CN104407159B - 一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒 - Google Patents

一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R1、试剂R2、校准品。通过在试剂R1中加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG，有效的提高了试剂盒的稳定性和分析灵敏度，其线性范围也较好，试剂的准确度高，有利于在市场中进一步的推广使用。

Description

一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒。
背景技术
免疫球蛋白由重链和轻链组成，根据重链(Heavychain，H链)恒定区化学结构的不同，相应的免疫球蛋白被划分为多种类型，分别为免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)以及免疫球蛋白G(IgG)。
人免疫球蛋白M(IgM)存在于人的血清中，占血清免疫球蛋白总量的5~10%，血清浓度约1mg/ml，主要由脾脏中浆细胞合成，一个IgM分子由5个单体通过J链连接成五聚体，有较高抗原结合价，也是五类免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）中分子量最大的，其分子量为950k道尔顿，故又称为巨球蛋白。
IgM是一种最早期的免疫球蛋白，是初次接触抗原后首先合成的免疫球蛋白。在成年人的血清中，占总免疫球蛋白的5%。IgM浓度下降发生在原发性及继发性免疫缺陷综合症中。IgM值的减少常见于蛋白质流失性肠道疾病及烧伤。严重感染和自身免疫性疾病可导致IgM浓度上升。多种巨球蛋白血症、细菌和寄生虫传染病、肝脏疾病、类风湿性关节炎及胆囊纤维症可使IgM浓度增加。
目前，实验室常用的IgM测定方法有HPLC及ELISA法。HPLC具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆IgM浓度的首选方法，但因HPLC需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用，而ELISA法操作过程有些繁琐，反应需要时间，不能一蹴而就。免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒基于IgM抗体与IgM抗原间的反应，形成免疫复合物，在340nm波长处检测其浊度变化，其变化程度与样本中的IgM含量成正比。该方法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂稳定性不好，准确度和灵敏度也不高，因而限制了其在临床上的推广应用。
发明内容
针对于现有技术存在的问题，本发明提供了一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性和线性范围比常规的检测试剂盒要好，分析灵敏度高，有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明是通过以下措施实现的：
一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：18.16mmol/LpH7.6Tris缓冲液、123.20mmol/L氯化钠、6%聚乙二醇400、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：18.16mmol/LpH7.6Tris缓冲液、30ml/L羊抗人IgM抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0.05%Kathon-CG。
所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，粒径为20-50nm。
所述试剂R1和试剂R2在使用时的体积比为R1：R2=250：50。
本发明所使用的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒是采用以下方法制备的：
采用多元醇法制备Fe3O4纳米粒子。取一定的乙酰丙酮铁和三甘醇加入到回流加热反应装置中，在磁力搅拌和Ar气保护的条件下，将装置缓慢加热至沸腾，并保持回流一段时间。冷却后向反应溶液中加入乙酸乙酯使生成的四氧化三铁纳米粒子产生絮凝，磁性分离黑色产物，清洗数次，分散到乙醇中，即得到稳定的Fe3O4纳米粒子乙醇胶体溶液。之后将所得Fe3O4纳米粒子采用Stober水解法制得SiO2包覆的Fe3O4纳米粒子。所得Fe3O4/SiO2复合纳米粒子的粒径为20-50nm。
本发明所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的IgM校准品。
本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法如下：
加入生理盐水、样本或校准品2μl，之后再加入R1试剂250μl预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入50μl的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
本发明的有益效果：
本发明提供的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，通过在试剂R1中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人IgM抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，大大的提高了试剂的分析灵敏度。同时在试剂R2中加入牛血清白蛋白，解决了抗体在稀溶液中不稳定这一难题，在试验中它能使抗体稳定，且相对地中性，但不会影响抗体的性质，而Kathon-CG是一种新型高效环保型广谱杀菌剂、防腐剂，在该试剂盒中使用Kathon-CG有效解决了BSA长时间保存易发霉的缺点，因此BSA与Kathon-CG共同作用有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。
附图说明
图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；
图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。
实施例1
一种常规的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH7.6Tris缓冲液18.16mmol/L
氯化钠123.20mmol/L
聚乙二醇4006%
试剂R2组成为：
Tris缓冲液pH7.618.16mmol/L
羊抗人IgM抗体30ml/L
本实施例描述的试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪，操作如下：
加入生理盐水、样本或校准品2μl，之后再加入R1试剂250μl预孵育5min后读取吸光度A1，之后再加入50μl的试剂R2反应5min后，读取吸光度A2，并计算ΔA。
本实施例所使用的校准品为久峰润达生物技术有限公司生产的IgM校准品。
实施例2
一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH7.6Tris缓冲液18.16mmol/L
氯化钠123.20mmol/L
聚乙二醇4006%
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒0.1%
试剂R2组成为：
Tris缓冲液pH7.618.16mmol/L
羊抗人IgM抗体30ml/L
牛血清白蛋白20g/L
Kathon-CG0.05%
具体测定方法同实施例1。
实施例3
一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH7.6Tris缓冲液18.16mmol/L
氯化钠123.20mmol/L
聚乙二醇4006%
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒1%
试剂R2组成为：
Tris缓冲液pH7.618.16mmol/L
羊抗人IgM抗体30ml/L
牛血清白蛋白30g/L
Kathon-CG0.05%
具体测定方法同实施例1。
实施例4
一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，它包括试剂R1、试剂R2、校准品。
其中试剂R1组成为：
pH7.6Tris缓冲液18.16mmol/L
氯化钠123.20mmol/L
聚乙二醇4006%
二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒2%
试剂R2组成为：
Tris缓冲液pH7.618.16mmol/L
羊抗人IgM抗体30ml/L
牛血清白蛋白40g/L
Kathon-CG0.05%
具体测定方法同实施例1。
对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。
准确度验证实验：
将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，市场上获得认可的一种准确度优异的免疫球蛋白IgM试剂盒（长春某公司生产）作为对照组进行对比实验，对40个样本进行检测，检测的结果如图1-图3。
通过图1-图3的检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.998、0.9991、0.9981，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的免疫球蛋白IgM检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。
线性相关性验证实验：
找到免疫球蛋白IgM高值样本为500mg/dL，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为37.00mg/dL、27.75mg/dL、18.50mg/dL、9.25mg/dL、0mg/dL浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表1所示。
表1实施例1-4线性相关验证实验检测结果
理论浓度（mg/dL） 实施例1检测结果（mg/dL） 实施例2检测结果（mg/dL） 实施例3检测结果（mg/dL） 实施例4检测结果（mg/dL）
500 494.94 503.29 505.44 496.72
400 401.21 406.77 398.42 405.71
300 288.30 297.48 300.28 298.87
200 204.22 200.03 197.67 201.59
100 99.23 100.95 99.69 101.29
0.00 0.17 0.23 0.21 0.20
相关系数r 0.9990 0.9997 0.9998 0.9997
上述检测结果显示，实施例1-4检测结果相关性均大于0.990，但实施例2、3、4的检测结果大于0.997，与实施例1相比具有更好的线性相关性，这说明本发明试剂具有更好的线性相关性。
稳定性验证实验：
在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。检测数据如表2。
表2稳定性验证实验检测结果
时间 实施例1试剂检测结果 实施例2试剂检测结果 实施例3试剂检测结果 实施例4试剂检测结果 新鲜的实施例1试剂检测结果
12个月 0.02457 0.02506 0.02487 0.02498 0.02479
13个月 0.03528 0.03587 0.03616 0.03632 0.03622
14个月 0.04346 0.04188 0.04214 0.04204 0.04174
15个月 0.03328 0.03398 0.03382 0.03358 0.03407
16个月 0.01967 0.02943 0.02967 0.03001 0.02957
17个月 0.00684 0.02734 0.02686 0.02691 0.02729
18个月 0.00032 0.04826 0.04757 0.04811 0.04843
19个月 0.00002 0.03725 0.03733 0.03688 0.03698
20个月 0.00001 0.04685 0.04596 0.04623 0.04703
21个月 0.00000 0.05374 0.05421 0.05417 0.05461
22个月 0.00000 0.03284 0.03314 0.03321 0.03358
23个月 0.00000 0.03263 0.03198 0.03167 0.03265
24个月 0.00000 0.02178 0.02213 0.02121 0.02235
25个月 0.00000 0.03357 0.03443 0.03500 0.04232
26个月 0.00000 0.01365 0.01932 0.02397 0.05328
实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中加入牛血清白蛋白和Kathon-CG，二者共同作用有效的提高了免疫球蛋白IgM检测试剂盒的稳定性。
分析灵敏度验证实验：
用本发明免疫球蛋白IgM试剂盒测试已知浓度在170mg/dL的样本，记录吸光度差值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表3所示。
表3分析灵敏度实验结果
理论浓度（mg/dL） 实施例1检测结果ΔA 实施例2检测结果ΔA 实施例3检测结果ΔA 实施例4检测结果ΔA
170 0.1968 0.2561 0.2498 0.2514
通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒的吸光度差值均比实施例1的高，说明在试剂中加入二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒在静电吸附的作用下与羊抗人IgM抗体结合，从而使抗体在磁性纳米颗粒上形成凝集，扩大了响应信号，大大的提高了试剂的分析灵敏度。
综合以上分析，本发明提供的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，在试剂R1中通过加入一定量的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒和在试剂R2中加入一定量的牛血清白蛋白和Kathon-CG能够有效的提高试剂盒的稳定性和分析灵敏度，线性范围较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。

Claims (3)

1.一种免疫球蛋白IgM免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1、试剂R2和校准品，其中试剂R1组成为：18.16mmol/LpH7.6Tris缓冲液、123.20mmol/L氯化钠、6%聚乙二醇400、0.1%-2%二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒；试剂R2组成为：18.16mmol/LpH7.6Tris缓冲液、30ml/L羊抗人IgM抗体、20-40g/L牛血清白蛋白、0.05%Kathon-CG。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒为Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，粒径为20-50nm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的体积比为R1：R2=250：50。
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