DE1695598A1

DE1695598A1 - 9-(ss-D-Arabinofuranosyl)adenin und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1695598A1
Application number: DE19671695598
Authority: DE
Inventors: Howells John David; Albert Ryder
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1966-12-30
Filing date: 1967-12-29
Publication date: 1972-01-13
Also published as: FR1576370A; NL6717839A; CH478241A; GB1159290A; NL143989B; AT281301B; DE1695598C3; DE1695598B2; BE708821A; ES348802A1; SE347287B; DK120561B

Description

DR. HTG. F. WTJE STHOFF DIPL. IWG. G. PtTLS DR.E.WPECHMANN

PATENTANWÄLTE

8 MÜNCHEN 9O

SOHWEIGERSTHASSE 2

TELSFON 22 06 01

ieS« ■

München

1A-34 010

Beschreibung zu der Patentanmeldung

Parke, Davis & Company Joseph Campau' Avenue at the Eiver Detroit, Michigan 48232 U.S.A.

betreffend

y-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sich auf 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)· adenin, das der formel "

entspricht,

109883/1690

, ' , Ferner,bezieht sich, die Erfindung auf ein Fermentationsverfahren zur Herstellung der obigen Verbindung durch Kultivieren eines ausgewählten Stammes des Organismus Streptomyces antibioticus, welcher 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin produziert·

Die Kultivierung des erwähnten Stammes erfolgt unter
P künstlichen Bedingungen in einem geeigneten Mhrmedium solange bis eine wesentliche Menge an 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin gebildet ist.

Uaeh der Züchtungs- oder Inkubationsperiode kann 9-(ß-D-Arabinofuranosyl) adenin aus dem Medium durch die weiter unten beschriebenen Maßnahmen; erhalten werden,worauf es bis zu
dem gewünschten Grad weiter gereinigt werden kann» Der Ausdruck "9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin produzierender Stamm

fc des Organismus Streptomyces antibiotieus" wie er hier benutzt wird, bezieht sich auf einen Stamm von Streptomyces antibioticus, der beim Züchten unter den hier beschriebenen künstlichen Bedingungen zur Bildung einer Brühe führt> aus welcher 9-(ß-P-Ar abinofuimnosyl)-adenin dur<?h:di.ö-weiter unten besohriebeneh Maßnahmen gewonnen werden kaftl· V . - - , ■ -

Ein für Zwecke der Erfindung brauchbarer Stamm von
Streptomyces antibioticus wurde isoliert aus einer Bodenprobe,

- — 3 _ ■

'109 88 3/16 90

-- BAD

' — 3 —

die in der ITahe von Bosco Trecase, Provinz Neapel, Campania, Italien, gesammelt w-orden war. Kulturen dieses Organiamua wurden deponiert bei dem "United States Department of Agriculture, Horthern utilization Research and Development Division", Peoria, Illinois und werden als "ERRI 3238" in... permanenter Kulturkollektion gehalten.

' ■ ■ ■ i

Der Organismus ist ein unter aeroben und aerialen Bedingungen (d.h. an der luft) Sporen bildendes Glied der Ordnung Actinomycetales und gehört zur Art Streptomyo.es, wie in der siebten Ausgabe von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1957) beschrieben* Seine macroskopischen Kultureigenschaften auf zahlreichen Medien, nach welchen die Glieder dieser Art identifiziert v/erden können, gehen aus Tabelle I hervor.

-A-

BAD OBIGiNAL.

)abelle I

Macroskopische Kulturcharakteristika eines 9'-fi2--D-

_Lrabinofuranosyl) adenin produzierenden Stammes von Streptomyces aitibioticus, entsprechend HEEL· 3238 ■- 1695598

Culturaedium ·

luf tmycel

.Farbe

Umkehrung des Substratmycels löslicher

Farbstoff

andere

Merkmale

iefeextrakt-,'IaIz extrakt i.gar .

graugelblich braun bräunlich-grau mittelbraun

rötlieh bei Zugabe von KaOE*).

laferf locken'

grau-

gelblioh-

braun

hell- bis mitte ΙΌ Iivbraun grau- bis „ rötlich stark gelb- .bei Zugabe lich-braun von FaOH*)

anorganische 3alze-Stärke·

hell— bis hellolivgrau bis grau- mäßig gelblichgelblich-braun braun hell- bis rötlich mittelgelb- bei.Zugabe lich-braun von NaOH*)

^.yceriniisparagin igar .

grau- grau-

.geIblich-braun gelblich grau- bis
stärk gelblich-braun

rötlich bei Zugabe von NaOH*)

Stärke
Ä.gar B

hell- bis hell brätnLichgrau- - ' grau bis lichtgelblich-braun grau-gelblichbraun

kein. Pigment

organisches Nitrat

(Brühe)

Nitrat nicht zu Nitrit reduziert

Gelatine dunkelbraun starke Verflüssigung

Milch

dunkelbraun starke

Hydrolyse

ruhe- aus Trypton-Hefeextrakt .

dunkelbraun - --

lepton-Hefe-Bxtrakt-Bisen-

schwarz

Tyrosin Agar - dunkelbraun - —.

Hefeextrakt-Malzextrakt

28°C gutes Wachstui 37 °C gutes Wachs tu] 45°C gutes Wachs tu] 50 C gutes Wachstui

*) Farbe des löslichen Pigments

_ 5 —

Wenn der Organismus auf gewissen Agarmedien kultiviert .' wird, ist das Luftmjrcel gewöhnlich hell bis grau—gelblich-braun. Die Züchtung in diesen Ägarmedien führt zur Bildung eines gelblich-braunen bis mittelbraunen löslichen Pigments, das rötlich wird, wenn die Medien mit Matriumhydroxyd behandelt werden» In ' Medien mit einem Gehalt an komplexen. Stickstoffquellen wird ein dunkelbraunes oder schwarzes lösliches Pigment gebildet»

Die Sporenketten sind gerade bis gewunden, gelegentlich weisen sie Schlingen oder, lose Spiralen auf. Mit dem Altern ' werden die Ketten immer stärker gewunden und unregelmäßiger» Die Sporen sind weich und elliptisch oder kugelförmigj ihre Größe schwankt zwischen o,7 - .1>2 /^u χ ο,9 - 1,7 /^U*

In Versuchen zur Kohlenstoff ausnutzung (carbon utilization tests) wurde mit den folgenden einzelnen Kohlenstoff quellen ein ziemlich gutes bis gutes Wachstum beobachtet: Glucose," L-Arabinose, D-Xylose, i-Inositol, D-Mannitol, D-Pructose und Ehamnose. Ein schlechtes bis ziemlich gutes Wachstum wurde beobachtet mit Raffinose, ein schlechtes oder gar kein Wachstum mit Sucrose und Zellulose.

In seiner Mikromorphologie-, der Farbe des luftmycels und der Melaninproduktion entspricht der Organismus der Art

- 5>

Streptomyces antibioticus und ist daher als Glied dieser Art anzusehen. Bei vergleichenden Studien im Laboratorium 'ähnelt der Organismus dem Typus von S. antibioticus, Stamm IMRTJ 3435 -In gewisser Hinsicht unterscheidet sich jedoch der Organismus ausgesprochen von dem Stamm IMRU 3435, wie aus Tabelle II hervorgeht} er ist daher anzusehen als ein neuer und unterschiedlicher Stamm von S. Antibioticus der durch die Kulturnummer IRRI 3238 bezeichnet wird»

109883/1890

~ BAD ORIGINAL

Tabelle II. Vergleich, eines 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin

produzierenden Stammes von Streptomyces antibioticus, entsprechend IERI 3238, mit S. antibiotieus, entsprechend IMRU 2435.

Charakteristik

S· antibioticus
entsprechend
URRL 3238

S.antibioticus entsprechend IMRU 3435

Parbe des Luftmycels*) hell- bis grauge Iblich-braun

mittelgrau bis hell bräunlich, grau

LlikromorpholDgie des Luftmycels

gelegentlich. Schlingen und Spiralen

keine Schlingen oder Spiralen zu beobachten

Lösliches Pigment

Hefeextrakt - Malzextrakt - Agar

Haferflocken Agar

Agar mit anorganischen Salzen und Stärke

6f lye er in-Asparagin-Agar

Einwirkung von IJaOH auf lösliches Pigment der obigen Medien

Tyrosin Agar mittelbraun

graustichig bis stark gelblich-braun

leicht bis mitteigelb IiGh-braun

graustichig bis stark gelblich-braun

Pigment wird rötlich

dunkelbraun

graugelb graugelb

Pigment unverändert

Kohlens t off anwe ndung

Sucrose

Xylose

!-Inositol

L-Rhamnose

Raffinose

sohle cht

gut ziemlich gut ziemlich gut schlecht bis ziemlich gut

ziemlich gut

gut

Reduktion von Nitrat zu Nitrit	negativ	positiv
G-elatine verflüssigung	stark	schwach
Milchhy dr ο Iy s e	stark	schwach
Wachstum auf Hefeextrakt- Malzextrakt-Agar bei 45 0 und bei 50⁰O .	positiv	negativ

*) Qiabelle I, erste fünf Medien.

109883/1690

Erfindungsgemäß wird 9-(ß-Arabinofurahosyl)adenin hergestellt durch Beimpfen eines wässrigen Nährmediums mit einem 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin produzierenden Stamm von Streptomyces antibioticus, Durohfuhren einer Fermentation unter .aseptischen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 2o und 45⁰C, bis eine wesentliche Menge an 9-(ß-D~ ^ Arabinofuranosyl)adenin in dem Fermentations gemisch gebildet ist, und Gewinnen des gewünschten Produktes durch anschließende Behandlung des Fermentationsgemisches.

Zum Beimpfen können Sporen oder Conidien der ausgewählten Kultur von Streptomyces antibioticus verwendet werden₀ Wässrige Suspensionen der Sporen b^w» Conidien mit etwas Seife oder einem anderen Netzmittel sind hierzu geeignet. Für große Fermentationen verwendet man vorzugsweise lebenskräftige junge belüftete und gerührte Brühekulturen und !likroorganismen.

> · ■ ■

Geeignete wässrige Nährmedien sind solche, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen haben und deren pH-Y/ert vorzugsweise zwischen 6 und 8 liegt*. Ausreichende Quellen an assimilierbarem Kohlenstoff sind u.a. reine Kohlehydrate, die durch den Organismus verwertet werden können und ebenso handelsübliche Kohlehydratgemische. Einige Beispiele von für diesen Zweck brauchbaren Stoffen sind verschiedene Zuckerarten z.B. Glucose, Maltose, lactose und Mannose j Stärke und rnodifi-

109883/1690

zierte Stärken, Mais syrup·, Malzextrakte} Portweinmelasse, Glycerin und .Maissohrot. Die Anteilsmenge an Kohlehydrat im K'ährmedium ist nicht ausschlaggebend} sie liegt zweckmäßigerweise zwischen etwa o,5 und 5 fi des Mediumgewichtes, es können jedoch auch Mengen benutzt werden, die etwas apßerhalb dieses Bereichs liegen.

Die Stickstoffquellen im Mhrmedium können von organischer, anorganischer oder gemischt organisch --> anorganischer Natur sein. Einige Beispiele für die vielen'stickstoffhaltigen Substanzen, die für das ITährmedium in Betracht kommen, sind Aminosäuren, Peptone, hyörolysierte und nicht hydrolysiert© Proteine, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Weizenkleber, Maismaisehe, auch entwässert, Fleischextrakt, anorganische !Titrate, Harnstoff und Ammoniumsalze» Da die am leichtesten verfügbaren Stickstoffquellen meist im Rohzustand vorliegen, hängt die dem ITährmedium zuzufügende Menge von dem Reinheitsgrad ab und es läßt sich nicht gut eine feststehende Menge an stickstoffhaltigen Stoffen angeben, die dem Medium als Stickstoffquelle zugefügt werden sollen* Es kann jedoch gesagt werden, daß für praktische Zwecke die stickstoffhaltigen Stoffe 6 G-ew.-^ des gesamten Ferine ntationsmediums nicht überschreiten müssen und daß sie auch in wesentlich geringeren Mengen anwesend sein können.

BAD ORIGINAL .

- 10

109883/ 1690

- ίο -

Die Anwesenheit einer gewissen Menge an Mineralsalzen •und Spuren von wachstumsfördernden Faktoren unbekannter Zusammensetzung ist wünschenswert, wenn man besonders gute Ausτ beuten an 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin erhalten wi11_o Manche leicht verfügbaren Rohstoffe, wie Maismaische, Hefezubereitungen, Sojabohnengrütze, Rückstände aus der Melassefermen- L· tation und andere Produkte ähnlichen Charakters enthalten

bereits derartige anorganische Salze und wachstumsfördernde Faktoren, weshalb es wünschenswert ist, daß das Fermentations·»- medium einen oder mehrere dieser Stoffe enthält. Um sicherzustellen, daß in dem Medium entsprechende Mineralbestandteile vorhanden sind, ist es in manchen Fällen vorteilhaft einige anorganische Salze, wie natriumchlorid, Uatriumbicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumacetat, Calciumcarbonate und Magnesiumsulfat zuzufügen; auch Spuren von Mineralstoffen wie Kupfer, ]. Kobalt, Mangan, Zink und Eisen sind günstig. Die bevorzugte " : Konzentration eines gegebenen Mineralsalzes liegt zwischen-o,1 ; und 1 ^σ/ο des Gewichtes des Nährmediums-.

! Die Züchtung des betreffenden Stammes von Streptomyces

antibioticus in wässrigen ITährmedium kann auf verschiedenste ; Vfeise durchgeführt werden. So kann man beispielsweise den Organismus unter aeroben Bedingungen andfer Oberfläche des Mediums züchten} ebenso gut kann man ihn jedoch unter der Oberfläche des Mediums, d.h. in untergetauchtem Zustand züch-

Ϊ09 8.83/1690 _{BAD O}r_IQINAL

1895598

ten, vorausgesetzt, daß für eine entsprechende SäuerstoffVersorgung gesorgt ist«

Die bevorzugte Methode zur Herstellung von 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin im größeren Maßstab besteht in der Fermentation eines 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin produzierenden Stammes von Streptomyces antibioticus in Unterwasser- oder Tiefkultur* Gemäß dieser Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beimpft man ein steriles wässriges Hährmedium mit der gewählten Kultur und unterwirft es der Inkubation (Bebrütung) unter Rühren und Belüftung bei aseptischen Bedingungen und einer Temperatur von etwa 2o bis 45⁰O, vorzugsweise um 33 bi;j- 40⁰C, bis eine wesentliche Menge an 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin in der Kulturflüssigkeit zu finden ist. Die zur Erzielung einer maximalen Ausbeute notwendige Zeit ändert sich mit der Größe und dem Typus der verwendeten Einrichtung, mit der Rühr- und Belüftungsgeschwindigkeit und mit den betreffenden Kulturen und anderen Faktoren. Bei technischen Fermentationen im größeren Maßstab, die in Fermentatoren vom Tanktypus durchgeführt werden, erreicht man eine maximale Produktion innerhalb etwa 3 bis 7 Tagen» Kürzere Fermentationsperiode sind ebenfalls möglich, führen jjedoch gewöhnlich zu schlechteren Ausbeuten. Wird die Fermentation in geschüttelten Kolben durchgeführt, so kann die bis zur maximalen "Produktion verstreichende Zeit etwas länger sein als wenn man große Fermentationstanks benutzt.

- 12 ~

109883/1890

T695598

Bei der Unterwasserkultur entwickelt sich der Mikroorganismus als relativ diskrete Teilchen, die überall im Uährmedium dispergiert sind, im Gegensatz zu der verhältnismäßig kontinuierlichen Haut, die sich bei der Züchtung an der Oberfläche auf dem Medium bildet. Infolge dieser Verteilung des Organismus innerhalb des ganzen Mediums können große Vo-

% lumina des beimpften Nährmediums zur Kultivierung des Organismus in !Danks und anderen Behältern, wie sie bei der Fermentation üblich sind, verwendet werden«. Stationäre Kübelfermentatoren, ausgerüstet mit Einrichtungen zum Durcharbeiten und Belüften, sind zur Großproduktion besonders gut geeignet, obgleich auch !Fermentationseinrichtungen anderer Bauart benützt werden können.- Zur Herstellung von geringeren Mengen an Produkt oder zur Bereitung von Kulturen des Organismus, die für großtechnische Fermentationen als Impfstoff benutzt werden sollen, kann die Unterwasserzuchtung_durchgeführt werden in kleinen

P, Flaschen oder Kolben, die durch entsprechende mechanische Einrichtungen geschüttelt oder gerührt werden.

Bei der ünterwasserkultur kann das Durcharbeiten und die Belüftung des Kulturgemisches auf verschiedenste Weise erreicht werden. 35as Gemisch kann beispielsweise in Bewegung gesetzt wer- \ den durch Turbinen, Paddel, Schrauben oder andere mechanische Sühreinriohtungen oder durch Schütteln des Fermentationsgefäßes selbst oder mit Hilfe von verschiedenen Pumpvorriclitungen oder

BAD ORlQfNAL * * 109883/1690 - ·;> -

auch einfach indem man Luft oder Sauerstoff durch das Medium hindurchleitet. Die Belüftung kann erreicht werden durch Einleiten von Luft oder Sauerstoff in das Fermentationsgemisch über einseitig offeiE oder perforierte Röhren oder über Röhren mit einem porösen Diffusionsabschnitt; man kann den gleichen Effekt auch erreichen durch Versprühen, Verspritzen oder Einschleudern des Mediums in bzw. durch eine sauerstoffhaltige Atmosphäre»

Eine Alternative zu der bevorzugten Unterwasserkulturmethode ist die Oberflächenzüchtung zwecks Erzeugung von 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin, bei welcher eine flache Schicht, gewöhnlich weniger als 2 cm dick, eines sterilen, wässrigen Hährmediums mit einem 9-(ß-D-Arabinofuranosyl/"-adenin produzierenden Stamm von Streptomyces antibioticus geimpft wird, worauf man das beimpfte Gemisch unter aeroben Bedingungen bei etwa 20 bis 45 0 bebrütet₀ Das so erhaltene Produkt entspricht im allgemeinen dem bei der Unterwasserkultur erhaltenen.

Fach Beendigung der Fermentationsphase des Verfahrens kann das gewünschte Produkt auf verschiedene Weise isoliert werden. Wurde die Unterwasserkultur angewendet, so gewinnt man das Produkt am besten wie folgt: das Mycel wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt» Der Filterkuchen wird gut mit v/asser durchgewaöchen, die Yiasohwässer mit der abfiltrier-

BAD ORiGiNAt - H 109883/16 90

■ . ten Brühe vereinigt und unter verringertem/ Druck auf etwa

1/12 ihres ursprünglichen Volumens eingeengt. Die konzen-• trierte Lösung wird längere Zeit (von einigen Stunden bis .mehreren Tagen, je nach dem Volumen) auf etwa 5° G gehalten, worauf man den sich ausscheidenden Feststoff unter Beifügung von Diatomenerde filtriert. Der Filterkuchen wird dann gut mit siedendem Wasser ausgezogen und die kombinierten Extrakte werden auf etwa 5°C gekühlt bis der Niederschlag völlig ausgefe fällt ist. Das sich ausscheidende kristalline 9-(ß-D-Arabinofurano sy :l)-adenin wird durch Filtrieren isoliert und durch mehrere aufeinanderfolgende Umkristallisationen aus siedendem Wasser gereinigt.

Gemäß einer, anderen Durchführungsform kann das bei der Unterwasserkultur anfallende Produkt mit Hilfe der folgenden Ädsorptionstechnik isoliert werden: Wenn die Fermentation durchgeführt ist, wird das Mycel wie oben durch Filtrieren, Eentrifugieren oder dergleichen abgetrennt. Das Rohprodukt

P wird dann adsorbiert, indem man die filtrierte Brühe mit Aktivkohle oder anderen adsorbierenden Mitteln behandelt.

Man kann dabei entweder in einzelnen Chargen arbeiten oder die Brühe kontinuierlich durch eine Adsorptionskolonne schicken. Gemäß der bevorzugten chargenweisen Methode fügt man 0,1 bis 0,6 vorzugsweise 0,35 bis 0,40 % (Gewicht auf Volumen) des bevorzugten Holzkohlen-Adsoptionsmittels zu der filtrierten

- 15 -

1098837 1690 ^BAD

Brühe hinzu und rührt das Gemisch ein bis drei Stunden lang durch«, In gewissen fällen ist es zweckmäßig, Verunreinigungen aus der filtrierten Brühe zu entfernen ehe man diese der Holzkohle nbe hand lung unterwirft} dies kann entweder dadurch geschehen, daß man sie mit einem nicht damit mischbaren organischen lösungsmittel wie ÄthylendiChlorid oder Äthylessigester extrahiert oder indem man sie mit einem synthetischen Kationaustaus cherhar ζ in Hatriumförm behandelt. Das ; Röh-produkt wird isoliert durch Eluieren des Hölzkohlenadsorbens mit wässrigem ^: Aceton oder mit einem wässrigen niedrigen Alkohol und Evaporieren des Eluats unter reduziertem Druck. Der dabei erhaltene feste Rückstand wird dann gereinigt, was entweder durch mehrfaches Umkristallisieren aus Wasser oder einem niedrigen Alkohol erfolgen kann, oder aber durch die folgende. Methodet der feste Rückstand wird extrahiert mit einem mit Wasser nicht mischbaren flüssigen Alkanol, wie n-Butylalkohol, und der Extrakt auf eine Tonerdesäule (pH 5-6) gegossen. Die Tonerdesäule f wird mit 95 >igem wässrigen Äthanol eluiert, das Eluat eingedampft und der feste Rückstand aus Wasser oder einem niedrigen Alkohol umkristallisiert, so daß man das gewünschte 9-(ß-D-arabinofuranosyl)adenin erhält* ^:

Das Produkt aus dem erfindungsgemäßen Verfahren, das 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin, ist verwendungsfähig als viren- _t

feindliches Mittel, das sowohl in Vitro als in Vivo aktiv ist

BAD OBlQlNAU. «j 6 -

109883/1690

gegen Herpes- sowie gegen Vaccinia-Viren.

Die Erfindung wird duroh folgende Beispiele näher erläutert i

Beispiel 1

Bs werden sterile Agarschalen bereitet, wozu das Streptomyces Sporenmedium nach Hickey und Tresner (R.J.Hickey und H-.D.Tres ner, J* Bact., Vol. 64» S. 891-892 (1952)). verwendet wurde. Vier solche Schalen werden mit lyophilisierten Sporen von Streptomyces antibioticus, entsprechend NEEL 5238 geimpft,

bei 28 C sieben lage oder bis das Wachstum der Luftsporen

genügend fortgeschritten ist bebrütet und dann bei 5°0 aufbewahrt. Die Sporen aus den vier Schalen werden in 40 ml einer n sterilen Lösung von Fatriumheptadecylsulfat suspen—

: diert*

Bs wird ein Fährmedium der folgenden Zusammensetzung vorbereitet»

Grlukosemonohydrat 2,o$

Sogabohnenmehl, extrahiert mit . . '

Lösungsmittel* 44 $ Protein 1_fo^

SJierisehes Pepton :

(Wilson's Protopeptone 159) ό,5 fo

Ammoniumchioriä o_r2 ^

Hatriumchlorid ο ,5 $S

"109083/1690 >* 17 r

Oalciumcarbonat ο,25 $>

Wasser auf 1oo $

Der pH-Wert des Mediums wird mit 10-n Hatriumhydroxydlösung auf ein pH von 7,5 eingestellt.

Zwölf Liter dieses Mediums werden in einen 3o 1-Fermen-

■tator aus nichtrostendem Stahl eingebracht. Das Medium wird sterilisiert indem man es 9o Minuten auf 121⁰O hält und naoh Abkühlen geimpft mit 4-ü ml der oben beschriebenen Sporen-Suspens ionj die Inkubationszeit bei 25 bis 27°C beträgt 32 Stunden, wobei gerührt (2oo Ümdr./Min.) und mit einer Geschwindigkeit von 12 Liter je Minute Luft durchgeleitet wird. Während dieser Zeit werden 38 g ieines Gemisches aus Schweinefett und Mineralölen mit Mono- und Diglyceriden in Portionen zugefügt, um ein allzu starkes Schäumen zu vermeiden.»

In vier 3o Liter-Fermentiergefäße aus rostfreiem Stahl werden je 16 Liter eines Hahrmediums der obigen Zusammensetzung eingefüllt. Der pH-Wert des Mediums in den Fermentiergefäßen wird mit 1o-n Natronlauge auf 7,5 eingestellt und die Gefäße werden sterilisiert durch 9o Minuten langes Erhitzen auf 121⁰C. Nach dem Kühlen wird das Medium in den Fermentiergefäßen geimpft mit 8o ml der oben beschriebenen Fermentationsmischung und 96 Stunden bei 25 - 27⁰C gebrütet,

109883/1690 BAD OFMi

" 18 -

* wobei mit 2oo Umdr_o/Min. gerührt und luft mit einer Geschwindigkeit von 16 Liter je Minute hindurchgeleitet wird. In jedes Fermentiergefäß werden während der Brütungszeit noch 17o g der oben beschriebenen Antischaummiscliung in Portionen hinzugegeben.

Die Fermentationsgemische aus den vier Gefäßen werden kombiniert und mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. Es kann ein Material wie Gelite 545 verwendet werden. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1o 1 konzentriert und das Konzentrat mit 2oo g aktivierter Kohle (z.B. Darco G^-öo) behandelt, bei Baumtemperatur eine Stunde gerührt und dann filtriert. Der Holzkohlenkuchen wird mit 7,5 1 V/asser gewaschen und dreimal mit je 1o 1 eines 5o ^igen Wasser-Acetongemisches extrahiert. Die drei Wasser-Acetonextrakte werden kombiniert, unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 konzentriert und 48 Stunden bei 5⁰O gekühlt. Das ausfallende 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin wird isoliert und durch, mehrfaches Umkristallisieren aus siedendem Methanol und siedendem Wasser gereinigt; Fp. W. 262 - 263⁰C„

Erhöht man bei dem oben beschriebenen Verfahren die Inkubationstemperatur in den beiden Fermentationsstufen von 25 - 27⁰O auf 36 «- 38⁰C, so erhält man das gleiche Produkt, 9-(ß-D-JLrabinofuranosyl)adenin, in höherer Ausbeute»

- 19 109883/1690

1635598

Beispiel 2

Es wird ein Eahrmedium der folgenden Zusammenstellung .

vorbereitet: ,

Grlucosemonohydrat 2, ο $ \

Sojabohne nine hl, extrahiert mit I

Lösungsmittel, 44 i° Protein 1»o <fo ϊ

Tierisches- Pepton

(Wilson*a Protopeptone 159) o,5 i°- \\

Ammoniumchlorid o,2 $ ' ? Natriumchlorid ο, 5 ■ i*

Calciumcarbonat Q »25 $ ■■ " *

Wasser auf 1oo $ . ■

Der pH-Wert des Mediums wird mit 1o-n.Natronlauge auf ;

7,5 eingestellt. \

38 liter dieses Mediums werden in einen 144 1-Fermen- ]. tator aus rostfreiem Stahl eingebracht. Das Medium wird ste-

ο
rilisiert indemv^s 6o Minuten auf 121 C hältι dann wird es abgekühlt und beimpft mit 40 ml einer SporenSusp-e&sioii, hergestellt nach Beispiel 1, Absatz 1» 15o ml eines Antisohaumgemisches, bestehend aus Fett und Mineralölen mit Mono- ftnd Diglyceriden (z.B* Swift*s Wo· 51 Inedible Defoamer) wird zugefügt, und das Gemisch 59 Stunden bei 26 bis 2f°Ö bebrütet, 'wobei iuft mit einer Geschwindigkeit von etwa ff"Tl $& Minute durchgeleitet wird» ·

,^:->..>' ' - .· ■ '■ .." -.-.' :-^: :■■',:■■_-■' -..20_- 10^08371690

114ο 1 eines Hährmediums der obigen Zusammensetzung werden in ein mit Inoonel umkleidetes Fermentiergefäß von • 19oo 1 Inhalt eingebracht. Der pH-V/ert des Mediums wird mit 1o-n Natronlauge auf 7,5 eingestellt, worauf das Medium durch 3o Minuten langes Erhitzen auf 121⁰G sterilisiert wird. Das abgekühlte Medium wird dann mit 38 1 des obigen Fermentations- h gemisches beimpft, etwa 1 1 der obigen Antischaummisehung zugefügt und das Gemisch 24 Stunden bei 24 bis 25,5⁰O bebrütet, wobei mit 84 Umdr./Min. gerührt und mit 1275 1 luft je Minute belüftet wird. Während dieser Periode werden nochmals 513 ml des Antischaummittels zugegeben.

In ^vzwei mit Inconel umkleidete Fermentiergefäße von etwa : 75oo 1 Inhalt werden je 454o 1 des obigen Nährmediums eingebracht. Die Medien werden mit 1o-n Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und durch 3o Minuten langes Erhitzen auf 121⁰C sterilisiert. Nach Abkühlen werden die beiden Gefäße mit je 568 1 des obigen Fermentationsgemisches beimpft, je = 1o Antischaummittel zugegeben und die Gefäße 95 Stunden auf 24,5 bis 26,5⁰C bebrütet, wobei mit 125 TJmdr_e/Min₀ gerührt und mit ; einer Geschwindigkeit von 34oo 1 Luft je Minute belüftet wird. Während dieser Periode werden bei Bedarf weitere 4d bis 46 1 · Antischaummittel zugefügt»

'- 21 -

109883/1690

Die Permentationsgemische aus den beiden Fermentiergefäßen werden kombiniert, mit 1o-n Natronlauge auf ein pH von 7,2" eingestellt, mit 136 kg Diatomeenerde aufgeschlämmt und filtrierte Das Filtrat wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 19oo 1 eingeengt und das Konzentrat mit 4o kg aktivierter Holzkohle behandelt, 1 Stunde bei Kaumtemperatur gerührt und filtrierte Der Kohlenkuehen wird mit 15oo 1 Wasser gewaschen und dann mit drei Portionen von je 19oo 1 5o $iger Wasser-Acetonmischung extrahiert» Die'drei Extrakte werden kombiniert, unter vermindertem Druck auf 17o 1 konzentriert und 48 Stunden bei 5⁰C gekühlt. Das feste 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin, das ausgefällt, wird isoliert und nacheinander aus Methanol und Wasser umkristallisiertj Fp. 262 - 263° C.

Bei der oben beschriebenen Arbeitsweise kann man verbesserte Ausbeuten an 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin erhalten wenn die Inkubationstemperatur in der ersten Fermentationästufe von I 26 - 27⁰C auf 29 - 3o°C, in der zweiten von 24 -'25,5⁰C auf 29 - 3o° C und in der Entfermentationsötufe von 24,5 - 26,5⁰O auf 36 - 38⁰C erhöht wird,

Beispiel 3

Es wird ein iTährmedium der folgenden Zusammensetzung vorbereitet: -

G-lucosemonohydrat 2,ο fo

109883/16 90

_ OO _ '

Sojäbohnenmehl, extrahiert mit lösungsmittel, 44 ^cß> Protein 1,o i*

•Tierisches Pep ton . ·

(Wilson's Protopeptone 159) o,5 $

. Ammoniumchlorid o,2 ^ .

Natriumchlorid o,5 $

Calciumcarbonat. o,25 $ Wasser auf I00 $

Der pH-Wert des Mediums wird mit 1o-n natronlauge auf 7,5 eingestellte

12 Liter dieses Mediums werden in ein 3o Liter-JFernientationsgefäß aus rostfreiem Stahl eingebrachte Das Medium wird zwecks Sterilisation 9o Minuten auf 121⁰C gehalten, worauf man abkühlen läßt und mit 4o ml einer Sporensuspension, bereitet nach Beispiel 1, impft. Das beimpfte Uedium wird dann 56 Stunden bei 29 - 3o°C bebrütet, wobei es mit 2oo L^Tindr»/Hin_e gerührt wird und die Belüftung 12 1 Luft je Minute beträgt« Während der Inkubationszeit fügt man in Portionen 44 g eines Gemisches aus Schweinefett und Mineralölen mit einem G-ehalt an Mono- und Diglyceriden zu, um ein allzu starkes Schäumen zu verhindern·

Weiter wird ein Hährmedium der folgenden Zusammensetzung bereitet?

109883/1690

Glueosemonohydrate 2,o $ Sojabohnenmehl, extrahiert
mit Lösungsmittel, 44 °f> Protein . 2,o fo

Natriumchlorid ο,5 f>

Calciumearbonat ο,25 fo

Wasser auf 1oo fo -

Der pH-\7ert des Mediums wird mit lo-n Natronlauge auf 7,5 eingestellt.

38 Liter dieses zweiten Mediums werden in ein 3?ermentationsgefäß aus rostfreiem Stahl von 114 1 Inhalt eingebracht. Das Medium wird zwecks Sterilisation 6o Minuten auf 121⁰C gehalten, worauf man es abkühlen läßt und es mit etwa ! 4oo ml des oben beschriebenen Fermentationsgemisohes impft. \ 15o ml eines Antischaumgemisches aus Schweinefett und Mineralölen mit einem Gehalt an Mono- und Dig lye er i den (z.B. Swift's .; I Γο, 51 Inedible Defoamer) wird zugefügt und das Gemisch 24 Stun- j den bei 29 - 3o°C bebrütet, wobei die Belüftung mit-einer Qe- \ schwindigkeit von rund 178 1 Iiuft je Minute erfolgt· 5

1136 1 eines ITährmediums mit gleicher Zusammensetzung wie das oben beschriebene Impfmedium von 38 1 werden in ein mit Inconel umkleidetes Permentationsgefäß von 19oo 1 Inhalt eingebracht. Das Medium wird mit 1o-n natronlauge auf ein pH von 7,5

109883/1690 BAD o^NAL -24-

eingestellt und. dann zwecks Sterilisation 3o Minuten auf 121⁰C gehalten« Nach dem Kühlen wird das Medium mit 38 1

des oben beschriebenen Permentationsgemisch.es geimpft, worauf man etwa 1 Eiter des ebenfalls oben beschriebenen Antischaumgemisches zugefügt und das Gemisch. 24 Stunden bei 3o - 31⁰O bebrütet, während man es mit 84 Umdr./Min. rührt und die Belüftung mit 1275 1 Luft je Minute durchführt. Während dieser Periode werden weitere 4 Liter Antischaummischung in Einzelportionen' zugefügt. ■

454o 1 eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie die oben beschriebenen Medien von 38 und 1136 1 werden in je eines von zwei mit Incone1 umkleideten Fermentationsgefäßen von 757o 1 Inhalt eingebracht. Das Medium in den beiden Gefäßen wird mit 1o-n Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt.und zwecks Sterilisation 3o Minuten bei 121⁰C b gehalten. Hach dem Kühlen werden die beiden Gefäße mit je

568 1 des oben beschriebenen Fermentationsgemisches geimpft, jeweils 1o 1 Antischaummittel zugefügt und 144 Stunden bei 36,5 - 38⁰C bebrütet, wobei man mit 125 Umdr./Min. rührt und die Belüftung mit 34oo Liter Luft je Minute erfolgt. Während > dieser Periode werden, falls nötig, Ho - 196 1 Antischaum- : mittel zugegeben«

BAD OFU&iNÄL

109883/1690

■- 2p -

Die Fermentationsgemische aus den "beiden lermentiergefäßen werden zusammengegossen, durch eine Platten- und Rahmenpresse mit Hilfe von .Diatomeenerde filtriert und der Filterkuchen mit etwa 38o 1 Wasser gewaschen. Das Piltrat und das Waschwässer werden zusammengegossen, die kombinierte !Flüssigkeit unter vermindertem Druck auf etwa 1/12 des OriginalvQlumens eingedampft und die konzentrierte Lösung . ä 72 Stunden bei 5°0 gekühlt. Der sich aus der gekühlten Lösung ausscheidende -Niederschlag wird unter Zufügung von Diatomeenerde abfiltriert, der, Filterkuchen mit Joo 1 und dann nochmals mit 15o 1 siedendem Wasser extrahiert und die Extrakte gemeinsam 72 Stunden auf 5⁰C gekühlt. Das aus der Lösung ausfallende kristalline 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin wird abfiltriert und aus 75 1 und daraufhin nochmals aus 100 siedendem Wasser umkristallisiert um es zu reinigen; Λ Pp. 262 - 263°Ö. '

Patentansprüche

1 09 883/1 6.9 0

Claims

8 ΜΐΓϊϊΟΗΕΙϊ 9Ο

SCHWEIGEHSTHASSE 2

T^BFO» 88 0051 ifiQRRQQ

I OCJvJ JuO

TKLKOBAMM Α1>ΠΕ8ΗΒ S

PBOTSOTPATBHT München

U-3fc 010

Patent ansprüche

9-(ß-D-Arabinofuranosyl)adenin der formel

2« Verfahren zur Herstellung von 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin, dadurch gekennzeichnet , daß man ein P wässriges Nährmedium beimpft mit einem 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-adenin produzierenden Stamm von Streptomyces antibioticus und das beimpfte Medium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 45°0 bebrütet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch ge kenn zeich ^: net, daß das wässrige BTährmedium einen pH-Wert zwischen 6 und 8 hat.

109883/1690

4ο -Verfahren naoh Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Eahrmedium Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff und einen Zusatz an anorganischen Salzen enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das beimpfte Medium bei einer ä Temperatur zwischen 33'und 4O⁰C bebrütet wird,,

6. . Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5» dadurch gekennzeichnet , daß das beimpfte Medium unter für eine Unterwasserkultur geeigneten Bedingungen bebrütet wird. "' .

. 86ZXI

109883/1690