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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, wasserlösliches, basische Eigenschaften aufweisendes Antibiotikum, das im folgenden mit Lemacidin bezeichnet wird, seine Komponenten Bl, B2 und BS, ihre Salze sowie pharmazeutische Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen und Substanzgemische.
Das Antibiotikum Lemacidin entsteht bei der Kultur eines Actinomyceten der Art Streptomyces venezuelae Ehrlich et al.. Stamm A 9692. Dieser Stamm wurde aus einer bei Roche, Kanton Waadt (Schweiz) gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien sowie in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter dieser Bezeichnung aufbewahrt.
Streptomyces venezuelae A 9692 bildet ein rosa bis zimtbraunes Luftmycel und trägt Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces darstellen. Die Sporenketten sind steif, gerade oder leicht gewellt ; Spiral-oder Quirlbildung konnte nie beobachtet werden. Die einzelnen Sporen sind glatt.
Es wird kein auffallendes Exopigment gebildet. Peptonhaltige Medien werden schwarzbraun melanoid verfärbt. Das Wachstum ist relativ wenig temperaturabhängig, sowohl bei 180 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum des Stammes A 9692 auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 - 7 und 10 werden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17,361 (1952) hergestellt.
1) Synthetischer Agar : Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb, Luftmycel sammetig, blasskarmin.
2) Synthetische Lösung : Wachstum spärlich. Sediment, Flocken, hellgelb.
3) Glukose-Agar : Wachstum dünn, schleierartig, hellbraun. Luftmycel fehlt. Substrat dunkelbraun.
4) Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum dünn, schleierartig, hellbraun. Luftmycel sammetig, anfangs kreideweiss, später zimtbraun.
5) Calciummalat-Agar : Wachstum spärlich, punktförmig, hellgelb. Luftmycel schneeweiss.
ss) Gelatinestich (180) : Wachstum oberflächlich, schleierartig, hellbraun. Substrat dunkelbraun. Verflüssigung nach 14 Tagen 1, 5 cm.
7) Stärkeplatte : Wachstum dünn, schleierartig, hellgelb. Luftmycel anfangs schneeweiss, später blasskarmin. Hydrolyse nach 10 Tagen 0, 9-1, 2 cm.
8) Kartoffeln : Wachstum sehr üppig, anfangs schleierartig und hellgelb, später runzelig und hellbraun. Luftmycel zimtbraun. Substrat dunkelbraun.
9) Karotten : Wachstum sehr spärlich, punktförmig, hellgelb. Luftmycel fehlt.
10) Lackmusmilch : Wachstum gut, Pellikula hellgelb. Substrat blau. Peptonisierung langsam. Koagu- lation gut.
Die morphologischen und physiologischen Merkmale des Stammes A 9692 sind diejenigen der Art Streptomyces venezuelae Ehrlich et al. Es ist bekannt, dass Streptomyces venezuelae ein Antibiotikum, nämlich das Chloromycetin, produziert (Ehrlich J., Barth Q. R., Smith R. M., Joslyn D. A. und Burkholder P. R., Science 106,417 [1947]). Dieses unterscheidet sich vom neuen Antibiotikum Lemacidin schon dadurch, dass es, im Gegensatz zu diesem, mittels organischen Lösungsmitteln aus dem Kulturfiltrat extrahiert werden kann und überdies keine basischen Eigenschaften besitzt.
Die vorliegende Erfindung ist, was die Herstellung des Antibiotikums Lemacidin anbelangt, nicht
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auf die Verwendung des Streptomyces venezuelae A 9692 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett-oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung des Antibiotikums Lemacidin wird ein die Eigenschaften von Streptomyces venezuelae A 9692 aufweisender Streptomyceten-Stamm, in wässeriger, eine Kohlenstoff-und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Lemacidin hierauf isoliert.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentem. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 400. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 1 In-5 Tagen.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kommen z. B. Glukose, Saccharose, Laktose, Stärke, Mannit sowie Glyzerin in-Frage. Als stickstoffhaltige Nährstoffe und gegebenenfalls wachstumsfördernde Stoffe seien genannt : Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destilla- tionsruckständen der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Soyapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze usw., aber auch Nitrate. Von andern anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.
Das gemäss der vorliegenden Erfindung herstellbare Antibiotikum Lemacidin ist ein wasserlöslicher Stoff, der nach papierchromatographischen Untersuchungen aus etwa drei, wahrscheinlich nahe verwandten Verbindungen besteht. Es ist in organischen Lösungsmitteln, vor allem Lipoidlösungsmitteln, volkom- men unlöslich. Das Antibiotikum ist basisch und bildet Salze, die zum Teil, z. B. das Hydrochlorid, in gewissen organischen Lösungsmitteln, wie niederen aliphatischen Alkoholen, löslich sind. Das Antibiotitikum findet sich bei der Züchtung in wässerigen Medien fast vollständig in der Nährlösung, während das von dieser abgetrennte Mycel praktisch keine antibiotische Aktivität aufweist.
Gemäss diesen Eigenschaften kann man zwecks Gewinnung des Antibiotikums Lemacidin aus einer Kulturlösung dieses nicht mit organischen Lösungsmitteln extrahieren. Es lässt sich ihr dagegen bei neutraler oder schwach alkalischer Reaktion mit Adsorptionsmitteln entziehen und aus den Adsorbaten mit sau- ren, zweckmässig ein PH unter 4 aufweisenden Elutionsflüssigkeiten extrahieren. Als Adsorptionsmittel kommen einerseits Aktivkohle, z. B. Norit, anderseits Kationenaustauscher, namentlich solche, die Carb- oxylgruppen enthalten, wie z. B. das im Handel befindliche Austauscherharz AmberliteIRC-50, in Frage.
Wird Aktivkohle als Adsorptionsmittel verwendet, so eignen sich als Elutionsflüssigkeiten sowohl saure wässerige Lösungen als auch Säuren enthaltende, mit Wasser mischbare Lösungsmittel, wie niedere aliphatische Alkohole und Ketone. Eine Mischung von gleichen Volumenteilen Methanol und In-Ameisensäure hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Da ausser dem Antibiotikum von der Aktivkohle noch grössere Mengen, zum Teil gefärbte Verunreinigungen aus der Kulturlösung adsorbiert werden, wäscht man die Adsorptionskolonne vor der Elution des Antibiotikums bei sonst unveränderten Bedingungen vorteilhaft mit Äthanol, wobei ein grosser Teil der Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum jedoch nicht extrahiert wird.
Aus dem sauren Eluat lässt sich ein stark angereichertes Präparat des Antibiotikums in Form eines weissen Pulvers gewinnen, indem man das Eluat im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei das organische Lösungsmittel sowie die Hauptmenge der Ameisensäure entfernt werden, und hierauf das wässerige Konzentrat, vorteilhaft nach Verdünnung mit 4-5 Volumen Methanol, mit Aceton versetzt, die entstandene Fällung mit diesem Lösungsmittel wäscht und zuletzt trocknet. Da das Kohleeluat, besonders von Kulturen mit Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösungen, erhebliche Mengen Ca-Ionen enthält, wird vor der Fällung des Antibiotikums aus dem Konzentrat das Calcium zweckmässig mit Oxalsäure ausgeschieden.
Zur Adsorption des Antibiotikums mit einem Kationenaustauscher wird dieser vorteilhaft in der HForm verwendet. Die Elution erfolgt mit verdünnter wässeriger Säure, gegebenenfalls nach Vorwaschung der Kolonne mit destilliertem Wasser, wobei inaktive Begleitstoffe eliminiert werden. Als Elutionsmittel ist besonders 0, 2n - Salzsäure geeignet. Das Antibiotikum ist im Eluat in Form eines Salzes enthalten. Kationenaustauscher-Eluate können als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum, gegebenenfalls nach vorausgehender Neutralisierung, zur Herstellung weiter angereicherter präparate des Antibiotikums dienen.
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Zur Herstellung des reinen Antibiotikums Lemacidin aus durch Kohle- oder Ionenausta. u5cheradsorp- tion vorgereinigten Präparaten versetzt man ihre wässerige, auf ein PH von 6, 5- 7, eingestellte Lösung mit einem zur vollständigen Fällung gerade ausreichenden Volumen einer wässerigen Lösung des Salzes eines Sulfonsäuregruppen enthaltenden Azofarbstoffes und isoliert das entstandene schwerlösliche Farbstoffsalz des Antibiotikums. Verwendet man als Azofarbstoffsalz das unter der Bezeichnung Helianthin oder Orange III im Handel befindliche Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure, so scheidet sich das Farbstoffsalz (Helianthat) des Antibiotikums Lemacidin ganz oder teilweise in kristallsierter Form aus.
Das Helianthat des Antibiotikums kann aus Wasser oder Methanol oder Mischungen dieser, aber auch aus Formamid und Wasser umkristallisiert werden. Umkristallisiert stellt es makroskopisch ein rotbraunes Pulver dar. Unter dem Mikroskop betrachtet, bildet es gelbe, unregelmässig geformte geschichtete Plättchen oder auch Nadeln, die bei 202 - 2030 unter Zersetzung schmelzen.
Um das Antibiotikum aus dem Farbstoffsalz zurückzugewinnen, setzt man dieses in wässerigem oder alkoholischem Medium mit dem Salz aus einer anorganischen oder organischen Säure und einer organischen Base um, wobei sich das Salz des Antibiotikums der betreffenden Säure und das Farbstoffsalz der Base bilden. Verwendet man z. B. Triäthylaminsulfat zu dieser Umsetzung und führt sie mit einer wässe- rigen Suspension des Antibiotikum-Helianthates aus, so erhält man das in Wasser lösliche Sulfat des Antibiotikums sowie das unlösliche Helianthat des Triäthylamins. Durch Zusatz von genügend Methanol zur Reaktionslösung geht letzteres in Lösung, während sich das nur in Wasser lösliche, in niederen Alkoholen dagegen vollständig unlösliche Antibiotikum-Sulfat ausscheidet und z. B. mittels Filtration isoliert werden kann.
Die Umsetzung kann aber auch in alkoholischer oder wässerig-alkoholischer Lösung vorgenommen werden, wobei das Sulfat sofort ausfällt und von der Farbstofflösung abgetrennt werden kann. Das so erhaltene Sulfat des Antibiotikums Lemacidin stellt ein farbloses, in Wasser und Formamid leicht losli- ches, in organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen und Ketonen dagegen unlösliches Pulver von hoher antibiotischer Wirksamkeit dar.
Aus dem Sulfat kann z. B. das Hydrochlorid des Antibiotikums durch Umsetzung in wässeriger Lösung mit Bariumchlorid und Isolierung aus der von Bariumsulfat befreiten Lösung als kaum gefärbtes, in Wasser sowie Methanol leicht, in Äthanol schwerer lösliches Pulver gewonnen werden. Anderseits ist es auch möglich. das Hydrochlorid direkt aus dem Helianthat des Antibiotikums herzustellen, indem man zur Lösung bzw. Suspension des letzteren in Methanol konzentrierte Salzsäure oder eine Lösung von gasförmiger Salzsäure in Methanol im Überschuss zusetzt, das gebildete Hydrochlorid mit Äther niederschlägt und isoliert.
Um geringe farbige Verunreinigungen aus dem nach diesen Methoden hergestellten Hydrochlorid zu entfernen, filtriert man dessen methanolische Lösung durch eine Kolonne von Aktivkohle, vorzugsweise von Gasruss, wobei das Hydrochlorid nach der Verdampfung des Lösungsmittels aus dem Filtrat als reinweisses Pulver erhalten wird, das sich beim sehr langsamen Verdunsten aus wässeriger oder methanolischer Lösung teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Die Herstellung des Antibiotikums Lemacidin in reiner Form kann auch in der Weise erfolgen, dass dieses aus wässerigen Lösungen mit einer organischen Säure, beispielsweise vom Typus der Pikrinsäure, wie Pikrinsäure selber oder Styphninsäure oder mitPikrolonsäure als schwerlösliches Salz gefällt wird. Das Pikrat und das Styphnat fallen zuerst in flüssiger Form, als ölige Tropfen aus, die beim Stehen bei Raumtemperatur allmählich fest werden ; sie konnten indessen bis jetzt nicht zur Kristallisation gebracht werden.
Im Unterschied dazu kann das Pikrolonat kristallisiert werden. Die gelben, zu Drusen vereinigten unregelmässigen Stäbchen schmelzen nach vorangehendem Sintern unter Zersetzung bei 202OC. Diese schwer- löslichen Salze können durch Behandlung mit Säuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in wässerigem Medium oder in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, in das entsprechende Salz überführt und als solches isoliert werden. Nach diesem Anreicherungsverfahren kann das Antibiotikum z. B. aus dem über das Helianthat gereinigten Sulfat, aber auch aus den Eluaten der Kohle- sowie der Kationenaustauscheradsorbate gewonnen werden.
Ein weiteres kristallisiertes, in Wasser schwerlösliches Salz des Antibiotikums Lemacidin stellt das Reineckat dar, das in unregelmässigen Platten kristallisiert und einen Zersetzungspunkt von 198 bis 2000C aufweist.
Die freie Base des Antibiotikums Lemacidin ist leicht aus ihren Salzen zugänglich, aus dem Sulfat z. B. durch Umsetzung in wässerigem Medium mit Bariumhydroxyd, Neutralisierung des überschüssigen Baryts mit Kohlendioxyd sowie Abtrennung des Bariumkarbonats und-sulfat-Niederschlags und Isolierung der Antibiotikum-Base mittels Gefriertrocknung. Einfacher erfolgt die Herstellung aus den Salzen unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschers, z. B. der OH-Form des unter der Bezeichnung Dowex-2 im Handel befindlichen Produktes.
Das Antibiotikum Lemacidin ist eine farblose, amorphe Base, die in Wasser und wässerigen Medien
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leicht löslich, in organischen Lösungsmitteln dagegen unlöslich ist. Die wässerige Lösung der Base reagiert alkalisch. Eine 1'%-Lösung eines mittels Ionenaustauscher hergestellten Präparates zeigt ein PH von 8,6.
Mit Säuren bildet das Antibiotikum Lemacidin Salze, von denen z. B. das farblose Sulfat und Hydrochlorid in Wasser sehr leicht löslich sind. Das Hydrochlorid löst sich ausserdem in niederen aliphatischen Alkoholen, besonders in Methanol.
Beim sehr langsamen Verdunsten wässeriger oder methanolischer Lösungen kann das Hydrochlorid des Antibiotikums in kristalliner Form erhalten werden. Es hat folgende Elementarzusammensetzung : C = 37, 3%,
EMI4.1
0%, N=16, 8%, 0=20, 8% (her.), Cl=18, l%, [ (x] p =+24, 4 (c= 1, 0wässerigen als auch in alkoholischen Medien schwer löslich. Aus solchen heiss gesättigten Lösungen scheidet es sich in unter dem Mikroskop gelb gefärbten, unregelmässig geformten, geschichteten Blättchen, auch Nadeln, ab, die nach der Umkristallisation einen Zersetzungspunkt von 202 bis 2030 zeigen.
Andere Salze des Antibiotikums Lemacidin leiten sich ab z. B. von der Essigsäure, Palmitinsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Pantothensäure, Ascorbinsäure oder Aminosäuren, wie Leucin und Methionin.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin gibt eine positive Ninhydrin-, schwach positive Biuret- sowie Elson-Morgan-Reaktion, während der Maltol-und Sakaguchi-Test negativ ausfällt. Wie die vergleichende papierchromatographische Untersuchung ergibt, ist es verschieden von den bekannten wasserlöslichen, farblosen, gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksamen Antibiotika.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin kann mittels Papierchromatographie in drei, wahrscheinlich nahe verwandte Komponenten Bl, B2 und B3 aufgetrennt werden. Verwendet man z. B. als Lösungsmittelsystem eine Mischung von 3 Teilen Äthanol und 1 Teil Wasser, die 2% Natriumchlorid enthält, und setzt man den Rf-Wert (= RB) der am schnellsten laufenden Komponente B3 (Bezugssubstanz) gleich 1, so ergeben sich für die zwei andern Komponenten B1 und B2 RB-Werte von 0,34 bzw. 0,61.
Das Antibiotikum Lemacidin besitzt eine hohe antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 370 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen :
EMI4.2
<tb>
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration <SEP> jug/cmS <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes. <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Penicillin-resistent <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Streptomycin-resistent <SEP> 10
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chloromycetin-resistent <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> l <SEP>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 10
<tb>
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EMI5.1
<tb>
<tb> Testorganismen <SEP> Hemmende <SEP> Konzentration <SEP> pg/cmt
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
<tb> Klebsiella <SEP> typ.
<SEP> A <SEP> 10
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 10
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 10
<tb>
In vivo ist das Antibiotikum Lemacidin ebenfalls wirksam. Bei fünfmaliger subkutaner Verabreichung von 1 mg/kg an mit Micrococcus pyogenes var. aureus infizierte Mäuse werden 1000/0 Überlebende beobachtet. Bei gleicher Applikation von 5 mg/kg zeigt sich eine ähnliche Wirkung bei Mäusen, die mit Escherichia coli, ebenso ein Effekt bei solchen, die mit Salmonella typhi murium infiziert sind.
Das Antibiotikum Lemacidin weist zwar eine gewisse Toxizität auf. immerhin wird z. B. die subkutane Applikation von 50 mg Antibiotikum Hydrochlorid/kg von Mäusen verhältnismässig gut vertragen.
Das Sulfat und das Pantothenat sind etwas weniger, das Salz der L (+)-Ascorbinsäure sowie die Salze der Aminosäuren L (-)-Leucin und L (-)-Methionin bedeutend weniger toxisch als das Hydrochlorid.
Das Antibiotikum, seine Komponenten Bl, B2 und B3 und ihre Salze können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 : Die Züchtung des Streptomyces A 9692 wird nach dem Submersverfahren durchgeführt. Man verwendet eine Nährlösung, die pro Liter Leitungswasser folgende Zusatzstoffe enthält :
EMI5.2
<tb>
<tb> Glyzerin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
Die Nährlösung wird in den Impfkolben oder in den Fermentem während 20 - 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Die sterilisierte Nährlösung zeigt ein PH von 7, 0 bis 7,5. Die Animpfung erfolgt mit bis zu 100/0 einer teilweise sporulierenden vegetativen Kultur des Organismus.
Man inkubiert unter gutem Schüt-
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teln oder Rühren bei 21-2*70, wobei Kulturen in Fermentem mit zirka 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Lösung in der Minute belüftet werden ; nach 30 - 50 Stunden Bebrütung hat die Kulturlösung den grössten Hemmwert gegenüber den Testorganismen (B. megatherium, Esch. coli, Candida vulgaris) erreicht. Man unterbricht die Kultur und trennt das nur schwach aktive Mycel sowie andere feste Bestandteile von der das Antibiotikum enthaltenden Lösung mittels Filtration oder Zentrifugation ab, wobei gegebenenfalls der Kulturlösung vor der Filtration etwa 1% eines Filterhilfsmittels, z. B. Hyflo Supercel, zugesetzt wird.
Das PH des Kulturfiltrates ist in der Regel im Vergleich mit der sterilisierten Nährlösung nicht oder nur wenig verändert.
Verwendet man an Stelle der oben angegebenen Nährlösung solche, die pro Liter Leitungswasser die unter a) bis g) angeführten Mischungen von Nährstoffen aufweisen, so erhält man nach analoger Züchtung und Aufarbeitung Kulturfiltrate von ähnlich hoher antibiotische Wirksamkeit. Anstatt durch einen Zusatz von Hyflo Supercel oder eines andern solchen Filterhilfsmittels kann man eine rasche Filtration der Kulturlösung auch dadurch erzielen, dass man diese vor der Filtration mit Salzsäure auf PH 5 und hierauf durch Zugabe einer wässerigen Lösung von Aluminiumsulfat auf eine Konzentration von 0, 5% dieses Salzes einstellt.
Nährstoffmischungen mit folgenden Zusatzstoffen pro Liter Wasser sind ebenfalls geeignet :
EMI6.1
<tb>
<tb> a) <SEP> Glukose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 40 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> b) <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Soyamehl <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> liquor <SEP> 20 <SEP> g
<tb> (Maisquellwasser)
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5g
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> c) <SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Pepton <SEP> 5g
<tb> Fleischextrakt <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> (Oxo <SEP> Lab <SEP> Lemco)
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> d)
<SEP> Glukose <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> e) <SEP> Mannit <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> f) <SEP> Malzextrakt <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
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EMI7.1
<tb>
<tb> g) <SEP> Laktose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Distiller's <SEP> Solubles <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Natriumnitrat <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb>
Ein gemäss den obigen Angaben gewonnenes Filtrat bzw.
Zentrifugat einer Kultur des Streptomyces A 9692 weist in der Regel ein PH von 7,0 bis 7, 5 auf. Wenn dies nicht der Fall ist, wird für die folgende Anreicherung des neuen Antibiotikums das PH mit Hilfe von 10n-Natronlauge auf diesen Wert eingestellt. Das schwach alkalische Filtrat wird hierauf zwecks Adsorption des Antibiotikums mit 1% Aktivkohle (Norit) versetzt und die Masse während 1 Stunde mechanisch gerührt, wobei die gesamte antiblotisch wirksame Substanz von der Kohle aufgenommen wird. Letztere wird durch Filtration, vorteilhaft unter Zugabe von etwas Filterhilfsmittel, wie z. B. Hyflo Supercel, von der vollständig inaktiven, fast wasserhellen Lösung abgetrennt.
Ausser dem Antibiotikum werden von der Kohle noch grosse Mengen anderer organischer, antibiotisch unwirksamer Stoffe, vor allem stark gefärbte Abbauprodukte aus der Nährlösung, aber auch anorganische Salze adsorbiert. Diese Begleitstoffe werden vorteilhaft vor der Elution des Antibiotikums aus der Kohle entfernt. Dazu wird die abfiltrierte, noch feuchte Kohlemasse in die 5-fache Menge 95% Äthanol eingetragen und die Suspension 1/2 Stunde gerührt. Die so vorgewaschene Kohle lässt sich durch Filtration leicht von der Waschflüssigkeit abtrennen. Das braun gefärbte Filtrat zeigt keine antibiotische Wirksamkeit.
Die Elution des neuen Antibiotikums erfolgt mit angesäuertem wässerigem Methanol, zweckmässig mit einer Mischung von gleichen Volumteilen Methanol und In-Ameisensäure, wobei auf 1 g Adsorptionsmittel 2 cm S Elutionsflüssigkeit zur Anwendung kommen. Die Suspension wird 1/2 Stunde mechanisch gut gerührt, dann filtriert, worauf der Kohlerückstand noch 3mal in gleicher Weise extrahiert wird.
Die Eluate, von denen nur das erste schwach gelblich gefärbt, die übrigen farblos sind, zeigen die gesamte antibiotische Aktivität. Sie werden vereinigt und im Vakuum bei niedriger Badtemperatur, z. B. bei 40-600, auf 1/100 des ursprünglichen Volumens eingeengt, wobei ausser dem Methanol. und viel Wasser auch der grösste Teil der Ameisensäure entfernt wird. Das PH des gelblich gefärbten, jedoch dünnflüssigen Konzentrats ist in der Regel um 4.
Das Konzentrat enthält, besonders wenn die Kultur nach Absatz 1 oder nach a) bis d) durchgeführt wurde, grössere Mengen Calcium. Man entfernt dieses in Form des schwerlöslichen Oxalats, indem man dem Konzentrat unter Rühren eine 10% wässerige Oxalsäurelösung zusetzt. Die für die vollständige Fällung erforderliche Menge Oxalsäurelösung wird in einem aliquoten Teil genau bestimmt. Für Konzentrate aus Kulturen mit Calciumcarbonat werden in der Regel zwischen 300 - 500 cmS Oxalsäurelösung pro Liter Konzentrat benötigt, entsprechend 3-5 cm ! pro Liter ursprüngliches Kulturfiltrat, während Konzentrate aus Kulturlösungen ohne Calciumcarbonatzusatz weniger erfordern.
Aus dem von Calcium befreiten Konzentrat wird das Antibiotikum in Form eines stark angereicherten, weissen Pulvers gewonnen, indem man das wässerige Konzentrat zunächst mit 4-5 Volumen Methanol verdünnt und hierauf das aktive Material mit 20 Volumen Aceton ausfällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, zweimal mit Aceton gewaschen und zuletzt im Vakuum von den Lösungsmittelresten befreit. Man erhält ein reinweisses Pulver, das nahezu die gesamte antibiotische Aktivität des Kulturfiltrates zeigt.
Die Ausbeute beträgt zirka 300 mg pro Liter Kulturfiltrat.
Beispiel 2 : Eine bedeutend stärkere Anreicherung des Antibiotikums Lemacidin als nach der in Beispiel 1 beschriebenen Acetonfällung lässt sich über die Darstellung von dessen kristallisiertem Helianthin-Salz erzielen. Hiezu wird das nachBeispiel1 gewonnenecalciumfreie Konzentrat mit2 Volumen Was- ser verdünnt, das PH der Lösung mit 10n-Natronlauge auf PH 6, 7 - 7, 0 eingestellt und unter kräftigem Rühren und in dünnem Strahl das zur vollständigen Fällung erforderliche Volumen einer nahezu gesättigten wässerigen Lösung von Helianthin, enthaltend 3,5 g Helianthin (Orange III, Natriumsalz der 4'-Dimethylamino-azobenzol-4-sulfonsäure) im Liter, zugegeben, wobei die Fällungslösung vorteilhaft direkt in die Antibiotikumlösung eingeleitet wird.
Das zur vollständigen Fällung benötigte Volumen der Helianthinlösung wird in einem Vorversuch mit einem aliquoten. Teil ermittelt. Es variiert je nach dem Antibiotikumgehalt in der Regel zwischen der 20 - 100fachen Menge des angewendeten, unverdünnten Konzentrats. Das sich bildende Helianthat (Helianthin-Salz des Antibiotikums) fällt zum grössten Teil in kristallisiertem Zustand, in der Form von dünnen Plättchen, auch Nadeln, aus. Man lässt die Fällungslösung einige Stunden bei tiefer Temperatur, um 00, stehen, wobei sich der Niederschlag vollständig absetzt. Hierauf wird die Hauptmenge der klaren überstehenden Lösung durch Dekantieren, der Rest mit Hilfe der
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Zentrifuge vom Niederschlag abgetrennt.
Dieser wird zwecks Waschung einmal mit etwa der gleichen Menge eiskaltem Wasser verrührt und hierauf mit Hilfe der Nutsche isoliert. Die Waschung wird zweimal in gleicher Weise, doch mit Aceton, wiederholt. Das so gewaschene Helianthat des neuen Antibiotikums wird im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt zwischen 100 und 180 mg Helianthat/cmS Konzentrat. Das Trockenprodukt stellt ein rotbraunes Pulver dar ; es ist in Wasser sowie in Methanol ziemlich schwer löslich, leichter dagegen in Formamid, aber unlöslich oder sehr wenig löslich in Lipoidlösungsmitteln, wie Aceton, Äther, Benzol, Chloroform u. a.
Es kann sowohl aus Wasser sowie Methanol, als auch aus Mischungen dieser Lösungsmittel umkristallisiert werden, wobei es in unter dem Mikroskop gelben, unregelmässig geformten, geschichteten Plättchen anfällt, die bei 202 - 2030C unter Zersetzung schmelzen.
Zur Herstellung des Sulfats des neuen Antibiotikums aus dem Helianthat werden z. B. 30 g des Helianthat-Trockenpulvers in 150 ems Wasser suspendiert, zur Suspension 33 cms einer wässerigen, Seligen Lösung von Triäthylaminsulfat zugegeben und die Masse während 1 Stunde gerührt, wobei sie sich durch das sich bildende schwerlösliche Triäthylaminsalz des Helianthins allmählich braunrot verfärbt. Die Umsetzung kann durch Erwärmen erheblich beschleunigt werden. Man versetzt hierauf die Reaktionsmischung mit 20 Volumen Methanol, wobei das Sulfat des Antibiotikums als weisser Niederschlag ausfällt, während das Triäthylamin-Helianthat in Lösung geht.
Das durch Zentrifugation oder Filtration gewonnene Antibiotikum-Sulfat wird durch zweimaliges Umfällen aus Wasser mit Methanol von anhaftendem Farbstoff befreit, zuletzt noch mit reinem Methanol gewaschen und dann getrocknet. Es stellt ein reinweisses, amorphes Pulver dar, das in organischen Lösungsmitteln unlöslich, leicht löslich dagegen in Wasser ist. Die Ausbeute beträgt 5,6 g.
Beispiel 3 : Zwecks Umwandlung des Sulfats in das sowohl in Wasser als auch in Methanol leicht lösliche Hydrochlorid des neuen Antibiotikums wird dieses in der 10-fachen Menge Wasser gelöst und die wässerige Lösung bis zur vollständigen Fällung mit einer 2 0% igen Bariumchloridlösung behandelt, wobei zirka 4 cms je g Sulfat erforderlich sind. Der-Niederschlag von Bariumsulfat wird durch Zentrifugieren entfernt und aus der farblosen überstehenden Lösung das Hydrochlorid mittels Gefriertrocknung isoliert. Es werden so etwas mehr als 1 g Hydrochlorid je g Sulfat gewonnen. Um eine weitere Reinigung des Hydrochlorids zu erzielen, wird dieses in wenig Methanol gelöst, die konzentrierte Lösung auf eine mit Methanol gewaschene Chromatographierkolonne von Gasruss gegossen und mit dem gleichen Lösungsmittel eluiert.
Der Verdampfungsrückstand des Eluats stellt ein reinweisses, in Methanol sowie in Wasser leicht lösliches Pulver dar, das sich aus diesen Lösungsmitteln beim sehr langsamen Verdunsten teilweise in kristalliner Form ausscheidet.
Anstatt das Hydrochlorid über das Sulfat zu bereiten, lässt sich dieses auch direkt aus dem Helianthat
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hierauf kurz aufgekocht. Nach Entfärbung mit etwas Norit wird filtriert, das wasserhelle Filtrat dann im Vakuum auf etwa 1/4 des ursprünglichen Volumens eingeengt und aus dem Konzentrat das Hydrochlorid mit 10 - 20 Volumen Äther oder Aceton gefällt.
Beispiel 4 : Das nach Beispiel 2 als rohes Sulfat gewonnene Antibiotikum wird über dasPikratwie folgt weiter gereinigt : Zu einer gut gerührten Lösung von 1 g Sulfat in 20 cms Wasser lässt man langsam 130 cms gesättigte wässerige Pikrinsäurelösung zulaufen, welche Menge zur vollständigen Fällung gerade ausreichend ist. Es bildet sich ein öliger Niederschlag, der abzentrifugiert, je einmal mit etwas gesättigter Pikrinsäurelösung und Wasser gewaschen und hierauf im Vakuumexsikkator getrocknet wird, wobei sich das Pikrat in eine feste, jedoch nicht kristallisierte Masse umwandelt. Die Ausbeute beträgt 1, 2 g.
Zur Umwandlung des Pikrats des Antibiotikums in dessen Hydrochlorid löst man ersteres in warmem, mit konzentrierter Salzsäure angesäuertem Methanol und giesst die Lösung in 10 Volumen Äther, wobei das unlösliche Hydrochlorid als weisse Masse ausfällt. Dieses wird von noch anhaftenden Resten Pikrinsäure befreit, indem man es in der zur Lösung erforderlichen Menge kochenden Methanols auflöst und die Ätherfällung wiederholt.
Man erhält so etwa 0,6 g reinweisses, pulverförmiges Hydrochlorid.
Beispiel 5 : Anstatt über das bisher nicht kristallisierbare Pikrat kann man das reine Antibioti- kum, z. B. als Hydrochlorid, über das kristallisierte Pikrolonat gewinnen, wobei man wie folgt verfährt :
Man lässt zu einer Lösung von 1, 0 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfats in 100 cm* Wasser unter Rühren innert 1 Stunde 700 cms einer konzentrierten wässerigen Lösung von Pikrolonsäure, 2,4 g im Liter enthaltend, zutropfen. Der ausgeschiedene amorphe Niederschlag des Pikrolonats wird abgenutscht und zwecks Kristallisation in 150 cm3 kochendem Wasser aufgelöst und die Lösung heiss filtriert. Aus dem
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Filtrat scheidet sich beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur das Pikrolonat in teilweise kristallsierter Form aus.
Der Niederschlag wird auf der Nutsche gesammelt, mit wenig eiskaltem Wasser gewa- schen und zwecks Umkristallisation in 100 cms kochendem Wasser aufgelöst Aus der heiss filtrierten Lösung fällt das Pikrolonat nunmehr vollständig in Form feiner, zu Drusen angeordneter, gelber Stäbchen aus, die nach dem Waschen mit wenig kaltem Wasser und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxyd, nach Sintern einen scharfen Zersetzungspunkt von 2020 aufweisen. Die Ausbeute des zweimal umkristallisierten Pikrolonats beträgt 0,64 g.
Aus dem vorstehend gewonnenen Pikrolonat wird das reine Hydrochlorid erhalten, indem man zur fein verteilten Suspension von 0, 6 g Pikrolonat in 10 cms eiskaltem Methanol unter kräftigem Rühren 0,6 ems einer IOn-Lösung von gasförmigem Chlorwasserstoff in absolutem Methanol portionenweise zugibt und nach der vollständigen Umsetzung das gebildete, teilweise ausgeschiedene Hydrochlorid des Antibiotikums durch Versetzen des Reaktionsgemisches mit 20 Volumen absolutem Äther vollständig ausfällt. Das Hydrochlorid wird abgenutscht, auf der Nutsche einmal mit etwas Äther gewaschen und hierauf zwecks Entfernung von noch anhaftenden Pikrolonsäureresten in 2 cm* Methanol gelöst und erneut mit Äther ausgeschieden und gewaschen.
Das nunmehr reine Hydrochlorid des Antibiotikums stellt nach dem Trocknen im Vakuum ein reinweisses, amorphes Pulver dar. Die Ausbeute ist 0,25 g.
Nach papierchromatographischen Untersuchungen stellt das so erhaltene Hydrochlorid des Antibiotikums Lemacidin ein Gemisch von drei wahrscheinlich nahe verwandten Verbindungen (B1, B2 und B3) dar.
Verwendet man z. B. als Lösungsmittelsystem eine Mischung von 3 Teilen Äthanol und 1 Teil Wasser, die 2% Natriumchlorid enthält, und setzt man den Rr-Wert (= RB) der am schnellsten laufenden Komponente B3 i (Bezugssubstanz) gleich 1, so ergeben sich für die zwei andern Komponenten Bl und B2 RB-Werte von 0, 34 bzw. 0, 61.
Beispiel 6 : Die Darstellung der freien Base des neuen Antibiotikums kann sowohl aus dessen Sulfat mit Bariumhydroxyd als auch unter Verwendung eines schwach basischen Ionenaustauschers erfolgen.
Im ersten Fall versetzt man z. B. eine Lösung von l g des nach Beispiel 2 erhaltenen Sulfats des Antibiotikums in 5 cm* Wasser mit einem geringen Überschuss einer warm gesättigten Lösung von Bariumhydroxyd, d. h. bis die Reaktionsmischung ein pH von etwa 9 aufweist. Man neutralisiert hierauf das überschüssige Bariumhydroxyd sofort, indem man Kohlendioxyd in die Lösung einleitet. Dann wird die Reaktionsmischung zwecks Überführung des gebildeten Bariumbicarbonats einige Minuten im Wasserbad bei 600 gehalten, worauf das ausgefallene Bariumcarbonat zusammen mit dem Bariumsulfat abzentrifugiert wird. Aus der überstehenden, wasserhellen, alkalischen Zentrifugationslösung isoliert man die freie Base des neuen Antibiotikums mittels Gefriertrocknung.
Sie stellt ein weisses, in Wasser mit stark alkalischer Reaktion lösliches, in organischen Lösungsmitteln unlösliches Pulver dar. Ausbeute 0,5 g.
Zur Gewinnung der freien Base mit Hilfe eines schwach basischen Ionenaustauschers wird wie folgt vorgegangen :
Man perkoliert eine etwa 20 wässerige Lösung von 0,2 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Rohsulfats des neuen Antibiotikums durch eine Kolonne des schwach basischen Ionenaustauschers Dowex-2, wobei etwa die 30-fache Menge des zuvor mit verdünnter Salzsäure-Wasser-verdünnter Natronlauge-Wasser wiederholt in dieser Reihenfolge gewaschenen Ionenaustauscherharzen angewendet wird. Die mit der Sulfatlösung beschickte Kolonne wird mit Wasser nachgewaschen, wobei die Base leicht eluiert wird. Das Eluat wird zwecks Gewinnung der Base wie zuvor vorteilhaft lyophilisiert. Ausbeute 0, 65 g. Die Base stellt ein weisses, amorphes Pulver dar.
Beispiel 7 : Eine nach Beispiel 1 gewonnene, vom Mycel befreite Kulturlösung des Antibiotikums Lemacidin wird langsam durch eine Kolonne eines schwach sauren, Carboxylgruppen enthaltenden Ionenaustauscherharzes, wie z. B. Amberlite IRC-50, filtriert, wobei je Liter der Antibiotikumlösung 100 g der H-Form des Austauschers angewendet werden und dieDurchflussgeschwindigkeit auf zirka 5 Liter je Stunde eingestellt wird. Das Antibiotikum Lemacidin wird, zusammen mit inaktiven, zum Teil stark braun gefärbten Begleitstoffen adsorbiert ; die abfliessende, ein PH von 3 bis 3,5 aufweisende Lösung hat nur eine sehr geringe antibiotische Wirksamkeit. Man wäscht hierauf die Amberlite-Kolonne mit 1/5 des Volumens der einfiltrierten Kulturlösung destilliertem Wasser nach, wobei ein Teil der inaktiven, gefärbten Begleitstoffe entfernt, das Antibiotikum selber jedoch nicht eluiert wird.
Um dieses aus dem Adsorbat zu gewinnen, schickt man durch die vorgewaschene Kolonne eine wässerige Lösung von. 0, 2n- Salzsäure u. zw. total 1/4 des Volumens der angewendeten Kulturlösung. Das stark saure Eluat wird entweder mit konzentrierter Natronlauge oder mit Hilfe eines basischen Ionenaustauschers neutralisiert. Die so gewonnene Lösung kann als solche oder nach Konzentrierung im Vakuum und bei niedriger Temperatur als Ausgangslösung zur Herstellung weiter angereicherter Präparate des Antibiotikums Lemacidin, z. B. nach den in den Beispielen 2 - 3 oder 4 beschriebenen Verfahren, verwendet werden.
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Beispiel 8 : Das Pantothenat des Antibiotikums Lemacidin kann z. B. aus dem nach Beispiel 2 gewonnenen Sulfat erhalten werden. Man versetzt hiezu die Lösung von 1, 0 g Sulfat in 10 cms Wasser mit
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bildeten Niederschlag von Calciumsulfat ab und lyophilisiert das Filtrat bzw. Zentrifugat oder dampft es im Vakuum zur Trockne ein. Der Trockenrückstand des Pantothenats des Antibiotikums Lemacidin stellt ein weisses, amorphes, in Wasser sehr leicht lösliches Pulver dar.
In ähnlicher Weise können andere Salze des Antibiotikums Lemacidin mit organischen Säuren wie z. B. mit L (+)-Ascorbinsäure oder mit Aminosäuren wie L (-)-Leucin bzw. L (-)-Methionin hergestellt wer- den. Man geht dabei vorteilhaft von der nach Beispiel 6 gewonnenen freien Base des Antibiotikums aus, indem man deren konzentrierte wässerige Lösung mit einer warm gesättigten Lösung der organischen Säure versetzt, wobei z. B. für 1 g Base 1,2 g Ascorbinsäure bzw. 0,9 g Leucin bzw. l, 05 g Methionin an- gewendet werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, seiner Komponenten und Salze durch aerobe Züchtung vonStreptomyces-Stämmen in einer wässerigen Nährlösung, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen, anorganische Salze sowie allenfalls wachstumsfördernde Stoffe enthält, und an- schliessende Isolierung der antibiotisch wirksamen Substanzen nach an sich bekannten Methoden, Auftrennung in Komponenten und Überführung in therapeutisch verwendbare Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces venezuelae A 9692 oder eine Mutation dieses Stammes vorzugsweise submers während 36-120 Stunden bei einer Temperatur zwischen 18 und 400, vorzugsweise bei 21 - 270, züchtet,
hierauf das Antibiotikum Lemacidin aus der Nährlösung abtrennt. weiter reinigt, gegebenenfalls in seine Komponenten Bd B2 und B3 aufteilt und, wenn erwünscht, Salze dieser Verbindungen herstellt.