unter immunologischer Reaktion ist die Fähigkeit, eine genügende Menge an Antikörpern zu erzeugen und an das System abzugeben, daß die Immobilisierung des angreifenden Antigens erzielt wird, zu verstehen. Somit handelt es sich beim Rötel-Virus um ein Antigen, das die Bildung und Freisetzung spezifischer Antikörper im Körper nach dem bekannten Prinzip des Antigen-Antikörper-Mechanismus hervorruft.

Um diese Erkrankung zu diagnostizieren, ist es notwendig, den Hämagglutinations-Titer des Rötel-Virus und den Serumantikörper-Titer gegenüber dem Rötel-Virus zu messen. Diese Information versetzt den Arzt in die Lage, die im Serum des Patienten vorhandene Antikörperkonzentration zu bestimmen. Wird beispielsweise festgestellt, daß die Antikörpermenge des Patienten zur Immobilisierung des Virus nicht genügt, kann eine ausreichende Dosis an y-Globulin verabreicht werden. Beispielsweise ist es wichtig festzustellen, ob Frauen im gebärfähigen Alter gegen diese Erkrankung, die eine Schädigung der Frucht hervorrufen kann, immun sind.

Im allgemeinen wird die Bestimmung des Titers des die Hämagglutination verursachenden Antikörpers im Serum eines Patienten in drei Stufen durchgeführt. Die erste Stufe wird als Hämagglutinations-Test bezeichnet. Dabei soll eine standardisierte Antigenlösung erhalten werden oder in anderen Worten die Menge an Antigen bestimmt werden, die eine standardisierte oder gemessene Menge von Zellen agglutiniert. Gegenwärtig verwendet man dafür beispielsweise frische Kükenoder Hühnererythrozyten, um zu einem standardisier- b5 ten Antigen-Titer zu gelangen. Die zweite Stufe betrifft die Herstellung des Serums. Dabei werden aus dem Serum nicht spezifische agglutinierende Stoffe, die die Bestimmung des Antikörper-Titers beeinflussen könnten, eatfemt. Bei der letzten Stufe werden die Seren reihenweise verdünnt und die Antikörper mit einer standardisierten Antigenmenge gehemmt. Diejenige Verdünnung der Seren, bei der das nicht gehemmte Antigen eine Hämagglutination der Erythrozyten verursacht, bestimmt den Antikörper-Titer des Serums. Diese Messung ist eigentlich die Bestimmung des Punktes, bei dem nicht mehr genügend viele Antikörper im Serum vorhanden sind, um die Antigene zu neutralisieren, so daß überschüssige Antigene zurückbleiben, die die Zellen agglutinieren können. Der Antikörper-Titer an diesem Punkt wird als der reziproke Wert der Antigen-Verdünnung ausgedrückt.

Kürzlich wurde eine Methode gefunden, nach der Zellen, wie Erythrozyten, einer doppelten Aldehydbehandlung unterzogen werden können. Dabei werden die Zellen fixiert und für längere Zeit lagerfähig gemacht. Nachstehend werden diese Zellen als fixierte Zellen bezeichnet. Der Vorteil der sich beim Hämagglutinations-Hemmungstest auf Rötel-Virus und andere derartige Viren durch die Verwendung von fixierten Zellen anstelle von frischen Zellen ergibt, ist offensichtlich. Klinische Testpackungen können diese fixierten Zellen anstelle von frischen Zellen enthalten. Dadurch ergibt sich eine verlängerte Lebensdauer der Testpackung und die Notwendigkeit, für die Ausführung des Tests periodisch frische Zellen beschaffen zu müssen, entfällt Schwankungen in den Testergebnissen, die sich mit unterschiedlichen Proben von frischen Zellen ergeben, werden ebenfalls vermindert.

Um diese fixierten Zellen in Hämagglutinations-Hemmungstests zu verwenden, war jedoch die Entwicklung eines neuartigen Puffersystems notwendig, damit der Test genau und empfindlich durchgeführt werden kann. Aufgabe der Erfindung ist es daher, neue Puffersysteme zur Verwendung von fixierten Zellen im Hämagglutinations- und Hämagglutinations-Hemmungstest mit verschiedenen Viren, wie dem Rötel-Virus, bereitzustellen. Ferner soll ein Verfahren zur Messung des Antikörper-Titers des Serums von Warmblütern für bestimmte Viren unter Verwendung von vorbehandelten und fixierten Zellen zur Verfugung gestellt werden.

Diese Aufgabe wird ausgehend von einer Pufferlösung der im Gattungsbegriff des Patentanspruchs 1 definierten Art durch die im kennzeichnenden Teil angegebenen Merkmale gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Pufferlösung sind in den Patentansprüchen 2 und 3 und ein Verfahren zur Messung des Antikörpertiters ist im Patentanspruch 4 beschrieben.

Wie bereits erwähnt, können Zellen, wie Erythrozyten, durch Behandlung mit bestimmten Aldehyden, die den Zellen eine verlängerte Stabilitätsperiode und verbesserte Lagerfähigkeit verleihen, fixiert werden. Das Verfahren läßt sich kurz wie folgt beschreiben: Die Erythrozyten werden zunächst mit einer verdünnten Lösung von Brenztraubenaldehyd und danach mit einer verdünnten Lösung von Formaldehyd behandelt. Die in dieser Weise behandelten Zellen erweisen sich selbst nach wiederholtem Einfrieren und Auftauen als stabil und sind monatelang lagerfähig. Diese Zellen werden als »fixierte Zellen« bezeichnet.

Zweck der ersten Stufe des Hämagglutinations-Tests ist es, eine standardisierte Antigen-Lösung oder spezifischer ausgedrückt, denjenigen Antigen-Titer zu erhalten, bei dem die Zellen nicht mehr agglutinieren,

sondern sich statt dessen aus der Lösung absetzen und am Boden der Mikroplatte eine knopfähnliche Ablagerung bilden. Dies wird dadurch erreicht, daß eine Antigen-Lösung mit einem erfindungsgemäßen Puffer auf einer Mikroplatte serienmäßig jeweils um den Faktor 2 verdünnt wird, was zu Konzentrationen von 1 Teil Antigen und 1 TeU Puffer (1:1) bzw. 1 Teil Antigen zu 2 Teilen Puffer (1:2) und dann 1:4, 1: 8 und 1:16 und so weiter führt. Der pH-Wert dieses Systems sollte innerhalb des Bereichs von 6,8 bis 8 gehalten werden. Der bevorzugte pH-Wert beträgt 7,1. Jede Mikroplattenvertiefung wird mit einer Suspension von fixierten Zellen in einem Acetatpuffer (Indikatorzellen), der auf einen pH-Wert von 5,4 bis 6,4 und vorzugsweise auf 5,8 eingestellt ist, versetzt. Der sich ergebende pH-Wert des kombinierten Systems sollte vorzugsweise im Bereich von 5,8 bis 6,4 liegen, da die Hämagglutinations-Reaktion in diesem Bereich gut abläuft und bei einem höheren pH-Wert weniger empfindlich ist. Der bevorzugte pH-Wert des kombinierten Systems ist 6,2. Bei einem pH-Wert des Antigen-Puffersystems von 7,1 und des fixierten Zellenpuffersystems von 5,8 ergibt sich ein pH-Wert des kombinierten Systems von 6,2.

Die Mikroplatten werden nach 2 bis 4 Stunden und dann wieder nach 16 Stunden kontrolliert. Der Titer, bei dem die Antigen-Lösung die Zellen nicht mehr agglutiniert, wird visuell bestimmt, indem die Bildung einer knopfähnlichen Ablagerung am Boden der entsprechenden Vertiefung beobachtet wird. Die knopfähnliche Ablagerung besteht aus Zellen, die infolge einer zur Agglutination nicht ausreichenden Antigen-Menge sedimentiert sind. Demzufolge wird der standardisierte Antigen-Titer als der reziproke Wert des Verdünnungsfaktors ausgedrückt, bei dem die Agglutination zuletzt eintritt. Wenn beispielsweise bei einer Antigen-Lösung von 1:16 die Zellen noch agglutinieren, aber bei einem Verdünnungsfaktor von 1:32 nicht mehr agglutinieren, sondern sedimentieren, hat der Standard-Antigen-Titer den Wert 16. Die letzte Antigen-Verdünnung, die eine vollständige Agglutination verursacht, wird als 1 Hämagglutinationseinheit bezeichnet.

Bei der zweiten Stufe wird das Serum hergestellt, das für die Antikörper-Messung getestet wird. Diese Herstellung der Seren gehört zum Stand der Technik, wobei aber das Serum aus Gründen der Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Puffer suspendiert wird. Im allgemeinen wird ein gegebenes Serumvolumen zu einer Suspension von Kaolin in dem Acetat-Protein-Puffer gegeben. Durch diesen Schritt werden nicht spezifische Inhibitoren aus dem Serum entfernt, die sonst im Hämagglutinations-Hemmungstest stören würden. Das Kaolin wird dann pelletisiert, und eine Suspension von fixierten Zellen im Acetat-Protein-Puffer wird dem mit Kaolin behandelten Serum zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird eine Zeitlang stehengelassen. Bei dieser beispielhaft angegebenen Arbeitsweise ergibt sich eine 1:5-Verdünnung des Serums. Diese Stufe bewirkt in ähnlicher Weise die Entfernung von Isoagglutininen, wodurch Störungen bei der Hämagglutinations-Hemmung ausgeschaltet werden. Schließlich wird das Serum zur Entfernung von Komplement erhitzt.

Bei der letzten Stufe werden die standardisierte Antigen-Lösung und das hergestellte Serum zur Bestimmung des Antikörper-Titers im Serum verwendet. Diese Stufe wird als Hämagglutinations-Hemmungstest bezeichnet Das Serum wird serienweise auf einer Mikroplatte um einen Faktor von 2 mit dem Acetat-Protein-Puffer, wie es zuvor mit der Antigen-Lösung geschah, verdünnt. Es ergeben sieb Verdünnungen von 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 und so weiter, da die Seren bereits in einer Verdünnung von 1:5 vorlagen. Jeder Vertiefung auf der Mikroplatte werden 4 Hämagglutinationseinheiten an Antigen, die in dem Acetat-Protein-Puffer suspendiert sind, zugesetzt, und

ίο die Mischung wird eine Zeitlang stehengelassen. Sodann wird das Gemisch mit stabilisierten Zellen versetzt, und die Platten werden so lange inkubiert, bis die Zellen knopfahnliche Ablagerungen bilden, was das Kriterium für den Antikörper-Titer darstellt Tatsächlieh bestimmt diese Reaktion den Titer, bei dem die Antikörpermenge im Serum nicht mehr zur Neutralisation der Antigene ausreicht, so daß die Antigene in die Lage versetzt werden, die Zellen zu agglutinieren. Der Titer, bei dem die Agglutination eintritt, wird bestimmt, indem die letzte Serumverdünnung beobachtet wird, bei der sich am Boden der Mikroplattenvertiefung eine knopfähnliche Ablagerung bildet Von diesem Serum wird dann der reziproke Wert der Verdünnung angegeben. Der sich ergebende Titer stellt die höchste Verdünnung der Serumtitration dar, bei der die Hämagglutination gehemmt wird.

Als Proteine für eine erfindungsgemäße Pufferlösung können Kaninchenserum-Albumin, Rinderserum-Albumin, Gelatine, andere derartige Albumine oder normales Serum verwendet werden. Außer den zwei notwendigen Bestandteilen können verschiedene Salze und andere Bestandteile zugegeben werden, um dem System eine physiologische Umgebung zu verleihen. Beispielsweise können Salze wie Calciumchlorid, Magnesiumsulfathydrat oder Natriumchlorid und Zucker zugesetzt werden. Ein bevorzugter Ansatz für einen solchen Puffer enthält die folgenden Bestandteile:

ADR-Puffer

Ein Puffer der vorstehenden Zusammensetzung ergibt einen pH-Wert von 7,1 und wirkt gut als Verdünnungsmittel für das Antigen und das Serum. Die fixierten Zellen verlangen einen Puffer, der einen niedrigeren pH-Wert, und zwar im Bereich von 5,4 bis 6,4, insbesondere von rund 5,8, aufweist. Ein solcher Puffer kann z. B. 0,2molares Acetat in einer 0,5prozentigen Lösung von Natriumchlorid enthalten.

Vorzugsweise beträgt der pH-Wert des kombinierten Antigen- und Zellen-Systems 5,8 bis 6,4 und insbesondere 6,2, da die die Hämagglutination verursachende Reaktion bei diesem pH-Wert, wie früher erwähnt, gut abläuft. Die erfindungsgemäßen Puffersysteme ermöglichen daher den Ersatz von frischen Zellen durch fixierte Zellen. Dies hat den Vorteil, daß die Herstellung einer Testpackung möglich wird, die langer gelagert werden kann. Eine fortlaufende Ergänzung mit frischen Zellen entfällt, und die Bestimmung des Antikörper-Titers erfolgt mit großer Genauigkeit.

Bestandteil	Volumen
0,1 m Natriumacetat	1 Liter
Wasserfreies Calciumchlorid	20 mg
Magnesiumsulfat · 7 H2O	120 mg
Natriumchlorid	8,5 mg
Dextrose	10,0 mg
Kaninchenserum-Albumin	5,0 ng

Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Beispiel

Teil I
Hämagglutinationsprüfung

In eine Reihe von Vertiefungen einer Mikroplatte werden 0,025 ml ADR-Puffer gegeben, und 0,025 ml Antigen werden serienmäßig in jede Vertiefung hinein verdünnt Schließlich werden 0,025 ml einer 0,35prozentigen Suspension von fixierten Zellen in einem Puffer, der aus 0,2 m Natriumacetat in einer 0,5prozentigen Lösung von Natriumchlorid besteht, serienmäßig in jede Vertiefung gegeben. Die serienmäßige Verdünnung führt zu Lösungen, die um einen Faktor von 2 verdünnt sind, d. h. 1:10, 1: 20,1:40, 1: 80, 1:160 und 1:320. Man läßt die Platte bei 4⁰C 2 bis 4 Stunden stehen und liest sie dann ab. Wenn beispielsweise eine knopfähnliche Ablagerung bei der 1: 32-Antigenverdünnung beobachtet wird, während bei der 1 : 16-Antigenverdünnung nocii Agglutination beobachtet wird, weist das Antigen einen Titer von 16 auf.

Teil II

Serumherstellung

Zu 0,2 ml Serumproben werden jeweils 0,3 ml ADR-Puffer gegeben. Diese Lösungen werden mit je 0,5 ml einer 25prozentigen Suspension von Kaolin in ADR-Puffer versetzt. Man läßt das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen und zentrifugiert zur Entfernung des Kaolins. Dann werden je 0,1 m! einer 50prozentigen Suspension von fixierten Zellen in ADR-Puffer zugesetzt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 4°C stehengelassen und sodann zentrifugiert. Die Seren werden dann \ Stunde bei 56°C durch Hitze desaktiviert.

Teil III

Hämagglutinations-Hemmungstest

0,025 ml ADR-Puffer werden in eine Mikroplatte gegeben und serienmäßig mit 0,025 ml behandelten Seren verdünnt, die in einer Verdünnung von 1:5 vorliegen. Es ergibt sich so eine serienmäßige Verdünnung der Seren um einen Faktor von 2, z. B. 1: 10, 1:20, 1:40, 1: 80, 1 : 160 und 1: 320. In jede Vertiefung werden 0,025 ml Antigen, das in ADR-Puffer bis auf 4 Hämagglutinations-Einheiten verdünnt worden ist, gegeben. Man läßt die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Dann werden 0,025 ml einer 0,35prozentigen Suspension von fixierten Kükenzellen in 0,2 m Acetat mit einem Gehalt an 0,5 Prozent Natriumchlorid zugegeben. Die Platte wird sodann mehrere Stunden bei 4°C inkubiert. Nach 2 bis 4 Stunden wird eine Sichtprüfung vorgenommen. Man erhält den Antikörper-Titer des Serums. Der Titer wird in derselben Weise, wie für die Hämagglutinations-Prüfung beschrieben, ermittelt.
Diese Arbeitsweise kann zur Bestimmung des Antikörper-Titers von Blutserum für den Rötel-Virus und andere Viren, wie die verschiedenen Stämme des Grippe-Virus, und Mumps angewandt werden. Die Ergebnisse des Tests stellen die Messung des Antikörper-Titers des Serums dar, das auf den gewünschten speziellen Virus geprüft wird.

In den folgenden Tabellen werden ähnliche Hämagglutinations-Hemmungs-Antikörper-Titer angegeben, die für verschiedene Antigene unter Verwendung von frischen Erythrozyten von Hühnern oder Küken oder fixierten Zellen erhalten wurden. In den Tabellen beziehen sich die mit »akut« überschriebenen Spalten auf den Titer, der mit einer Serumprobe erhalten wurde, die vor dem Impfen mit dem Antigen entnommen wurde, und die mit »Serum con« überschriebenen Spalten auf Titer, die an Proben erhalten wurden, die 14 Tage nach der Impfung entnommen wurden. Natürlich ist eine Erhöhung des Titers nach der Impfung zu erwarten, wobei eine 4fache Erhöhung des Titers ein Hinweis auf Serumumwandlung ist.

I. Grippe

Die verwendeten Grippe-Stämme waren: A/AA, A/PR8, A2/170, A2/TW, B/Md und B/M ASS. Es wurden zwei unterschiedlich vermehrte Antigene verwendet: eine Gewebekultur und ein in Ei gewachsenes Antigen. Die Zellensysterne bestanden aus einer 0,5prozentigen Suspension von frischen Hühner-Erythrozyten und einer 0,5prozentigen Suspension von fixierten Hühner-Erythrozyten.

A. Hämagglutination

	Virus	Quelle	Hämagglutinations-Titer	fixierte
40			frische	Hühnerzellen
			Hühnerzellen	0,5%
			0,5%	64, 64, 32
	A/AA	Gewebe-	64,32
45		Kultur (TC)		32,32
		Ei	64, 32, 32	32, 32, 22
	A/PR8	TC	32, 32, 32	256, 256
		Ei	128, 128	32, 32, 32
	A2/170	TC	32, 32, 32	16, 16, 16
50		Ei	16, 16, 16	32, 32, 32
	A2/TW	TC	64,16,64,16	32,32
		Ei	64	32, 64, 64
	B/Md	TC	32, 32, 32	32, 32/32
		Ei	64, 64, 64	256, 256, 256
55	B/MASS.	TC	128,128,128

B. Hämagglutinations-Hemmung

Quelle Hämagglutinations-Hemmungs-Titer

frische Hühnerzellen 0,5% akut Serum con

fixierte Hühnerzellen 0,5%

akut Serum con

A/PR8

TC	<20,	<20	640, 640
Ei	<20,	<20	640, 1280
TC	20		640. 640

<20,<20
<20, <20, <20
<20. <20

640, 1280

320, 640

640. 1280. 1280

Fortsetzung

Quelle Hämagglutinations-Hemmungs-Titer

irische llühnerzellen 0,5% akut Serum con

fixierte Hühnerzellen 0.5%

akut Serum con

Λ2/170

A2/TW

B/MASS.

TC

Ei

TC

Ei
TC

II. Mumps

20, 20, 40 20, 20, 20

40,20 20,40 80 <20

20 <20

640, 640, 1280 320, 1280 320

640, 160 1280 640, 1280

2560, 2560 320 20, <20
<20, <20

20, <20

20,40
<20, <20

20+, 20, 20
<20, <20, 40

20,20
<20

80, 640 320, 320 320, 320 320, 160 160, 320 160, 320, 320 160, 320, 160 640, 1280 1280, 640 2560,5120 320, 320

Der verwendete Mumps-Stamm war verdünnt. Es handelte sich um den Stamm BA ALL-25 vom Presbyter-St. Lukas-Hospital in Chicago, Illinois. Das Antigen war in Ei vermehrt worden.

A. Hämagglutination:

Der Antigen-Titer betrug 1 : 64.

B. Hämagglutinations-Hemmung

Humanserum	Hämagglutinations-Hemmungs-Titer	fixierte
	frische	Hühnerzellen
	Hühnerzellen	0,5%
	0,5%	<20, <20,<20
1. Akut	<20, <20	80, 80, 80
con	160, 160	<20, <20, <20
2. Akut	<20	640, 640, 640
con	320, 320, 640	<20, <20, <20
3. Akut	<20	160, 320, 160
con	160, 160, 160	<20, <20, <20
4. Akut	<20	320, 320, 320
con	160, 320, 320	<20, <20, <20
5. Akut	<20	40, 80, 160
con	80, 80, 160

25

30

35

Meerschweinchen 40, 40, 80

40, 40, 40

Die Hämagglutinations-Titer waren für die frischen Hühner-Erythrozyten und für die fixierten Zellen im wesentlichen die gleichen. In gleicher Weise waren die Hämagglutinations-Hemmungs-Antikörper-Titer vergleichbar, gleichgültig ob frische oder fixierte Zellen verwendet wurden.

III. Röteln

Hämagglutirmtions-Hemmungs-Antikörper-Titer gegen Rötel-Virus

Humanserutn	Hämagglutinations-Hemmungs-Titer	fixierte
	frische	Küken-
	Kükenzellen	zellen
		<10
1.AkUt	10	>230
con	640	<10
2.Akut	10	320
mn	640

Humanserum Hämagglutinations-Hemmungs-Titer

frische fixierte

Kükenzellen Küken

zellen

3. Akut
con

4. Akut
con

5.Akut

con
6.Akut

con
7. Akut

con
8.Akut

con
9.Akut

con
10. Akut

10
640

10
160

160
<10

320
<10

640
10

320
10
80
10

320

160 10 80 10

160 10

160 10 80 10 80 10

160

Eine geeignete klinische Testpackung für diagnostische Zwecke für etwa 20 Bestimmungen kann beispielsweise Ampullen umfassen, die 24 ml Adsorbens, wie eine Kaolinsuspension, 3,0 ml fixierte Adsorptionszeller (50prozentige Suspension), 40 ml Pufferlösung, 40 m fixierte Indikatorzellen (0,35prozentige Suspension) 4,0 ml Antigen und 1 ml Humanserum für die nega tive Kontrolle und 1 ml Humanserum für die positiv« Kontrolle enthalten. Die angegebenen Volumina stel len eine angemessene Materialmenge für 20 Bestim mungen mit nach der Makromethode durchgeführtei Titrationen bereit, die in 12 x 75 mm Glasröhrchei unter Verwendung von Makropipetten ausgeführt wer den können. Zusätzliche Bestimmungen können mi nach der Mikromethode durchgeführten Titrationei unter Verwendung von Mikrotiterplatten anstelle voi Röhrchen, 0,025-mm-Mikrotiter-Tropfgläsern un< 0,025 Mikro-Verdünnerösen erfolgen. Da die für di< Ausführung der Tests verwendeten, speziell behandel ten Zellen bei etwa 5^CC 2 Monate lang stabil sind sollte die Testpackung, wenn sie nicht benützt wird bei diesen Temperaturen gelagert werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Pufferlösung zur Verwendung in einem Hämagglutinations-Hemmungstest zum Verdünnen von Antigen, Serum und fiyierten Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Alkalimetallacetat und ein Protein enthält.

2. Pufferlösung nach Anspruch 1 zum Verdünnen von Antigen und Serum, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 6,8 bis 8 beträgt.

3. Pufferlösung nach Anspruch 1 zum Verdünnen von fixierten Eiythrozyten, dadurch gekennzeichnet, "daß der pH-Wert 5,4 bis 6,4 beträgt.

4. Hämagglutinations-Hemmungstest zur Bestimmung des Antikörpertiters im Serum unter Verwendung von fixierten Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Verdünnen von Antigen, Serum und fixierten Erythrozyten eine Pufferlösung nach den Ansprüchen 1 bis 3 verwendet.