DE2615092C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens

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DE2615092C2 DE2615092A DE2615092A DE2615092C2 DE 2615092 C2 DE2615092 C2 DE 2615092C2 DE 2615092 A DE2615092 A DE 2615092A DE 2615092 A DE2615092 A DE 2615092A DE 2615092 C2 DE2615092 C2 DE 2615092C2
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Description

Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß für die Diffusion und die Beendigung der Reaktion eine lange Zeit erforderlich ist, im allgemeinen 1 bis 2 Tage. 5 Ferner ist eine weitere Zeitspanne von 1 bis 2 Tagen abzuwarten, wenn die Probe das Antigen in einer Menge enthält, die über dem einwandfrei meßbaren Bereich liegt. Außerdem ist es bei Anwendung dieser Verfahren nicht einfach, genaue Werte zu erhalten, da die Bcstimdurch gekennzeichnet, daß die Probe vor io mung durch visuelle Beobachtung mit Hilfe eines VerZugabe des Antikörpers mit einer getrennt herge- größcrungsglases durchgeführt wird, stellten, exogenen antigenen Substanz, die mit der zu Ferner ist zusätzlich zu den vorgenannten Verfahren
bestimmenden antigenen Substanz idenlisch ist, in auch ein turbidimetrisches Verfahren bekannt; vgl. Clin. einer solchen Menge versetzt wird, daß bei der Re- Chetn., VoI 20, Nr. 8 (1974), S. 1055—1061. Bei diesem aktion mit dem verwendeten Antikörper eine maxi- 15 Verfahren wird die Beziehung zwischen den Mengen an
Antigen und Präzipitat ausgenützt Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, daß man bei der Präzipitationsreaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper bei konstanter Antigenmcnge eine in Fig. 1 gezeigte
Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin M (IgM), 20 Kurve erhalten kann. Obgleich die Anligenmenge geAlbumin, Λι-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin maß diesem Verfahren durch Trübungsmessung des Re- oder Kompiementkomponenten bestimmt. aktionsgemisches bestimmt werden kann, ist eine Bcstä-
3. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens tigung der tatsächlichen Menge notwendig (X im Antinach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine gen-Mangelbereich und Y im Antigen-Überschußbegetrennt hergestellte, exogene, antigene Substanz in 25 reich), da der Trübungswert für das Antigen zwei Werte
einer solchen Menge, daß bei der Reaktion mit dem liefert, nämlich X und Y. ™' ■*" ■
verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge erzielt wird.
4. Reagenz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Substanz Immunoglobulin G (IgG), Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin M (IgM), Albumin, Λι-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin oder eine Komplementkomponente ist.
male Präzipitation erreicht wird.
2. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen nach Anspruch !.dadurch gekennzeichnet, daß man Immunoglobulin G (IgG),
|jefert närn|jcn χ ^ ^ ße
stätigungstest« bezeichnet. Aufgrund dieser Tatsache ist dieses Verfahren nicht dazu geeignet, eine große Anzahl von Proben innerhalb einer beschränkten Zeit zu untersuchen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen lurbidimetrischcn Bestimmung von anligcncn Substanzen zur Verfügung zu sicllen, bei dem die vorgcnannicn Nachteile vermieden werden und das für eine
r> einfache und genaue Bestimmung der Menge an antige-
ncr Substanz geeignet ist, ohne dall ein Bcstätigungstcsi erforderlich ist.
Die Bestimmung von antigenen Substanzen, wie Im- Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur
munoglobulin, Albumin, «,-Anticrypsin, Transierrin, quantitativen Bestimmung von anligcncn Substanzen. Haptoglobin und Komplementkomponenten, spielt bei 40 bei dem eine Probe zur Auslösung der Antigen-Antikörder Diagnose und Behandlung von verschiedenen per- Reaktion mit einem für die zu bestimmende antige-Krankheiten eine wichtige Rolle. nc Substanz spezifischen Antikörper versetzt und die
Zur quantitativen Bestimmung dieser Substanzen Menge des gebildeten Präzipitats turbidimetrisch besind Verfahren bekannt, die sich der einfachen Diffusion stimmt wird, das dadurch gekennzeichnet ist. daß die in Platten oder Röhrchen bedienen. Die einfache Diffu- 45 Probe vor Zugabe des Antikörpers mit einer getrennt sion in Platten wird im allgemeinen durchgeführt, indem hergestellten, exogenen antigenen Substanz, die mit der man eine Trägerplatte aus Agargel herstellt, die einen
für eine zu bestimmende antigene Substanz (Antigen)
spezifischen Antikörper enthält, die antigene Substanz
in ein kleines Loch in der Gelplatte bringt, die Platte bei 50
einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit
stehenläßt, um eine Diffusion der antigenen Substanz
durch die Gelplatte und eine Reaktion mit dem Antikörper zu ermöglichen, und die Größe des rings um das
Loch gebildeten weißen Präzipitatrings (Reaktionsprodukt) mißt.
Die einfache Diffusion in einem Röhrchen wird durchgeführt, indem man eine antigene Substanz auf ein in einem Glasröhrchen befindliches Agargel, das einen
Antikörper enthält, bringt. Innerhalb dieses Röhrchens «i folgendermaßen durchgerührt: ein Antikörper und eine reagiert dann das Antigen mit dem Antikörper. Bei die- Probe mit einem Gehalt an aniigcncr Substanz werden sem Verfahren diffundiert das Antigen in das Gel von
oben nach unten und bildet eine scharfe Präzipitatbande
(Reaktionsprodukte Die Bewegung der Bande kommt
an der Stelle zum Stillstand, wo das System seinen
Gleichgewichtszustand erreicht. Die Antigenmenge
zu bestimmenden antigenen Substanz identisch ist. in einer solchen Menge versetzt wird, daß bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper eine maximale Präzipitation erreicht wird. Dazu kann ein leicher Überschuß der exogenen antigenen Substanz eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird die Menge an aniigcncr Substanz unter ausschließlicher Verwendung der Kurve im Überschußbereich an antigcncr Substanz verwendet, d. h. die letzte Hälfte der in F i g. 1 gezeigten Standardkurve ausgehend vom Punkt Z Somit ist es nicht notwendig, einen »Bestätigungstest« durchzuführen.
In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren
wird bestimmt, indem man den Abstand zwischen dem oberen Ende des Gels und der endgültig gebildeten
getrennt mit einem Puffer, beispielsweise Phosphatpuffer. Tris-HCI-Puffcr oder Vcronalpuffer. die jeweils Kochsalz enthalten, auf Konzentrationen verdünnt, die jeweils für die Antigen-Antikörper-Reakiion und furche anschließende turbidimctrische Messung der Probe geeignet sind. Die getrennt hergestellte, exogene antigene Substanz wird ebenfalls mit dem gleichen Puffer ;i,il
eine Konzentration verdünnt, bei der eine Messung leicht durchführbar und eine maximale Präzipitation erzielbar ist Die verdünnte antigene Substanz wird mit verdünnter exogener antigener Substanz versetzt. Das erhaltene Gemisch wird mit verdünntem Antikörper vermischt, woraui die Antigen-Antikörper-Reaktion bei Temperaturen von 10 bis 400C, vorzugsweise 20 bis 37"C, eine vorbesiimmte Zeit stattfindet Die Menge an antigener Substanz wird turbidimetrisch bestimmt, indem man die Menge an Präzipitat mißt und mit einer vorher erhaltenen Standardkurve vergleicht Bei der Aufstellung der Standardkurve werden die gleichen Antikörper- und Standardantigenlösungen von verschiedenen bekannten Konzentrationen verwendet.
Dieses Verfahren läßt sich auf alle Arten von antigenen Substanzen anwenden, beispielsweise auf Immunoglobuline, wie IgG, IgA und IgM, Albumin, «i-Antitrypsin, Transferrin, Haptoglobin und Komplementkomponenlen, wie die Komplementkomponente Cj.
Das Diagramm von F i g. 1 zeigt die B_-ziehung zwischen den Mengen an der zu bestimmenden antigenen Substanz und dem gebildeten Präzipitat unter Verwendung eines herkömmlichen turbidimetrischen Verfahrens. Dabei ist die Konzentration des Antikörpers, der mit der anligenen Substanz reagiert, konstant.
Die Diagramme der F i g. 2 bis 8 zeigen Standardkurven zur Bestimmung von IgG, IgA, IgM. den Komplemcntkomponcnten Cj, Haptoglobin, Transferrin bzw. Λ,-Aniitrypsin.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren gelingt eine einfache und genaue quantitative Bestimmung von antigenen Substanzen in kurzer Zeit.
Für praktische Zwecke ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Testpakkung anzuwenden. Die Erfindung betrifft somit auch ein Reagenz zur Durchführung des Verfahrens, das gekennzeichnet ist durch eine getrennt hergestellte exogene, antigene Substanz in einer ausreichenden Menge, um bei der Reaktion mit dem Antikörper die maximale Fällung zu ergeben.
Daneben enthält die Testpackung:
(a) Eine Pufferlösung zur Verdünnung der zu bestimmenden Probe,
(b) eine Anlikörperlösung, die auf eine zur Antigen-Antikörper-Reaktion geeignete Konzentration verdünnt ist und
(c) eine Reihe von Standardlösungen der anligenen Substanz, die jeweils verschiedene, bekannte Mengen an antigener Substanz enthalten.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel I
In Reagenzgläschen werden jeweils 0,95 ml Serum, das 11 ng IgG (exogene, antigene Substanz) enthält, gegeben. Diese Menge an IgG ergibt bei der Reaktion mit dem Antikörper die maximale Präzipitatir.enge. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an IgG und jeweils mit 1.0 ml verdünntem Aniiscrum (Antikörper), das mit 0.001 in Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 60fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches in den einzelnen Röhrchen betrügt jeweils 2 ml. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 37' C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten aiUigencn Substanz IgG und dem gebildeten Präzipitat ist in F i g. 2 zu sehen.
Beispiel 2
3u Proben von jeweils 0,1 ml Humanserum, das mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das SOfache verdünnt ist, werden jeweils mit 0,9 ml (entsprechend 110μg) IgG (exogene, antigene Substanz) versetzt und gründlich vermischt. Aus den Röhrchen werden jeweils 0,1 ml Gemisch entnommen und mit 1,0 ml auf das 60fache mit dem gleichen Puffer verdünntem Antikörper und 0,9 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 versetzt. Man läßt die Antigen-Antikörper-Reaktion bei 26°C eintreten. Nach 30 Minuten wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Beim Vergleich der Ergebnisse mit dem Diagramm von Beispiel 1 ergibt sich als Durchschnittswert der 30 Proben ein Wert von 1307 mg/dl, was dem Normalwert von gesunden Personen entspricht.
Zur Ausbeulebestimmung wird eine Probe aus den 30 Humanserumproben verwendet und mit bekannten Mengen an IgG versetzt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt.
Tabelle
IgG zugesetzt
(mg/dl)
berechnet
(mg/dl)
gefunden
mg/dl
Ausbeute*)
525
1050
2100
*) Ausbeute (%) -
2685
3210
4260
2160
2800
3280
4200
104
102
99
gefundener Wert
berechneter Wert
x 100.
Beispiel 3
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 17 μg IgA (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt die maximale Präzipitatmenge bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an IgA und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stun-
:>5 de bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz IgA und dem gebildeten Präzipitat ist in F i g. 3 gezeigt.
Bei der Ausbeutebestimmung gemäß Beispiel 2 erhält
bo man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 4
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes b5 Serum init einein Gehalt an 25 μg IgM (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden je-
weils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an IgM und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Veronalpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 30fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 370C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz IgM und dem Präzipitat ist in F i g. 4.gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 5
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 18 μg Komplementkomponente C3 (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maxirnr Ie Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an der Komplementkomponente C3 und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20fache verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der antigenen Substanz Komplementkomponente Cj und dem gebildeten Präzipitat ist in F i g. 5 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 6
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 15 μg Haptoglobin (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 m' Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit einem Gehalt an unterschiedlichen, bekannten Mengen an Haptoglobin und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37=C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz Haptoglobin und dem gebildeten Prä;zipitat ist in F i g. 6 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 7
In Teströhrchen werden jeweils 035 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 14 μg Transferrin (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Aniikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an Transferrin und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 60fache Volumen verdünnt ist. versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Snunde bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz Transferrin und dem gebildeten Präzipitat ist in Fig. 7 gezeigt.
to Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 8
30 Proben von jeweils 0,1 ml mit 0.001 m Phosphatptiffcr-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7.4 auf das 20f;sche verdünntem Humanserum werden in Teströhrchen mit 1,0 ml (entsprechend 14μg) Transferrin (exogene, antigene Substanz) versetzt und gründlich vermischt.
Sodann wird das Gemisch mit 1,0 ml mit der gleichen Pufferlösung auf das 60fachc verdünntem Antikörper versetzt und die Antigcn-Antikörpcr-Reaktion bei 37°C hervorgerufen. Nach 60 Minuten wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Ergebnisse werden mit dem gemäß Beispiel 7 erhaltenen Diagramm verglichen. Als Mittelwert der 30 Proben ergibt sich ein Wert von 291 mg/dl, was dem Normalwcrt für gesunde Personen entspricht.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 wird eine willkürlich gewählte Probe aus den 30 Humanserumproben verwendet. Man erhält gute Ergebnisse.
Beispiel 9
In Teströhrchen werden jeweils 0,95 ml verdünntes Serum mit einem Gehalt an 28 μg Λι-Antitrypsin (exogene, antigene Substanz; diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge) gegeben. Die einzelnen Röhrchen werden jeweils mit 0,05 ml Standardserum (standardisierte antigene Substanz) mit einem Gehalt an unterschiedlichen, bekannten Mengen an Λι-Antitrypsin und jeweils mit 1,0 ml verdünntem Antiserum (Antikörper), das mit 0,001 m Veronalpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 auf das 20fache Volumen verdünnt ist, versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches beträgt jeweils 2,0 ml. Das Gemisch wird jeweils 1 Stunde bei 37°C stehengelassen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt. Die Beziehung zwischen der bestimmten antigenen Substanz <*rAntitrypsin und dem gebildeten Präzipitat ist in F i g. 8 gezeigt.
Beim Ausbeutetest gemäß Beispiel 2 erhält man zufriedenstellende Ergebnisse.
Beispiel 10
Herstellung einer Testpackung
zur quantitativen Bestimmung von IgG
Die Testpackung wird folgendermaßen hergestellt:
(a) Röhrchen mit Pufferlösung: 0.99 ml 0,001 m Veronalpuffer-Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4.
(b) Röhrchen mit exogenem IgG: 0.98 ml Antiserum mit einem Gehalt an 11 μg IgG- Diese Menge ergibt bei der Reaktion mit dem verwendeten Antikörper die maximale Präzipitatmenge.
(c) Flasche mit Antikörper: Antiserum, das mit 0,001 m
Veronalpuffer vom pH-Wert 7,4 auf eine für die Aniigcn-Antikörper-Rcakiion geeignete Konzentration verdünnt ist.
(el) Kino Reihe von Standard-lgG-l.ösungen: Seren,die IgG in Mengen von 2, 4, b. 8 bzw. 10jig/0,02 ml enthalten.
Diese Testpackuiig kann folgendermaßen verwendet weiden: 0,01 ml Probe wird in das Röhrchen mit der Pufferlösung (a) gegeben und gründlich vermischt. An- i<> schließend werden 0,02 ml des Gemisches in das Röhrchen mit dem exogenen IgG (b) gegeben. Sodann wird I ml aus dem Fläschchcn mit Antikörper (c) entnommen und in das das Gemisch enthaltende Röhrchen gegeben. Man laßt die Antigcn-Antikörpcr-Reaktion 60 Minuten bei 37"C ablaufen. Anschließend wird die Trübung turbidimetrisch bestimmt.
Das gleiche Verfahren wird unter Verwendung des Standardpuffers anstelle der Probe durchgeführt. Mit Hilfe der so gewonnenen Eichkurve wird die Menge an IgG bestimmt.
Hierzu 4 Blatt Zeichnungen
25
Ji
40
50
faO
65

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen, bei dem eine Probe zur Auslösung der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem für die zu bestimmende antigene Substanz spezifischen Antikörper versetzt und die gebildete Präzipitatmenge turbidimetrisch bestimmt wird, da-
Bande mißt.
DE2615092A 1975-04-10 1976-04-07 Verfahren zur quantitativen Bestimmung von antigenen Substanzen und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens Expired DE2615092C2 (de)

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