DE1018588B

DE1018588B - Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin auf biologischem Wege

Info

Publication number: DE1018588B
Application number: DEG19291A
Authority: DE
Inventors: Alan Rhodes; Rodger Crosse; Thomas Primrose Ferguson; Derek Lawrence Fletcher
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1955-03-28
Filing date: 1956-03-27
Publication date: 1957-10-31

Description

Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin auf biologischem Wege Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin unter submersen Kulturbedingungen.
Griseofulvin ist ein bekanntes Antibiotikum, dessen bedeutende Antifunguseigenschaften erwiesen sind. Seine Struktur wurde zuerst von Grove und Mitarbeitern (Chem. & Ind" 1951, S. 219) aufgeklärt und die folgende Formel aufgestellt Die Herstellung und Isolierung des Griseofulvins im großen hat sich bis jetzt als schwierig erwiesen. So ist aus der Literatur (vgl. Oxford und Mitarbeiter, J. Biochem. 33 [2], 240 r1939]; Brian und Mitarbeiter, Trans. Brit. Mycol. Soc., 29, 173 [1946]; Grove und Mitarbeiter, Nature, 160, 574 [1947]; Grove und Mitarbeiter [loc. cit.]; und MacMillan, Chem. & Ind., 1951, S. 719) ersichtlich, daß Griseofulvin in Oberflächenkulturen nur von höchstens drei Pilzspezies, nämlich P. griseofulvom, P. janczewskii und P. patulum, erzeugt wurde.
Das Antibiotikum Griseofulvin besitzt wertvolle Antifunguseigenschaften und ist unter anderem für die Verwendung als Antifungusmittel, insbesondere in der Landwirtschaft, beispielsweise zum Gebrauch als Sprühmittel für Früchte und andere Zwecke oder zur Samenbehandlung, sehr geeignet. Die Verwendung eines Antibiotikums, insbesondere in großem Maßstab, wie für landwirtschaftliche Zwecke, macht dessen großtechnische und billige Erzeugung erforderlich. Die bis jetzt vorgeschlagenen Methoden zur Griseofulvinherstellung beruhten alle auf der Oberflächenzüchtung verschiedener Pilze, eine Technik, die sich in keiner Weise für eine großtechnische Herstellung eignet.
Es sind bereits seit langem Versuche unternommen worden, ein verbessertes Verfahren zur Griseofulvinherstellung zu finden. Hierbei wurden natürlich submerse Züchtungsmethoden in Betracht gezogen, doch blieben alle Bemühungen in dieser Richtung ohne Erfolg. Es konnten bis jetzt keine Maßnahmen ermittelt werden, die eine Griseofulvinerzeugung auf submersem Wege ermöglichen würden. Die für die Herstellung anderer Antibiotika, beispielsweise Penicillin, angewandten Züchtungsbedingungen lassen sich nicht auf die Griseofulvinerzeugung übertragen. Wenn man versuchen würde, Griseofulvin unter den üblichen für die Herstellung von Penicillin verwendeten Bedingungen submers zu erzeugen, käme man niemals zu befriedigenden Resultaten. Läßt sich nun aber ein für die Antibiotikaherstellung bekanntes Verfahren nicht auf die Erzeugung eines bestimmten Antibiotikums mit wirklich befriedigenden und technisch bedeutungsvollen Ergebnissen übertragen, so treten stets erhebliche Schwierigkeiten auf, die in der Auswahl der geeigneten Züchtungsbedingungen, wie beispielsweise in der Wahl des verwendeten Organismus, in der Zusammensetzung des Nährmediums und in der Züchtungsdauer, liegen. Bei der Griseofulvinerzeugung tritt ferner eine zusätzliche Schwierigkeit bei der Extraktion des Griseofulvins aus dem Kulturmedium auf, da es sich nicht, wie beispielsweise Penicillin, leicht aus dem Kulturmedium extrahieren läßt. Auf Grund dieser Schwierigkeiten ist es bis jetzt, wie oben erwähnt, niemals gelungen, Griseofulvin durch submerse Züchtungsmethoden zu erzeugen.
Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, Griseofulvin in großem Maßstab durch Züchtung geeigneter Organismen unter submersen aeroben Kulturbedingungen und sorgfältiger Beachtung der verschiedenen, die Züchtung beeinflussenden Faktoren bequemer als bisher zu erhalten.
Es ist bekannt, daß verschiedene Spezies des Genus Penicillium bei Züchtung auf geeigneten Medien Griseofulvin in unterschiedlichen Mengen erzeugen. Es ist schwierig, genau festzulegen, welche Spezies für die Griseofulvinherstellung durch submerse Fermentation geeignet sind, und tatsächlich bestehen beträchtliche Unterschiede unter den Stämmen einer einzelnen Spezies. Die einfachste Methode zur Bestimmung, welche Stämme für eine befriedigend verlaufende submerse Fermentation verwendet werden können, ist wohl die Ausführung von Versuchsfermentationen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und Auswahl solcher Stämme, die das Antibiotikum in günstigen Ausbeuten liefern. Das Antibiotikum findet sich hauptsächlich im Mycel, doch ist bei der Bestimmung der erzeugten Menge auf die in der gesamten Flüssigkeit vorhandene Menge Antibiotikum Bezug genommen. Im allgemeinen soll bei der Züchtung ein Griseofulvin erzeugender Organismus verwendet werden, der unter submersen Kulturbedingungen mindestens 150 y (#Lg) Griseofulvin je ml Flüssigkeit erzeugt, wobei die Kultur natürlich unter den hier beschriebenen Bedingungen und so lange, bis der Abbau des Mycels gerade beginnt, ausgeführt wird. Es soll zweckmäßigerweise ein Stamm, der mindestens 200 y/ml, und vorzugsweise ein solcher, der mindestens 500 y/ml erzeugt, verwendet werden.
Es wurde gefunden, daß ein Stamm, der als Penicillium patulum Bainier Thom (4640,455) C. M. I. 39,809 (NRRL [989] als P. urticae Bain [A]-G. Smith 1949) bekannt ist, sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders eignet. Dieser Stamm und seine Mutanten werden zur Zeit bevorzugt, da gefunden wurde, daß damit eine hohe Griseofulvinausbeute unter verschiedenen submersen Kulturbedingungen erhalten wird. Außerdem zeigte sich, daß dieser Stamm und seine Mutanten keine feststellbare Neigung zur Bildung von Deschlorgriseofulvin aufweisen, wenn sie unter den hier beschriebenen Bedingungen gezüchtet werden, selbst bei Anwendung von auf 1 y/ml ansprechenden Testen. Die Deschlorverbindung besitzt bekanntlich merklich geringere Antifungusaktivität als das Griseofulvin selbst und ist ziemlich' wertlos.
Andere Stämme, die untersucht wurden und sich als mehr oder weniger geeignet erwiesen, sind die folgenden: Asymmetrica-Fasciculata (P.-urticae-Arten) Penicillium patulum CMI 28,808 Bainier Coll-Thom (4640-454).
NCTC (1722) 1932 - NRRL 994, ATCC 9260 Penicillium urticae Bain, (Rg 8g) (P. griseofulvum) C. B. S. Baarn Asymmetrica-Divaricata (P.-nigricans-Arten) Penicillium nigricans (Bain) (Zaleski).
C. B. S. Baarn. Penicillium janczewskii Zal. C. M. I. 29,100. (Soil, Lakenheath Warren, Suffolk 1947 - J. H. Warcup 1325) Penicillium albidum Sopp. C. M. I. 40,219 Penicillium raciborskii ZaL C. M. I. 40,568 (?T) Penicillium melinii Thom. C. M. I. 40,216 Es wurde gefunden, daß die Fermentation zur Erzielung verhältnismäßig hoher Ausbeuten an Griseofulvin, die unter submersen Kulturbedingungen durch die vorliegende Erfindung ermöglicht werden, unter bestimmten teils wesentlichen oder teils vorzugsweisen Bedingungen geführt werden soll.
Ganz allgemein sollen die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Medien eine Stickstoffquelle, eine Kohlenstoff- und Energiequelle und Nährsalze enthalten. Rein synthetische Medien (in denen z. B. der Stickstoff in Form von Natriumnitrat vorliegt) können verwendet werden. Es ist jedoch vorzuziehen, Medien, in denen der Stickstoff durch komplexe organische Materialien geliefert wird, zu verwenden, da solche Materialien bekanntlich häufig den Vorteil besitzen, die zur Unterstützung eines guten Wachstums der Mikroorganismen zweckmäßigen Wachstumfaktoren zu liefern. Geeignete komplexe stickstoffhaltige Materialien sind beispielsweise Maisquellwasser, Milcherzeugnisse, wie Molkenpulver, Buttermilch, flüssige Molke, Baumwollsamenmehl, Hafermehl, Sojabohnenmehl u. dgl. Die Wahl dieser Materialien wird weitgehend von Angebot und Preis abhängen, aber sie wird auch durch andere bei der angewandten Fermentierungstechnik eine Rolle spielende Faktoren, wie z. B. die Leichtigkeit der pH-Kontrolle, beeinflußt. Die endgültige Auswahl wird so getroffen, daß unter den jeweiligen Umständen der größtmögliche Erfolg resultiert. Gute Resultate können auch durch gemeinsame Verwendung von zwei oder mehreren verschiedenen Stickstoffquellen, wie beispielsweise einer Mischung von Maisquellwasser und Molkenpulver oder flüssiger Molke, erzielt werden.
Die Kohlenstoff- und Energiequelle ist vorzugsweise ein Kohlenhydrat, wie Lactose, Glucose, Saccharose oder Stärke. Aus wirtschaftlichen Gründen können diese vorzugsweise in unreinen Formen als Abfallprodukte anderer Prozesse zur Anwendung kommen, beispielsweise in Form von Flüssigkeiten aus der Milchproduktenerzeugung, Melassen oder Sulfitablauge. Auch Fette können für diesen Zweck verwendet werden, doch sind Kohlenhydrate vorzuziehen. Wie bei der Stickstoffquelle wird die Endwahl so getroffen werden, daß unter den gegebenen Umständen größter Erfolg resultiert.
Unter den Nährsalzen, die vorhanden sein sollen, sind vor allem die Phosphate zu nennen. Eine Chloridionen-und Magnesiumionenquelle ist ebenfalls zweckmäßig, insbesondere wenn die anderen verwendeten Nährstoffe an verwertbarem Chlor und Magnesium arm sind. Es wurde gefunden, daß der grundsätzlich wichtigste Faktor für eine erfolgreiche Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Kontrolle des im Medium verfügbaren Stickstoffgehalts ist. Es hat sich zwar gezeigt, daß die Griseofulvinherstellung innerhalb eines großen Bereichs des verwertbaren Stickstoffgehalts des Mediums möglich ist, doch wurde gefunden, daß dieser Gehalt die Ausbeute an Griseofulvin merklich beeinflußt und für technisch befriedigende Ausbeuten sorgfältig bei niedrigerem Spiegel gehalten werden muß, als man erwarten würde.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Griseofulvinherstellung unter submersen aeroben Bedingungen zu schaffen. Zu diesem Verfahren gehört die Züchtung eines griseofulvinerzeugenden Organismus in einem das Wachstum dieses Organismus zur Griseofulvinerzeugung fördernden Kulturmedium, das eine assimilierbare Stickstoffquelle in einer Menge von 0,04 bis 0,300/0 N, eine Kohlenstoff- und Energiequelle und Nährsalze enthält.

Es wurde gefunden, daß zur Erzielung optimaler Resultate die verwendbare Stickstoffmenge vorzugsweise zwischen etwa 0,075 und 0,250/, liegt. Der optimale Stickstoffgehalt variiert etwas mit der Art des Impfstoffes und dem Typ des Fermentierungsgefäßes. So beträgt beispielsweise der Stickstoffgehalt des Mediums in 250-ml-Schüttelkolben optimal etwa 0,2 0/0, bei Verwendung einer Sporensuspension als Impfstoff jedoch etwa 0,1 bis 0,15 0/0, wenn ein 5 0/0iger vegetativer Impfstoff verwendet wird. In 680-1-Fermentationsbehältern wurden sehr befriedigende Ausbeuten an Griseofulvin bei einem Stickstoffgehalt von 0,2 0/0 im Medium und vegetativer Impfung erzielt. Diese Abweichungen der optimalen Stickstoffmenge sind aus folgender Tabelle ersichtlich.

Tabelle A

Bedingungen 7 Tage 8 Tage 9 Tage 10 Tage 11 Tage

Stick-

Impfung Kohlenhydrat Stoff- p Bestim- p Bestim- P il p Bestim- p Bestim-

gehalt H mung H mung H mung H i mung H i mung

_ I 0@° I

i

Lactose 0,24 6,43 593 6,29 973 6,61 1080 7,07 1455 6,89 1230

0,17 6,40 664 6,20 902 6,45 952 6,71 1173 6,65 1318

>> 0,10 6,45 840 6,31 1730 6,37 1564 6,68 1292 6,55 2625

Glucose 0,24 7,20 656 7,21 700 7,72 772 7,66 772 7,83 872

Vege- 0,17 7,20 532 7,20 810 7,51 861 7,66 933 7,68 1108

tative >> 0,10 6,24 930 6,39 1220 6,88 726 7,06 884 6,83 1176

Impfung Saccharose 0,24 6,85 641 7,62 620 8,03 536 8,25 582 - -

0,17 7,36 541 7,63 618 7,71 678 7,95 700 7,78 : 804

z> 0,10 6,57 1070 6,51 1162 6,87 842 7,13 933 7,32 i 836

Stärke 0,24 8,18 517 7,86 532 7,94 535 8,25 602 8,47 470

0,10 6,86 1055 6,65 733 7,18

568 7,46 6731 87,68 I 6798

» 8

Lactose 0,24 6,63 ; 302 6,19 308 6,18 287 6,58 332 7,03 i 570

0,17 6,71 339 6,26 301 6,69 333 7,01 400 7,28 682

>., 0,10 6,60 259 6,09 300 6,23 342 6,38 386 6,41 360

Glucose 0,24 7,56 586 7,25 638 7,57 653 7,80 892 7,77 802

Sporen 0,17 7,39 764 7,05 730 7,51 572 7,73 602 7,73 I 725

0,10 6,44 640 6,78 1 604 7,76 I 659 7,08 596 - -

i

Direkt Saccharose 0,24 7,37 376 7,53 642 7,74 I 589 8,05 823 - -

0,17 7,59 495 7,35 598 7,52 777 7,83 720 8,08 930

» 0,10 7,01 496 6,61 472 6,65 372 6,99 456 7,06 532

Stärke 0,24 7,51 561 7,33 570 7,55 612 7,83 618 8,11 602

0,17 7,40 578 7,01 443 7,61 574 8,01 575 8,27 573

j 0,10 7,20 303 6,31 238 7,39 471 7,47 j 381 7,57 475

Vege- I

tative Lactose

Impfung (Kalk) 0,17 6,72 698 6,87 855 6,29

884 6,65 800 6,16 1016

Die zur Durchführung der Fermentierungen, deren Ergebnisse in obiger Tabelle aufgeführt sind, verwendeten Medien hatten folgende Zusammensetzung: Maisquellwasser-Trockenprodukt für 0,10/0, 0,170/, bzw. 0,24°/o N; Lactose, Glucose, Saccharose oder Stärke 70/0; KH,P04 0,40/0; KCl 0,10/0; gemahlener Kalkstein 0,80/0 (oder in einem Fall gefällter Kalk).

Folgende Faktoren sind ebenfalls bei der erfolgreichen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzielung bester Ergebnisse wichtig: a) Wie oben ausgeführt, ist als Kohlenstoff- und Energiequelle ein Kohlenhydrat zu bevorzugen. Der Kohlenhydratgehalt soll vorzugsweise eher höher, als man erwarten würde, liegen. Der Kohlenhydratgehalt kann bis herab zu 3,5"/, oder darunter betragen, doch ist ein solcher von über 50/, zu bevorzugen. Die obere Grenze ist nicht kritisch, wird aber normalerweise etwa 120/, nicht übersteigen. Wenn ein Kohlenhydrat in unreiner Form, z. B. Melasse, verwendet wird, ist es natürlich selbstverständlich, daß diese Prozentangabe auf den Kohlenhydratgehalt des Endmediums bezogen ist und entsprechend höhere Prozentsätze an unreinen Kohlenhydrat enthaltendem Material zugesetzt werden müssen. Wie bereits erwähnt, sind alle üblicherweise bei Fermentationsverfahren verwendeten Kohlenhydratquellen für das vorliegende Verfahren brauchbar, einschließlich Glucose, Rohzucker und Stärke, doch ist der Einsatz von Lactose zu bevorzugen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß der vorteilhafte Effekt der Lactose nur bei Anwendung einer vegetativen Impfung in Erscheinung tritt. Dies kann ebenfalls qualitativ aus der obigen Tabelle A ersehen werden. Die vorteilhaften Ergebnisse, die mit hohen Kohlenhydratspiegeln erzielt wurden, sind in quantitativer Hinsicht aus folgender Tabelle B ersichtlich.

Tabelle B

7 Tage 8 Tage 9 Tage 10 Tage 11 Tage 12 Tage

Kohlenhydrat- - ---

quelle Bestim- i Bestim- Bestim- Bestim- Bestim- Bestim-

mung PH mung PH mung PH mung pii mung pH mung

7°/° Lactose 6,11 4 552 6,13 ! 734 6,91 1300 6,41 1 1352 6,60 1135 -

3,5°/°Lactose 6,74 510 6,84 636 6,51 772 6,65 604 7,28 534 7,79 600

7°/ Glucose 7,07 613 7,02 ( 775 7,85 778 7,45 754 7,64 837 7,85 862

3,5°/° Glucose 7,89 473 7,91 471 8,47 500 8,43 ! 470 8,40 514 8,71 498

711/° Saccharose 7,37 625 7,53 ' 555 8,15 583 7,85 544 7,87 634 7,83 675

3,511/°Saccharose 8,10 388 8,08 448 8,68 432 8,56 409 8,52 1 491 8,79 467

7°/° Stärke 7,08 503 7,59 684 7,92 606 7,57 I 813 7,62 j 826 8,09 917

3,5°/° Stärke 7,98 272 8,27 ( 302 8,64 298 8,53 285 8,45 310 8,71 294

Die Ergebnisse in obiger Tabelle wurden unter Verwendung eines vegetativen Impfstoffes in folgenden Medien erhalten: Maisquellwasser-Trockenextrakt für 0,170/, N ; Lactose, Glucose, Saccharose und Stärke 7111, oder 3,5°/'°; KH,P040,4°,/°; KCl 0,1°/°; gemahlener Kalkstein 0,8 °/°.

b) Der pH-Wert des Mediums ist nicht kritisch, er soll jedoch vorzugsweise vor dem Beginn der Fermentation auf einen Wert zwischen 4,5 und 5,5 eingestellt werden. Im Verlauf der Fermentation steigt der pH-Wert an und liegt am Ende häufig in der Größenordnung von 6,5 bis B. Griseofulvin selbst ist in einem pH-Bereich von 3,0 bis 8,8 stabil. Um eine eventuelle anfänglich nötige Ein-Stellung des pH-Werts auszuführen und die Fermentationsfiüssigkeit abzupuffern, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, dem Medium zwischen 0,4 und 1,2 °;'° Phosphat und gemahlenen Kalkstein oder Kalk zuzusetzen. Die Verwendung von 0,4 bis 0,8 °;'° K H. P 04 und 0,8 0.I° Kalk ist zu bevorzugen. Es sei bemerkt, daß diese Substanzen auch als Nährsalze dienen und daß insbesondere das Phosphat eine sehr günstige Wirkung auf die Griseofulvinausbeute ausübt. Die Anwesenheit von gemahlenem Kalkstein setzt die Pegmentierung der Flüssigkeit stark herab. Die folgenden beiden Tabellen C und D sollen die Wirkungen des Phosphats und gemahlenen Kalksteins zeigen.

Tabelle C
pn des Mediums und Gehalt an gemahlenem Kalkstein in Lactose-Maisquellwasser-Medium
Bedingungen 6 Tage 8 Tage 11 Tage
Kalkgehalt Phosphatgehalt
p/o I a/a pH Bestimmung PH Bestimmung PH Bestimmung
I
0 0 6,20 197 6,32 362 7,20 452
0 0 6,06 180 6,20 300 6,97 326
0 0,4 5,84 248 6,03 289 6,84 655
0 0,4 5,84 325 6,00 250 6,73 624
0 0,8 5,84 270 6,07 380 6,64 515
0 1 0,8 5,84 280 6,00 442 - -
0,4 0 6,63 139 6,74 - 7,47 423
0,4 1 0 7,27 165 6,75 250 7,38 410
0,4 0,4 6,54 I 227 6,75 340 7,71 568
0,4 0,4 6,51 248 6,59 370 7,71 652
0,4 0,8 6,42 229 6,73 i 325 7,43 830
0,4 @r 0,8 6,49 227 6,81 325 7,58 798
i
0,8 0 6,70 133 6,82 152 7,93 j 304
0,8 i 0 6,89 i 133 7,12 1 200 8,08 312
0,8 0,4 6,63 257 6,68 315 7,45 532
0,8 0,4 6,62 253 6,58 312 7,48 631
0,8 0,8 6,61 248 6,81 315 7,59 672
0,8 ! 0,8 6,60 253 6,68 289 7,43 684
1,2 0 6,78 152 7,03 252 7,97 307
1,2 0 6,93 148 7,31 277 7,99 381
1,2 1 0,4 6,55 270 6,85 320 - 516
1,2 0,4 6,52 293 6,67 350 7,37 521
1,2 0,8 6,61 238 6,76 292 7,37 i 611
1,2 0,8 6,60 227 6,65 334 7,27 582

Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung des Lactose-Maisquellwasser-Mediums I, das iveitcr unten beschrieben ist, erzielt. Aus ihnen ist ersichtlich, daß bei Verwendung von Lactose als Kohlenhydratquelle die Titer sehr günstig von der Anwesenheit von Phosphat, aber nur mäßig von Kalkstein beeinflußt werden. In Abwesenheit des letzteren tritt jedoch unerwünschte Braunfärbung auf. Die nächste Tabelle zeigt, daß bei Verwendung eines sonst gleichen Mediums, in dem jedoch Glucose die Lactose ersetzt, und mit zwei verschiedenen Phosphatquellen in einer Menge von 0,4°/o in jedem Fall die vorteilhaften Wirkungen des Kalksteins auf den Titer sehr viel stärker ausgeprägt sind. Auch hier setzt die Anwesenheit von Kalkstein die Pigmentierung herab.

Tabelle D

pH des Mediums und Kalksteingehalts in Glucose-Maisquellwasser-Medium

Bedingungen 6 Tage 8 Tage 9 Tage

Kalkgehalt Phosphat PH Bestimmung PH Bestimmung PH Bestimmung

/o

0 K H2 P O,, 6,05 475 6,76 535 7,11 570

0 i KH,P04 6,18 518 6,85 525 7,11 448

0,4 I KH,P04 6,38 448 7,40 608 8,80 400

0,4 KH,P04 6,36 485 8,39 626 8,06 620

0,8 K HZ P 04 6,85 473 7,44 740 8,88 633

0,8 K H2 P 04 6,85 450 7,45 672 8,97 550

1,2 KH,P04 6,88 525 7,30 584 8,13 592

1,2 KH,P04 6,84 535 7,41 760 8,02 522

0 K2 H P 04 6,42 480 7,24 1 670 7,83 512

0 K2 H P 04 6,40 450 7,27 658 7,83 510

0,4 K,HP04 6,85 608 7,56 678 7,95 648

0,4 K,HP04 6,94 606 7,51 708 8,08 681

0,8 K2 H P 04 7,28 625 7,50 735 8,07 634

0,8 K,HP04 7,36 612 - - 9,06 548

1,2 X,HP04 7,21 602 7,58 740 9,13 736

1,2 K2 H P 04 6,94 545 - - 9,13 623

c) Der Grad der Belüftung soll gut sein. Allgemein scheint es, daß in gewissen Grenzen die Ausbeuten an Griseofulvin um so größer sind, je stärker die Belüftung ist. Dies ist insbesondere der Fall, je höher der Stickstoffgehalt des Mediums ist. Es ist jedoch unmöglich, genaue Werte für die Belüftung anzugeben, da bekanntlich der Grad der Belüftung nicht nur von der tatsächlichen Geschwindigkeit der Luftzufuhr, sondern auch von deren Wirksamkeit abhängt, welch letztere von vielen anderen Variablen, einschließlich Größe und Form der Fermentationsgefäße und der Art, wie die Luft eingeführt wird, abhängt.

Die Wirkung erhöhter Belüftung ist in der folgenden Tabelle E gezeigt. In dieser sind die Resultate einer Reihe von Fermentationen aufgeführt, welche unter Verwendung von Medien, in denen der Stickstoffgehalt in jedem Fall 0,15 °/o betrug, die Kohlenhydratquellen jedoch variiert wurden, geführt wurden. In 250-ml-Kolben wurden 40 ml, 60 ml bzw. 80 ml Flüssigkeit geschüttelt. Es ist selbstverständlich, daß die Belüftung um so größer war, je kleiner die Flüssigkeitsmenge war. Außer in bezug auf die Kohlenhydratquelle entsprach das in jedem Falle verwendete Medium dem im nachstehenden beschriebenen Maisquellwasser-Lactose-Medium I, welches mit 1 ml, 1,5 ml bzw. 2 ml submerser Sporensuspension beimpft wurde.

Tabelle E

Bedingungen 6 Tage 7 Tage 8 Tage

Kohlenhydrat 1'lüssigkeits- p Bestimmung P ff p Bestimmung

volumen H Ff H

40M1 6,47 255 6,41 300 - 318

6,47 137 6,41 256 - -

Lactose 60 ml 6,34 140 6,12 - 6,33 110

6,56 218 6,18 - 6,33 380

80M1 6,67 187 6,56 270 6,41 208

7,03 158 6,41 I 218 6,47 205

40 ml 7,74 475 7,81 652 8,08 655

7,74 443 7,81 500 8,08 655

Rohzucker 60 ml 7,75 441 7,57 515 7,59 606

7,61 395 7,74 505 7,84 593

80 ml 7,63 7,64 505 386 7,24 7,34 4537 30 7,62 7,73 40 0

40 ml 7,47 585 7,57 675 - - 932

7,47 554 7,57 727 - -

Glucose 60 ml 7,52 562 7,50 615 7,70 708

7,52 546 -- - - -

80 ml 6,68 418 7,05 573 7,57 650

6135 - 368 7,12 537 - -

d) Zur Vermeidung der Bildung von Deschlorgriseofulvin soll das Medium einen Teil verfügbaren Chlors enthalten. Vorausgesetzt, daß genügend Chlor vorhanden ist, scheint der Gehalt nicht kritisch zu sein. Wenn komplexe organische Materialien als Stickstoffquelle verwendet werden, so enthalten diese gewöhnlich einen Teil Chlor. Es wurde jedoch gefunden, daß es im allgemeinen zur Gewährleistung befriedigender Resultate günstig ist, zwischen 0,05 und 0,25 % eines geeigneten löslichen Chlorids zuzusetzen, und die Verwendung von etwa 0,1% K Cl ist zu bevorzugen.

e) Der verwendete Impfstoff kann entweder eine Sporensuspension oder ein gut wachsender vegetativer Impfstoff sein, letzterer ist jedoch zu bevorzugen. Es hat sich gezeigt, daß es bei der Verwendung einer Sporensuspension zur Impfung eines 150-1-Beimpfungsgefäßes günstig ist, 150 ml einer Suspension, die eiil2 Zahl von etwa 18 - 10s Sporen je ml enthält, zu verwenden. Nach gutem Wachstum wird dieser vegetative Impfstoff in einer Menge von 1 bis 10 % zur Beimpfung des Fermentationsmediums verwendet.

Im folgenden werden nur zum Zwecke der Erläuterung drei Beispiele von Medien, die sich für die Herstellungsstufe des Verfahrens als günstig erwiesen haben, gegeben.

a) Medium für submerse Fermentation I

Maisquellwasser-Trockenextrakt 2,85 0/0 (= 0,15 % N)

Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,00/,

a

K H2 P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40/0

gemahlener Kalkstein,

natürliches pH . . . . . . . . . . . . . . 0,8"/,

b) Medium für submerse Fermentation 1I

Molke . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,738 0/0 (= 3,5 % Lactose)

Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . 3,50/, (= 0,1% Stickstoff)

K H2 P 04 . . . . . . . . . . . . . . 0,40/,

0

Maisquellwasser-Trocken-

extrakt, natürliches pR 0,38 0/0 (liefert etwa 0,035 % N)

c) Medium für submerse Fermentation III

Maisquellwasser-Trockenextrakt 2,85 0/0 (= 0,15 % N)

Stärke........................ 7,0%

or

K H2 P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40/0

gemahlener Kalkstein,

natürliches p$ . . . . . . . . . . . . . . 0,80/,

Die Temperatur, bei welcher die Fermentation ausgeführt wird, ist offensichtlich nicht kritisch. Jedoch ist die Anwendung einer Temperatur von etwa 25° zu bevorzugen. Es kann auch oftmals zweckmäßig sein, ein Entschäumungsmittel bei der Fermentation zuzusetzen, wie Petroläther (white mineral oil). Eine geeignete Menge im Medium beträgt von 0,25 bis 0,75 0/0.

Es wurde gefunden, daß es im allgemeinen nicht günstig ist, zur Erzielung der Sporulation des Griseofulvin erzeugenden Pilzes zum Zwecke der Herstellung einer zur Verwendung als Impfstoff geeigneten Sporensuspension sowohl für die Entwicklungs- wie auch die Herstellungsstufe, insbesondere im Falle des bevorzugten Stammes Penicillium patulum Bainier-Thom, ein normales Produktionsmedium zu verwenden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Sporensuspensionen in einem submersen Medium erzeugt werden können, vorausgesetzt, daß gewissen Forderungen Rechnung getragen wird. Insbesondere ist es zweckmäßig, daß der insgesamt verfügbare Stickstoffgehalt der zur Herstellung von Sporensuspensionen verwendeten Medien unter 0,25 0/0 betragen und vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,10/0 liegen soll und daß außerdem eine gute Belüftung aufrechterhalten wird, wobei der letztere Faktor vielleicht der wichtigere ist. Die optimalen Werte für diese Faktoren variieren schwach von Stamm zu Stamm des Organismus.

Es wurde gefunden, daß eine ausgeprägte Wechselwirkung zwischen Stickstoffgehalt und erforderlicher Belüftung besteht, wobei der erforderliche Stickstoffgehalt um so niedriger ist, je weniger belüftet wird. So wurde beispielsweise gefunden, daß 600 ml eines Mediums, in welchem Molke als Stickstoffquelle in einer Menge, daß der Stickstoffgehalt etwa 0,05 % betrug, verwendet wurde und welches Lactose, Phosphat, Chlorid und Maisquellwasser in geeigneten Verhältnissen enthielt, reichliche Sporulation ergaben, wenn in einem 2-1-Kolben 6 Tage bei 25° stark geschüttelt wurde. Zur Erläuterung sei ein Beispiel für ein Medium, das sich für die Sporulationsstufe des Verfahrens als geeignet erwiesen hat, gegeben.

Medium für submerse Sporulation

vom P. patulum Bainier-Thom. IV

Molkenpulver etwa . .2,84 0,"', zur Erzielung von

0,05 % N, 1,725 % Lactose

Lactose . . . . . . . . . . . .1,7751)/,

K H,P 04 . . . . . . . . . .0,40/,

K Cl . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/,

Maisquellwasser-

Trockenextrakt,

natürliches p$ ...... 0,38 0/0

zur Erzielung von etwa 0,04 % N

Wie oben erwähnt, kann die aus der Sporulationsstufe erhaltene Sporensuspension entweder zur direkten Impfung der eigentlichen Fermentationsstufe verwendet werden, oder sie kann zur Bildung eines vegetativen Impfstoffs für die Fermentationsstufe einer Entwicklung in jedem geeigneten Medium unterzogen werden.

Dies letztere Verfahren ist zu bevorzugen, besonders wenn als Kohlenhydratquelle in der Fermentationsstufe Lactose verwendet wird. Wenn Glucose in der Fermentationsstufe verwendet wird, so ist der durch Verwendung einer vegetativen Impfung hervorgerufene Vorteil nicht so offensichtlich. Die die Entwicklungsstufe des Verfahrens beherrschenden Bedingungen sind im allgemeinen denjenigen der schließlichen Fermentationsstufe nicht unähnlich, und es wurde gefunden, daß mit verschiedenen Entwicklungsmedien, einschließlich der beiden Medien 1 oder 2, die oben für die Fermentationsstufe des Verfahrens beschrieben wurden, befriedigende Resultate erzielt werden können.
Es hat sich herausgestellt, daß das durch die Fermentation erzeugte Griseofulvin zum größten Teil, z. B. 90 0/0, im Mycel selbst bleibt und nicht in die Flüssigkeit eintritt, außer wenn man die Fermentation zu weit fortschreiten läßt. In letzterem Fall wird das Mycel abgebaut, und das Griseofulvin kann sich in der gesamten Flüssigkeit verteilen. Die Extraktion des Griseofulvins aus der Flüssigkeit selbst ist schwierig. Es ist deshalb vorzuziehen, den Vorteil des Verbleibens des Griseofulvins im Mycel wahrzunehmen und die Fermentation abzubrechen, ehe der Abbau des Mycels in einem merklichen Ausmaß auftritt.
Die Extraktion des Antibiotikums kann auf beliebige Weise erfolgen. Methoden zur Ausführung dieser Extraktion sind schon früher für Oberflächenkulturen beschrieben worden, und im allgemeinen sind solche Methoden für die Anwendung beim erfindungsgemäßen Verfahren geeignet. Es wird nun als Beispiel eine allgemeine Beschreibung von bevorzugten Extraktionsmethoden gegeben.
Das Mycel wird aus der Flüssigkeit vorzugsweise durch Filtrieren bei einem p$, der unter 8,0 liegen soll, abgetrennt. Das Filtrat, das etwa 100;0 des erzeugten Griseofulvins enthält, wird dann im allgemeinen verworfen, obwohl das Antibiotikum durch Extraktionsmethoden von dieser, falls erwünscht, abgetrennt werden kann. Der Mycelfeststoff wird mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat, n-Butanol-amylacetat oder vorzugsweise Butylacetat, extrahiert. Die Extraktion wird zweckmäßig in der Weise ausgeführt, daß das Mycel und das Lösungsmittel vermischt werden, vorzugsweise in gleichem Verhältnis Gewicht zu Volumen für eine Zeitspanne von etwa 15 Minuten, und dann durch Sedimentieren und Dekantieren getrennt werden. Dieses Extraktionsverfahren soll vorzugsweise zwei oder mehrere Male wiederholt werden. Die abdekantierte Lösung wird dann vorzugsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren geklärt und vorzugsweise im Vakuum eingeengt, wobei die Temperatur 50° nicht überschreiten soll. Die Konzentrierung wird soweit wie praktisch möglich ausgeführt. Man läßt dann das Konzentrat auf etwa 20° abkühlen und filtriert die Festbestandteile ab. Wenn etwas ölige Flüssigkeit, wie es im allgemeinen der Fall ist, aus dem Mycel gleichzeitig mit dem Griseofulvin extrahiert wurde, wird das an den Festbestandteilen anhaftende Öl durch Mischen mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Butylacetat, in gleichemVerhältnis Gewicht zu Volumen und erneutem Filtrieren ausgewaschen. Der gewaschene Festbestandteil wird vorzugsweise im Vakuum z. B. über Phosphorpentoxyd bei Raumtemperatur getrocknet. Das so erhaltene rohe Griseofulvin kann durch Auflösen in einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Filtrieren und Ausfällen durch Zugabe von Wasser, in welchem Griseofulvin so gut wie nicht löslich ist, gereinigt werden. Falls erforderlich, kann dies Verfahren wiederholt werden, und das Produkt wird dann getrocknet, wobei reines kristallines Griseofulvin erhalten wird.

Das folgende Beispiel für das Herstellungsverfahren von Griseofulvin in kleinem Maßstab soll die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken: Herstellung der Sporensuspension 600 ml des folgenden Mediums wurden in einem konischen 2-1-Kolben im Autoklav behandelt.

Molkenpulver entsprechend

(Lactose 3,5 0/0, Stickstoff 0,05 0/0)

K H2 P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40/,

K Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/0

Maisquellwasser-Trockenextrakt . . . . . . . . . 0,380/,

(entsprechend etwa 0,040/,N)

Der Kolben wurde mit einer Sporensuspension aus einer gut sporulierten Czapek-Dox-Agarkultur von Penicillium patulum Bainier Thom (4640,455) C. M. I. 39,809 geimpft und bei 25° auf einer Schüttelmaschine 7 Tage inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt hatte die Kultur reichlich submerse Sporen erzeugt.

Vegetative Impfstoffstufe In einem Fermentierungsbehälter wurden 1501 des folgenden Mediums unter Rühren mit 150 ml der submersen Sporensuspension, die etwa 18 - 100 Sporen pro ml enthielt, beimpft.

Molkenpulver, Lactose entsprechend

(Lactose 3,5 0/0, Stickstoff 0,110/0)

K H2 P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40/0

K Cl . .............................. 0,10 /0

Maisquellwasser-Trockenextrakt . . . . . . . . . 0,38"/,

(entsprechend etwa 0,040/0 N)

Keine pH-Einstellung; Sterilisation 20 Minuten bei 120°.

Der Luftstrom betrug etwa 0,084 m3/Min. für die ersten 24 Stunden und wurde dann allmählich in dem Maß, wie sich das Wachstum entwickelte und die Schaumbildung nachließ, auf 0,225 m3/Min. erhöht. Die Temperatur betrug 25°. Es wurde mit einer Geschwindigkeit von 350 Umdrehungen pro Minute gerührt. Der so erzeugte Impfstoff wurde nach 28 Stunden in das Fermentationsmedium übergeführt.

Fermentationsstufe

Es wurden 4501 folgenden Mediums verwendet.

Maisquellwasser-Trockenextrakt,

entsprechend Stickstoff .... . . . . . . . . . . . . 0,20/,

Lactose ................................ 70/0

Kalkstein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,80/0

KH,P0. ............................... 0,40/0

K C1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0

Keine pH-Einstellung; Sterilisation 20 Minuten bei 120°.

Das Fermentationsmedium wurde mit 10"/, vegetativen Impfstoffs aus dem Impfstoffermentationsgefäß beimpft. Der Luftstrom wurde für die ersten 8 Stunden so nah wie möglich auf 0,283 m3/Min. gehalten und betrug dann etwa 0,57 m3/Min. Die Temperatur betrug 25°, die Rührgeschwindigkeit 350 Umdrehungen pro Minute. Petroläther wurde als Entschäumungsmittel, soweit erforderlich, verwendet.

Die Enzelheiten der Fermentation waren die folgenden:

Stunden Titer

0 --

56 -

90 530

114 910

138 1355

162 1675

Die Beschickung ergab nach Lösungsmittelextraktion nach dem im vorstehenden beschriebenen Verfahren 150 g reines 950/0iges Griseofulvin.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin durch Züchtung eines Griseofulvin erzeugenden Organismus in einem das Wachstum dieses Organismus zur Griseofulvinerzeugung fördernden Kulturmedium, das eine assimilierbare Stickstoffquelle, eine Kohlenstoff- und Energiequelle und Nährsalze enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren unter submersen aeroben Bedingungen ausgeführt und die assimilierbare Stickstoffquelle in dem Kulturmedium in solcher Menge verwendet wird, daß ein Gehalt an verfügbarem Stickstoff von 0,04 bis 0,300/" vorzugsweise von 0,075 bis 0,250/" vorliegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoff- und Energiequelle in dem Medium ein Kohlenhydrat in einer Menge von mindestens 3,50/0, vorzugsweise mindestens 5,001, verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Stickstoffquelle komplexe organische Stoffe verwendet werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Griseofulvin erzeu- Bender Organismus Penicillium patulum Bainier Thom verwendet wird. S. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Nährsalze in dem Kulturmedium auch Phosphate, vorzugsweise
5 K Hz P 04 und K2 H P 04, vorzugsweise in einer Menge von 0,4 bis 0,8 0/0, verwendet werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daB als Nährsalze in dem Kulturmedium auch Chloride, vorzugsweise io Kaliumcblorid, vorzugsweise in einer Menge von mindestens 0,10/" verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium mit 1 bis 10 °/o eines gut wachsenden vegetativen Impfstoffs des Organismus geimpft Nvird. B. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daB der Griseofulvin erzeugende Organismus bis zu dem Zeitpunkt des Mycelabbaus gezüchtet, das Mycel von der Flüssigkeit abgetrennt und das Griseofulvin aus dem Mycel durch Lösungsmittelextraktion, vorzugsweise mit Butylacetat, gewonnen wird.