DE2224707C3

DE2224707C3 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl>7methoxy-S-cephem^-carbonsäure

Info

Publication number: DE2224707C3
Application number: DE19722224707
Authority: DE
Inventors: Jerome Morganville Birnbaum; Edward Rahway Inamine
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-05-20
Filing date: 1972-05-19
Publication date: 1974-01-10
Also published as: HU165957B; NL7206339A; GB1382316A; DK130846B; FR2143672B1; ES402903A1; DD96974A5; NO135185C; FI49839C; DE2224707A1; FI49839B; JPS5248196B1; CA986863A; NO135185B; FR2143672A1; CH582237A5; DE2224707B2; DK130846C; SE385019B

Description

7-(D-5-Arnmo-5-carboxyvaleramido)-3-(carb- clavuligerus NRRL3585 m einem Nahnnedium^as

amoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbon- dadurch gekennzeichnet ist, daß _ man_ demNah, -

säure, die die nachstehende Strukturformel I aufweist, medium Natriumsulfat Natnumdi hmmt oö r

entsteht bei der aeroben Fermentation von Strepto- ,₅ a-Aminoadipinsäure fur sich allem oder m Kombina-

myces lactamdurans NRRL 3802 oder Streptomyces tion zusetzt.

O NH,

OCH

HOc-CH-CH₂-CH₂-CH₂-C-NH

Il

CH₂OCNH₂

Die Fermentation wird bei Temperaturen von 20 bis 37°C durchgeführt; wenn man die besten Ergebnisse erzielen will, führt man die Fermentation vorzugsweise bei etwa 24 bis 32⁰C durch. Der für das Züchten von Kulturen von Streptomyces und für die Erzeugung des Antibioticums geeignete pH-Wert der Nährmedien soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen.

Das Nährmedium enthält für den Mikroorganismus assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff und außerdem anorganische Salze. Ferner enthält das Medium Spurenmetalle, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen der anderen Bestandteile des Mediums vorliegen. Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet man im allgemeinen Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Saccharose, Maltose, Fructose, Lactose u. dgl., und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer und Roggen, Maisstärke, Maismehl u. dgl., für sich allein oder in Kombination miteinander. Die genaue Menge an Kohlehydraten in dem Fermentationsmedium richtet sich teilweise nach den anderen Bestandteilen. Es wurde jedoch gefunden, daß Kohlehydratkonzentrationen von etwa 1 bis 6 Gewichtsprozent des Fermentationsmediums genügen. Man kann mit einer einzigen Quelle für Kohlenstoff arbeiten, aber auch mehrere solche Quellen für Kohlenstoff kombinieren.

Zufriedenstellende Quellen für Stickstoff sind die zahlreichen Eiweißstoffe, wie die verschiedenen Formen von Caseinhydrolysaten, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile, Hefeprodukte, Tomatenbrei u. dgl. Die verschiedenen Stickstoffquellen können für sich allein oder in Kombination miteinander verwendet werden und werden in Mengen von 0,2 bis 6 Gewichtsprozent, bezogen auf das wäßrige¹ Fermentationsmedium, zugesetzt.

Durch den Zusatz von Natriumthiosulfat (Na₂S₁O₃), Natriumdithionit (Na₂S₂O₄), u-Aminoadipinsiäure oder durch gemeinsamen Zusatz von Natriumthiosulfat und a-Aminoadipinsäure zum Fermentationsmedium wird die Bildung von 7-(i>5-Amino-5-carb-COOH

oxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methox>3-cephem-4-carbonsäure gesteigert.

Die Menge an Natriumthiosulfat und/oder a-Amin» adipinsäure oder an Natriumdithionit, die zur Erhöhung der Ausbeute an Antibioticum erforderlich ist, richtet sich nach der jeweiligen Kultur und dem jeweiligen Medium. Wenn man mit Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 arbeitet, beobachtet man eine Produktionserhöhung an dem Antibioticum in synthetischen Medien, wenn diese 0,005 bis 1,6% (alle hier für die Zusätze gemäß der Erfindung angegebenen Prozcntwerte beziehen sich auf Gewicktsteile je 100 Raumteile Fermentationsmedium) irgendeines dieser Zusätze enthalten. Um eine gute Erzeugung des Antibioticums zu gewährleisten, verwendet man jedoch vorzugsweise die Zusätze in Mengen von etwa 0,1 bis 0,8% Die besten Ausbeuten erhält man mit 0,3 bis 0^5%, und besonders gute Ausbeuten werden bei 0,4% an diesen Zusätzen erzielt. Durch Zusatz von Natriumdithionit oder Natriumthiosulfat zu einem synthetischen oder chemisch definierten Medium bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 erhöht sich die Produktion von 7-(D-5-Amino-5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure um 91 bis 105%, wenn das Fermentationsmedium 0,4% Natriumthiosulfat enthält. Konzentrationen von Natriumthiosulfat oder Natriumdithionit von mehr als 1,6% vermindern die Ausbeute des Antibioticums in den Fermentationsmedien.

In komplexen organischen Nährmedien erhält man bei Verwendung von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 die besten Ausbeuten an Antibioticum bei Konzentrationen an Natriumthiosulfat od&r Natriumdithionit von 0,05 bis 0,1%.

Es wurde ferner gefunden, daß die Kombination von Natriumthiosulfat mit DL-a-Aminoadipinsäure bei Verwendung von Streptomyces !actamdurans NRRL 3802 die Ausbeute des Antibioticums im Nährmedium erhöht. Hierbei ist die Konzentration an Natriumthiosulfat die gleiche, wie oben angegeben, und die Konzentration an DL-a-Aminoadipinsäure

beträgt 0,005 bis 0,15%. Vorzugsweise setzt man die von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 die höch-

DL-ci-Aminoadipinsäure in einer Konzentration von sten Ausbeuten mit dem folgenden Nährmeditim

stwa 0,01% zu, und bei Kombination der beiden erzielt.

Zusätze betragen die günstigsten Konzentrationen MerTiim T

an Natriumthiosulfat und an DL-u-Aminoadipinsäure 5 iviemum 1

etwa 0,4 bzw. 0,01%. Stärke 4,8%

Wenn man mit Streptomyces lactamdurans NRRL lösliche Schlempebestandteile 0,5%

3802 arbeitet, spielt überraschenderweise der Zeit- Sojabohnengrütze 0,21%

punkt des Zusatzes der die Ausbeute erhöhenden Glycerin 0,8%

Verbindungen zu dem Fermentationsansatz eine ent- 10 hydrolysiertes Casein

scheidende Rolle. Die besten Ausbeuten erhält man, (N-Z-Amin*), Typ A) 0,5%

wenn man das Natriumthiosulfat und/oder die Eisen(II)-sulfat-heptahydrat 0,01%

DL-a-Aminoadipinsäure oder das Natriumdithionit Mit Leitungswasser aufgefüllt auf ... 1,01
24 bis 48 Stunden nach der Beimpfung zusetzt. Wenn

der Zusatz ZU einem früheren Zeitpunkt in dem 15 *) N-Z-Amin, Typ A ist ein angedautes Enzym aus Casein, Fermentationsverfahren Stattfindet, erzielt man ent- hergestellt von der Sheffield Chemical Co., Norwich, New York, USA. weder keine Ausbeuteerhöhung oder sogar eine hemmende Wirkung. Während man mit Streptomyces lactamdurans NRRL Im Gegensatz dazu ist beim Arbeiten mit einer 3802 besonders gute Ausbeuten an dem Antibioticum Kultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 20 mit dem nachstehend angegebenen Nährmedium II bei Verwendung von Natriumthiosulfat weder der Zeit- erzielt:
punkt des Zusatzes noch die Konzentration dieser

Verbindung ausschlaggebend. Im allgemeinen erhöht Medium II
Natriumthiosulfat die Erzeugung des Antibioticums

um etwa 40%, unabhängig davon, ob die Verbindung 25 Lösliche Schlempebestandteile 3,0%

gleich zu Beginn der Fermentation oder nach der Primäre Trockenhefe 1,0%

Beimpfung zugesetzt wird. Besonders gute Ausbeuten Schaumverhütungsmittel aus 40,5%

an dem Antibioticum werden jedoch bei Konzentra- Paraffinwachs, 4,5% Ölsäure und

tion an diesem Zusatz von etwa 0,20 bis 0,60% 55,0% Wasser 0,25%

beobachtet. ₃o Glycin 0,05%

Wenn Natriumdithionit mit einer Kultur von l-Phenylalanin 0,30%

Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 verwendet Maisstärke 2,0%

wird, kommt es entscheidend auf den Zeitpunkt des Mit entmineralisiertem Wasser aufZusatzes an. Das Dithionit beschleunigt die Synthese gefüllt auf 1,01

des Antibioticums, wenn es mehrere Stunden, gewöhn- 35

lieh 24 bis 31 Stunden, nach der Beimpfung zugesetzt Die obige Beschreibung bezieht sich in erster Linie wird, es hemmt dagegen das Wachstum des Mikro- auf die Fermentation mit einem besonderen Stamm Organismus, wenn es gleich zu Beginn der Fermenta- von Kulturen von Streptomyces lactamdurans und tion zugesetzt wird. Im allgemeinen erzielt man gute Streptomyces clavuligerus. Man kann aber auch Ergebnisse, wenn man das Dithionit in Konzentra- 40 andere Stämme dieser Mikroorganismen, wie Mutionen von 0,005 bis 0,075% zusetzt; besonders gute tanten, zur Erzeugung des Antibioticums verwenden, Ausbeuten an dem Antibioticum werden erzielt, wenn und auch dann kann man von Natriumthiosulfat, diese Verbindung zu dem Produkiionsmedium inner- Natriumdithionit oder der Kombination aus Natriumhalb 24 bis 31 Stunden nach der Beimpfung in Kon- thiosulfat und dl- oder L-a-Aminoadipinsäure zur zentrationen von etwa 0,025 bis 0,050% zugesetzt wird. 45 Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum GeWenn man mit Streptomyces clavuligerus NRRL brauch machen.

3585 arbeitet, wird durch gemeinsamen Zusatz von Obwohl das neue Antibioticum gemäß der Erfin-

etwa 0,005 bis 0,6% Thiosulfat und etwa 0,01 bis dung in Oberflächenkultur oder in Submerskultur

0,4% L-a-Aminoadipinsäure im allgemeinen die Erzeu- erzeugt werden kann, führt man die Fermentation zur

gung des Antibioticums noch stärker beschleunigt als 50 Zeit vorzugsweise in Submerskultur durch. Fermen-

bei Zusatz von Thiosulfat allein. Der Zusatz von tationen in kleinem Maßstabe werden zweckmäßig

0,20% Natriumthiosulfat und 0,05% L-a-Aminoadipin- durchgeführt, indem man geeignete Mengen des

säure hat sich als besonders geeignet zur Erhöhung Nährmediums in Kolben einbringt, die Kolben und

der Produktion an Antibioticum erwiesen, wenn der ihren Inhalt durch Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert, die

Zusatz zu Beginn des Fermentationsverfahrens erfolgt. 55 Kolben entweder mit Sporen oder mit einer vegeta-

Wenn L-a-Aminoadipinsäure bei der Fermentation tiven Zellenkultur des 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-

einer Kultur von Streptomyces clavuligerus NRRL amido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy-

3585 allein verwendet wird, wird die Erzeugung des 3-cephem-4-carbonsäure erzeugenden Streptomyces

Antibioticum! durch Konzentrationen von etwa 0,01 Stammes NRRL 3802 oder NRRL 3585 beimpft, die

bis 0,4% erhöht. Besonders gute Ausbeuten erhält 60 Hälse der Kolben locker mit Watte verschließt und die

man bei Konzentrationen von etwa 0,025 bis 0,05%. Fermentation 3 bis 5 Tage bei einer konstanten Raum-

Die Fermentationsmedien, zu denen das Thiosulfat, temperatur von etwa 28° C in der Schüttelmaschine

das Dithionit und die a-Aminoadipinsäureverbindung durchführt. Für Arbeiten in größerem Maßstabe Führt

zugesetzt werden, kann ein beliebiges geeignetes man die Fermentation vorzugsweise in großen Behäl-

wäßriges Nährmedium sein; mit gewissen Nährmedien 65 tern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung dir das

erhält man jedoch bei Verwendung dieser Zusätze Fermentationsmedium durch. Bei dieser Methode

besonders gute Ausbeuten an Antibioticum. So wurde wird das Nährmedium im Behälter angemacht und

überraschenderweise gefunden, daß man mit Kulturen durch Erhitzen auf 120" C sterilisiert. Nach dem

Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vegetativen Zellenkultur des Streptomyces Stammes NRRL 3802 oder NRRL 3585 beimpft und die Fermentation 2 bis 4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 28°C durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von 7-(D-5-Amino-5-carb-

3-cephem-4-carbonsäure eignet sich besonders Tür die Herstellung des neuen Antibioticums in großen Mengen.

Dk Fermentation unter Verwendung des 7-(D-5-Arnino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure erzeugenden Mikroorganismus kann bei Temperaturen von etwa 20 bis 37° C durchgeführt werden. Zur Erzielung der besten Ergebnisse ist es jedoch am zweckmäßigsten, die Fermentation bei Temperaturen von 26 bis 30°C durchzuführen. Der pH-Wert des zum Züchten des Streptomyces Stammes NRRL 3802 oder NRRL 3585 und zur Erzeugung des Antibioticums geeigneten Nährmediums kann im Bereich von stwa 5 bis 9 variieren. Vorzugsweise arbeitet man jedoch bei pH-Werten von etwa 6,0 bis 7,5.

Zur Durchführung der Erfindung stellt man eine Zellensuspension her, indem man steriles Medium zu einer Agar-Schrägröhrchenkultur eines 7-(D-5-Amino - 5 - carboxy valeramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl )-7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure erzeugenden Mikroorganismus zusetzt. Das Erzeugnis der Schrägröhrchenkultur wird dann zur Beimpfung eines Saatkolbens verwendet, und der Saatkolben wird 1 bis

3 Tage bei 28° C geschüttelt, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Dann wird der Saatkolben zur Beimpfung der Produktionskolben verwendet. Man kann den Saatkolben auch mit einer gefriergetrockneten Kultur oder einem eingefrorenen Impfgut beimpfen.

Die Beimpfung wird im allgemeinen mit 1 ml je 40 ml Produktionsmedium durchgeführt. Dann wurden die Zusätze in den gewünschten Konzentrationen nach der erforderlichen Wartezeit in die Produktionskolben eingegeben, und die Fermentation wird 2 bis

4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung der Temperatur von etwa 28°C durchgeführt. Alle Produktionskolben, d.h. diejenigen Kolben, die die Zusätze enthalten, und diejenigen Kolben, die für die Leerversuche verwendet werden, werden dann, im allgemeinen nach 96 Stunden, analysiert, um die Menge an Antibioticum zu bestimmen, die sich in jedem Kolben gebildet hat.

Das Antibioticum 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy-3-cephem-4-carbonsäure wird zweckmäßig nach der Scheiben-Plattenmethode unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 als Testorganismus analysiert. Man verwendet Scheiben von 9,5 cm Durchmesser. Die Aktivität des Antibioticums wird in y/ml freier Säure ausgedrückt. Aus Lösungen von bekannten Konzentrationen an dem Antibioticum wird eine Standardkurve erstellt.

Dann werden die Produktionskolben analysiert, indem man die Probe mit 0,02molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Der Testorganismus ist Vibrio percolans ATCC 8461, und als Analysenmedium verwendet man einen Nähragar aus 3 g Rindfleischextrakt, 5,0 g aus Collagen gewonnenem Pepton, 5,0 g Agar und 11 Wasser H- 0,2% eines Hefeextraktes aus 2%igem wasserlöslichem Anteil autolysierter Hefe. Die Scheiben werden in eine genormte Lösung des Antibioticums getaucht, die 5 γ des Antibioticums je Milliliter enthält, und abwechselnd mit der Probe auf die Platte gelegt. Die Platten werden 18 Stunden bei 37°C inkubiert, worauf man die Zonendurchmesser in Millimeter bestimmt. Es werden fünf Normplatten verwendet, die vier Konzentrationen des genormten Antibioticums von 2,5 bis 20}>ml enthalten. Die

ίο Analyse wird mit Hilfe eines Nomogramms berechnet, und die Ergebnisse werden in y/ml freier Säure angegeben.

Das Antibioticum läßt sich aus dem Fermentationsmediuai nach verschiedenen Verfahren gewinnen.

Man kann die filtrierte Fermentationsflüssigkeit durch eine oder mehrere Ionenaustauschersäulen hindurchleiten. Da das Antibioticum eine amphotere Verbindung ist, kann man sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschharzen arbeiten, um die beste Gewinnung zu erzielen. Das adsorbierte Antibioticum wird dann, vorzugsweise mit einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Pyridin, das sich leicht entfernen läßt, elujert.
I ist eine amphotere Verbindung mit einem schein-

baren isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert von etwa 3,5 und ist in Lösung bei pH-Werten von 1,5 bis 9,0 beständig.

Das Antibioticum der Strukturformel I und seine Salze sind nicht nur gegen Penicillinase, sondern auch

gegen die Cephalosporinasen beständig. Diese Verbindung hemmt das Wachstum von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen und weist eine erhöhte Aktivität gegen gram-negative Mikroorganismen auf. Zum Unterschied von Cephalosporin C, das eine verhältnismäßig geringe antibakterielle Aktivität besitzt, zeigen die Produkte der Erfindung eine beträchtliche Aktivität in vivo gegen gram-negative Mikroorganismen mit einer Stärke, die im allgemeinen höher ist als diejenige von Cephalothin. Zu dieser

Aktivität gehört die Wirksamkeit in vivo gegen Proteus morganii und außerdem Wirksamkeit gegen die folgenden gram-negativen Bakterien: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae AD, Klebsieila

pneumoniae B und Paracolobactru arizonae.

Beispiel 1

Eine Agar-Schrägröhrchenkultur von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wird mit 10 ml steriler abgerahmter Milch versetzt. Die Suspension der abgerahmten Milch wird in einzelnen sterilen Reagensgläsern gefriergetrocknet; jedes Glas enthält 0,1 bis 0,2 ml der Suspension. Die gefrergetrocknete Kultur wird verwendet, um einen mit Umlenkorganen ausgestatteten 250-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen,

der 40 ml eines Saatmediums enthält, welches aus lprozentiger primärer Hefe in destilliertem Wasser besteht.

Der Saatkolben wird zwei Tage in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 220 U/min und einem Hub von 4 cm bei 28° C bebrütet. Für die zweite Aussaat setzt man 1,0 ml der obigen Kultur zu einem synthetischen Medium zu, welches die gleiche Zusammensetzung hat wie das synthetische Produktionsmedium, und inkubiert, wie oben, zwei Tage.

Zu einem jeden von acht 250-ml-Erlenmeyerkolben, von denen jeder 40 ml steriles Medium der folgenden Zusammensetzung:

Synthetisches Produklionsmedium

Glucose 5,0%

Mononatriumglutamat 0,425%

Dikaliumphosphal 0,2%

Ammoniumchlorid 0,1 %

NaCI 0,05%

MgSO₄ 7H₂O 0,05%

CaCO₃ 0,025%

i-Inosit 0,02%

FeSO₄ 7H₂O 0,0025%

ZnSO₄ 7H₂O 0,001%

MnSO₄ H₂O 0,0005%

p-Aminobenzoesäure 0,000001%

in Wasser bei einem pH-Wert von 7,0 enthält, setzt man 1,0 ml der, wie oben beschrieben, hergestellten zweiten Aussaat zu. Nach 30stündigem Inkubieren wird eine wäßrige Lösung hergestellt, die so viel Na₂S₂O₄ (Natriumdithionil) oder Na₂S₂O₃ (Natriumthiosulfat) enthält, daß die Konzentration an dem betreffenden Salz 0,1% beträgt, und diese Lösung wird auf sechs Kolben verteilt. Dann inkubiert man weitere 66 Stunden bei 28" C in einer mit 220 U/min umlaufenden Schültelmaschine bei einem Hub von 5 cm. Der Inhalt eines jeden Kolbens wird 3 Minuten mit 8500 U/min zentrifugiert und die Flüssigkeit von den Feststoffen dekantiert. Die überstehende Flüssigkeit wird mit Hilfe von Vibrio percolans ATTCC 8461 als Testorganismus analysiert. Die Analysen der Flüssigkeiten sind nachstehend angegeben:

Versuch

Kolben

1 (Leerversuch)

I (Leerversuch)

2
3

Zusatz

keiner

0,1% Na₂S₂O₃

0,1% Na₂S₂O₄

keiner

0,!% Na₂S₂O₃

0,1% Na₂S₂O₄

Erzeugung

an freier

Säure

36
56
50

40
54
56

Beispiel 2

Kolben	Zugesetztes Na₂S₂O₃	Erzeug an freier
	%	y/ml
1 (Leerversuch)	keines	33
2	0,05	51
3	0,10	57
4	0,20	59
5	0,40	62
6	0,80	56
7	1,2	51
8	1,6	43

Beispiel 3

Die folgende Fermentation wird nach dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren durchgeführt, wobei man jedoch den Zeitpunkt des Zusatzes des Na₂S₂O₃ bzw. die Menge des zugesetzten Na₂S₂O₃ variiert, um die günstigsten Bedingungen für eine erhöhte Erzeugung des Antibioticums aufzuzeigen:

35 Zusätze

! keine (Leerversuch)

Na₂S₂O₁ nach

2. 0 Stunden

3. 30 Stunden

4. keine (Leerversuch)

Na₂S₂O₃ nach

5. 0 Stunden

6. 30 Stunden

Erzeugung an freier Säure, y/ml Zugesetzte Menge Na₂S₂O₃, %

0	0,05	0,10	0,2	0,4
39
	34	0	0	0
	70	74	70	84
28
	12	0	0	0
	49	45	49	54

7. keine (Leerversuch)

8. 0,4% Na₂S₂O₃ ...

9. keine (Leerversuch)
10. 0,4% Na₂S₂O₃ ...

Zeitpunkt des Na₂S₂U₃-ZuSiUZeS Stunden

kein Zusatz

43

52

24

33

10

30

74

60

71

80

54

48

79

4°

45

Beispiel 4

Die folgende Fermentation wird ausgeführt, um den Vorteil der Verwendung einer Kombination von Na₂S₂O₃ und DL-a-Aminoadipinsäure (AAA) als Zusatz zu dem oben beschriebenen Fermentationsmedium zu erläutern.

Nach Beispiel I hergestellte Kolben, die Produktionsmedium und die Saat des Mikroorganismus enthalten, werden nach 30stündiger Inkubation mit Na₂S₂O₃ in den folgenden Konzentrationen versetzt. Nach weiterer 66stündiger Inkubation wird die Fe^rmentationsflüssigkeil, wie oben beschrieben, analysiert, wobei man die folgenden Ergebnisse erhält:

55

60

Versuch	Kolben
I	1
	2
	3
2	1
	2
	3
3	1
	2
	3
	4
4	1
	2
	3
	4

Zusätze nach 30 Stunden

Erzeugung

an freier

Säure

,/ml

keine (Leerversuch)

0,4% Na₂S₂O₃

0,4% Na₂S₂O₃ + 0,01 % AAA

keine (Leerversuch)

0,4% Na₂S₂O₃

0,4% Na₂S₂O₃ + 0,01 % AAA

keine (Leerversuch)

0,4% Na₂S₂O₃

0,1% AAA

0,4% Na₂S₂O₃ + 0,01 % AAA

keine (Leerversuch)

0,4% Na₂S₂O₃

0,01% AAA

0,4% Na₂S₂O₃ + 0,01 % AAA

120

Beispiel 5

Die folgenden Untersuchungen werden mit einem komplexen organischen Medium als Fermcntations-

682/454

medium durchgeführt. Das Saatmedium wird nach Beispiel 1 hergestellt. Ein 2,5%iges Impfgut aus der ersten Aussaat wird einem zweiten Aussaatkolben zugesetzt, der 2%iges Hefeautolysat von einem pH-Wert von 7,0 enthält.

Nach 48sliindiger Inkubation in der zweiten Saatstufe verwendet man 1 ml, um einen jeden, 40 ml komplexes organisches Medium enthaltenden Kolben zu beimpfen. Dieses Medium hat die folgende Zusammensetzung:

Komplexes organisches Medium

Primäre Trockenhefe 10 g

lösliche Schlempebestandteile 30 g

Glycin 0,5 g

L-Phenylalanin 3 g

Maisstärke 20 g

Schaumverhüturigsmittel aus 40,5% Paraffinwachs, 4,5% ölsäure und

55,0% Wasser 2,5 ml

Mit Wasser aufgefüllt auf 1000 ml

Der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt.

Zu diesem Medium wird das Zusatz in den nachstehend angegebenen Konzentrationen hinzugefügt. Die Gesamtfermentationsdauer beträgt 96Stunden; die Analyse wird, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind die folgenden:

	Zusätze	Erzeugung von 842A, j./ml	it des 0	Zusaü 24	es, Sl 48	uiulcn 72
Kolben	Leerversuch	Zeilpuii kein Zusatz
1	0,005% Nh₂S₂O₃	183	180	233	171	175
2	0,01% Na₂S₂O₃		208	230	222	191
3	0,05% Na₂S₂O₃		226	256	241	176
4	0,10% Na₂S₂O₃		217		241	184
j 6

Stufe B: Saatsystem

Die Schrägröhrchenkulturen der Stufe A werde zum Beimpfen von 100 ml Saatmedium der folgend« Zusammensetzung verwendet:

Glucose i 5,0 g

Sojabohnenmehl 15,0 g

Maisquel!wasser 5,0 g

Calciumcarbonat 2^0 g

Natriumchlorid [[[[ 5^0 g

Mit entmineralisiertem Wasser aufgefüllt auf 101

Dieses Medium wird mit Natronlauge auf cinei pH-Wert von 6,7 eingestellt. Dann wird das Saat ^m? ^,f,^{8 Slunden be}i 28°C unter Schütteln in eine mit 220 U/mm umlaufenden Taumel-Schüttelmaschim mit einem Hub von 5 cm inkubiert.

Stufe C: Erzeugung des Antibioticums

^!'?n^{ml im}P^f8^{ut aus} der Saatstufe wird verwendet um 40 ml Produktionsmedium in 250-ml-Erlenmcyer kolben zu beimpfen. Dieses Medium hat die folgendi Zusammensetzung:

Medium I

Stärke 4 8°<!.

lösliche Schlempebestandteile 0,5",,

Sojabohnengrütze .. 2 1 %

hydrolysiertes Casein

(N — Z-Amin, Typ A)... 0 5" ι

Eisen(II)-su!fat-heptahydrat 0 0ΓΌ

Mit Leitungswasser aufgefüllt auf ... {fi\

u^Du/^{Se LÖSUnß wird mit} Natronlauge auf ,-inen pH-Wert von 6,5 eingestellt, auf 250-ml-Erlennvyerkolben verte.lt und durch 15 bis 20 Minuten langes FnHf!^{1 auf} _r'f^C bei 1,05 kg/cm* sterilisier; Die S^*™«¹^ "be·" einen Zeitraum von vier

be, 28 C in der Schüttelmaschine bei 220!
und einem Hub von 5 cm

Wenn die Fermentation beendet ist, werde
Zellen abzentnfugiert, und die Fermentations.'!

agen min

Beispiel 6

Zusatz von Natriumthiosulfat; abgeändertes Fermentationsverfahren

S t u fc A: Sch rägröh rchen

Ein gefriergetrocknetes Glas mit einer Kultur von Streptomyces clavuligerus (NRRL 3585) wird aseptisch geöffnet und der Mikroorganismus auf Agar-Schrägröhrchen der folgenden Zusammensetzung übertragen:

Dextrin 10,0 g

Hefeextrakt 1,0 g

hydrolysiertes Casein

(N-Z-Amin, TypA) 2,0g

Rinderextrakt 1,0 g

Agar 20,0 g

Mit entmineralisiertem Wasser aufgefüllt auf 1,01

Der pH-Wert dieses Mediums wird mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Die Schrägröhrchen werden dann 7 Tage bei 28°C inkubiert und in der Kälte aufbewahrt.

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dem

- (carbamoyloxymethyl) - 7 - meilu.xy- -4- carbonsäure in der Fermeni.Kionswird nach der biologischen Scheibeii;ina-.... .^bestimmt. Als Testorganismus vei ^en-Vibrio Dercolans (ATCC8461). Filterp.pierin verdünnte Fermentations!! üssig- und auf agarhaltige Petrischale,, aufrestorganismus Vibrio perc-.lans worden sind. Ferner weiden Scheiben aufgelegt, die zuvor mit bekannten Konzentratio^s getaucht worden sind Die Nacht bei 28°C inkubiert und der Hemmungszonen verzeichnet, η des Antibioticums in der Fermendurch Interpolieren aus der die die Beziehung zwischen szonendurchniesser und bekannten

Si«"«ngHonendurchaieseer und bekannten ticumianih^M ft ^Norn»>ösungen des An.ibiodaß StA ^Ch f^1CSem Erfahren wird berechnet, SS^ ^day.^uIi««i· NRRL 3583 in dem ¹?¹¹¹¹ ™ Mute! 749 ,./ml -carboxyvaleramidoJ-a-icarbamoyl-

7-(D 5

11

oxymethyO^-methoxy-S-cephem^-carbonsäure erzeugt.

Stufe D: Zusatz von Natriumthiosulfat

Durch Zusatz von Natriumthiosulfat zu dem Medium I in Stufe C wird die Ausbeute an 7-{D-5-Amino- - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephcm-4-carboi.isäure bedeutend erhöht. In Tabelle I ist das Ausmaß dieser Erhöhung für einen Bereich von verschiedenen Konzentrationen angegeben. Der Leerversuch wird gemäß den oben beschriebenen Verfahrensstufen A bis C durchgeführt, und die übrigen Versuche werden in gleicher Weise, aber unter Zusatz der angegebenen Mengen an Natriumthiosulfat vom Zeitpunkt 0 bis 48 Stunden durchgeführt. Die Zeit Null bedeutet, daß das Natriumthiosulfat etwa zur Zeit der Beimpfung mit der Saat aus der Stufe B zugesetzt wird. Die Analysen werden, wie in Stufe C beschrieben, durchgeführt.

Tabelle I

Versuch

Kolben

2
3

2
3
4
5
6

2
3
4

2
3
4
5

1
2
3
4

Zeitpunkt

des Zusatzes

Stunden

Leerversuch

Stunden

Leerversuch

Stunden

Leerversucli
Stunden
Stunden
Stunden

Leerversuch
Stunden
Stunden
Stunden
Stunden

Leerversiich
Stunden
Stunden
Stunden

Leerversuch
Stunden

Zugesetztes Thiosulfat

0,10

0,20

0,40

0,10

0,10
0,20
0,40

0,10

0,20

0,40

0,60

0,10
0,20
0,40

0
0,20

Antibiotikum erzeugung

v/ml

721 865 828

755

991

1163

856

1120

1095

748

936

845

1023

658

945

1154

1150

1162

891 1211 1291 1133

766 995

Die Ergebnisse der Tabelle I zeigen, daß der Zusatz von Natriumthiosulfat die Erzeugung des Antibioticums in sechs Versuchen im Mittel um 40% erhöht. Weder der Zeitpunkt des Zusatzes noch die Konzentration an Thiosulfat scheint besonders ausschlaggebend zu sein.

Beispiel 7

Zusatz von Natriumthiosulfat und/oder
L-a-Aminoadipinsäure

Bei diesem Versuch arbeitet man nach Beispiel 6 mit dem Unterschied, daß die dort angegebenen Konzentrationen an Natriumthiosulfat durch du folgenden Konzentrationen an L-a-Aminoadipinsäun allein bzw. an Natriumthiosulfat in Kombinatior mit L-a-Aminoadipinsäure (L-AAA) erset2:t werden Die Zusätze erfolgen zu dem Impfgut des Beispiels 6 Stufe C, vor der Inkubation.

Tabelle II

Kolben Nr.	Zusatz an Na₂S₂O₃ und L-AAA	Antibioticum erzeugung )'/ml
1 2 3 4 5 6	keiner (Leerversuch) 0,025% L-AAA 0,050% L-AAA 0,20% Na₂S₂O₃ 0,20% Na₂S₂O₃ + 0,025% L-AAA 0,20% Na₂S₂O₃ + 0,05% L-AAA	766 833 880 995 1051 1195

Die Ergebnisse zeigen, daß der kombinierte Zusatz von Natriumthiosulfat und L-a-Aminoadipinsäure (L-AAA) die Erzeugung des Antibiotikums 7-(D-5-Amino - 5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl)-7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure stärker beschleunigt als der Zusatz von Natriumthiosulfat allein. Der Zusatz eines Gemisches aus 0,20% Na₂S₂O₃ und 0,05% L-a-Aminoadipinsäure erhöht die Ausbeute an 7 - (d - 5 - Amino - 5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl) - 7 - methoxy - 3 - cephem - 4 - carbonsäure am wirksamsten.

Beispiel 8

Zusatz von Natriumdithionit

Man arbeitet nach Beispiel 6, jedoch in Stufe D mit Natriumdithionit (Na₂S₂O₄) an Stelle des Natriumthiosulfat. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen an Natriumdithionit und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an dem Antibioticum angegeben.

Tabelle III

	Zeitpunkt	Antibioticum-
Na₂S₂Q₄	des Zusatzes	erzeugung
%	Stunden	r/m\
Keines	0	703
(Leerversuch)
0,025	0	0
0,050	0	0
0,025	24	835
0,050	24	763
0,025	31	793
0,050	31	738

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Natriumdithionit die Synthese des Antibioticums erhöht, wenn es 24 bis 31 Stunden nach der Beimpfung zugesetzt wird; wenn man die Verbindung jedoch zu Beginn der Fermentation zusetzt, hemmt sie das Wachstum des Mikroorganismus.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 7-(D-5-Amino-5 - carboxyvaleramido) - 3 - (carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäurc durch aerobe Fermentation von Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 oder Streptomyces clavuligerus NRRL3585 in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmediurn Natriumthiosulfat, Natriumdithionit oder a-Aminoadipinsäure für sich allein oder in Kombination zusetzt.