DE2533447C3

DE2533447C3 - Peptidantibiotikum Gardimycin und sein Mononatriumsalz, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen

Info

Publication number: DE2533447C3
Application number: DE2533447A
Authority: DE
Inventors: Carolina Coronelli; Giancarlo Pavia Lancini; Francesco Parenti; Giorgio Tamoni
Original assignee: GRUPPO LEPETIT SpA MAILAND (ITALIEN)
Current assignee: GRUPPO LEPETIT SpA MAILAND (ITALIEN)
Priority date: 1974-07-27
Filing date: 1975-07-25
Publication date: 1980-11-27
Also published as: AR208199A1; HU169882B; IE41640L; DE2533447B2; NL160332C; DE2533447A1; YU189475A; RO65722A; IN141371B; NL160332B; BE831743A; NL7508828A; CA1063051A; LU73071A1; US4022884A; NO142789B; PH12611A; CS194232B2; FI54495C; NO142789C

Description

Verhältnis von Aminosäuren

Valin 2

Serin 1

Glycin 2

Glutaminsäure 1

Isoleucin 2

Leucin 1

Alanin 1

Lanthionin 1
p-Methyllanthionin 1

Tryptophan 1

Hydrolyse 6 N-HCI 16 Std. bei 110 C

25

JO

35

Hydrolyse 5 N-Ba(OH)₂ 16 Std. bei 110 C

2. Gardimycin-mononatriumsalz, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

Schmelzpunkt 260° C (Zers.);

Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometrische Titration) 2005—2168; Elementaranalyse:

C 48,7-48,6%; H 6,7-6,6%;

N 11,8-12,2%; S 5,3-5,5%; so

Na 1,1%; H₂O 3,6-3,3%;
spezifischer Drehwert [<%]■' = —44° (C= 0,5% in Dimethylformamid);

löslich in Wasser, wäßriger Natriumbicarbonatlösung, verdünnten wäßrigen Lösungen von Alkalihydroxide^ heißem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Eisessig; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform. Tetrachlorkohlenstoff, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und &o Tetrahydrofuran;

pK_a-Werte (potentiometrisch bestimmt) von 7,1 in Wasser und 8,5 in Äthylenglykolmonomethyläther zu Wasser (16:4).

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 oder Actinoplanes liguriae ATCC 31048 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Sake enthält, bei Temperaturen von 25 bis 35°C züchtet, aus der auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellten Kühlflüssigkeit das Gardimycin mit Butanol extrahiert, den Butanolextrakt auf einen pH-Wert von 4,0 ansäuert, den Butanolextrakt einengt und in der Kälte stehenläßt, den entstandenen Niederschlag abtrennt und durch Gegenstromextraktion mit dem Lösungsmittelsystem Butanol, m/15 Natriumkaliumphosphatpuffer (pH 7,2), Hexan im Volumenverhältnis 1 :1 :0,1 behandelt und gewünschtenfalls das erhaltene Mononatriumsalz mit einer Säure zur freien Säure Gardimycin umsetzt.

4. Verwendung von Gardimycin und se<nes Mononatriumsalzcs bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.

Gardimycin wird durch Fermentation von Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes erhalten. Bei dieser Fermentation entstehen die Metabolite A, B und C, wobei der Metabolit B Gardimycin darstellt. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen wurden aus Bodenproben isoliert, die in Temossi, Italien, und Garbadi Bridge, Indien, gesammelt wurden. Sie erhielten die Codenummer A/6353 bzw. A/10889. Beide Stämme wurden bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 31048 bzw. ATCC 31049 hinterlegt.

Zur Herstellung des Gardimycins wird der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Im allgemeinen wird der Mikroorganismus in einem Schüttelkoiben vorkultiviert, bis sich eine erhebliche Menge an Antibiotikum gebildet hat. Sodann wird diese Kultur zum Beimpfen von größeren Fermentern verwendet. Die Züchtung wird vorzugsweise bei 25 bis 35°C unter aeroben Bedingungen so lange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge an Antibiotikum gebildet hat. Während dieser Zeit werden nach der Agardiffusionsmethode mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt, um die Konzentration der antibiotischen Substanzen zu bestimmen. Dabei wird als Testorganismus Sarcina lutea benutzt.

Das Antibiotikum wird aus der auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellten Kulturflüssigkeit mit Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird vom wäßrigen Medium abgetrennt, auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, bis auf ein kleines Volumen eingeengt und 10 bis 15 Stunden in der Kälte stehengelassen. Danach wird der entstandene Niederschlag abfiltriert. Die Papierchromatographie an Whatman-Papier Nr. 1 und Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel des erhaltenen Rohproduktes und die nachfolgende Bioautographie (vgl. Nicolaus et al., Il Farmaco, Ed. Prat., Bd. 8 [1961], S. 350 bis 370) mit Stapbylococcus aureus als Testkeim zeigen die Anwesenheit von mindestens zwei Fermentationsprodukten an, die zur Identifizierung als Metabolit A und Metabolit B bezeichnet werden, von dem der eine, d. h. B, das Gardimycin ist, das in höheren Ausbeuten gebildet wird.

Diese zwei Komponenten haben unterschiedliche Rr-Werte, die in verschiedenen Eluierungssystemen

variieren. Die Metaboliten A und B werden durch mehrfache Gegenstromextraktion mit dem Lösungsmkteisystem Butanol, M/15 Natrium-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2), Hsxan im Volumenverh.iltnis 1 :1 :0,1 gereinigt und als reine Verbindungen isoliert. Während dieses Schritts wird der Metabolit B, d.h. das Gardimycin, als Mononatriumsalz erhalten, der durch Ansäuern in die entsprechende freie Säure umgewandelt werden kann.

Die Mutterlaugen des Butanolextrakts werden in ein inertes, nicht polares organisches Lösungsmittel, beispielsweise Leichtbenzin, gegossen. Hierbei entsteht ein weiterer Niederschlag. Nach den chromatographischen Untersuchungen und der Bioautographie, die auf die vorstehende Weise ausgeführt werden, besteht der erhaltene Feststoff im wesentlichen aus einer einzigen

Tabelle 1

Wirkungsspektrum (MHK: ;j.g/ml)

Verbindung, die sich von den Metaboiiten A und B hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Rf-Werte in dem gleichen Eluierungssystem unterscheidet Zur Identifizierung wird sie Metabolit C genannt
Die Metaboliten A und C werden verworfen. Sie sind niciit bzw. wenig antibiotisch aktiv.

Metabolit B, d. h. Gardimycin, und sein Mononatriumsalz zeigen gute antibakterielle Aktivität in vitro und in vivo. Die Verbindungen haben insbesondere in vitro

in eine hervorragende antibakterielie Aktivität gegen gram-positive Keime bei Konzentrationen von 1 bis 50 μg/ml. In Tabelle I sind die minimalen Hemmkonzentrationen der Verbindungen und von Lincomycin und Erythromycin gegenüber verschiedenen pathogenen Keimen zusammengefaßt

Stamm

Gardimycin

Gardimycin- Lincomycin

Mononalriumsalz

Erythromycin

S. aureus ATCC 6538	50	25	0,025	0,006
S. aureus Tour	25	25	0,4	0,2
S.^haemolyticus C 203 ISM	0,8	0,8	0,025	0,012
D. pneumoniae UC 41	25	25	0,05	0,012
P. vulgaris X 19 H ATCC 881	>100	>100	>100	>100
E. coli SKF 12140	>100	>100	>100	50
P. aeruginosa ATCC 10145	>100	>100	>100	25
C. albicans SKF 2270	>100	>100	>100	>100

ISM = Institulo Sieroteragico Milanese;
SKF = Smith, KiineÄ French Co.;
UC = Upjohn Company.

Gardimycin zeigt überraschenderweise in vivo eine hohe Aktivität bei durch gram-positive Kokken der Gattung Diplococcus und Streptococcus infizierten Mäusen, die mit einer sehr niedrigen akuten Toxizität

Tabelle II

einhergeht. In Tabelle II sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen bei der experimentellen Infektion von Mäusen mit Streptococcus haemolyticus C 203 ISM und Diplococcus pneumoniae UC 41 zusammengefaßt.

Verbindung

LDso mg/kg
i. p. Maus

S.jS-haem.
C 203 ISM
ED50 mg/kg

T. I.
LD₅₀/ED₅₀

D. pneum.
UC41
ED₅₀ mg/kg

s. c.

T. I.

LD50/ED50

Gardimycin freie Säure 3310

Gardimycin Mononatriumsalz 3500

Erythromycin 690

Lincomycin 1000

0,467 0,435 3,79 5,36 7080

8050

182

187

13,2
13,2
9,33
>160

251

265

74

nicht
bestimmt

Gardimycin und sein Mononatriumsalz eignen sich zur Bekämpfung von Infckuunen, z. B. Streptokokken-Angina, Tonsillitis, rheumatischem Fieber, Scharlach, Otitis media und Endocarditis, die durch gram-positive Keime, insbesondere Streptococcus haemolyticus und/oder Diplococcus pneumoniae, hervorgerufen werden. Die Verbindungen werden vorzugsweise parenteral appliziert. Gardimycin zeigt eine sehr niedrige Resistenzentwicklung und keine Kreuzresistenz mit bekannten Antibiotika.

Beschreibung des Stammes A/6353 (ATCC Nr. 31048) Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Agarme-

b5 dien. Auf Hafermehlagar haben die Kolonien, die einen Durchmesser von etwa 5 mm besitzen, eingekerbte Konturen, schwach radiale Furchen und eine zentrale Vertiefung. Luftmycel fehlt immer.

Sporangien bilden sich reichlich auf Hafermehlagar, Glycerin-Asparagin-Agar und Czapek-Glucose-Agar, wobei Aussehen und Größe in Abhängigkeit vom Medium verschieden ist. Auf Hafermehlagar haben die Kolonien reguläre Konturen und ein kugelförmiges bis ovales Aussehen. Die Sporangien haben eine Größe von 15 bis 25 μ. Die Sporen sind beweglich und kugelförmig mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2 μ. Ein gelb-bernsteinfarbenes, lösliches Pigment wird in verschiedenen Medien produziert.

Beschreibung von Actinoplanes A/10889 (ATCC Nr. 31049)

Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Agar-Nährböden. Die Oberfläche ist undurchsichtig und

Tabelle III

gewöhnlich rauh bis gerunzelt. Luftmycel fehlt gewöhnlich, jedoch werden in einigen Medien Ansätze eines Luftmycels beobachtet. Unter dem Mikroskop zeigt das vegetative Mycel schwache Verzweigungen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 μ. Sporangien werden mäßig nur auf Calciummalatagar gebildet, sie sind kugelig mit unregelmäßiger Oberfläche, oft gelappt und mit einem Durchmesser von 7 bis 12 μ. Nach dem Aufbrechen der Wandung des Sporangiums werden die Sporen entlassen. Die Sporen sind nahezu kugelförmig und beweglich. Die Abmessungen betragen 1 bis 1,5 μ.

Einige morphologische Eigenschaften der beiden Stämme sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Stämme

Λ/1Ο889 (ATCC 31049)

Λ/6353 (ATCC 31048)

Sporangien

Sporen
Luftmycel
Lösliches Pigment

nur auf Calciummalatagar gebildet Größe: 7 X 12 ·;.

kugelig (1 bis 1,5 μ) im Ansatz beobachtet fehlt

reichlich auf einigen Agar-Nährböden gebildet, jedoch unterschiedlich in Größe und Gestalt.
Auf Hafermehlagar ist die Größe zwischen
15-25 μ

kugelig (1,5 bis 2 μ)
fehlt immer

gelb-bernsteinfarbenes Pigment auf einigen
Agar-Nährböden

In Tabelle IV sind die Wuchsformen von Actinoplanes II, The Williams and Wilkins Co. [1961]) empfohlen

A/6353 und Actinoplanes A/10889 auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt, die von Shirling j-3 und Gottlieb (Intern. J. Syst. Bact., Bd. 16 [1966], S. 313—340) sowie von Waksman (The Actinomycetes, Bd.

Tabelle IV

wurden. Die bei einigen Nährböden angegebenen Zahlen beziehen sich auf die von Shirling und Gottlieb angegebenen Nährböden. Die Wuchsformen wurden nach 6- bis 14tägiger Inkubation bei 30⁰C bestimmt.

Nährböden

Wuchsfornien Λ/10889

A/6353

Medium Nr. 2

(Hefeextrakt-

Malzagar)

Medium Nr. 3
(Hafermehlagar)

Medium Nr. 4
(anorganische Salze-Stärke-Agar)

Medium Nr. 5
(Glycerin-Asparagin-Agar)

Medium Nr. 6

(Peptcn-Hefeextrakt-

Eisenagar)

Medium Nr. 7
(Tyrosin-Agar)

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, bernsteinfarben

mäßiges Wachstum, glatt, undurchsichtig, cremefarben bis orange an den Kanten

mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, tieforange

mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, orange

spärliches Wachstum, rauhe Oberfläche, dunkelbraun, mit braunem Pigment

reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, kaffeebraun, schwach-braunes Pigment reichliches Wachstum, schwach
runzelig, hell-orange bis hell-bernsteinfarben

reichliches Wachstum mit glatter und
dünner Oberfläche, hell-orange, einige Sporangien, hell-gelbes lösliches
Pigment

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, orange, einige Sporangien,
kanariengelbes lösliches Pigment

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-orange, reichliche Pigmentbildung, kanariengelbes lösliches Pigment

mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, rosa-bernsteinfarben, gute
Sporangienbildung, rosa-bernsteinfarbenes lösliches Pigment

I-'orlsctzunii

Nährböden

Hafcrmehl-Agar
(nach Waksman)

llickey und
Tresner's Agar

Czapek Glucose
Agar

Glucose-Asparagin-A gar

Nähragar
Karloffelagar

Bennefs Agar

Calciummalatagar
Magermilch-Agar

Czapek-Agar
Ei-Agar

Pepton-Glucose-Agar

Loeffler-Serum

Kartoffelnährboden

Wu c Ii s Io rni c η
Λ/10889

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, hellbraun

kaum Wachstum, glatte Oberfläche, hellorange,
Spuren eines rudimentären Luftmycels

reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, tief-orange

mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, orange bis hellbraun

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche,

orange bis hellbraun,

Spuren eines rudimentären Luftmycels

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, hell-orange

mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, cremefarben bis hell-orange

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, tief-orange

kaum Wachstum, krustige Oberfläche, hellorange

reichliches Wachstum, glatte Oberfläche, orange

sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, hyalin

sehr spärliches Wachstum, dünn und glatt, hyalin

sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, hell-orange bis bernsteinfarben

spärliches Wachstum, runzelige Oberfläche, orange

Λ/6353

reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, orange, Spuren eines rudimentären Luftmycels reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-orange bis topas-gelb; gute Bildung großer Sporangien, gelbes lösliches Pigment

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, rosa-bernsleinfarben, reichliche Sporangienbildung

reichliches Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, orange, reichliche Sporangienbildung

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, orange, einige Sporangien

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, orange

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, bernsteinfarben

reichliches Wachstum mit krustiger Oberfläche, hell-orange

spärliches Wachstum mit glatter Oberfläche, farblos, einige Sporangien

reichliches Wachstum mit schwach krustiger Oberfläche, lief-orange, gelbes lösliches Pigment

spärliches Wachstum, hell-orange, mäßige Bildung von Sporangien

reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-cremefarben, mäßige Bildung von Sporangien

reichliches Wachstum mit runzeliger Oberfläche, tief-orange

sehr spärliches Wachstum, dünn und glatt, farblos

spärliches Wachstum, hell-orange

spärliches Wachstum, runzelig, hellorange

Die günstigste Temperatur zur Entwicklung der Kolonien liegt im Bereich von etwa 18 bis 42° C, das Temperaturoptimum bei etwa 28 bis 37° C.

In Tabelle V ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen zusammengefaßt, die nach der Methode von Pridham und Gottlieb bestimmt wird.

Tabelle V

Kohlenstoffquelle

Wachstum
A/10889 A/6353

Inosit

Fructose

Rhamnose

Kohlenstoffquelle 55

Mannit

Xylose

Raffinose ⁶⁰ Arabinose

Cellulose

Salicin

Sucrose ^6d Mannose

Lactose Glucose (positive Kontrolle)

Wachstum A/10889 A/6353

j

030 248/211

In Tabelle VI sind die physiologischen Eigenschaften der beiden Stämme zusammengefaßt.

Tabelle VI

Versuch	Λ/10889	A/6353
Stärkehydrolyse	positiv	positiv
Schwefel wasserstoffbildung	positiv	negativ
Melaninbildung	positiv	negativ
Tyrosinhydrolyse	positiv	negativ
Casein hydrolyse	negativ	positiv
Calciummalathydrolyse	negativ	negativ
Lackmusmilchkoaguiation	negativ	negativ
Lackmusmilchpeptonisierung	negativ	negativ
Nitratreduktion	positiv	negativ
Gelatineverflüssigung	positiv	negativ

Die beiden Stämme A/6353 und A/10889 werden wegen ihrer kugelförmigen Sporangien, beweglichen Sporen und der Morphologie ihrer Kolonien der Gattung Actinoplanes zugeschrieben. Sie unterscheiden sich jedoch eindeutig voneinander hinsichtlich ihres Wachstums auf verschiedenen Agarnährböden, der Bildung oder Nichtbildung löslicher Pigmente, der Kohlenstoffverwertung und der physiologischen Eigenschaften, insbesondere zeigt der Stamm A/6353 eine sehr begrenzte Fähigkeit glykosidische Bindungen, einschließlich Sucrose, zu hydrolysieren, die, soweit beschrieben, von jeder Spezies der Gattung Actinoplanes verwertet wird. Der Stamm A/10889 bildet ein rudimentäres Luftmycel, was selten bei einer Spezies der Gattung Actinoplanes zu beobachten ist. Die zwei Stämme sind von allen, bisher bekannten Spezies der Gattung Actinoplanes leicht zu unterscheiden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung des Antibiotkums, Isolierung und
Abtrennung verschiedener Metaboliten

Mit dem Stamm Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 wird unter aeroben Bedingungen eine Vorkultur in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt, bis eine ausreichende antibiotische Aktivität der Kulturflüssigkeit vorliegt Ein Nährmedium für eine Schüttelkultur kann beispielsweise folgende Zusammensetzung haben:

	g/Liter
Fleischextrakt	3,0
Hefeextrakt	10,0
Calciumcarbonat	4,0
Stärke	25,0
Leitungswasser auf	1000 ml

Die Kolben werden etwa 24 Stunden bei etwa 28 bis 30⁰C geschüttelt. Anschließend werden jeweils 1 Liter der Vorkultur zum Beimpfen von Fermentern, verwendet, die jeweils 10 Liter des folgenden Nährmediums enthalten:

Fleischextrakt
Pepton
Hefeextrakt
Natriumchlorid

g/10 Liter

40 40 10 25

Sojabohnenmehl
Glucose

Calciumcarbonat
Leitungswasser auf

100
500

50

10 Liter

Die Ansätze werden aerob bei 28 bis 30° C inkubiert und gerührt. In Zeitabständen wird die antibiotische Aktivität mikrobiologisch nach dem Agardiffusionstest mit Sarcina lutea als Teslorganismus bestimmt. Die maximale antibiotische Aktivität wird nach 96- bis 120stündiger Fermentation erreicht.

Die Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und danach mit einer Filterhilfe (Diatomeenerde) filtriert. Das Mycel wird verworfen. Das Filtrat wird mit Butanol in einer Menge entsprechend 50% seines Volumens extrahiert. Der Butanolextrakt wird von der wäßrigen Phase abgetrennt, mit angesäuerter wäßriger Lösung (pH 4,0) gewaschen, auf etwa '/io seines ursprünglichen Volumens eingedampft und 10 bis 12 Stunden bei einer Temperatur von 3 bis 6° C stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Butanol gewaschen und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute 3 g.

Chromatographische Untersuchungen des Niederschlags an Whatman Papier Nr. 1 oder Kieselgel und anschließende Bioautographie der Flecken mit Staphylococcus areus als Testorganismus weisen auf die Gegenwart von zwei Komponenten hin, die als Metabolit A und Metabolit B (Gardimycin) bezeichnet werden. In Abhängigkeit von der Natur des verwendeten Eluierungssystems besitzen sie verschiedene Rr Werte.

Das Rohgemisch wird zur weiteren Reinigung in etwa 30 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird etwa 16 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert und sodann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt. Es werden 1,5 g Rohprodukt erhalten, das noch aus einem Gemisch von Metabolit A und Gardimycin besteht. Die zwei Antibiotika werden durch mehrere Gegenstromextraktionen getrennt und gereinigt. Dies ist aufgrund der verschiedenen Verteilungskoeffizienten des Metabolits A und Gardimycin in einem zuvor bestimmten Lösungsmittelsystem möglich. Das verwendete Lösungsmittelsystem besteht aus Butanol zu M/15 Natrium-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) zu Hexan in einem Volumenverhältnis von 1 :1 :0,1. Die Verteilungskoeffizienten des Metaboliten A und

so Gardimycin in diesem Lösungsmiltelsystem betragen 0,3 bzw. 0,8. Nach 100 Extraktionen werden 0,45 g Gardimycin als Mononatriumsalz erhalten.

Die Mutterlaugen, die aus dem Butanolextrakt nach dem Ausfällen des Metabolitengemisches A und B erhalten werden, werden auf ein kleines Volumen eingeengt und dann in einen Überschuß von Petroläther gegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Nach den chromatographischen Untersuchungen, die unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend ausgeführt wurden, besteht diese Fraktion aus einem Produkt, das sich in den gleichen Eluierungssystemen von den Metaboliten A und B hinsichtlich seines Ri-Wertes unterscheidet Diese Fraktion wird als Metabolit C bezeichnet Die Metaboliten A und C werden verworfen. Die unterschiedlichen chromatographischen Ergebnisse der drei Metaboliten in verschiedenen Eluierungssystemen sind in Tabelle VII zusammengefaßt

Tabelle VlI

Papierchromatographie auf Whatman-Papier Nr. 1; die Flecke werden durch Bioautographie mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht
Eluierungssystem

1) Butanol, gesättigt mit M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0)

2) Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2% p-Toluolsulibnsäure enthält

3) Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2% Ammoniak enthält

4) M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0), gesättigt mit Butanol

5) 20%ige wäßrige Natriumchloridlösung

6) Butanol zu Methanol zu Wasser = 40 : 10 : 20 mit 0,75% Methylorange

7) Butanol zu Methanol zu Wasser = 40 : 10 : 20

8) Aceton zu Wasser =1:1

9) Äthylacetat, gesättigt mit Wasser

Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel; die Flecke werden durch Schwefelsäure, Vanillin und Bioautographie mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht Eluierungssystem

Ammoniak zu Äthanol zu Wasser = 1:8:1 *) Der Melabolit B wird als Mononatriumsalz untersucht.

Rr-Wcrte
Gardimycin*)

Metabolit Λ

0,70

0,30

Mctabolil C

0,15	0,00	0,85
0,80	0,75	0,95
0,10	0,15	0,85
0,80	0,65	0,00
0,80	0,00	0,00
0,65	0,70	0,90
0,60	0,85	0,90
0,80	0,80	0,65
0,00	0,00	0,75

0,00

Beispiel 2

Der Stamm Actinoplanes liguriae ATCC 31048 wird gemäß Beispiel 1 aerob 130 bis 170 Stunden bei Temperaturen von etwa 28 bis 30° C gezüchtet. Es werden 1,4 g des Metabolitengemisches A und B (Gardimycin) erhalten. Das Vorliegen der beiden Metaboliten wird mit Hilfe der gleichen in Beispiel 1 angeführten chromatographischen Untersuchungen entdeckt. Die Reinigung und Trennung der beiden Metaboliten wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt Es werden 0,2 g Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes erhalten. Der Metabolit A wird verworfen.

Physikochemische Eigenschaften des Gardimycins in Form seines Mononatriumsalzes:

Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes ist ein amorphes weißes Pulver mit amphoterem Charakter und einem isoelektrischen Punkt von 4,2, der durch Elektrofokussierung in Ampholin bestimmt wird. Nach starker löstündi^cr H^vdro!^vse in 6 N-Salzsäure bei 120⁰C im Bombenrohr können folgende Aminosäuren nachgewiesen werden:

Valin, Serin, Glycin, Glutaminsäure, Isoleucin, Leucin, Alanin, Lanthionin und jS-Methyllanthionin. Nach 15stündiger Hydrolyse mit 5 N-Bariumhydroxid bei 110° C im Bombenrohr und chromatographischer Analyse der Hydrolyseprodukte kann Tryptophan nachgewiesen werden. Die vorstehend genannten Aminosäuren liegen in folgendem Verhältnis vor:

Isoleucin
Leucin
Alanin
Lanthionin
jS-Methyllanthionin
Tryptophan

Verhältnis von Aminosäuren

Valin
Serin
Glycin
Glutaminsäure

Weiterhin ist Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes durch folgende Eigenschaften gekennzeich-

	1) Schmelzpunkt:	4,,„, (nm)	Losungsmit
45	260°C(Zers.)	273 (Schulter)
		280	si V™
		299
		273 (Schulter)	26
50		279	24
	2) Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometri	288
	sehe Titration):		26
	2005—2168		22
	3) Elementaranalyse:
55	C 48,7-48,6%
	H 6,7- 6,6%
	N 11.8-12,2%
	S 5,3- 5,5%
bO	Na 1,1%
	H₂O 3,6- 3,3%

65







4) UV-Absorptionsbanden in folgenden
teln:
Lösungsmittel
Methanol


0,1 N-Natronlauge

Forlsct/.una

Lösungsmittel

Anus Im)

0,1 N-Salzsäure

Phosphatpuffer
(pH 7,38}

273 (Schulter)

279

288

273 (Schulter)

279

288

26
22

24
20

Die vollständigen UV-Spektren sind in Fig.2 wiedergegeben.

5) Infrarotspektrum:

Charakteristische Banden werden in Nujol bei folgenden Wellenzahlen beobachtet:

3280, 2920-2840 (Nujol), 1650, 1520, 1455 (Nujol), 1375(NuJoI), 1260,1045,990 und 720.

Das IR-Spektrum ist in F i g. 3 wiedergegeben.

6) Spezifischer Drehwert:

[α] = -44° (c= 0,5% in Dimethylformamid)

7) Löslichkeit:

Löslich in Wasser, wäßriger Natriumbicarbonatlösung, verdünnten wäßrigen Lösungen von Alkalihydroxiden, heißem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Eisessig; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrahydrofuran

8) Charakteristische Reaktionen:
Fehling positiv
Tollens positiv
KMnO₄ positiv
H2SO4 konz. positiv
Ninhydrin negativ
FeCb negativ
Millon negativ
Schiff negativ
Maltol negativ

9) pKa-Werte:

Die pK_a-Werte (rjotentiometrisch bestimmt) in Wasser 7,1 und in Äthylenglykolmonomethyläther zu Wasser (16:4) 8,5.

10) Ausgehend vom Mononatriumsalz des Gardimycins kann Gardimycin in Form der freien Säure hergestellt werden:

1 g des Gardimycinmononatriumsalzes werden in 150 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit lOprozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und dann zweimal mit 75 ml wassergesättigtem Butanol extrahiert.
Die Butanol-Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei 45° C auf ein Volumen entsprechend '/20 des Ausgangsvoluniens eingeengt. Nach 12stündigem Stehen bei 4°C wird die entstandene Fällung abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und bei 40 bis 45°C unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0,95 g Produkt erhalten, das sich beim Erhitzen auf etwa 250 bis 300⁰C zersetzt.

Gardimycin in Form der freien Säure ist durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:

1) Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometrische Titration):
1980-2145;

2) Elementaranalyse:

C 49,88%, H 6,91%, N 13,88%, S 6,45%

3) U.V.-Absorptionsbanden in folgenden Lösungsmitteln:

Losungsmittel	Α™« (nm)	£l cm
Methanol	273 (Schuller) 280 299	26 24
0,1 N-Natronlauge	273 (Schulter) 279 288	26 22
0,1 N-Salzsäure	273 (Schulter) 279 288	26 22
Phosphatpuffer (pH 7,38)	273 (Schulter) 279 288	24 20

Die vollständ'gen UV-Spektren entsprechen denen des Monoriatriumsalzes;

4) Infrarotspektrum:

Charakten,tische Banden werden in Nujol bei folgenden Wellenzahlen beobachtet:

3300, 3060, 2920-2850 (Nujol), 1660, 1525, 1450 (Nujol), 1375 (Nujol), 1235 und 975.

Das IR Spektrum entspricht im wesentlichen dem IR-Spektrum des Mononatriumsalzes.

5) Spezifischer Drehwert:

[λ] 67° (C= 0,5% in Dimethylformamid).

Der Unterschied zwischen diesem Wert und dem des Mononatriumsalzes läßt sich aus der höheren Reinheit der getesteten Probe der freien Säure erklären. Kleine Unreinheiten können den Drehwert erheblich beeinflussen, wenn auch nicht die anderen Parameter;

6) Löslichkeit:

Löslich in Phosphatpuffer pH 7,4, Boratpuffer pH 9,90, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid; unlöslich in Acetatpuffer pH 1,79, Benzol, Hexan, Cyclohey.an, Chloroform, Aceton, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrachlorwasserstoff;

7) Charakteristische Reaktionen	positiv
Fehling	positiv
Tollens	positiv
KMnO₄	positiv
H₂SO₄ konz.	negativ
Ninhydrin	negativ
FeCl₃	negativ
Millon	negativ
Schiff	negativ
Maltol
8) pKa-Werte:	Wasser potentiome
Zwei pKa-Werte wurden in
Irisch bestimmt: 6,8 und 4,2;

9) isoelektrischer Punkt (bestimmt durch Elektrofokussierungin Ampholin):4,2;

10) Aminosäure Verhältnis: wie das Mononatriumsalz.

Weitere Angaben über Gardimycin wurden in Journal of Antibiotics, Bd. 29 (1976), S. 507-510 und Annali die Chimica, Bd. 67 (1977), S. 691-697 veröffentlicht, wo sich auch nähere Angaben über die Summenformel und die Aminosäuren Lanthionin und j3-MethyIlanthionin finden.

Hierzu 3 BIiUt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Peptidantibiotikum Gardimycin mit einer basischen und zwei sauren Funktionen, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

Schmelzpunkt« 250—300°C(Zers.);

Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometrische Titration) 1980—2145;

IR-Absorptionsspektrum in Nujol gemäß ^U) Fig.l;

UV-Absorptionsspektrum gemäß F i g. 2; spezifischer Drehwert [α] =-67° (c=0,5% in Dimethylformamid);

löslich in Phosphatpuffer pH 7,4, Boratpuffer pH 9,90, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid;

unlöslich in Acetatpuffer pH 1,79, Benzol, Hexan, Cyclohexan, Chloroform, Aceton, Alka-

nolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrachlorkohlenstoff;

pKa-Werte (potentiometrisch bestimmt) 6,8 und 4,2 in Wasser;

isoelektrischer Punkt (bestimmt durch Elektrofokussierung in Ampholin)4,2;