DE2551576C3

DE2551576C3 - Träger für immunochemische Messungen

Info

Publication number: DE2551576C3
Application number: DE2551576A
Authority: DE
Inventors: Masakatsu Tokio Hashimoto; Nobuhisa Omiya Saitama Ogawa
Original assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokio
Current assignee: Mochida Seiyaku Kk Tokio
Priority date: 1974-11-16
Filing date: 1975-11-17
Publication date: 1978-06-29
Also published as: NL7513302A; GB1487698A; NL180546C; NL180546B; DE2551576A1; JPS5157818A; BR7507475A; US4062936A; DE2551576B2; DK513375A; FR2291496A1; FR2291496B1; DK143045C; CA1049404A; DK143045B; JPS5247012B2

Description

In den vergangenen Jahren wurde die Messung biologisch aktiver Komnonenten in einem lebenden Körper, wie Insulin, Wachstumshormonen, Prolactin, Gastrin, Nebennierenrindenhormonen, Schilddrüsenhormonen, Angiotensin oder dergleichen, als wichtig Tür die Diagnose, Therapie und Verhinderung von menschüschen Krankheiten oder zur Durchführung von verschiedenen Funktionstests angesehen. Die Folge ist, daß derartige Messungen nunmehr sehr häufig durchgefiihrt werden.

Da jedoch alle diese biologischen Komponenten in sehr kleinen Mengen vorliegen, können sie nicht nach einer herkömmlichen chemischen Methode gemessen werden, vielmehr werden sie nach einer immunochemischen Methode gemessen, beispielsweise durch eine Radioimmunoanalyse, die nachfolgend als RIA bezeichnet wird. Diese Analyse ermöglicht eine außergewöhnliche Messung.

Die RIA-Methode eignet sich jedoch nicht zum Messen von Komponenten des menschlichen Körpers im Rahmen einer Routineuntersuchung in medizinischen Labors, da sie spezielle Instrumente erfordert, die unter Einsatz von Isotopen arbeiten, wobei die Bedienung dieser Instrumente schwierig und nicht sehr bequem ist.

Eine bekannte einfache Methode zur Messung von biologischen Komponenten im menschlichen Körper besteht darin, einen Träger aus Blutzellen, Polystyrollatex, Kaolinit, Betonit, Aktivkohle, kristallinem Cholesterin oder dergleichen mit einem Antigen oder Antikörper zu sensibilisieren und dann den Träger mit dem Antikörper oder Antigen in der Probe umzusetzen, wodurch eine immunochemische Agglutinierungsreaktion oder eine Agglutinierungsinhibierungsreaktion erfolgt. Eine Methode unter Einsatz von Blutzellen als Träger ist infolge ihrer hohen Empfindlichkeit besonders vorzuziehen. (Kabat and Mayer's, Experimental Immunochemistry, 2. Auflage, 2. Druck, Springfield, IiI, 1964, Seite 119-122).

Die Blutzellen, die als Träger für die vorstehend erwähnte immunochemische Messung eingesetzt werden, werden gewöhnlich aus Blutzellen hergestellt, die von verschiedenen Tieren ohne eine chemische Behandlung erhalten werden. Man kann auch auf Blutzellen zurückgreifen, die zuerst mit einem geeigneten Fixiermittel, wie Formaldehyd, Pyruvinaldehyd, Wasserstoffperoxyd oder dergleichen und dann mit einem Bindemittel, wie Gerbsäure, Bisdiazobenzidin, 1,.VDinuor-4,6-dinitrobenzol oder dergleichen, behandelt worden sind.

Die Tiere, aus denen die Blutzellen erhalten werden, sind im allgemeinen Säugetiere, beispielsweise Rinder, Pferde, Schafe, Kaninchen, Menschen etc., oder Vögel, beispielsweise Küken, Tauben, Truthähne oder dergleichen, man kann jedoch auch auf andere Tiere zurückgreifen, beispielsweise Reptilien, wie Krokodile und Schlangen, sowie Amphibien, wie Frösche etc., ferner auf Wassertiere, wie Delphine.

Die Blutzellen, die aus diesen Tieren erhalten werden, können in unbehandeltem Zustand verwendet werden, in den meisten Fällen werden jedoch fixierte Blutzellen, die mit den vorstehend geschilderten Fixiermitteln behandelt worden sind, verwendet, da nichtbehandelte Blutzellen in ihrer natürlichen Form eine schlechte Festigkeit besitzen und zu einer Iläniolysc während mechanischer oder chemischer Behandlungen neigen.

Unter dem Begriff »Blutzellcn« soll die Materialkomponente in dem Blut verstanden werden, die sich hauptsächlich aus π ten Blutzellen zusammensetzt.

wobei sowohl nichtbehandelte Blutzellen, die keinerlei Behandlung unterzogen worden sind, als auch die erwähnten fixierten Blutzellen in Frage kommen. Die Menge der Blutzellen wird durch das scheinbare Volumen an Blutzellen wiedergegeben, das beim Zentrifugieren von Blut ermittelt wird.

Diese Blutzellen müssen mit dem vorstehend erwähnten Bindemittel behandelt werden, bevor sie als Träger verwendet werden. Es ist schwer. Antigene oder Antikörper an Blutzellen zu binden, die nicht mit einem Bindemittel behandelt worden sind. Auch dann, wenn sie gebunden sind, läßt sich kein gleichmäßiges Produkt erhalten, so daß es unmöglich ist, einen Träger zu gewinnen, er eine reproduzierbare Empfindlichkeit aufweist. Andererseits besitzen Blutzellen, die mit einem Bindemittel behandelt worden sind, ein verbessertes Bindevermögen auf ihren Oberflächen, wodurch die Bindung an ein Antigen oder an einen Antikörper erhöht wird, so daß ein Träger mit einer besseren immunochemischen Agglutinierungsreaktion oder Agglutinierungsinhibierungsreaktion erhalten wird. Wird beispielsweise Gerbsäure als Bindemittel bei der Durchführung von üblichen Methoden verwendet, dann wird eine Suspension von Blutzellen in einer Pufferlösung (Blutzellenkonzentration 2 bis 8%) mit einem gleichen Volumen einer Lösung eines Bindemittels in der Pufferlösung vermischt, worauf beide Komponenten bei 37 bis 56"C während einer Zeitspanne von 30 bis 60 Minuten reagieren gelassen werden. Die Gerbsäurelösung besitzt gewöhnlich eine Konzentration von 1/20 000 bis 1/40 000. Die Angabe 1/20 000 im Zusammenhang mit der Gerbsäurelösung bedeutet, daß 20 000 ml der Lösung durch Zugabe von 1 g des gelösten Stoffes zu dem Lösungsmittel hergestellt worden sind. Auf weitere Fälle wird nachfolgend eingegangen.

Werden Blutzellen mit Gerbsäure behandelt, dann werden ungefähr 0,3 bis 2,5 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden. Die Blutzellen besitzen eine Empfindlichkeit von ungefähr 100 ng/m! bei dtr Messung von menschlichem Serumalbumin (nachfolgend als USA bezeichnet) mit den Blutzellen als Träger. Dieser Empfindlichkeitswert ist vergleichsweise hoch im Vergleich zu anderen Trägertypen als Blutzellen, beispielsweise kleinen Polystyrollatexteilchen. Dennoch ist dieser Wert nicht mehr als '/|_U bis '/|_()ü00 der Empfindlichkeit der RIA-Methode.

Daher ist es bei der Durchführung von immunochemischen Agglutinierungsreaktionen oder Agglutinierungsinhibierungsreaktionen unmöglich, eine Empfindlichkeit zu erzielen, die mit derjenigen einer RIA-Methode unter Einsatz eines herkömmlichen Trägers vergleichbar ist. Dies bedeutet mit anderen Worten, daß die Messung mit einer derartig hohen Empfindlichkeit einen neuen Trager erfordert.

Als stark empfindlicher und sehr spezifischer Träger tür die Durchführung einer immunochemischen Messung sollte er folgende Eigenschaften besitzen: Wird der Träger mit einem Antigen oder Antikörper entsprechend der zu messenden Substanz sensibilisier!, dann kann eine geringe Menge Antigen oder Antikörper in einem lebenden Körper als biologische Komponente leicht eine immunochemis;he Reaktion mit dem Antikörper oder Antigen, mit welchem der Träger sensihilisiert worden ist, verursachen, so daß auf der Grundlage dieser Reaktion der sensibilisierte Träger eine vollständige Agglutinierungsreaktion eingeht. Für den Fall, daß die immunochemischc Reaktion nicht stattfindet, tritt keine spontane Agglutinierungsreaktion ein.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Trägers, der bei einer vereinfachten Messung von biologischen Komponenten unter Anwendung einer immunochemischen Agglulinierungsreaktion oder einer Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität wie im Falle einer Radioimmunoanalyse ergibt.

Die Erfindung bezieht sich auf einen Träger für immunochemische Messungen, bestehend aus Blutzellen, an die Gerbsäure gebunden ist. Dieser Träger ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbsäure in einer Menge von 30 bis 500 mg Gerbsäure pro ml der Blutzellen gebunden ist.

Es wurde gefunden, daß durch Vermischen der Blutzellen mit einer großen Menge an Gerbsäure ein Träger aus Blutzellen erhalten wird, bei welchem 30 bis 500 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden sind, wobei dieser Träger bei der Durchführung von immunochemischen Messungen ganz hervorragende Eigenschaften besitzt.

Der erfindungsgemäße Träger wird vorzugsweise in der Weise hergestellt, daß eine Blutzellensuspension, die durch Suspendieren von Blutzellen in einer Pufferlösung hergestellt worden ist, mit einer Gerbsäurelösung umgesetzt wird, wobei die Konzentrationen und das Mischungsverhältnis derart eingestellt werden, daß 30 bis 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Blutzellen können allen Typen entsprechen, die als Träger für herkömmliche immunochemische Messungen eingesetzt worden sind.

Ist die Menge der an die Blutzellen gebundenen Gerbsäure geringer als 30 mg, dann kann der Träger nicht die gewünschte hohe Empfindlichkeit und Spezifität erreichen. Übersteigt sie 500 mg, dann ist die Agglutinierungswirkung des Trägers zu intensiv, um nach der nachfolgend geschilderten Methode kontrolliert werden zu können, so daß daher der Träger nicht mehr zur Durchführung einer immunochemischen Messung eingesetzt v/erden kann.

Vorzugsweise werden zur Umsetzung zwischen Blutzellen und Gerbsäure eine Blutzellensuspension, die 2 bis 4 % Blutzellen in einer Pufferlösung enthält, sowie eine Lösung von Gerbsäure in der gleichen Pufferlösung mil einer Konzentration von 1/50 bis 1/1000 vermischt. Die Konzentration der Blutzellen in der Suspension, die Konzentration der Gerbsäure in der Gerbsäurelösung sowie das Mischungsverhältnis der Blutzellensuspension zu der Gcrbsäurelösung werden dabei so gewählt, daß die erforderliche große Menge an Gerbsäure an die Blutzellen gebunden wird.

Die Pufferlösung zur Suspendierung der Blutzellcii sowie zur Auflösung der Gerbsäure kann jede Pufferlösung sein, wie sie in herkömmlicher Weise zur Durchführung von immunochemischen Reaktionen eingesetzt wird. Bevorzugt verwendete Pufferlösungen sind im Anspruch 7 beschrieben.

Die Blutzellen können mit der Gerbsäure bei Zimmertempeatur umgesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn man auf eine Temperatur /wischen 37 und 56 C erhitzt, dies ist der übliche Temperaturbereich, der im allgemeinen bei der Durchführung von immunochemischen Verfahren eingehalten wird.

Der erfindungsgemäße Träger, der eine größere

Menge an Gerbsäure als übliche Träger festhält, besitzt eine wesentlich gesteigerte Agglutinierungswirkung und vermag gleichzeitig eine größere Menge an Antigen oder Antikörper an sich zu binden als herkömmliche Träger.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die zur Behandlung von Blutzellen zugesetzt worden ist, und der Menge an Gerbsäure, die an die Blutzellen gebunden ist, geht aus der Tabelle I hervor.

Tabelle I

Menge an	Gerb-	Gerbsäure, die	Bindungsgrad
säure, die	I ml	an 1 ml Blut
Blutzellen	zuge-	zellen gebunden
setzt wird		ist
(TIg)		(mg)	(%)
I		0,94	94,0
10		8,82	88,2
100		86,2	86,2
600		498	83,0

Die in der TaIx ■ I angegebenen Werte sind Gerbsäurewerte, die unter Verwendung von Foi i-Denis-Rcagens in Äthanolextrakten aus Blutzellen, die mit Gerbsäure behandelt worden sind, gemessen worden sind. Ungefähr die gleichen Werte werden durch Messen des Restgerbsäuregehaltes in der überstehenden Flüssigkeit nach dem Binden der Gerbsäure an die Blutzellen und Abziehen von der Ausgangsmenge an Gerbsäure erhalten. Aus dieser Tabelle geht hervor, daß der größte Teil der zugesetzten Gerbsäure an den Blutzellen gebunden ist, und zwar unabhängig von der Menge an Gerbsäure, die den Blutzellen zugesetzt wird.

Die Agglutinierungswirkung des Trägers selbst, die: Agglutinierungswirkung, die dann ermittelt wird, wenn Rinderserumalbumin als Stabilisierungsmittel für ein Reaktionssystem zugesetzt wird, und die Agglutinierungswirkung eines Trägers, der mit einem An'.i-HSA-Antikörper sensibilisiert worden ist, wurden zur Durchführung eines Vergleichs der herkömmlichen Träger mit dem erfindungsgemäßen Träger ermittelt. Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst schwankt im allgemeinen mit dem pH-Wert, der Ionenstärke etc. der Pufferlösung, in welcher der Träger suspendiert ist. In dem vorliegenden Beispiel werden Träger, an die verschiedenen Mengen Gerbsäure gebunden sind, in einer Phosphatpuffersalzlösung (pH 6.4 und Konzentration 0,067 Mol) mit einer Konzentration von 0,133% suspendiert, wobei 0,5 ml einer jeden Suspension in ein kleines Reagensglas eingefüllt und 2 Stunden stehengelassen werden, worauf die Agglutirierungswirkung des Trägers auf der Grundlage der Sedimentation am Boden des Reagenzglases ermittelt wird.

Die Agglutinierungswirkung eines Trägers selbst wird nach Zugabe eines Rinjerserumalbumins als Stabilisierungsmittel für ein Reaktionssystem in dergleichen Weise wie in dem Fall gemessen, daß kein Serumalbumin vorliegt, mit der Ausnahme, daß eine Phosphatpuffersalzlösung, die 0,2%Rinderserumalbumin enthält, zum Suspendieren des Tragers verwendet wird. Die Agglutinierungswirkung eines Trägers, der mit einem AnIi-I ISA-Antikörper sensibilisiert ist. wird in der gleichen Weise wie in Spalte 2 von Tabelle II angegeben ist, mit der Ausnahme, daß ein Träger verwendet wird, der mit einem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Die Kriterien für die Sedimentation auf dem Boden eines Reagensglases werden wie folgt festgelegt:

+ + + sehr intensive positive Reaktion

+ + intensive Reaktion

+ positive Reaktion

- negative Reaktion

Die Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle!!

Gerbsäure, die an
1 mi Blutzellen
gebunden ist

(mg)

Spalte 1

Agglutinierungswirkung des Trägers
selbst

Spalte 2

Agglutinierungswirkung des
Trägers selbst mit Zusatz von
Rinderserumalbumin als
Stabilisierungsmittel für das
Reaktionssystem

Spalte 3

Agglutinierungswirkung des Trägers, der mit einem
Anli-HSA-Anti
körper sensibilisiert
ist

500

100

10

Die Tabelle II zeigt, daß der erfindungsgemäße Träger, an dem eine große Menge Gerbsäure gebunden ist. eine spontane Agglutinierungsreaktion bedingt, während die herkömmlichen Träger, an denen nur eine kleine Menge Gerbsäure gebunden ist, diese Wirkung nicht zeigt. Dies legt nahe, daß dann, wenn eine große Menge an Gerbsäure an die Blut/eilen gebunden ist, eine bestimmte Veränderung der Oberfläche der Blut zellen erfolgt, die eine Erhöhung der Agglutinierungswirkung des Trägers selbst bedingt.

Die Beziehung zwischen der Menge an Gerbsäure, die an Blutzellen gebunden ist, und der Menge an Antikörper oder Antigen, der bzw. das an den Träger gebunden ist, der wiederum mit Gerbsäure verbunden ist, wurde untersucht.

Die Menge an Antikörper oder Antigen, der b/w.

d;is ;ιη einen Träger gebunden ist. wird durch Bestimmung der Menge an Antikörper oder Antigen in der überstellenden flüssigkeit n;ieh der Sensibilisierung des Trägers mit Antikörper oder Antigen nach einer immunologischen Dilfusionsmethode und Ah/iehen von der Anlangsmenge an Anliköiper oiler \niigcn. der bzw. das /um /wecke der Sensibilisierung /ιιμο-sct/t worden ist. ermittelt.

In dem vorliegenden Heispiel wird ein Kaninchen-Gammaglohulin bzw. I ISA als Antikörper und Antigen NLTwendel.

Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III Ικίλοι.

Tabelle III

Gerbsäure, die ;m I ml
lilul/clliMi gebunden isl

(mg)

500

100

50

IO

(iebundener Antikörper (Gammuglohulin). mg (5 mg Zusatz zu 0.2 ml Ulut/ellen)

3.0 (60%)
2.5 (50%)
1.9 (38%)
0.6 (12%)
0.4 (8%)

Gebundenes Antigen (HSM. mg

(2 mg Zusatz /u 0.2 ml
lilul/cllen)

1.7 (85%)
1.5 (75%)
1.3 (65%)
0.7 (35%)
0.3 (15%)

Wie aus der Tabelle III hervorgeht, steigt mit zunehmender gebundener Menge Gerbsäure an dem Träger die an dem Träger gebundene Gammaglobulinmengc. Hin Träger, an dem 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, bindet ungefähr 7,5mal soviel Gammaglobulin wie ein Träger, an dem I mg Gerbsäure gebunden sind. Im !"alle von gebundenem Antigen ist die Situation ähnlich. Daraus isl zu schließen, daß der erfindungsgemäße Träger eine merklich gesteigerte Wirkung besitzt. Antikörper oder Antigen zu binden, und zwar im Vergleich zu herkömmlichen Trägern.

I^;erncr besitzt der erfindungsgemäße Träger den Vorteil, daß die hohe Agglutinicrungswirkung und das ausgeprägte Vermögen, eine große Menge an Antigen oder Antikörper zu binden, je nach dem Anwendungszvveck gesteuert werden kann. Eine derartige Steuerung läßt sich in sehr wirksamer Weise durch Anwendung der bekannten Methoden durchführen, beispielsweise bei der Scnsibilierung eines Trägers mit einem Antigen oder Antikörper, um die Menge an Antigen oder Antikörper zu steuern, ferner durch Zugabe von normalem Kaninchenalbumin. Rinderserumalbumin oder eines grenzlläehenaktiven Mittels etc. als Stabilisierungsmittel für das immunochemische Reaktionssystem, durch eine Steuerung des pH-Wertes und der loncnstärke des immunochemischen Reaktionssystems oder durch eine Kombination dieser bekannten Methode (vgl. die Tabelle II).

Der erfindungsgemäße Träger kann als Träger für Antigen oder Antikörper zur Durchführung von immunochemischen Agglutinierungs- und Agglutinicrungsinhibierungsrcaktionen eingesetzt werden. Wird beispielsweise USA unter Einsatz des erfindungsgemäßen Trägers gemessen, dann ist eine Messung von USA in einer Größenordnung von lOOpg/ml möglich. Dies bedeutet, daß die Empfindlichkeit der Messung um ungefähr das lOOOfache im Vergleich zu dem Hinsat/ herkömmlicher Träger verstärkt wird.

Die folgenden Versuche und Beispiele erläutern die Erfindung.

Versuch

2 ml Schafblutzellen, die mit Formalin fixiert worden sind, werden in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung Mispendiert. Die Suspension -wird mit 60 ml einer Lösung von Gerbsäure mit verschiedenen Konzentrationen, gelöst in der Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Verschiedene Träger mit verschiedenen Mengen an gebundener Gerbsäure werden erhalten. Jeder der Träger wird in 60 ml der Pufferlösung suspendiert und dann mit einer Antikörperlösung vermischt, die in der Weise hergestellt wird, daß 60 mg eines Anti-HSA-Antikörpers (als Kaninchengammaglobulin) in der Pufferlösung aufgelöst werden. Die Mischung wird bei 56 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt, bis der Träger mit dem Anti-HSA-Antikörper sensibilisiert ist. Danach wird jeder der auf diese Weise erhaltenen sensibilisierten Träger mit 50 ml Pufferlösung gewaschen und zu einer l%igen Suspension in einer Phosphatpuffersalzlösung formuliert, die 10% Rohrzucker, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0.02% normales Kaninchenserum enthält.

0.1 ml einer jeden dieser sensibilisierten Trägersuspensionen werden in ein Reagensglas mit einem Innendurchmesser von ungefähr 9 mm mit einem kugelförmigen Boden eingebracht und allmählich mit 0.3 ml der Phosphatpuffersalzlösung zur GeNvinnung einer 0,25%igen Suspension vermischt, worauf sich die Zugaben von 0,1 ml HSA-Lösungen mit 0,05, 0,1, 0,2. 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10, 20, 50 bzw. lOOng/ml HSA anschließen. Nach einem Schütteln werden die Mischungen während einer Zeitspanne von 2 Stunden stehengelassen. Die Sedimentaiionsmuster, die sich am Boden der Reagensgläser entwickeln, werden beobachtet. Die Ergebnisse werden als negativ bzw. positiv eingestuft, je nachdem, ob ein Sedimentationsring gebildet worden ist oder nicht.

Die Tabelle IV zeigt die Ergebnisse der Empfindlichkeiten von verschiedenen Trägern bei HSA-Messungen, und zwar dargestellt als die minimalen Mengen an USA, die erforderlich sind, um positive Reaktionen zu bewirken.

9	labellelV	25 5	1 576	) (298)	10
Konzentration der (ierbsäurelösung, die für die Behandlung der Blut/eilen verwendet wird			(103)
	Gerbsäure, die an I ml Blut/eilen gebunden ist,	(29)	I^;. mpfindlichkoit bei der USA-Messung.
1 /50	(mg)	(10,4)	(ng/ml)
1/250	500*	(0,96)	0,5
1/900	100	0,1
1/2500	30	5,0
I /30 000	10	20
1	100

·) Die Werte in Klammern sind die tatsächlich gemessenen Werte.

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, wird das beste Ergebnis mit dem Träger erhalten, bei welchem 100 mg Gerbsäure an I ml Blutzellen gebunden sind. Dieser Träger besitzt eine ungefähr lOOOmal so große Empfindlichkeit wie ein herkömmlicher Träger, bei dem nur 1 mg Gerbsäure an 1 ml Blutzellen gebunden ist.

Versuch 2

60 ml jeweils einer der Tngersuspensionen, die nach der in Versuch 1 beschriebenen Weise hergestellt worden sind, werden mit einer Lösung von 6 mg eines Kombinationsproduktes aus 2,4-Dinitrophenol und Rinderserumalbumin (nachfolgend als DNP-BSA bezeichnet) in 60 ml Phosphatpuffersalzlösung vermischt. Die Lösung wird bei 56 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt, bis der Träger mil DNP-BSA sensibilisiert ist. Dann wird jeder der Träger mit 50 ml der vorstehend erwähnten Pufferlösung gewaschen und zu einer l%igen Suspension in der PhosphatpulTersalzlösung formuliert, die 10% Rohrzucker, 0,1% Rinderserumalbumin und 0,02% normales Kaninchenserum enthält.

Zuerst wird mit den sensibilisierten Trägern das maximale Verdünnungsverhältnis eines Antiserums, das für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, untersucht.

Ein Anti-DNP-BSA-Antiserum wird in der Weise hergestellt, daß Freund'sches Complete Adjuvant mit DNP-BSA nach einer herkömmlichen Methode vermischt und dabei ein Kaninchen immunisiert wird. Die Absorption des Serums mit BSA liefert ein Antiserum, das eine Antikörperaktivität nur gegenüber DNP besitzt. Das Antiserum wird mit 0,25% einer Salzlösung verdünnt, die 1 % BSA enthält, und zwar in der Reihenfolge des 1-, 10-, 20-, 50-, 100-, 200-, 300-, 400- und 500fachen. Dann werden 0,1ml der verdünnten Sera in ein Reagensglas gegeben, das 0,1 ml jeweils einer der sensibilisierten Trägersuspensionen und 0,3 ml Phosphatpuflersalzlösung enthält, worauf geschüttelt wird. Nach einem Stehenlassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wird das maximale Verdünnungsverhältnis des Antiserums, da: für das Auftreten einer Agglutinierungsreaktion der Träger erforderlich ist, bestimmt.

Dann werden einige Agglutinierungsinhibierungssysteme aus jedem der sensibilisierten Träger zusammengesetzt, worauf das Antiserum bei dem maximalen Verdünnungsverhältnis bestimmt wird, das für die Agglutinierungsreaktion erforderlich ist. Jedes der Systeme, das auf diese Weise erhalten wird, wird auf seine Empfindlichkeit zur Durchführung einer DNP-Messung untersucht.

Für jedes der Agglutinierungsinhibierungsreaktionssysteme werden 0,1 ml des erwähnten Antiserums mit maximaler Verdünnung in einem Reagensglas mit 0,1 ml einer DNP-Lösung vermischt, die 50, 100, 200, 300, 500, 700 oder 1000 ng/ml DNP in einer Phosphutpuffersal7lösung enthält, der 0,1 ml der sensibilisierten Trägerlösung und 0,2 ml PhosphatpulTersalzlösung zugesetzt worden sind. Nach einem Schütteln und Stehenlassen während einer Zeitspanne von 2 Stunden wird das Sedimentationsmuster, das sich auf dem Boden des Reagensglases entwickelt hat, beobachtet. Falls ein Sedimentationsring gebildet wird, wird das Ergebnis als positiv eingestuft, während es als negativ bewertet wird, wenn sich kein Sedimentationsring gebildet hat.

Die Empfindlichkeiten der Träger sind in der Tabelle V zusammengefaßt und werden als minimale Menge an DNP wiedergegeben, die für das Auftreten positiver Reaktionen erforderlich sind.

Tabelle V

Konzentration der Gerb- Gerbsäure, die an Maximales Verdünnungs- Empfindlichkeit

säurelösung, die für die
Behandlung von Blutzellen eingesetzt wird

1 ml Blutzellen
gebunden ist.

(mg)

verhältnis des Antiserums,
das für das Auftreten einer
Agglutinierungsreaktion
erforderlich ist

bei der DNP-Messung,

(ng/ml)

1/50
1/250

500
100

100
100

	Fortsot/ιιημ	Gerbsäure	25	ist.	5	1 576	12
π	Kon/eniration der (ierh-
siiurelösung. du. lür die					limplmdlichkeit
Behandlung von Hirn	'. die ;		in	Maximales Verdünnungs-	hei der I)NI'-
zellen eingesetzt wird	I ml Hlut/ellen			verhältnis des Antiserums,	Messune,
	gebunden			das für das Auftreten einer
			Agglutinierungsreaktion
1/900			erforderlich ist	(ng/ml)
1/2500	(mg)			200
	30		100	1000
	IO		50

1/30000 1 *)

*) Es erfolgt keine Aggluliiiierung. selbst wenn nichtverdünntes Serum verwendet wird.

Aus der Tabelle V geht hervor, daß herkömmliche Träger, an denen 1 mg Gerbsaure pm 1 ml Blutzellen gebunden ist, auch dann nicht agglutiniert werden können, wenn nichtverdünntes Antiserum verwendet wird, während der erfindungsgemäße Träger, an dem 100 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen gebunden sind, eine Agglutinierungsreaktion mit einem Antiserum zu bewirken vermag, das um das 300fache verdünnt worden ist.

Die erfindungsgemäßen Träger besitzen eine 5- bis lOmul größere Empfindlichkeit bei der Messung als uie herkömmlichen Träger.

Aus diesen Versuchen geht hervor, daß die Verwendung des erfindungsgemäßen Trägers zur Durchführung einer immunochemischen Agglutinierungsinhibierungsreaktion eine starke Vervielfachung der Verdünnung des Antiserums im Vergleich zu einer Verwendung von herkömmlichen Trägers ermöglicht, so daß Messungen mit einer höheren Empfindlichkeit möglich sind, bei denen Antiseren mit einem derart niedrigen Antikörpergehalt verwendet werden können, welcher bisher für eine Messung unmöglich war.

Beispiel 1

30 ml Schafblutzellen, die mit Formalin fixiert worden sind, werden mit 300 ml Phosphatpuffersalzlösung gewaschen und dann in einer Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 900 ml eingestellt wird. Die Suspension wird mit 900 m! einer Gerbsüurelösung mit einer 1/300-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, versetzt, worauf die Mischung bei 56 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger jeweils zweimal mit 600 ml der Pufferlösung gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt worden ist. enthält ungefähr 90 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen in gebundener Form.

Beispiel 2

50 ml Kükenblutzellen, die mit Pyruvinaldehyd fixiert worden sind, werden lOmal mit der physiologischen Salzlösung gewaschen und dann in 1000 ml dieses Lösungsmittels suspendiert.

Dieser Blutzellensuspension werden 2000 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/350-Konzentration zugemischt, worauf die Mischung bei 25 C während einer Zeitspanne von 60 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird der Träger mit 1000 ml des Lösungsmittels gewaschen. Der Träger, der zur Durchführung dieses Beispiels eingesetzt wird, weist in gebundener Form ungefähr 100 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen auf.

Beispiel 3

50 ml Kaninchenblutzellen, die nach einer Behandlung mit Wasserstoffperoxyd fixiert sind, werden mit 500 ml einer Boratpuffersalzlösung gewaschen und dann erneut in der Pufferlösung suspendiert. Die Suspension wird mit 1500 ml einer Gerbsäurelösung mit einer 1/500-Konzentration, gelöst in der gleichen Pufferlösung, vermischt, worauf die Mischung bei 56 C während einer Zeitspanne von 45 Minuten umgesetzt wird. Nach der Umsetzung wird das Produkt mit 1000 ml der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 50 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen auf.

Beispiel 4

30 ml nichtbehandelter Rinderblutzellen werden mit 500 ml Veronalpufferlösung gewaschen, worauf die Blutzellen zentrifugiert werden. Die Blutzellen werden in einer Gerbsäurelösung suspendiert, die durch Auflösen von 1 g Gerbsäure in 1000 ml der Pufferlösung hergestellt worden ist, worauf die Suspension bei 37 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt wird. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen.

Der Träger dieses Beispiels weist ungefähr 30 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen auf.

Beispiel 5

20 ml Rinderblutzellen, die mit Wasserstoffperoxyd fixiert worden sind, werden mit 300 ml Phosphatpuffersalzlösung gewaschen und dann in der Pufferlösung suspendiert, wobei das Gesamtvolumen der Lösung auf 600 ml eingestellt wird.

Die Blutzellensuspension wird mit einer Lösung von Gerbsäure mit einer 1/50-Konzentration, gelöst in der Pufferlösung, vermischt. Die Mischung wird bei 56 C während einer Zeitspanne von 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wird das Produkt mit der Pufferlösung zur Gewinnung eines Trägers gewaschen. Der Träger dieses Beispiels enthält ungefähr 500 mg Gerbsäure pro 1 ml Blutzellen.

Wie vorstehend erwähnt worden ist, besitzt der erfindungsgemäße Träger für immunochemische Messungen eine höhere Empfindlichkeit und eine höhere

Spe/il'ilät als herkömmliche Träger, so daü er ohne weiteres eine immunoehemisehe Reaktion auslöst, und /war auch dann, wenn die Menge der biologischen Komponenten sehr gering isl. l^;erncr bedingt er. aufgrund dieser Reaktion, eine vollständige Agglutinie-

rungsreaktion. Daher erleichtert die Verwendung des ernndungsgemäßen Trägers die Messung von hioligischen Komponenten, so dal.i er von sehr hohem medizinischen Wert ist.

Claims

1
Patentansprüche:

J. Trüger fur immunchemische Messungen, bestehend aus Blutzellen, an die Gerbsäure gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Gerbsäure in einer Menge vo.i 30 bis 500 mg Gerbsäure pro ml der Blutzellen gebunden ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Trägers nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutzellensuspension, die durch Suspendieren von Blutzellen in einer Pufferlösung hergestellt worden ist, mit einer Gerbsäurelösung umgesetzt wird, wobei die Konzentrationen und das Mischungsverhältnis derart eingestellt werden, daß 30 bis 500 mg Gerbsäure pro 1 ml der Blutzellen gebunden werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Blutzellen aus verschiedenen Tieren in nicht behandeltem Zustand erhallen worden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Blutzellen, die aus verschiedenen Tieren erhalten worden sind, mit einem geeigneten Fixiermittel fixiert worden sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Fixiermittel Formaldehyd, Pyruvinaldehyd oder Wasserstoffperoxid verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Anspüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutzellensuspension mit einer Blutzellenkonzentration von 2 bis 4% in einer Pufferlösung mit einer Lösung vermischt and umgesetzt wird, die Gerbsäure in Lösung in der gleichen Pufferlösung in einer Konzentration von 1/50 bis l/!000 enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Pufferlösung aus einer Phosphatpufferlösung, einer physiologischen Salzlösung, einer Boratpuffersalzlösung oder aus einer Veronalpufferlösung besteht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Reaklionstemperatur zwischen 37 und 56 C eingehalten wird.

9. Reaktionssystem für eine immunochemische Messung, bestehend aus einem Träger, der mit einem Antigen oder Antikörper sensibilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Träger gemäß Anspruch 1 ist.

10. Reaktionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er der jeweiligen Messung durch Zugabe eines Stabilisierungsmittels angepaßt ist.

11. Reaktionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daG es zusätzlich dem Meßzweck durch Steuerung seines pH-Wertes angepaßt ist.

12. Reaktionssystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich dem jeweiligen Meßzweck durch Steuerung seiner ionenstärke angepaßt ist.

13. Verwendung des Reaktionssystems nach Anspruch 9 zur Durchführung einer immunochemischen Agglutinierungs- oder Agglutinierungsinhihierungsreaktion mit einerlcstprobe, welche die /u messenden biologischen Komponenten enthält.