DE2219993A1 - Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

EDWARD MEYEES, East Brunswick, New Jersey, V.St*A,, und WIJjLIAM IAWEENOE PAEKER, North Brunswick,. New Jersey, V,St.A.

"Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Priorität; 27. April 1971, V.St.A., Nr. 137 894 und

7. April 1972, V.St.A., Kr. (noch nicht bekannt)

Die Erfindung betrifft neue Antibiotika der allgemeinen Bezeichnung EM-49 und Verfahren zu ihrer Herstellung und Trennung in einzelne Bestandteile. ■ .

Die Antibiotika werden durch Züchten des Mikroorganismus Bacillus circulans AIGO 21656 in einer wäßrigen Nährlösung mit einem Gehalt an einer-assimilierbaren Kohlencydratguelle und einer assimilierbaren Stickstoffquelle unter aeroben Submersbedingungen erhalten, bis sich in der Lösung eine beträchtliche antibiotische Aktivität aeigt.

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INSPECTED

_ ρ —

Die Fermentationsbrühe v;ird angesäuert, und die Feststoffe werden abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die Waschwässer v/erden mit dem FiI tr at vereinigt. Diese Lösung wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, vorzugsweise n-Butanol, extrahiert. Die alkoholische Lösung wird eingeengt und das Antibiotikum mit einem organischen Lösungsmittel, wie-Äthylacetat, Acetonitril, Äther oder vorzugsweise Aceton, ausgefällt. Das erhaltene Produkt kann mittels Gegenstromverteilung in einem Wasser-Alkohol-organische' Säure-System, z.B. n-Propa.ij.üo.-n-Butanol-Wasser-EssigGäure, oder durch Bildung des Methylorangesälzes (Helianthat) und Wiedergewinnung des Antibiotikums/aus diesem Salz vielter gereinigt werden.

Diese Verfahrensschritte ergeben bei der Isolierung des Produkts ein Antibiotikum, das als EM-if9 bezeichnet wird, als Säuresalz entsprechend der bei der Ansäuerung der Brühe verwendeten Säure, Das Salz kann in die freie Base durch Neutralisieren mit einer Base, wie Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid oder Bariumhydroxid, und Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, wie n-Butanol, überführt werden.

Das auf diese Weise erhaltene Antibiotikum EM-^9 ist eine gegen Mikroben aktive Substanz, die die nachstehend beschriebene Aktivität besitzt. Durch verfeinerte Auftrennungsverfahren, wie sie nachstehend beschrieben werden, kann dieses Antibiotikum EM-i.|-9 in vier Fraktionen, die strukturell nahe

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■ι _ ' '

verwandte aktive Substanzen enthalten, und eine fünfte aktive Fraktion aufgetrennt γ/erden, die strukturell eine nicht so nahe verwandte aktive Substanz enthält.

Fig. 1 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf 9 als Hydrochlorid in .KBr.

Fig. 2 zeigt das 100 MHz-WMR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 als Hydrochlorid in Dirne thylsulf oxid-d^-.

Fig. 3 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 in KBr*

Fig. Zf zeigt das 60 MIIz-iMR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 in Dimethylsulfoxid-dg·

Fig. 5 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 ^o in KBr.

Fig. 6 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 ß in KBr. Fig. 7 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 # in KBr. Fig. 8 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 h in KBr,

Fig. 9 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums EM-Zf9 SMF in KBr. ' ' ·

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Das Antibiotikum EM-i+9 und die daraus erhaltenen Fraktionen sind wirksam gegen Fungi und gramnegative und grampositive Bakterien, z.B. Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans. Die Antibiotika oder deren physiologisch unbedenkliche Salze können als Mittel gegen Mikroben entweder als äußerlich anzuwendendes Desinfektionsmittel, z.B. als Spray oder Staub, mit einem Gehalt bis zu etwa λ% der Aktivsubstanz in einem üblichen Trägermaterial, oder zur Bekämpfung von Infektionen aufgrund der vorgenannten Mikroorganismen bei zahlreichen Tierarten, z.B. lokal in einer üblichen Creme oder Salbe mit einem Gehalt bis zu \% Aktivsubstanz oder in einer injizierbaren Dosierungsform von etwa 50 bis 125 mg/kg/ Tag, verwendet werden. Die ED™ bei Mäusen, z.B. gegen eine letale Escherichia coli-Systeminfektion liegt bei annähernd 50 mg/kg.

Der für die Herstellung des Antibiotikums EM-49 wertvolle Mikroorganismus ist ein aus dem Boden isolierter Stamm des Bacillus circulans. Eine Weiterzüchtung dieses Organismus kann aus der Sammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (USA), unter der Hinterlegungsnummer ATCC 21656 erhalten werden. '

Die Charakteristika des Bacillus circulans ATCC 21656 sind folgende:

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Mikroskopisch: Sporenbildender Bazillus, der gramvariabel bis gramnegativ ist. Sporen sind zentral- oder fast zentral, oval; die Sporenwand ist dick und leicht fleckig; der Sporenträger ist fest umrissen angeschwollen. Die Stäbchen sind nicht·in Ketten angeordnet. Mit 0,5%iger basischer Fuchsinlösung angefärbte Abstriche zeigen eine schwache Ver-■ kapselung.

Makroskopisch: Kolonien auf Glucose-Agar sind glänzend mit glatten oder gelappten Kanten, Die Kolonien «ind zusammenhängend und sehr schleimig; beweglich, sich rasch über die Oberfläche des Agars ausbreitend, insbesondere, wenn die Platten feucht sind. - In der Nährlösung ist die Trübung hellfarbig mit einem starken Sediment. Es bildet sich ein dicker.schleimiger .Belag aus, der die Nährlösung buchstäblich abschließt. . . .

Physiologisch: Der Voges-Proskauer-Test für die Erzeugung von Acetylmethylcarbinol ist negativ. Die Indolerzeugung ist negativ. Stärke wird stark hydrolysiert, da es ein Casein ist. Aus Kohlenhydraten wird kein Gas gebildetj obwohl der Organismus wächst und auf einem anorganischen Medium¹ mit Glucose, Saccharose oder Xylose als einzige Kohlenstoff quelle Säure bildet. Bei 60 bis 65°C .,findet kein Wachsturn statt.

Der Bacillus circulans ATCC 21656 erzeugt ein Antibiotikum, das eine Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakte-

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rien und Fungi, wie Candida albicans, besitzt. Zur Bildung des Antibiotikums wird nach einer bevorzugten Ausführungsforni Bacillus circulans ATCC 21656 bei etwa 25°C unter aero-, ben Submersbedingungen in einer wäßrigen Nährlösung mit einem Gehalt an einer assimilierbaren Kohlenhydrat- und Stickstoffquelle gezüchtet. Die Fermentation dauert annähernd 60 bis 150, vorzugsweise etwa li|4 Stunden. Danach hat sich das Antibiotikum gebildet.

Nach Beendigung der Fermentation wird die Brühe mit Säure, wie konzentrierter Salzsäure, auf den pH-Wert 2 eingestellt. Zur angesäuerten Fermentationsbrühe wird ein Filtrierhilfsmittel gegeben und dann die gesamte Suspension filtriert. Die Feststoffe werden mit reichlich Wasser gewaschen. Die Waschwässer werden mit dem Filtrat vereinigt. Die ausgewaschenen Feststoffe werden verworfen. Das Filtrat, wird zusammen mit den Waschwässern mit wassergesättigtem n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 2f5°C auf ein geringes Volumen eingeengt. Das Konzentrat wird dann mit dem 15-fachen Volumen Aceton verdünnt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird mit Aceton, Äthylacetat und Äther gewaschen und liefert nach dem Trocknen ein hellbraunes Pulver. Vas rohe Antibiotikum wird durch

Gegenstromverteilung unter Verwendung von n-Propanol-n-Butanol-Wasser-Essigsäure im Volumenverhältnis von 5Ο:75ί100:2

Trennstufen weiter gereinigt. Das nach 29 / durch Gegenstromverteilung

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** -i r.

erhaltene Material wird zur Charakterisierung des. Antibiotikum verwendet·

Das Antibiotikum EM-/f9 ist ein basisches Peptid und bildet mit zahlreichen anorganischen und organischen Säuren Salze. Da' das bevorzugte Herstellungsverfahren die Ansäuerung der Fermentationsbrühe mit Säure umfaßt, wird das Antibiotikum in Form des Säuresalzes erhalten. Wenn die Fermentationsbrühe mit Salzsäure angesäuert wird, wird <itxrs Hydrochlorid erhalten« Wenn andere Säuren, z.B. andere Mineralsäuren, wie Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, verwendet werden, erhält man die entsprechenden Säuresalze, Die Salzform, in der das Antibiotikum zuerst erhalten wird, kann mit einer Base, wie Natriumhydroxid, neutralisiert werden, um die freie Base zu erhalten. Gegebenenfalls kann die freie Base in andere Säuresalze durch Behandlung mit Essigsäure, Propionsäure oder anderen organischen Säuren, oder mit Phosphorsäure überführt werden. Wasserunlösliche Salze, z.B. von Arylsulfonsäuren, wie 2-Naphthalinsulfonsäure, Methylorange oder

p-Phenylaaobenzolsulfonsäure, können durch Umsetzen eines Säuresalzes des Antibiotikums EM-Zf9, wie dem Hydrochlorid, mit einem Alkalimetallsalz der Arylsulfonsäure gebildet werden,

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Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums EM-if9 erfolgt mittels des Methylorangesalzes. Das hellbr.aune Pulver, das, wie vorstehend ausgeführt, durch Ausfällung mit Aceton aus dem Konzentrat erhalten worden ist, wird mit einer wäßrigen Lösung von Methylorange behandelt, wobei das Methylorangesalz als amorphes Pulver ausfällt, das durch Wiederausfällung aus Dimethylformamid oder einem Gemisch von Methanol und Acetonitril gereinigt, wird. Eine Behandlung mit Salzsäure überführt das Methylorangesalz in das Hydrochlorid._

Das vorstehend genannte hellbraune, in Aceton unlösliche Pulver enthält das Antibiotikum EM-^9»' das, wie beschrieben, gereinigt und in dieser gereinigten Form verwendet werden kann. Das gereinigte Pulver enthält nahe verwandte Peptidantibiotika, die gegebenenfalls durch Ionenaustauschchromatographie getrennt werden können.. Kennzeichnend für alle diese Antibiotika sind vier freie Aminogruppen,,

Wenn eine wäßrige Lösμng des über das vorstehend beschriebene Methylorangesalz erhaltene* Antibiotikum EM-^-kydr ο Chlorids an einer Säule, von Carboxymethylcellulose in der Natriumform, z.B. "Whatman cellulose €M-52", chromatographiert wird und wenn man mit verdünnter JNatriumchloridlosung eluiert, trennt sich das Antibiotikum in vier Fraktionen auf, wie durch Oberflächenspannung des Eluats überprüft wird. Diese Frak-

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tionen werden als Antibiotikum EM-Zf9o6, Antibiotikum EM-49 ß, Antibiotikum EM-49 X und Antibiotikum EM-Zf-9 S in der Reihenfolge ihrer Eluierung bezeichnet. Die verschiedenen Fraktionen lassen sich durch ihre Aminosäurezusammensetzung .und durch Unterschiede in der Struktur der Fettsäureanteile unterscheiden. Eine Aminosäureanalyse zeigt an, daß die Anti-" biotika EM-4906 und EM-49 β fünf 2, if-Diaminobuttersäure- und drei Leucin-Reste, aber kein Phenylalanin enthalten. Die Antibiotika EM-Zf9 y und EM-i+9 & enthalten ej nen Phenylalaninrest, zwei Leucin-Reste und fünf 2,^-Diaminobuttersäure-Reste, Die Antibiotika Wi~L\9ot- und EM-i)-9 ß unterscheiden sich in den Strukturen der Fettsäuren, die bei einer Säurehydrolyse freigesetzt v/erden. Die Antibiotika EM-49 ä' und EM-if-9 & unterscheiden sich in der gleichen V/eise voneinander.

Die chromatographische Auftrennung des in Aceton unlöslichen Pulvers in bestimmten Systemen zeigt zusätzlich zu EM-/f9 eine langsam laufende Fraktion (SMF), die ebenfalls ein breites Wirkungsspektrurn gegen Mikroorganismen besitzt. Diese Fraktion wird durch Extraktion mit n-Butanol mit anschließender Chromatographie an Diäthylaminoäthylcellulose und wiederholter Trennungschromatographie an einer Siliciumdioxid-Cellulo-' se-Säule und Eluieren .mit einem n-Butanol-Isobuttersäure-Pyridin-V/asser-Gemisch im Verhältnis Zj.O:9iZf:lO isoliert und. gereinigt. Gegebenenfalls kann das" Antibiotikum EM-i+9 SMF durch Chromatographie des in Aceton^ unlÖsliphen.Pulvätfifc jan .einem al-

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kylierten vernetzten Dextran ("Sephadex LH20") und Eluieren mit Methanol isoliert und gereinigt werden. Das Antibiotikum EM-if9 SMF kann sehr leicht durch Bildung des kristallinen Eeinecke-Salzes isoliert werden, das als ein purpurfarbener kristalliner Feststoff erhalten wird.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Hefebouillon-Schrägagar wird mit Bacillus circulans ATCC 21656 besät. Der Agar wird etwa 15 Stunden bei 37°C bebrütet und dann zur Beimpfung von 50 ml einer wäßrigen Sojabohnen-· mehlflüssigkeit in einem 250 ml-Erlenmeyer-Kolben verwendet. Die Zusammensetzung der Nährflüssigkeit ist wie folgt:

Nährflüssigkeit ' Menge

. _| ι- . ■ ¹J ι _ . . 1 . 1 ... 1 1 H ίι "

Sojabohnenmehl 15,0 g

entwässerter Kartoffelbrei 15,0 g

Glucose 50,0 g

CoCl₂*2H₂O , 0,005 S

CaCO ' 10,0 g

Destilliertes Wasser ad 11

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Diose Flüssigkeit wird vor der Verwendung 30 Minuten bei 121⁰C und einem Dampfdruck von 1,05 kg/cm sterilisiert. Die beimpften Erlenmeyer-Kolben werden 72 Stunden bei 25 C auf einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bebrütet, die mit 280 Umdrehungen je Minute und einem Hub von etwa 5 cm arbeitet.

Eine 2,5 vol.-%ige Überführung wird von dem Bebrütungskolben zu 500 ml-Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, die jeweils 100 ml eines wäßrigen Maisquellwassermediums der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Medium Menge

Maisquellwasser 6|0.g

(HH^)H₂PO₄ 3,0 g

'Hefeextrakt 2,5 g

Dextrose 10,0 g

Destilliertes Wasser ' ad 11

Einstellen des pH-Wertes auf · "

7,0 nit CaCO₃ Z,5 S

Die Fermontationskolben werden unter den gleichen Bedingungen bebrütet und geschüttelt wie die Keimungskolben. Nach 3 und 6 Tagen werden Proben entnommen, die mittels Papierchromatographie und einer Erprobung am lebenden Tier geprüft worden. Für die Papierchromatographie werden ent-

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sprechende Mengen eines Butanolextraktes der angesäuerten Brühe auf Blätter von "WIi at man Nr. 1 "-Papier aufgebracht und das Chromatogramm mit einer Lösung.der folgenden Zusammensetzung entwickelt: n-Butanol,, Essigsäure und Wasser im Volumenverhaltnis AfJ 1*5· Die obere Phase dieses Lösungsmittelsystems wird als Lösung verwendet» In diesem System hat das Antibiotikum EM-49 als Hydrochlorid einen R„-Wert von 0,71. Das Antibiotikum wird durch Biοaut-οgraphie gegen Staphylococcus aureus PDA 209P und Escherichia coli ATCC IO536 nachgewiesen. Zur Erprobung am lebender. Tier werden beide Organismen in üblichen Röhrchenverdünnungsversuchen verwendet.

Beispiel 2\

Ein 25O 1-Ansatz von Bacillus circulans ATCC 21656 wird in einem 38Ο 1-Gefäß aus rostfreiem Stahl in folgendem Medium und unter den nachstehenden Bedingungen fermentiert:

Stufe 1:

Beimpfung: Eine Kultur von Bacillus circulans ATCC 21656 wird durch Lagerung in flüssigem Stickstoff konserviert und bei Bedarf auf Hefebouillon-Schrägagar der, nachstehenden Zusammensetzung gezüchtete

Nährflüssigkeit Menge

Fleischextrakt 1,5 S

Hefeextrakt 3,0 g

. Pepton . 6,0 g

Dextrose 1,0. g

Agar 15,0 g

Destilliertes Wasser ad 11

Vor der Verwendung wird die Nährflüssigkeit 15 Minuten bei C bei einem Druck von 1,05 kg/cm sterilisiert.

Der Wuchs auf dem Schrägagar wird zur Beimpfung der ersten Keimungskolben mit der nachstehenden, 30 Minuten'bei 121⁰C sterilisierten Nährflüssigkeit verwendet:

Nährflüssigkeit Menge

ml dieser Nährflüssigkeit in einem 5CO ml-Erlenmeyer-Kolben werden 72. Stunden bei 25°C in einer sich drehenden

Sojabohnenmehl	15,0 g	I I . I
entwässerter Kartoffelbrei	• ' 15,0 g
Glucose	50,0 g
CoCl2'2H2O	0,005 g
CaCO, 3	10,0 g
Destilliertes V/asser	ad 1000 ml

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- Ak -

Schüttelvorrichtung bebrütet. Die Schüttelvorrichtung wird mit 28O Umdrehungen je Minute und einem Hub von 5 cm betrieben.

Stufe 2: ■ .

Beimpfung: 100 ml Flüssigkeit aus Stufe 1.

Nährflüssigkeit: Die gleiphe wie die Keimungsflüssigkeit der Stufe 1.

Die Impfflüssigkeit und. 1000 ml der Nährflüssigkeit in einem ZfOOO ml-Erlenmeyer-Kolben werden 72 Stunden bei 25°C in einer sich drehenden Schüttelvorrichtung bebrütet. Die Schüttelvorrichtung wird mit 280 Umdrehungen je Minute und einem Hub von 5 om betrieben.

Stufe 3:

Beimpfung: 3OOO ml Flüssigkeit aus Stufe 2.

Medium:

Medium Menge

Maisquellwasser · 6,0 g

(MH^)H₂EO₁₁₁ 3,0 g

Hefeextrakt 2,5 g

• Dextrose 10,0 g

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~ 15 -

Medium Menge

Destilliertes Wasser ■ ad . 1000 ml Einstellen auf pH-Wert 7,0

mit CaCO₃ . . 2,5 g

Die Impfflüssigkeit wird zu 250 1 des Mediums gegeben und 1/jif Stunden bebrütet,- Während der Bebr'ütung wird die Brühe mit einer oberflächlichen Luftgeschwindigkeit von 60 cm je Minute bei 0,7 kg/cm belüftet. Während dieser Zeit wird die Brühe mit einer Leistung " von 0,4 Watt Je Liter und mit 155 Umdrehungen.je Minute gerührt.

Beispiel 3

209 1 einer gemäß Beispiel 2 erhaltenen Fermentationsbrühe vferderimit 1,5 1 konzentrierter Salzsäure auf einen pH~Wert von 2,0 eingestellt. Zu der angesäuerten Brühe werden 15 kg eines Filtrierhilfsmittels ("Hyflo") gegeben. Das Gemisch wird filtriert. Man erhält Zf 1 kg unlösliches Material. Der unlösliche Kuchen wird mit 10 1 Wasser gewaschen. Die Waschwässer werden mit dem Filtrat vereinigt. Man erhält 190 1, Der ausgewaschene Kuchen (Zf1 kg) wird verworfen.

Beispiel k

190 1 des gemäß Beispiel 3 erhaltenen Filtrats werden dreimal mit 56 1 eines mit Wasser gesättigten n-Butanols extra-

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hiert. Die Butanolschichten (194 D werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur unter 45 C auf ein geringes Volumen (2,3 1) eingeengt.

Beispiel

Ein 50 ml-Anteil des gemäß Beispiel 4 erhaltenen Konzentrats v/ird mit 750 ml Aceton verdünnt. Der erhaltene Niederschlag wird abzeirfcrlfugiert, durch Suspendieren in 60 ml Aceton gewaschen und dann erneut zentrifugiert. Das Verfahren wird unter Verwendung von Äthylacetat (drei 60 ml-Anteile) und schließlich Äther (drei 60 ml-Anteile) wiederholt. Der Niederschlag wird an Luft getrocknet, pulverisiert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,4 g'eines hellbraunen Pulvers.

Beispiel 6

Eine 1,4 g-Probe des gemäß Beispiel 5 erhaltenen, in Aceton unlöslichen Pulvers wird durch Gegenstromverteilung unter Verwendung eines n-Propanol-n-Butanol-Wasser-Essigsäuro-Gemisches in Volumenverhältnis von ^O:75ϊ100:2 weiter gereinigt. Es werden 29 Trennstufen unter ,Verwendung von

, durchgeführt.

ZfO ml jeder Phase je Röhrchen . / · Die höchste Aktivität gemäß Bestimmung durch Papierblatt-Agardiffusionsversuch befindet sich im Röhrchen 11. Die Inhalte der Röhrchen

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8 bis 14 werden vereinigt, und die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt.· Der Rückstand wird in einer geringen Menge Methanol gelöst und das Antibiotikum durch Zugabe von Aceton und Äther ausgefällt. Der Fiederschlag wird gut mit Äther gewaschen und in Luft und danach unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält O,/f66 g eines hellbraunen Pulvers. Dieses Pulver ist in der Hauptsache das basische Peptid-Antibiotikum EM-Zj.9 in Form des HydroChlorids. In den unter diesen Bedingungen erzeugten Brühen ist kein Circulin nachgewiesen worden.

Analyse	45	■21 σι	Optische	Drehung Wasser	c=1,0 in
C:	7	,42 %	589 nm		-42Ϊ30
H:	14	1,86 (ionisch)^	• 57.8		-44
N:	1	546		-30
Cl:		436		-91

Das IR-Spektrum des Antibiotikums als Hydrochlorid in KBr ist aus Fig. 1 ersichtlich. Das 100 MHz-NMR-Spektrum des Antibiotikums als Ilydrochl.orid in Dimethylsulfoxid-dg ist aus Fig. 2 ersichtlich.

Die Papierchromatographie an "Whatman Nr. 1"-Filterpapier unter Verwendung der Bioautographie gegen E. coil ATCC 1-053.6-wird zum Nachweis des Antibiotikums verwendet. -.-._■

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Lösungsmittelsystera (Volumen) R„

n-Butanol-Essigsäure-Wasser (^:1:5) 0,71

n-Propanol~n-Butanol~Wasser (2:3^1-) 0,57

Chloroform-Methanol-Wasser (5:/+:2) 0,38

Chloroform-Methanol-]% ige Essigsäure (5:4*2) 0,35

Chloroform-Methanol-0,5n-M,0H (5:^:2) 0,91

Das Hydrochloric! des Antibiotikums EM-ii-9 schmilzt bei 180 bis 207⁰C (Zersetzung), unter vermindertem Druck. Es ist

löslich in Wasser, Methanol, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Essigsäure und unlöslich in Aceton, Äthylacetat, Äther und Acetonitril.

Durch 16-stündiges Erhitzen auf 110⁰C in 6n-HCl wird aus einer Probe von 2,30 mg des Antibiotikums EM-49-llydrochlorid, das nach dem vorstehenden Verfahren hergestellt worden ist, ein Hydrolysat erhalten, das nach Analysierung gemäß der üblichen Stein-Moore-Methode das Vorliegen von 3,95 Mikromolen Leucin und 7,35 Mikromolen 2,if-Diaminobuttersaure zeigt. In dem Hydrolysat werden auch 0,86 Mikromole Phenylalanin nachgewiesen. Ferner werden nur Spuren anderer Aminosäuren festgestellt. Weiterhin fehlen identifizierbare Mengen der Aminosäure Threonin, doch dient dies zur Unterscheidung des Antibiotikums EM-Jf9 von anderen Peptid-

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Antibiotika, wie Circulin, Polymyxinen und Polypeptin. Aus dem Hydrolysat wird durch Extraktion mit Äther eine noch nicht identifizierte Fettsäure erhalten, wobei die Anwesenheit von annähernd 10 Ge\'i.~% dieser Säure in dem Antibiotikum angezeigt wird. Das UV-Spektrum des Hydrochloride

■to/

in 0,05n-HCl zeigt ein schwaches Maximum bei 2Zj.8 nm (E =25) und eine Endabsorption. Die Intensität der Absorptionen bei 2Zf8 nm wird wahrscheinlich durch gefärbte Verunreinigungen erhöht, deren auslaufende Absorption bis ins sichtbare Gebiet reicht. Dieses Maximum und die Endabsorption beruhen zumindest teilweise auf der Phenylalanin-Komponente.

Beispiel 7

Das Hydrochlorid des Antibiotikums EM-Zf9 wird in die freie Base durch Gegenstromverteilung unter Verwendung eines n-Butanol-0,5ii-JNHkOH-Systems überführt. 1,01 g des gemäß Beispiel 6 hergestellten Hydrochloride des Antibiotikums EM-Zf9 werden in 29 Trennstufen einer Gegenstromverteilung unter Verwendung von jeweils ZfO ml einer oberen und unteren Phase je Röhrchen unterworfen ·. Die Inhalte der Röhrchen 25 bis 29 werden vereinigt. Die obere Phase wird abgetrennt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml warmem Methanol gelöst. Dann werden 50 ml Ä'thylacetat, 50 ml Benzol und 50 ml Cyclöhexan zugegeben. Nach dem Entfernen des Lösungsmittelgemisches unter

■ ' -20-209852/1158

verminderter D_ruck erhält man 0,75 G eines nahezu weißen Pulvers, das die freie Base des Antibiotikums ii'M-/|.9 ist. Diese Verbindung schmilzt bei 2.1+5 bis 2i+8°C in einem evakuierten Kapillarröhrchen.

Analyse: C: %,6ki H: 8,65; Ns 16,50; Cl: 0,0 V-

Das in A'thanol durch Ultrazentrifugierung bestimmte Molekulargewicht der freien Base beträgt annähernd 1O8O. Das Äquivalentgewicht durch Titrieren mit Perchlorsäure be-" trägt 272· Die empirische.Formel der freien Base ist annähernd Cr-. H₀-,W₁ -,O₁ „,

51 93 O 12

Das in Methanol aufgenommene UV-Spektrum hat zusätzlich zu einer starken Endabsorption die folgenden Maxima:

E¹

	5 (Schulter).	5,8.
252	(Schulter)	A-,5
258		A-, 1
265
268		3,2

Das IR-Spektrum in KBr ist aus Fig. 3 ersichtlich. Das 60 MHz-NMR-Spektriim in Dimethylsulfoxid-dg ist in Fig. Zf zu

sehen.

-21-

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ORtGfNAL INSPECTED

Lösungen des Antibiotikums EM-49-Hydrochlorid in Wasser (0,1 bis 10 mg/ml) werden mit Natrium- und Kaliumsalzlösungen (0,5 Molar) behandelt. Salze mit folgenden Anionen ergeben keinen Niederschlag: CH.,COO~, H₂PQ_Z", J~, ClO,", C^ , Br"", B,0 "" und JO ~. Die nachstehenden Anionen ergeben . Niederschläge, deren Reihenfolge die abnehmende Löslichkeit

angibt: SO₁"". MoO,""",. HPO₁"", CrO ~~ Fe(CN).~\ Fe(CN)."*⁵, -4 4 4 4 ο ο ■

Cr₂0_?~" und WO "".

Beispiel 8 · ■

Das Antibiotikum EM-49 kann auch aus einer wäßrigen Lösung als Salz· von verschiedenen Arylsulfonsäuren durch Behandeln mit der Säure oder einem Salz der Säure, wie nachstehend erläutert, ausgefällt werden:

1,00 g Antibiotikum EM-49-Hydrochlorid werden in ^O ml Wasser gelöst. Dazu wird eine Lösung von 1,25 g p-Phenylazobenzolsulfonsäure in 20 rnl Wasser gegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und dann absitzen gelassen. Das tiberstehende wird dekantiert und' der Niederschlag zweimal durch Dekantieren mit ~j>Q ml Anteilen V/asser und ein drittes Mal durch Filtrieren gewaschen. Der Niederschlag wird unter verminderten] Druck getrocknet und ergibt 1,43 g.eines amorphen Feststoffes. Dieses feste p-i*]ienylazobenzolsulfonsäuresalz kristallisiert, wenn es mit Methanol vermischt wird. Eine Probe wird viermal aus Methanol/Acetonitril (2?1) umkrist.al-

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■ - 22 -

lisiert und ergibt eine Substanz, die sich beim raschen Erhitzen unter vermindertem Druck bei etwa 26?°C zersetzt. Wenn die Substanz mehrere Stunden bei 0,02 Torr und 100⁰C getrocknet worden ist, nimmt sie Zj.,17^ Gewicht auf, wenn sie mit atmosphärischer Feuchtigkeit im Gleichgewicht steht.

Analyse: Gefunden: C: 53,29; H: 6,^2; N: 13,10; 0: 21,33 durch Differenz; S: 5,86.

Für ein Molekulargewicht von 2103, das auf der Grundlage von vier Schwefelatomen in der- Formel berechnet worden ist, entspricht die Analyse der Formel ^qn^-i-zQ^p^pißh·

Beispiel 9

Ein Gemisch von 30,8 mg Antibiotikum EM-Zf9-Hydrochlorid, 1 ml n-Butanol, 1 ml Methylathylketon, 0,2 ml einer 1-molaren Lösung von 2,Zf-Dinitrofluorbenzol in Benzol und 2 ml einer 10bigen Natriumbicarbonatlösung wird 1,7 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die obere Schicht wird abgetrennt und die untere Schicht mehrere Male mit Äthylacetat gewaschen. Lie Lösungsmittel werden aus den vereinigten oberen Schichten und V/aschwässern unter vermindertem Dr,uck entfernt. Der Rückstand wird soweit wie möglich in Methylathylketon gelöst.-Unlösliches wird durch Zentrifugieren entfernt und verworfen. Das Überstehende wird im Stickstoffstrom zur Trockne

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eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Aceton gelöst. Durch Zugabe von Benzol wird die Verbindung ausgefällt. Das feste 2,4~Dinitrophenyl-Derivat wird mehrmals mit Benzol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 35> 1 mg eines gelben Pulvers. Eine analytische Dünnschichtchromatographie an Siiieagel und Eluieren mit Methanol/Chloroform (1:9) ergibt einen klaren Fleck, R„=0,5.1·

Die Substanz wird durch -präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung des gleichen Systems gereinigt. Es wird ein-gelbes Band mit einem R„-Wert 0,52 bis 0,68 gesammelt. Das Produkt wird aus dem Siiieagel mit Aceton/ Methanol (1:1) ausgewaschen und durch Ausfällen aus einer· Acetonlösung mit Benzol in ein Pulver (30,Zf mg) überführt. ^:

UV-Spektrum in Methylathylketon: X . 352 nm·. Ε^Ί^

iu ax»

Eine Probe wird bei 0,02 Torr und 100⁰C getrocknet und mit atmosphärischer Feuchtigkeit ins Gleichgewicht gebracht.

Analyse: Gefunden: H₂O: 1,0i$; C: 52,02; H: 6,13; N: -16,61; 0: 25,2^-% durch Differenz. Für ein Molekulargewicht■von 17*fZf entspricht diese Analyse einer empirischen Formel von

^C76^II105^W21⁰27^# '

Beispiel 10 ' ■

1,00 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen in Aceton unlöslichen

■ . -2k·

209852M1E8

-Zh-

Pulvers wird soweit wie möglich in 10 ml Wasser gelöst. Unlösliches wird abzentrifugiert und mit 10 ml V/asser gewaschen. Dann werden' die überstehenden Lösungen vereinigt«

1,00 g Methylorange wird in 15 nil Wasser suspendiert. Dann werden 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Gemisch wird erwärmt, bis sich das Methylorange gerade löst. Diese warme Lösung wird zu der Lösung des Antibiotikums EM-Zf 9 gegeben. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, der Feststoff durch Zentrifugieren isoliert, dreimal mit 35 nil Wasser gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet.

Das rohe Methylorangesalz wird soweit wie möglich in 3 ^ffll Dimethylformamid gelöst. Unlösliches wird abzentrifugiert und zweimal mit 3 Mil Dimethylformamid gewaschen. Die vereinigten Dimethylformamidlösungen werden mit 90 ml Wasser zusammengebracht. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und dreimal mit 30 ml Wasser gewaschen.

Das Methylorangesalz des Antibiotikums Hi-Zf9 ist amorph, doch wird es durch Wiederausfällen aus Methanol/Acetonitril (2:1) gereinigt. Diese Substanz wird 18 Stunden bei 0,02 Torr und 100⁰C getrocknet und danach mit der atmosphärischen Feuchtigkeit ins Gleichgewicht gebracht. Schmelzpunkt auf der Kofier-Bank: '242 bis 2ZfAf⁰C (Zersetzung).

-25-209R52M158

Analyse: Gefunden: C: 53,01; H: 6,74; N: 14>19; S: 5,44 (Wasser 5,05/0· Für ein Molekulargewicht von 2238 entspricht die Elementaranalyse einer empirischen Formel ^c104^H144^N24°24^S4^#

Das Methylorangesalz des Antibiotikums .EM-/+9 wird durch 20-minütiges Rühren mit 10 ml einer O,36n-ßalzsäure in das Hydrochlorid überführt. Unlösliches wird abzentrifugiert- und zweimal mit 5 ml einer O,36n-Salzsäure gewaschen. Die vereinigten überstehenden Lösungen werden dann mit 320 mg Holzkohle "Darco G-60" verrührt und durch Diatomeenerde filtriert. Man erhält eine nahezu farblose Lösung.

Das Filtrat wird'"zweimal mit 10 .ml-Anteilen n-Butanol extrahiert. Nach Entfernen des Butanols unter vermindertem Druck erhält man einen amorphen Feststoff. Dieser wird . durch Auflösen in einer geringen Menge Methanol in' ein feines Pulver überführt. Dann wird Ä'thylacetat zugegeben, bis das Antibiotikum ausfällt. Danach wird das Lösungsmittelgemisch unter vermindertem Druck entfernt. Das Pulver wird bei 50 C und 0,02 Torr mehrere Stunden,, z.B. 5 · Stunden, getrocknet und dann etwa \^ Stunden mit.der atmosphärischen Feuchtigkeit ins.Gleichgewiqht gebracht.

Beispiel 11 . , . ■:.

Eine Lösung von 5OQ mg des gemäß Beispiel 10 erhaltenen

-26-20 985 2/1Ί-5 8'''-"

Hydrochloride des Antibiotikums EM-49 in 5 ml Wasser wird an einer Säule von 2,5 χ 60 cm an Carboxymethylcellulose in der Natriumform ("Whatman CM-52") bei 50⁰C und unter Anwendung einer Durchflußgeschwindigkeit von 75 ml D© Stunde chromatographiert. Die Säule wird mit einer 0,15n-Natriumchloridlösung eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 600 Tropfen (etwa 24 ml) gesammelt werden. Beim Eluat wird die Oberflächenspannung überprüft, da die Antibiotika die Oberflächenspannung herabsetzen, so daß konstante Tropffraktionen, die das Antibiotikum enthalten, ein verkleinertes Volumen besitzen. Eine Aufzeichnung des Fraktionsvolumens gegen das gesamte Elutionsvolumen zeigt das Antibiotikum als entgegengesetzte Maxima. Die Elution wird fortgesetzt (etwa 16 1), bis drei Maxima eluiert worden sind, die als Antibiotikum EM-49 pO, EM-49 ß und EM-49 X bezeichnet werden. Die Säule wird dann mit O,20n-Natriumchlorid (etwa 2 1) eluiert, um eine vierte Fraktion zu eluieren, ,wie sich durch das Oberflächenspannungsmaximum zeigt; diese Fraktion wird ale Antibiotikum EM-49 6 bezeichnet.

Die Fraktionen, die die entsprechenden Maxima für die Antibiotika EM-49 oC , EM-49 ß, EM-49 % und EM-49 £ enthalten, werden vereinigt. Jede Fraktion wird mit der Hälfte ihres Volumens n-Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte werden zweimal mit den gleichen Volumina einer O,36n-Salzsäure gewaschen und dann sur Trockne eingedampft.

—27—

209852/1158

Die Rückstände werden jeweils in Methanol gelöst, mit Äthylacetat ausge.fällt, mit Ätliylacetat und Äther gewaschen, 30 Minuten bei 75⁰C und 0,02 Torr getrocknet und dann etwa 15 Stunden mit der atmosphärischen Feuchtigkeit ins Gleichgewicht gebracht. ' · ■

Eine Analyse jeder der vorgenannten Fraktionen (erhalten als Hydrochloride) ergibt folgendes;

Analysen (gefunden) % H₂O CH N Gl (ionisch)

EM~49oO 5,84 4-2,96-- 8,16. 13,41 11,85

EM-49 ß ' 8,91 4-3,49 7,85 13,68 11,06

EM-49 tf ,8,86 43,4-2 6,96 12,92 ' 10,64

EM~49cS 7,09" 44,75 7,17 13,13 10,58,

Bezogen auf die wasserfreien Substanzen liefern die vorstehenden Daten die nachstehenden ungefähren Molekulargewichte und die darauf beruhenden empirischen Formeln für die Hydrochloride:

Molekulargewicht Empirische Formel

EM-49 06	1203
EM-49 ß	1190
EM-49 y	1250
EM-49 S	1267

209852/1158

Proben der jeweiligen Antibiotika EH-49 ⁰^ , ΕΜ~/# ß, EM-Zf 9 X und EM-/f9 σ werden etwa. 15 Stunden bei 110⁰C in 6n-Salzsäure hydrolysiert. Jedes Hydrolysat wird mit Äther extrahiert, um den Fettsäureanteil zu entfernen. Der Rückstand wird zur Aminosäureanalyse verwendet.

Die Aminosäureanalyse der Fraktionen zeigt an, daß sich die Antibiotika EM-4906 und EM-Zf 9 ß von den Antibiotika EM-Z+9 X und EM-/+9 S in den Aminosäureresten wie folgt unterscheiden:

Reste .ie Moleklil

2,Zf-Dab

EM-49 ß
EM-49 ^
EM-Zf9 S

5 5 5 5

Leucin	Phenylalanin
3	0
3	0
2	1
2	1

2, /f-Diaminobuttersäuro

Die IR-Spektren jeder der vorgenannten Antibiotika sind aus den Fig. 5> 6, 7 und 8 ersichtlich. Wie-das Antibiotikum EM~Zj.9-Hydr.ochlorid sind die vorgenannten Antibiotika in Wasser, Methanol, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Essigsäure löslich und in Aceton, Äthylacetat, Äther und Acetonitril unlöslich. Jedes der vorgenannten Antibiotika bildet wie das Antibiotikum EM-Zf9 Salze.

-29-2Q98S2/1158

Die ltherextrakte der Hydrolysate enthalten Fettsäuren, die-aus' den Antibiotika abgespalten worden sind. Diese werden zur Bildung der Methylester mit Diazomethan behandelt. Die Methylester werden dann gaschromatographisch untersucht. Die Fettsäuren vom Antibiotikum EM-Zf9 dL- unterscheiden sich von den Fettsäuren aus dem Antibiotikum EM-Zj-9 ß» und die Fettsäuren aus dem Antibiotikum EM-49 Y und aus dem Antibiotikum EM-Zf9 & unterscheiden sich in der gleichen Weise. ■

Das EM-/f9 o6 -ß-Paar kann von dem Y- S -Paar durch ein klei nes Maximum bei 696 cm im IR-Spektrum des letztgenannten Paars unterschieden.werden, das charakteristisch für ' den Phenylalaninanteil ist. In ähnlicher Weise hat das UV-Spektrum des Υ - <i -Paars die charakteristische Absorption des Phenylalaninanteils zwischen 2^5 und 270 nm. Diese Absorption fehlt im UV-Spektrum des oO-ß-Paars.

Beispiel 12

70 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen in Aceton unlöslichen Pulvers wen33i zweimal zwischen 200 ml Wasser vom pH 7,5 und Butanol. extrahiert. Die Wasserschichten haben keine antibiotische Aktivität und werden verworfen. Die Butanol-Schichten werden vereinigt und viermal mit jeweils 200 ml butanolgesättigtem Wasser vom pH 1,0 extrahiert. Die ver-

. -30-

209852/1158

einigten Wasserextrakte enthalten die größte Menge der Aktivsubstanz, die aus dem Antibiotikum EM-i+9 und der langsam laufenden Fraktion (SMF) besteht. Der Wasserextrakt wird unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt und mit Aceton ausgefällt. Das neue Pulver aus Aceton wiegt annähernd 15 g·

Das Antibiotikum EM-i+9 und die langsam laufende Fraktion werden zunächst grob getrennt durch Auflösen der 15 g Feststoffe in 30 ™-' -Methanol und Durchlaufen dieser Lösung durch eine Diäthylaminoäthylcellulose-Säule (^,5 x 60 cm) in Methanol. Nachdem der größte Teil der■dunklen Farbe aus der Säule herausgelaufen ist, wird die langsam laufende Fraktion mit 2.% Essigsäure in Methanol eluiert. Es werden annähernd 50 ml Fraktion gesammelt, bis keine Aktivsubstanz mehr aus der Säule heraustritt, wie sich durch einen Plattenversuch gegen E. coil (SC2927) auf Agarplatten zeigt. Die Fraktionen werden dann durch Dünnschichtchromatographie an "Gelman"-Siliciumdioxid-Blättern mit dem Lösungsmittelsystem Butanol-Isobuttersäure-Pyridin-Wasser im Verhältnis l±ö:9:l±i]0 und durch Bioautcgraphie an mit E. coli besäten Agarplatten analysiert. Die Fraktionen mit der langsam laufenden Fraktion (R_f = 0,15)* werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Man erhält etwa 5g· Dieser Feststoff wird dann einer Trennungschromatographie an einem Siliciumdioxid-Cellulose-Gemisch (2:1, bezogen auf das

-31-209852/1158

Gewicht; Säulengröße 3 χ 60 era) unter Verwendung des gleichen Lösungsmittelsystems wie für die Dünnschichtchromatbgraphie unterworfen. An dieser.Säule werden das Antibiotikum EM-/f9 und die langsam laufende Fraktion sehr gut getrennt. Sie werden durch die gleiche Dünnschichtchromatographieanalyse analysiert. Wiederum.werden die gewünschten Fraktionen vereinigt und zur Trockne eingedampft./Mari erhalt etwa 300 Mg. Zur weiteren Reinigung der Verbindung wird die gleiche Trennungschromatographie wiederholt. Die Probe wird in Aceton/Methanol (1:1) gelöst und durch .eine Säule mit alkyliertem vernetzten Dextran ("Sephadex LH20") geschickt, das mit dem gleichen Lösungsmittel durchdrungen und eingefüllt ist. Wenn man mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt, kann man getrennte Banden sehen. Die langsam laufende Fraktion tritt jetzt mit'-der Lösungsmittel front heraus.. Die Fraktionen werden wiederum mittels Dünnschichtchromatographie analysiert. Jene mit einem einzigen Flecken der langsam laufenden Fraktion 'werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Die endgültige Ausbeute beträgt etwa 15Ο mg. Diese Substanz ist blaßgelb,- bioautographisch rein und zeigt keinen Schmelzpunkt bis zu 310⁰C, Ab 270⁰C beginnt sich die ■ Substanz braun zu färben.

» ■

Aus dieser Probe wird ein kristallines Reinecke-Salz durch Auflösen von 100 mg des Endproduktes in 5 ml Wasser und Zugabe von verdünnter Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 2 bis

-3c 209852Π1Ε8

3 hergestellt. Dann wird tropfenweise eine klare gesättigte . ■ wäßrige' Lösung von Ammonium-Eeinecke-Salz zugegeben, bis V

sich kein IJ^ederschlag mehr bildet. Der Niederschlag wird · j abzentrifugiert und einmal mit 5 ml Wasser gewaschen. Dann · ι wird der Niederschlag getrocknet und aus Aceton/Hexan um- (: kristallisiert. Man erhält 50 mg· Das kristalline Reinecke- | Salz der langsam laufenden Fraktion ist ein purpurrotes : < Pulver, das unlöslich in V/asser, doch leichtlöslich in Aceton und Methanol ist. Es besitzt keinen definierten Schmelzpunkt, jedoch zersetzt es sich bei 198 bis 200⁰C, Es wer- ( den die folgenden Farbtests erhalten: Ninhydrin(-), Anthron j .(-), Hydrolysat-NinhydrinC+). ■ " I

Das Antibiotikum EM-i+9 SMF zeigt im UV-Spektrum eine Endabsorption. Das IR-Spektrum ist aus Figur 9 ersichtlich.

Analyse: Gefunden: C: 50,^6%; H: G,k7%; N: 11,69%; Neutra- ' !

lisationsaquivalent = I

Für ein Molekulargewicht von 1200 entspricht die Elementaranalyse einer empirischen Formel ^C5o^li76^W1O°2Zj.·

Ein Hydrolysat, das durch 17-stündiges Hydrolysieren von 2,012
mg des Antibiotikums in 6n-Salzsäure bei 110⁰C hergestellt
und auf Aminosäuren analysiert worden ist, zeigt die folgenden Verbindungen, die in den angegebenen Mengen vorliegen:

-55-2098S7M1S8

; - 33 -

! . 2, Jf-Diamino buttersäure · 1,7^f

MI, OH ' .1,01

Threonin ■ Spuren

Serin 0,8/f -

Glutaminsäure . Spuren -

Alanin ' ■ 0,51

Valin 0,82

' Leucin 0,1+5

Tyrosin Spuren

Phenylalanin 0,/f7

Das kristalline Reinecke-Salz des Antibiotikums EM-49 SMF besitzt einen Schmelzpunkt von 198 bis 200⁰C (Zersetzung) und zeigt ein UV-Spektrum von

und ist unlöslich in Wasser und löslich in Aceton und Methanol.

» Beispiel 1^

Zweifache Röhrchenverdünnungsversuche mit verschiedenen Mikroorganismen zeigen die nachstehenden Ergebnisse. Das bei die-

. ' -3k'

209852/1158

ser Untersuchung verwendete Antibiotikum EM-i.j.9 ist das Hydrochlorid und entspricht bezüglich der Reinheit dem in Beispiel 6 beschriebenen hellbraunen Pulver.

Organismus MIC

Staphylococcus aureus FDA 209P	0,6
Streptococcus pyogenes C 203	0,8
Escherichia coli ATCC 10536	0,6
Escherichia coli SG" 829Ί-
Pseudomonas aeruginosa SC 8329	12,5
Candida albicans.SC 531^4·	6,3
Candida crusei SC 2616+'	2Λ
Saccharomyces cerevisiae SC I6OO '	50,0
Aspergillus niger SC 2δ2δ+^	25,0
Fusarium bulbigenum SC 5273	6,3
Trichophyton mentagrophytes SC 2637	37,5
Trichomonas vaginalis SC 856O+'

' Organismen aus, der SamnvLung der Firma Squibb & Sons

Beispiel 1^ /

Der in vivo-Versuch an Mäusen, bei denen intraperit-oneal LDt-Q-Dosen von Streptococcus pyogenes C203 injiziert worden sind, zeigt, daß 50% der Mäuse überleben, wenn eine Gesarat-

209852/1158

menge von 120 mg/kg des Antibiotikums EM-Zj.9 als Hydrochlorid subcutan in zwei Teildosen gegeben wird, und zwar 1 Stunde und' 5·Stunden nach der Infektion. Bei der Kontrollgruppe, die kein Antibiotikum erhalten hat, überlebte keine Maus.

Beispiel 15 · '

Wenn in ähnlicher Weise Mäuse intraperitoneal mit 500 LDcq-Dosen von Escherichia coli SC 8294 injiziei-t werden, die in 5%igem Magenschleimstoff vom Schwein suspendiert sind, überleben 50/0 nach subcutaner Injektion von 59 mg/kg Antibiotikum EM-Zf9 als Hydrochlorid eine Stunde nach der Infektion. Keine Maus überlebte die Infektion, wenn kein Antibiotikum verabreicht worden ist.

Beispiel 16

Zweifache Rohrchenverdunnungsversuche gegen die angegebenen Mikroorganismen zeigen die folgenden Ergebnisse:

-36-

209852/1158

Organismus MIG (yug/ml)

EM-49

O^ . ß ä" S SMF

Staphylococcus aureus 209P 12,5 6,3 3,1 2,4 75

Streptococcus pyogenes C203 1,6 0,8 0,4 0,4 3,1

Escherichia coli SC2927 0,6 0,6 0,6 0,4 1,6

Escherichia coli SC8294 0,4 0,3 0,3 0,3 12,5

Pseudomonas aeruginosa SC8329 0,8 0,8 0,4 1,2 >100,0

Candida albicans SC5314 9,4 9,4 6,3 4,7 >25,0

Trichomonas vaginalis SC856O 2:50,0 25,0 37,5 25,0

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Claims (15)

1) "Antibiotica der allgemeinen Bezeichnung EM-49 und ihre Salze.

*

2) Antibiotikum nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung Antibioti-

! kum EM-49 und seine Salze, dadurch gekennzeich-

net, daß das Antibiotikum EM-49 die folgenden ungefähren Werte bei der Elementaranalyse besitzt»

Ci 56,64& H: 8,65$; Ni 16,5O?S,

ein IR-Spektrum gemäß Pig, 3, ein NMR-Spektrum gemäß Fig. 4·, einen Schmelzpunkt von 245 - 248⁰C und aufgrund der Titration mit Perchlorsäure ein Äq.aivalentgewicht von 272 hat. ^v ,

3) Hydrochlorid des Antibiotikums EM-49 nach Anspruch 2, dadurch

' gekennzeichnet, daß es die folgenden ungefähren Werte bei der Elementaranalyse besitzt:

ί C: 45,58?S; H: 7,31& N: 14,42& Cl (ionisch) ι. 11,86$, ein ΙΕ-Spektrum gemäß Fig. 1, ein NMR-Spektrum gemäß Fig. 2 und einen Schmelzpunkt unter vermindertem Druck im Bereich von 180 bis 207⁰C hat und daß es in Wasser, Methanol, Äthanol, Dimethylsulf-

\ oxid und Essigsäure löslich und in Aceton, A'thylacetat, A'ther und Acetonitril unlöslich ist.

4) Methylorangesalz des Antibiotikums EM-49 nach Anspruch 2»

5) Antibiotikum nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung Antibioti-

kum EM-49 alpha, das ein IR-Spektrum gemäß Fig. 5 zeigt, und ^! seine Salze.

6) Hydrochlorid des Antibiotikums EM-49 alpha nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden ungefähren Werte bei

209852/1158

7219993

der Elementaranalyse besitzt«

G-: 42,96$; H: 8,16$; N: 13,41$; Cl (ionisch) ί 11,85$, daß es fünf 2,4-Diaminobuttersäurereste, drei leucinreste und keinen Phenylalaninrest im Molekül aufweist und daß es in Wasser,.

Methanol, Äthanol., Bimethylsulfoxid und Essigsäure löslich und in Aceton, Äthylacetat, Äther und Acetonitril unlöslich ist»

7) Antibiotikum nach Anspruch .1 mit der Bezeichnung Antibiotikum EM-49 beta, das ein IR-Spektrum gemäß Pig, 6 zeigt, und seine Salze.

8) Hydrochlorid des Antibiotikums EM-49 beta nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden ungefähren Werte bei der Elementaranalyse besitzt»

C: 43,49$; Hi 7,85$; N: 13,68$; Cl (ionisch): 11,06$, daß es fünf 2,4-Diarainobuttersäurereste, drei Leucinreste und keinen Phenylalaninrest im Molekül aufweist und daß es in Wasser, Methanol, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Essigsäure löslich und in Aceton, Äthylacetat, Äther und Acetonitril unlöslich ist.

9) Antibiotikum nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung Antibiotikum EM-49 gamma, das ein IR-Spektrum gemäß Fig. 7 zeigt, und seine Salze*

10) Hydrochlorid des Antibiotikums EM-49 gamma nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,-daß es die folgenden ungefähren Werte bei der Elementaranalyse besitzt:

C* 43,42$; H: 6,96$; Nt 12,92$; Cl (ionisch): 10,64$, daß es fünf 2,4-Diamjnobuttersäurereste, zwei Leucinreste und einen Phenylalaninrest im Molekül aufweist und daß es in Wasser, Metha-

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- .- ^ - 2213993

nol, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Essigsäure löslich und in
Aceton, Äthylacetat, Ä'ther und Acetonitril unlöslich ist.

11) Antibiotikum nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung Antibiotikum EM-49 delta, das ein IR-Spektrum gemäß Fig. 8 zeigt, und
seine Salze.

12) Hydr.ochlorid des Antibiotikums EM-49 delta nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden ungefähren Werte bei der Elementaranalyse besitzt:

G: 44,75$; H: 7,17$; N: 13,'i3#; Cl (ionisch): 10,58?S,
daß ee fünf 2,4-Diaminobuttersäurere&te, awei Leucinreste und
einen Phenylalanine st im'Molekül aufweist und daß es in Wasser,
Methanol, Äthanol, Dimethylsulfoxid und Essigsäure löslich und in Aceton, Äthylacetat, Äther und Acetonitril unlöslich ist,

13) Antibiotikum nach Anspruch 1 mit der Bezeichnung Antibiotikum EM-49 SMF (langsam laufende Fraktion bei der Chromatographie) und seine Salze, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum
EM-49 SMF die folgenden ungefähren Werte bei der Elementaranalyse besitzt:

C: 50,46$; H: 6,47$; N: 11,69$,

ein IR-Spektruro gemäß Fig. 9 und ein Neutralisationsäquivalent

von 584 hat.

14) Tetrarhodano-diammin-chromat(IH)-OaIz des Antibiotikums

EM-49 SMF (Reinecke-Salz) mit einem Schmelzpunkt von etw 198-200⁰C.

15) Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der allgemeinen
Bezeichnung EM-49 und ihrer Salze nach den Ansprüchen 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Bacillus circu-

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lans ATCO 21656 in einer wäßrigen Nährlösung mit einem Gehalt an einem assimilierbaren Kohlenhydrat» und einer assimilierbaren Stickstoffquelle unter aeroben Submersbedlngungen Buchtet,, bis sich in der Lösung eine beträchtliche roitibiotioche
Aktivität zeigt, und dann die Antibiotika aus der lösung isoliert.

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