DE2649604C2

DE2649604C2 - Neue antibiotische Substanz SF-1771-B, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2649604C2
Application number: DE2649604A
Authority: DE
Inventors: Shigeharu Inoue; Michio Kojima; Taro Yokohama Kanagawa Niida; Kazunori Ohba; Shoji Tokyo Omoto; Takashi Shomura; Kunikazu Totsukawa; Takashi Kawasaki Kanagawa Tsuruoka; Hiroshi Yokohama Kanagawa Watanabe
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1975-10-29
Filing date: 1976-10-29
Publication date: 1984-04-05
Also published as: FR2361906A1; FR2361906B1; CA1082626A; GB1540466A; DE2649604A1

Description

50

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotlsche Substanz SF-1771-B (vgl. den Patentanspruch 1).

Durch Kultivieren eines neuen Stammes. Streptomyces toyocaensis SF-1771. in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen wird eine neue antlbiotische Substanz SF-1771 gebildet, die aus der Fermentationsbrühe durch Behandlung des Brühenfihrates mit einem synthetischen, adsorbierenden Harz zur Adsorption der aktiven Verbindung und Eluleren des Harzes mit wäßrigem Alkohol oder wäßrigem Aceton und anschließende chromatografische Reinigung isoliert werden kann. Sie ist ein kupferhaltiges Antibiotikum, das antibakteriell Aktivität gegenüber bscherichia coli. Salmonella typhi. Pseudomonas aeruginosa. Staphylococcus aureus und Bacillus subiilis zeigt. Die Entfernung der Kupierkomponente aus der Substanz SF-1771 durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff, einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel ergibt die erfindungsgemäße antibiotische Substanz SF-1771-B. welche keine KunlerkoniDonente enthält und eine ebenso hohe

60 Bedingungen für eine ausreichende Zeit zur Bildung und Ansammlung der Substanz SF-1771, die folgende Parameter aufweist: blau gefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch und löslich in Wasser ist und eine antibakierielle Aktivität zeigt, deren Hydrochlorid sich langsam nach braun bei 185⁰C verfärbt und sich bei 208° C unter Schäumen zersetzt, deren Hydrochlorid in Wasser leicht löslich ist. in Methanol löslich ist. in Äthanol und Butanol gering löslich ist, jedoch in den anderen, organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren Hydrochlorid bei den Reaktionen .~ U Ninhydrin-Reagens, Ehrlich-Reagens, KaliuT-permanganatreagens. Greig-Leiback-Reagens. KaKumpermanganatreagens. Greig-Leiback-Reagens posiliv ist und bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ ist. deren Hydrochlorid ein Molekulargewicht von etwa 1600. bestimmt nach der Barger-Methode, aufweist und bei der Elementaranalyse folgende Werte ergibt: C = 38.70",.. H = 5.42%. N = 13.03%, O = 29,62%. S = 3.62%. Cl = 6,07%, _ünd Cu = 3,53% (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie), deren Hydrochlorid charakteristische Absorptionsspitzen bei 248 nm (E¹^_n,= 146) und bei 282 bis 284 mm (EJ^_n, = 106 Im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in Wasser, zeigt und charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 2 gezeigt sind, im IR-Absorptionsspektrum, als Tablette in Kaliumbromid, aufweist, und außerdem das Hydrochlorid ein Gradienieneluiionsmuster auf einem Ionenaustauschergel-Filtrationsmlttel im Vergleich zu dem Elutionsmuster von Ammoniumformiat aufweist, wie es In der Fig. 3 dargestellt ist. in dem Kulturmedium gezüchtet wird, diese antibiotische Substanz mit Schwefelwasserstoff einem Alkalimetallsulfid oder einem Kupfer chelatlerenden MIttel zur Entfernung des Kupferbestandteils aus dem Molekül der Substanz SF-1771 behandelt wird, wobei die Fig. 2 und 3 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

3. Verwendung der Substanz SF-1771-B oder eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes hiervon gemäß Anspruch I als antibakierielles Mittel oder als Antitumormittel.

antibakterielle Aktivität, jedoch eine geringere Toxizitäl als die Substanz SF-1771 zeigt (vgl. den Patentanspruch 2).

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Substanz SF-1771-B, wie sie im Patentanspruch 3 angegeben ist.

Eine große Vielzahl von pathogenen Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, sind die Verursacher von Krankheiten bei Menschen. Tieren und Pflanzen. Obwohl eine Anzahl von Antibiotika entwickelt wurde, von denen einige eine hohe antimikrobielle Aktivität gegenüber einem oder mehreren pathogenen Mikroorganismen zeigen, besteht dennoch ein liedarf für wirksamere Mittel zur Bekämpfung /ahlreicher durch diese Mikroorganismen hei Menschen. Tieren und l'lhni/en hervorgerufener Krankheilen.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Antibiotikums, das als antibakterielles Mittel für die therapeutische Behandlung um bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren und/oder /ur Sterilisation son chi-

rurgischen Materialien und Instrumenten vorteilhaft is!, sowie eines Verfahrens zur Herstellung dieses neuen Antibiotikums.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung näher erläutert. Es wurden ausgedehnte Untersuchungen unternommen, um das neue und vorteilhafte Antibiotikum herzustellen. Es wurde gefunden, daß beim Kultivieren eines neuen Stammes der Gattung Streptomyces, der aus einer in Tada-u-mi-cho, Takehara Cita, Hiroshima Prefecture, Japan, gesammelten Bodenprobe isolier! wurde, in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen eine eine antibakteriell Aktivität gegenüber gram-negativen und gram-positiven Bakterien zeigende Substanz gebildet und in der Kultur angesammelt sich bei 212° C unter Schäumen. Das Hydrochlorid ist in Wasser leicht löslich, löslich in Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol jedoch unlöslich in den anderen organischen Lösungsmitteln. Das Hydrochiorld ist bei den Reaktionen mit Ninhydrlnreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens und Greig-Leiback-Reagens positiv, und es 1st bei der Reaktion reit Sakguchi-Reagens negativ. Das Hydrochlorid zeigt ein Molekulargewicht von etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode und eine spezifische, optische Drehung [z]ff = -18,4° (c = 1, H,O). Das Hydrochlorid der-Substanz zeigt eine Elementaranalyse von: C = 41,365b, H = 5,53%, N = 14,19%, S = 3,64% und O = 28,93%. Das Hydrochlorid zeigt eine charakteristische Absorptionsspitze bei 288 bis 290 nm

wird. Es war nun möglich, diese antibakterielle Substanz 15 (E_{1 c}'_m = 84) im UV-Absorptionsspektrum, aufgelöst in

aus der Kultur zu isolieren und sie zu reinigen. Als Ergebnis der chemischen, physikalischen und mikrobiellen Eigenschaften dieser isolierten Substanr wurde bestätigt, daß diese antibiotisch wirkende Substanz ein neues Antibiotikum ist, das sich von jedem der bekannten Antibiotika unterscheidet. Dieses neue Antibiotikum wurde daher als Substanz SF-1771 bezeichnet. Sie ist eine blaugefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, das basisch ist, in Wasser löslich ist und eine antibakterielle Aktivität zeigt. Das Hydrochlorid verfärbt sich langsam bei 185° C nach braun und zersetzt sich bei 208" C unter Schäumen, das Hydrochlorid ist in Wasser leicht löslich, löslich In Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol, jedoch unlöslich in den anderen organi-Wasser, und es zeigt charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 5 der Zeichnung gezeigt sind, im IR-Absorptlonsspektrum In Tablettenform In Kaliumbromid, weiterhin zeigt es ein Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz, wie es in Fig. 6 der Zeichnung wiedergegeben ist, aufgelöst in Deuterowasser. Die Erfindung betrifft weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz der Substanz SF-1771-B.

Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-1771-B sind die gleichen, wie sie zuvor für die Substanz SF-1771 beschrieben wurde.

Diese Säureadditionssalze der Substanz SF-1771-B wie auch der Substanz SF-I 771 können durch Umsetzung der

sehen Lösungsmitteln. Das Hydrochlorid ist positiv bei 30 Substanz SF-1771-B oder der Substanz SF-177] in Form den Reaktionen mit Ninhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, der freien Base mit einer pharmazeulisch annehmbaren

Kaliumpermanganatreagens, Greig-Leiback-Reagens und es ist negativ bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens. Das Hydrochlorid zeigt ein Molekulargewicht von etwa 1600, bestimmt nach der Barger-Methode, und ergibt bei der Elementaranalyse: C = 38,70%, H = 5,42%, N = 13.03%. O = 29,62%, S = 3,62%, Cl = 6,07% und Cu = 3,53% (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie). Das Hydrochlorid zeigt charakteristische Absorpllonsspitzen bei 248 nm (E\\._m = 146) und bei 282 bis 284 nm (Ej c_m = 106) im UV-Absorptionsspektrum in Wasser und es zeigt charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in der Fig. 2 der Zeichnung gezeigt sind, bei dem IR-Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder Essigsäure in Lösung in Wasser bei Umgebungstemperatur in bekannter Weise hergestellt werden.

Im folgenden wird auf die Zeichnung Bezug genommen. In der Zeichnung sind

Fig. 1 ein UV-Absorptionsspektrum des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 in Wasser.

Fig. 2 ein IR-Absorptionsspektrum des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 in Tabellenform in Kaliumbromid.

Fig. 3 Muster der Gradientenelution der Substanz SF-1771 und hiermit in Beziehung gesetzte Antibiotika bei

Beispiele pharmazeutisch annehmbarer Säureadditions- 45 der Chromatografie auf einem Ionenaustauscher-gel-filsalze der Substanz SF-1771 umfassen das Hydrochlorid. trationsmittel (CM-Sephadex C-25) (H*) im Vergleich zu Sulfat, Nitrat, Phosphat. Acetat. Maleat, Fumarat. Succi-

Absorptionsspektrum als Tablette In Kaliumbromid.

nat, Tartrat, Oxalat, Citrat, Methansulfonat, Äthansulfonat und dergleichen.

Weilerhin wurde gefunden, daß die in dem Molekül der Substanz SF-1771 vorhandene Kupferkomponente, wenn die Substanz SF-177I mit Schwefelwasserstoff oder einem Alkalimetallsulfid, wie Natriumsulfid, ?n Lösung in Wasser behandelt wird, hieraus in Form von Kupfersulfid entfernt wird, so daß eine weitere neue Substanz gebildet wird, welche die Kupferkomponente nicht enthält jedoch eine ebenso hohe antibakterielle Aktivität mit geringerer Toxizität als die Substanz SF-1771 selbst zeigt. Es wurde gefunden, daß die Substanz SF-1771-B ebenfalls eine Antitumorakilvltät aufweist. Diese neue Substan/ uurde als Substanz SF-1771-B bezeichnet.

Gegensüind der Erfindung ist daher als neues und vorteilhaftes Antibiotikum die Substanz SF-1771 -B, eine farblose oder schwach gelb gefärbte Verbindung in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch ist, in Wasser ^b5 löslich ist und eine antibakteriell Aktivität und eine Antitumoraktivität zeigt. Das Hydrochiorld hiervon verfärbt sich bei 180" C langsam nach braun und zersetzt dem Elutionsmuster von Ammoniumformiat.

Fig. 4 ein UV-Absorptionsspekrum des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B in Wasser.

Fig. 5 ein IR-Absorptionsspektrum des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B als Tablette in Kaliumbromid.

Fig. 6 ein Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz des Hydrochlorids der Substanz SF-1771-B in Deuterowasser, gemessen bei 100 MHz.

Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 zeigt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

(1) Aussehen: blau gefärbtes, amorphes Pulver

(2) Zersetzungstemperatur: Verfärbung nach braun erfolgt langsam bei 185" C und däe Zersetzung tritt bei 208" C unter Schäumen auf.

(31 Elementaranalyse: Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 enthält die Elemente Kohlenstoff. Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel. Kupfer und Chlor und ergibt bei der Analyse folgendes Ergebnis: C = .18,70",,, H = 5.42",,. N = 13,03",,, 0 -- 29.62",,. S = 3.62",,, Cl = 6,07",, und Cu = 3,53%. (gemessen durch Atomabsorntionssoektroskoiiie).

(4) UV-Absorptionsspektrum: Das UV-Spektrum des Hydrochlorlds der Substanz SF-1771, gemessen In wäßriger Lösung, ist in der Fig. 1 dargestellt und zeigt Absorplionsspitzen bei 248 ηιμ (Ku_n, = 146) und bei 282 bis 284 ηιμ (Eu_n, = 106).

(5) IR-Absorptionsspektrum: Das IR-Spektruni des Hydrochlorids der Substanz SF-1771 In Form der Kaliumbromidlableltc ist in der Fig. 2 dargestellt.

(6) Molekulargewicht: Das Molekulargewicht beträgt etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode, und es wird angenommen, daß ein einzelnes Kupleratom pro Molekül der Substanz SF-1771 vorhanden ist.

(7) Löslichkeit: leicht löslich in Wasser, löslich in Methanoi, gering iösiich in Aihanol und Buianüi, jedoch unlöslich in den anderen organischen Lösungsmitteln.

(8) Farbreaktion: positiv gegenüber Ninhydrin-, thrlich-, Kaliumpcrmanganat- und Greig-Leiback-Reagenzlen; negativ gegenüber Sakaguchi-Reagens.

(9) Stabilität: stabil in neutralen und sauren Medien, jedoch relativ instabil in alkalischen Medien.

(10) Rf-Weri: Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerde (Kieselgcl 60 l··".*, ergibt das Hydrochloric] der Substanz SF-1771 einen einzelnen Fleck bei den in der folgenden Tabelle I gezeigten Rf-Werten.

Tabelle I

Entwicklerlösunesmittel

Rf-Wert

Propylalkohol-Pyridin-Essigsäure-Wasser 0,76

(15 : 10 : 3 : 12 in Volumen)

Methanol-10°/oiges wäßriges Ammonium- 0,57 acetat-10%iges wäßriges Ammoniak (10 : 9 : 1 in Volumen)

10%iges wäßriges Ammoniumacetat- 0,68

Methanol (1 : 1 in Volumen)

10%iges wäßriges Ammoniumacetat- 0,54

Methanol (1 : 2 in Volumen)

(11) Rf-Wcrt: Bei der Papierchromatografie (aufsteigende Methode) erscheint der einzelne Fleck bei den in der folgenden Tabelle II angegebenen Rl-Wericn:

Tabelle II

30

Entwicklerlösungsmittel

Rf-Wert

wassergesättigtes n-Butanol	0
3%iges wäßriges Ammoniumchlorid	0,71
(in Gewicht)
Phenol-Wasser (3 : 1 in Volumen)	0,69
Aceton-Wasser (1 : 1 in Volumen)	0,09
n-Butanol-Methanol-Wasser	0,06
(4 : 1 : 2 in Volumen)
Benzol-Methanol (4 : 1 in Volumen)	0,02
Wasser	0,07

(12) Optische Drehung: Die Bestimmung der spezifischen, optischen Drehung Ist mit der D^:Strahlung als Folge der blauen Färbung der Lösung des Hydrochlorldes der Substanz SF-1771' unmöglich.

(13) Elutlonsmuster: Die Flg. 3 zeigt die Muster der Gradlentenelutlon des Hydrochlorldes der Substanz SF-1771 und hiermit In Beziehung gesetzter Antibiotika bei der Elutlon aus einem Ionenaustauschergelflltratlonsmlttel (CM-Sephadex C-25) In der H*- Form, entwickelt mit 0 bis l,0M Ammoniumformlat als Elutlonsmlttel. Jedes Eluat wurde als 5-ml-Fraktlon gesammelt, und die optische Dichte jeder Fraktion wurde bestimmt. Der Unterschied zwischen den bestimmten Werten der optischen Dichte jeder Fraktion und des gemessenen Wertes der optischen Dichte des reinen Elutlonsmittels wurde als Werte Δ OD auf der Ordinate, bezogen auf die Nummer des Röhrchens für jede Fraktion, aufgetragen auf der Abszisse, wie in der FI g. 3 dargestellt, aufgetragen. Die mit der neuen Substanz In Beziehung gesetzten, untersuchten Antibiotika waren Bleomyclne, Victomycln und Platomycin A und B für Vergleichszwecke. Aus diesen Elutlonsmustern Ist ersichtlich, daß das Hydrochlorld der Substanz SF-1771 später als Bleomycin Bj jedoch etwas schneller als Bleomycin B_a, Victomycln und Platomycin A eluiert wird.

Die neue Substanz SF-1771 zeigt ein antibakteriell Spektrum, wie es in der folgenden Tabelle III angegeben ist. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) der Substanz SF-1771 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenveruünnungsmeihode derart bestimmt, daß die Bestimmung nach einer bei 37" C während 18 Stunden durchgeführten Inkubation unter Verwendung eines Herzlnfusionsagars als Inkubationsmedium durchgeführt wurde.

Tabelle III

Antibakterielles Spektrum der Substanz SF-1771

Testmikroorganismen

MIC (\i%lm\)

40 Escherichia coli
Escherichia coli K-12-R
Salmonella typhi
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus 209P
Bacillus subtilis PCI-219

0,39
0,39
< 0,2
25
3,12
1,56

Wie sich aus den Ergebnissen der Tabelle III entnehmen läßt, zeigt die neue Substanz SF-1771 eine hohe antibakterielle Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien, wobei sie eine bemerkenswert hohe antibakterielle Aktivität gegenüber den gram-negativen Bakterien aufweist.

Weiterhin wurde gefunden, daß die Substanz SF-1771 ebenfalls eine Antipllzaktivität gegenüber verschiedenen Pilzen zeigt. Die minimalen Hemmkonzentrationen der Substanz SF-1771 gegenüber verschiedenen Pilzen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmethode in der Welse bestimmt, daß die Bestimmung nach der Durchführung der Inkubation bei 28° C während drei Tagen unter Verwendung eines Sabouraud-glucoseagars als Inkubationsmedium durchgeführt wurde. Für Trichophyton asteroides und Asperglllus fumigatus war die Inkubationszeit jedoch fünf Tage. Das Antipilzspektrum der Substanz SF-1771 ist in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Antipilzspektrum der Substanz SF-1771

ihismen MIC ^g/ml)

Candida albicans
Candida krusei

> 100
12,5

Candida parapsilosis	50
Candida stellatoidea	100
Candida tropicalis	> 100
Cryptococcus albidus	0,78
Cryptococcus laurentii	6,25
Cryptococcus neoformans 301	0,78
Cryptococcus terreus	0,78
Cryptococcus uniguttulatus	3,13
Pichia spartinae	12,5
Saccharomyces cerevisiae	12,5
Trichophyton asteroides	6,25

Aspergillus fumigatus

1,56

15

20

25

Weiterhin wurde gefunden, daß die Substanz SF-1771 zur Behandlung von Trlchophytonsinfektionen bei Tieren wirksam ist. So wurden sechs Gruppen von Testtieren, wobei jede Gruppe aus zehn Meerschweinchen vom Hartley-Stamm (männlich, erwachsen, Gewicht 310 bis 400 g) bestand, mit Trichophyton asteroides In solcher Welse geimpft, daß der Pelz von vier Bereichen der Haut auf dem Rücken eines jeden Tieres weggeschnitten wurde, daß diese Hautfiächen mit Sandpapler abgerieben wurden und dann hierauf eine wäßrige Suspension des Mycels von Trichophyton asteroides aufgetragen wurde. Zwei Tage nach dem Impfen wurde eine Lösung von 1 Gew.-9b der Substanz SF-1771 in Äthanol auf die beimpften Hautbereiche einmal am Tag während neun Tagen zur therapeutischen Behandlung der Trlcnophy- *o ton-Infektion aufgebracht. Bei der Kontrollgruppe der Testtiere wurde lediglich wäßriges 70%lges Äthanol auf die beimpften Hautbereiche in der gleichen Welse wie zuvor aufgetragen. Nach dieser Behandlung wurden die Tiere getötet und aus den so behandelten Hautfiächen wurden drei Stücke (3x3 mm) der Haut ausgeschnitten, diese wurden anschließend auf einer Platte von Agarkulturmedium bei 27° C für drei Tage Inkubiert. Die mikroskopische Betrachtung zeigte, daß kein Wachstum des Pilzes auf allen Hautstücken beobachtet werden konnte, welche aus den mit der neuen Substanz SF-1771 behandelten Hautfiächen ausgeschnitten worden waren, während das Wachstum des Pilzes auf praktisch allen Hautstücken beobachtet werden konnte, die aus den Hautfiächen der lediglich mit dem wäßrigen Äthanol behan- delten Kontrolltieren ausgeschnitten worden waren.

Zur Bestimmung der akuten Toxlzität der Substanz SF-1771 wurden Lösungen, welche 6,25 mg bis 50 mg der Substanz SF-1771 pro 0,2 ml Isotonischer Natriumchloridlösung enthielten. Intravenös mit einer Dosis von 0,2 ml pro Maus bei mehreren Gruppen von Mäusen injiziert, wobei jede Gruppe aus fünf Mäusen vom ICR-Stamm (männlich, erwachsen. Gewicht im Durchschnitt 20 g) bestand.

Sieben Tage nach dieser intravenösen Injektion wurde bestimmt, daß die Prozentsätze der Anzahl der toten Mäuse, bezogen auf die Gesamtanzahl der untersuchten Mäuse, 100%, 100%, 60% und 20% bei den Dosiswerten von 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg bzw. 6,25 mg/kg der Substanz SF-1771 pro Maus lagen. Es kann daher nicht gesagt werden, daß die Substanz SF-1771 nichttoxisch Ist, jedoch Ist sie dennoch zur Sterilisation von chirurgischen Materlallen und Instrumenten wie auch von anderen Einrichtungen, Apparaturen und Stellen, weiche steril gehalten werden sollen, vorteilhaft. Die Substanz SF-1771 kann ebenfalls als antibakteriell Mittel für externe Anwendungen verwendet werden. Für diese Zwecke kann die Substanz SF-177^ In Form einer wäßrigen Lösung formuliert werden, welche 0,01 bis 0,1 Gew.-<>t, der Substanz SF-1771 oder eines Säureadditionssalzes hiervon enthält.

Es wurde ein Vergleich zwischen der Substanz SF-1771 und bekannten, wasserlöslichen, basischen Antibiotika durchgeführt. Als wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches einen Kupferbestandleil enthält, sind Phleomycin (T. Ikekawa et al., »Journal of Antibiotics« Ser. A. Vol. 17, [1964] S. 194) Bleomycine (H. Umezawa et al., »Journal of Antibiotics«, Ser. A. Vol. 19 [19661, S. 200), Zorbamycin und Zorbonomycln B. C (A. D. Argoudellset al., »Journal of Antibiotics« Vol. 24 [1971]. S. 543), die Substanzen YA-56-X. Y A-56-Y (Y. Ito et al., »Journal of Antibiotics« Vol. 24 [197I), S. 727), Victomycin (T. Nara et al., »Journal of Antibiotics« Vol. 28 [1975], S. 366). Platomycin A, B (T. Nara et al., »Journal of Antibiotics« Vol. 28 [1975], S. 662), die Substanz SS-70-A (japanische Patentanmeldung 86 034/1974) und die Substanz SS-70-B (japanische Patentanmeldung 86 035/1974) bekannt. Alle diese bekannten, kupferhaltigen Antibiotika zeigen zwei Absorptionsspllzen, d. h. die erste bei 243 bis 246 nm und die zweite bei 290 bis 303 nm in ihrem UV-Absorptionsspektren. Jedoch können Bleomycine und Phleomycin voneinander unterschieden werden und sie können weiterhin von den ancjeren, bekannten kupferhaltigen Antibiotika unterschieden werden. Im Gegensatz dazu zeigt die neue Substanz SF-1771 die erste Absorptionsspitze bei 248 nm und die zweite bei 282 bis 284 nm in ihrem UV-Absorptionsspcktrum, was anzeigt, daß die Lage der Absorptionsspitzen der Substanz SF-1771 von der Lage der Absorptionsspitzen der zuvor genannten, bekannten, wasserlöslichen und basischen, kupferhaltigen Antibiotika deutlich verschieden ist. In diesem Zusammenhang sei darauf hingewiesen, daß die neue Substanz SF-1771 ein wasserlösliches und basisches Antibiotikum vom Peptldtyp ist, daß sie sich jedoch von allen bekannten, wasserlöslichen und basischen, kupferhaltigen Antibiotika, wie sie zuvor genannt wurden, unterscheidet. Daher ist die Substanz SF-1771 eine neue, antlbiotisch wirkende Verbindung, die von jedem der bekannten Antibiotika vom Bleomycin- und Phleomycintyp verschieden ist.

Die neue Substanz SF-Π71 kann durch Kultivieren eines Stammes der Gattung Streptomyces hergestellt werden, wobei dieser Stamm aus einer in Tada-u-mi-cho, Takehara City, Hiroshima-Prefecture, Japan gesammelten Bodenprobe, wie zuvor beschrieben, isoliert wurde, und dieser Stamm als Stamm SF-1771 bezeichnet wurde. Das Kultivieren bzw. Züchten kann unter aeroben Bedingungen in gleicher Welse wie bei der Herstellung von bekannten Antibiotika durch Kultivieren von bekannten Stämmen der Art Slreptomyces durchgeführt werden.

Der Stamm SF-1771 hat folgende Merkmale:

(I) Morphologisch? Beobachtung:

Luftmycel wird stark auf Glyzerln-Asparagin-asar, Stärkeagar, Hafermehlagar, Hefe-Malz-agar und Tyroslnagar gebildet und die Bildung von Sporen 1st häufig.

Das Mycel bildet einfüßlge Zweige, bildet jedoch keine Quirle.

Das Luftmycel trägt Spiralen an seiner Spitze. Eine Bildung von speziellen Strukturen wie Sclerotium wurde nicht beobachtet. Die elektronenmikroskopische Beobachtung zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen stachelig Ist. Die Sporen besitzen eine elliptische bis ovale Gestalt und messen normalerweise 0,8 bis 1,1 Mikron mal 1,2 bis 1,4 Mikron. Reife Sporenketten mit mehr als 10 Sporen pro Kette werden üblicherweise gebildet.

10

(II) Kulturmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien:

Die Kulturmerkmale sind In der folgenden Tabelle V zusammengestellt. In der folgenden Tabelle beruhen die in eckigen Klammern angegebenen Beschreibungen der Farben auf der Norm von »Color Harmony Mannual of Container Corporation of America«.

Tabelle V

Kulturmedium

Wachstum, Farbe der Rückseite Luftmvcel

lösliches Pigment

Saccharosenitratagar

dünnes Wachstum farblos schwach gelb

Glucose-Asparagin-agar

Glyzerin-Asparagin-agar gutes Wachstum,

schwach gelb Stärkeagar

Hafermehlagar
Hefe-Malz-agar

Tyrosinagar

gutes Wachstum, schwach gräulich-gelb

gutes Wachstum, gräulich-gelb

gutes Wachstum, blaßgelb bis gelb

gutes Wachstum, gräulich-gelb

gering, weiß bis keines

grau-weiß

bräunlich grau [3ge] keines

häufig, grau [2fe] keines

häufig, hell-gelblich- keines braun [4ig]

baumwollartig keines

häufig, schwach

bräunlich-grau

blaßgrau keines

[2dc]

Anmerkung: Die Inkubationstemperatur betrug im allgemeinen 28" C. falls nichts anderes angegeben ist.

(Ill) Physiologische Eigenschaften:

(1) Temperaturbereich des Wachstums: Der Stamm SF-1771 wächst in einem Temperaturbereich von 20 bis 38" C auf Hefe-Malz-agarmediuni.

(2) Verflüssigung von Gelatine: Gelatine wird langsam durch die Inkubation bei 20" C für 21 oder mehr Tage verflüssigt.

(3) Hydrolyse von Stärke: positiv (bei 28"C)

(4) Koagulation von Magermilch: negativ (bei 28" C und 37"C)

(5) Peptonisierung von Magermilch: positiv (bei 28" C und 37"C)

(6) Chromogenitat: negativ

(IV) Verwertung von Kohlenstoffquellen (geschätzt in Pridham-Gottlleb-Agarmedium, inkubierl bei 28° C):

(1) Verwertbar: D-Glucose, D-Fructose, D-Mannit, I-Inosit.

(2) nicht verwertbar: Saccharose, Rhamnose. Raffinose, L-Arabinose, D-Xylose.

Die oben angegebenen Eigenschaften des Stammes SF-1771 können wie folgt zusammengefaßt werden.

Der Stamm SF-1771 gehört zur Gattung Streptomyces und das Luftmycel bildet Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen Ist stachelig. Der Stamm SF-1771 zeigt ein gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien, und die Färbung der Rückseite des Wachstums Ist blaßgelb bis gräulich-gelb und nicht unterscheidungskräftig gefärbt. Das Luftmycel besitzt eine graue bis braune Farbe und es wird auf keinem Kulturmedium ein lösliches Pigment gebildet.

Der Stamm SF-1771 wurde als Streptomyces sp SF-1771 bezeichnet und bei der »American Type Culture Collection«. Washington D. C. LiSA unter der Nummer ATCC 31248 hinterlegt.

Als bekannte Arten, die dem Stamm SF-1771 ähnlich sind, können Streptomyces toyocaensis, Streptomyces natalensis, Streptomyces fasiculatus und Streptomyces albulus genannt werden.

Im Hinblick auf die Beschreibungen im ISP (International Strcptornyccs Project), vvcrir, auf die Aufsätze in »International Journal of Systematic Bacteriology« Vol. 18 [1968], S. 108 bis 110 und S. 174 bis 176 und"Vol. 22 [1972], S. 271 bis 273 und S. 323 bis 326 Bezug genommen wird, können diese vier Arten von dem Stamm SF-1771 in ihren morphologischen Eigenschaften und Kulturmerkmalen nicht unterschieden werden. Daher wurde ein unmittelbarer Vergleich zwischen den Typenkulturen dieser vier bekannten Arten und dem Stamm SF-1771 durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß der Stamm SF-1771 der Art Streptomyces toyocaensis unter den zuvor genannten vier Arten am nächsten kommt und von den restlichen, drei bekannten Arten untersuieidbar ist. Ein genauerer Vergleich zeigt, daß der Stamm SF-1771 mit der Typenkultur von Streptomyces toyocaensis in zahlreichen Eigenschaften kolnzidiert, daß er von diesem Stamm jedoch hinsichtlich der in der folgenden Tabelle VI angegebenen Merkmale unterscheidbar ist.

Tabelle VI

Merkmale

Stamm Typenkultur von

SF-1771 Streptomyces

toyocaensis

auf Hafermehlagarmedium:

Farbe der Rückseite gräulich-gelb gelb bis

des Wachstums bräunlich-gelb

lösliches Pigment keines blaßgelb auf Nähragarmedium:

Luftmycel baumwollartig, gering

gebildetes Substanz Toyocamycin

Antibiotikum

SF-1771

Der Stamm SF-1771 koinzldiert daher hinsichtlich seiner Haupteigenschaften mit Streptomyces toyocaensis, obwohl eine Unterscheidung bei weniger wichtigen Merkmalen beobachtet wird. Daher erscheint es vernünftig, daß der Stamm SF-1771 als ein neuer Stamm der bekannten Art Streptomyces toyocaensis identifiziert wird. Daher wird der Stamm SF-1771 jetzt als Streptomyces toyocaensis SF-1771 bezeichnet.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Substanz SF-1771-B wird der Stamm Streptomyces toyocaensis SF-177i In an sich bekannter Weise unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium jo gezüchtet werden, welches Nährstoffe, nämlich durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält. Als Nährstoffe können beliebige der bekannten Nährsubstanzen verwendet werden, welche üblicherweise bei dem Züchten der bekannten Stämme von Streptomyces verwendet wurden. Beispielsweise sind Glucose, Saccharose, Stärke, Glyzerin. Stärkesirup. Melassen, Sojabohnenöl und dergleichen als Kohlenstoffquelle brauchbar. Sojabohnenmehl, Weizenkeime. Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Hefe, Maisqueliwasser, Ammoniumsulfat, Natriumnitrat und dergleichen sind als Stickstoffquelle brauchbar. Gegebenenfalls können anorganisch; Salze wie Calciumcarbonat. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen zu dem Kulturmedium zugesetzt werden. Weiterhin können dem Kulturmedium solche organische und anorganische Materialien zugesetzt werden, welche das Wachstum des die Substanz SF-1771 bildenden Stammes unterstützen und die Bildung der Substanz SF-1771 fördern. Zu dem Kulturmedium kann Kupfersulfat zugesetzt werden, jedoch ist die Zugabe einer Kupferverbindung zu dem Kulturmedium nicht unbedingt erforderlich, da eine Spur von Kupfer genügt, welche in natürlicher Weise in den Nährsubstanzen natürlichen Ursprungs, die in dem Kulturmedium verwendet werden, von dem Stamm SF-1771 als Kupferquelle zur Bildung der Substanz SF-1771, das ein kupferhaltiges Antibiotikum !st, verwertet wird. ■

Als Methode zur Kultivierung des Stammes SF-1771 wird vorteilhafterweise die submerse Kultivierung in ähnlicher Weise wie bei den allgemeinen Verfahrenswelsen zur Herstellung von bekannten Antibiotika angewandt. Die Kultivierung bzw. das Züchten wird unter aeroben Bedingungen und bei einer Inkubationstemperatur in einem Bereich von 25° C bis 35° C durchgeführt werden. Für die technische oder labormäßige Herstellung der Substanz SF-1771 wird es oft bevorzugt, die Kultivierung bei einer Temperatur In der Nähe von 28° C durchzuführen. Unter diesen Kultivierungsbedingungen erreicht die Konzentration der Substanz SF-1771 In der Kulturbrühe ein Maximum am Ende von 2 bis 8 Tagen der Fermentation, entweder bei einer Schüttelkultlvierungsmethode oder bei einer Tankkultlvierungsmclhode.

Für die Untersuchung dir neuen Substanz SF-1771 kann die folgende Untersuchungsmethode angewandt werden: Als Untersuchungskulturmedium wird ein 0,5% Polypepton, 0,3% Fleischextrakt und 1.5% Agar (pH = 7,0) enthaltendes Medium verwendet. Als Untersuchungsstamm wird Escherlchia coii NIHJ verwendet. Bei dieser Untersuchungsmethode kann bei einer Konzentration von 25 bis 5 ng/ml der Substanz SF-1771 die Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration der Substanz SF-177! und dem Durchmesser der Hcmrnzonc linear aufgetragen werden, wobei die Hemmzone von 22,0 bis 16,0 mm Im Durchmesser, bestimmt nach der Papierscheibenmethode, erhalten wird.

Da die neuen Substanz SF-1771 eine die Kupferkomponente wie zuvor beschrieben enthaltende, wasserlösliche und basische Substanz vom Peptidtyp Ist, kann sie üblicherweise aus der Kulturbrühe durch Adsorption auf einem anorganischen Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle und/oder Aluminiumoxid, oder einem synthetischen Adsorptionsharz, wie einem schwach sauren Ionenaustauscherharz (Amberlite XAD-2. Diaion HP-20), einem lonenaustauscher-Gelfiltratlonsmittel oder Gelfiltratlonsmittel, und anschließendes Eluieren von dem Adsorptionsmittel mit Hilfe eines geeigneten Elutionsmittels gewonnen werden.

Zur Gewinnung und Reinigung der Substanz SF-1771 ist jedoch die folgende Methode am wirksamsten: Die Kulturbrühe wird mit Hilfe eines g&elgneten Filtrationshilfsstoffes wie Diatomeenerde zur Entfernung des Mycels und der anderen festen Stoffe filtriert, und das so erhaltene Brühenflltrat wird durch eine Säule eines synthetischen Adsorptionsharzes, das aus einem mikroporösen Copolymerlsat von Styrol und Divinylbenzol besteht (Amberlite XAD-2) für die Adsorption der Substanz SF-1771 durchgeschickt. Das Harz wird dann mit Wasser gewaschen und mit einem Eiutionsrnittel eiuiert, das aus wäßrigem Äthanol oder wäßrigem Aceton besteht und das auf einen sauren pH-Wert (pH = 3,0 bis 3,5) durch Zugabe einer Mineralsäure wie Salzsäure oder einer organischen Säure wie Essigsäure eingestellt sein kann. Das Eiuat wird in Fraktionen aufgefangen und die aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt und gegebenenfalls neutralisiert. Die aktiven Fraktionen werden dann unter vermindertem Druck durch Abdestillieren des organischen Lösungsmittels (des Äthanols oder Acetons) eir^een^t Die erhabene konzentrierte Lösun" v/'rd durch eine Säule mit einem Ionenaustauscher-Gelfiltrationsmitte! in Form eines carboxymethylsubstituierten, vernetzten Dextrangels (CM-Sephadex C-25) durchgeschickt. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen Lösung eines geeigneten Salzes wie einer wäßrigen 0,2 M Natriumchloridlösung elulert. Das Eluat wird In Fraktionen aufgefangen, und die aktiven -Fraktionen werden miteinander vereinigt und durch Behandlung mit dem zuvor genannten Ionenaustauscherharz (Amberlite XAD-2) entsalzt. Die entsalzte Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet, wobei ein rohes, die Substanz SF-1771 enthaltendes Pulver erhalten wird. Zur Reinigung dieses Rohpulvers wird dieses Rohpulver in einem kleinen Volumen Wasser aufgenommen, und die wäßrige Lösung wird einer Säulenchromatografie auf einem aus einem Dextransulfatderlvat bestehenden Gel (Sephadex

LH-20) unterworfen, mit Methanol oder einem Mlschlorungsmlttel aus Butanrl-Methanol-Wasser (4:1:2 Im volumen) als Elutlonsmlttel f;ntwickelt. Das Eluat wird wieder In Fraktionen gesammelt, und die aktiven Fraktionen, welche einen einzigen Fleck der Substanz SF-1771 bei der Papierchromatografie ergeben, werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein Reinprodukt der Substanz SF-1771 als blau gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wird.

Die Behandlung zur Entfernung der Kupferkomponente aus dem Molekül der Substanz SF-1771 kann entweder in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Substanz SF-1771 in Lösung in Methanol oder einem anderen geeigneten, inerten, organischen Lösungsmittel mil Schwefelwasserstoff oder einem Alkalimetallsulfid, wie Natriumsulfid und/oder JCallumsuifld, für eine ausreichende Zelt zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus dem Molekül der Substanz SF-1771 behandelt wird, oder in der Weise, daß die Substanz SF-1771 mit einem Kupfer chelatierenden Mittel, wie 8-Hydroxychinolin und/oder Dlthlzon, für eine ausreichende Zeitspanne zur Entfernung des Kupferbestandteiles aus der Substanz SF-1771 behandelt wird. Wenn die Substanz SF-1771 mit dem Kupfer chelatierenden Mittel zur Entfernung der Kupferkomponente hieraus umgesetzt wird, wird es bevorzugt, daß die Substanz SF-1771 in Lösung In angesäuertem Wasser mit einer Lösung von Dlthlzon In Chloroform umgesetzt wird. Diese Reaktion zur Entfernung des Kupferbeslandteiles aus der Substanz SF-1771 können bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden, wobei als Reaktionsmedium Wasser oder ein organisches Lösungsmittel, in welchem die Reagenzien löslich sind und welches gegenüber der Reaktion Inert 1st, verwendet wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß dieser Ausführungsform zur Herstellung der Substanz SF-1771-B kann nicht nur unier Verwendung der Substanz SF-1771 in Isolierter Form eines Rohpulvers oder eines reinen Produktes, wie zuvor beschrieben, als Ausgangsmaterial, das mit einem MIttel zur Entfernung des Kupferbestandteiles behandelt wird, durchgeführt werden, sondern auch unter Verwendung der Fermentationsbrühe, des Brühenflltrates oder einer rohen Lösung, welche die Substanz SF-1771 hierin aufgelöst enthält, in der Welse durchgeführt werden, daß die Substanz SF-1771 mit Schwefelwasserstoff, ' einem Alkallmetallsulfid oder einem Kupfer chelatierenden Mittel, während sie noch In der Fermentationsbrühe, dem Brühenflltrat oder der rohen Lösung vorliegt, behandelt wird. Zur Isolierung der Substanz SF-1771-B aus dem Reaktionsgemisch, in welchem die Substanz SF-1771 mit dem Mittel zur Entfernung des Kupferbestandteiles hieraus behandelt wurde, können solche Methoden angewandt werden, die den zur Gewinnung der Substanz SF-1771 aus der Kultur des die Substanz SF-1771 bildenden Mlkrooiganismus anwendbaren Methoden ähnlich sind. So kann das Reaktionsgemisch, das aus der Behandlung der Substanz SF-1771 zur Entfernung der Kupferkomponente hieraus kommt, mit dem zuvor genannten Ionenaustauscherharz (Amberllte XAD-2) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B behandelt werden, und das adsorbierende Harz kann dann elulert werden, anschließend kann eine Chromatografie der aktiven Fraktionen des Eluates unter Bildung eines rohen, die Substanz SF-1771-B enthaltenden Pulvers durchgeführt werden. Für die weitere Reinigung kann dieses rohe Pulver auf einer Säule aus einem Gel aus einem Dextransulfatderlvat (Sephadex LH-20) oder synthetischem Harz (Diaion HP-20) chromatograflert werden, so daß ein Reinprodukt der Substanz SF-1771-B erhalten wird. Die Substanz SF-1771-B ebenso wie die Substanz SF-1771 sind wasserlösliche und basische Antibiotika vom Peptidtyp, und daher kann die Substanz SF-1771-B im allgemeinen mittels einer Reinigungsmethode gereinigt werden, die derjenigen zur Reinigung der Substanz SF-1771 analog ist.

Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B zeigt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften, wobei einige dieser Eigenschaften bereits zuvor beschrieben wurden:

(1) Aussehen: farbloses (weiß gefärbtes) bis schwach gelb gefärbtes, amorphes Pulver.

(2) Zersetzungstemperatur. Verfärbung nach braun erfolgt langsam bei 180° C und die Zersetzung tritt bei 212° C unter Schäumen auf.

(3) Elementaranalyse: Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Chlor und ergibt folgendes Analysenergebnis: C = 41,36%, H - 5,53%, N = 14,19*,, O = 28,93% und S = 3,64%. Ferner wurde festgestellt, daß der Gehalt an Chlor bei der Ek mentaranalyse 6,12% betrug, obwohl die Bestimmung des Chlorgehaltes in exakter Weise als Folge der Anwesenheit der Schwefelkomponente in dem Molekül nur schwierig durchzuführen war.

(4) UV-Absorptionsspektrum: Das UV-Spektrum des Hydrochlorldes der Substanz SF-1771-B, gemessen In einer wäßrigen Lösung, ist In der Flg. 4 der Zeichnung wiedergegeben und zeigt eine Absorptionsspitze bei 288 bis 290 nm (E \"*_cm = 84).

(5) IR-Absorptlonsspektrum: Das IR-Spektrum des Hydrochlorldes der Substanz SF-1771-B, als Tablette in Kaliumbromid, Ist In der Fig. 5 der Zeichnung wiedergegeben.

(6) Absorptionsspektrum der protonenmagnetischen Resonanz: Das PMR-Spektrum des Hydrochlorides der Substanz SF-1771-B in Deuterlumoxid Ist in der Fig. 6 der Zeichnung wiedergegeben, bestimmt bei 100 MHz.

(7) Molekulargewicht: etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode.

(8) Löslichkeit: leicht löslich In Wasser, löslich in Methanol, gering löslich in Äthanol und Butanol, jedoch unlöslich In den anderen, organischen Lösungsmitteln.

(9) Farbreaktion: positiv gegenüber Nlnhydrin-, Ehrlich-, Kaliumpermanganat- und Grelg-Lelback-Reagenzlen. Negativ gegenüber Sakaguchl-Reagens.

(10) Stabilität: Stabil in neutralen und sauren Medien, jedoch relativ Instabil In alkalischen Medien.

(U) Rf-Wert: Bei der Dünnschichtchromatografie auf Kieselerdegel (Kleselgel 60 F₂<„), ergib; das Hydrochlorid der Substanz SF-1771-B einen einzigen Fleck bei den In der folgenden Tabelle VlI angegebenen Rf-Werten. Zum Vergleich sind die Rf-Werte für das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 ebenfalls In dieser Tabelle VII angegeben.

Tabelle VIl

Entwicklerlösungsmittel

Rf-Wert

SF-1771-B SF-1771

Propylalkohol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
(15 : 10 : 3 : 12 in Volumen)

0.76

Fortsetzung

Entwicklerlösungsmittel

Rf-Wert

SF-1771-B SF-1771

10

15

Methanol-lOWges wäßriges 0,50 0,57

Ammoniumacetat-10°/dges
wäßriges Ammoniak
(10 : 9 : 1 in Volumen)

10°/oiges wäßriges Ammonium- 0,48 0,68

acetat-Methanol
(1 : 1 in Volumen)

10°/fflges wäßriges Ammonium- 0,38 0,54

acetat-Methanol
(1 : 2 in Volumen)

(12) Optische Drehung: [α]-?= - 18,4° (c = 1, H₂O)

Die Substanz SF-1771-B gemäß der Erfindung zeigt ein antibakteriell Spektrum, wie es in der folgenden Tabelle VIII zusammengestellt ist. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) dieser Substanz gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurden nach der bekannten Brühenverdünnungsmeihode in der Welse bestimmt, daß die Bestimmung nach der Durchführung der Inkubation bei 37° C während 18 Stunden unter Verwendung einer Herzinfuslonsagars als Inkubatlonsmedlum durchgeführt wurde.

30

Tabelle VIII

Antibakterielles Spektrum der Substanz SF-1771-B

Testmikroorganismen

MlC ^g/ml)

Escherichia coli '
Escherichia coli K-12-R
Salmonella typhi
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus 209P
Bacillus subtilis PCI-219
Salmonella pullorum
Pasturella sp. 001
Pasturella sp. 005
Pastur.illa sp. 020

0,39 0.39 0,19 50 6.25 1.56 0,39 3.12 1,56 1,56

40

Wie aus den Ergebnissen der Tabelle VIII ersichtlich, zeigt die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B ebenfalls eine antibakterielle Aktivität gegenüber den gram-negativen und gram-positiven Bakterien, die Im wesentlichen ebenso hoch wie diejenige der Substanz SF-1771 Ist.

Für die Abschätzung der akuten Toxlzität der Substanz SF-1771-B wurden Lösungen, welche 6,25mg bis 50 mg der Substanz SF-1771-B pro 0,2 ml isotonischer Natrlumchlorldlösung enthielten. Intravenös bei einer Dosis von 0.2 ml pro Maus bei mehreren Gruppen von Mäusen, wobei jede Gruppe aus fünf Mausen vom ICR-Stamm (männlich, erwachsen, Durchschnittsgewicht 20 g) bestand, injlzlim. Sieben Tage nach dieser intravenösen Injektion wurde bestimmt, daß die Prozentsätze der Anzahl der toten Mäuse, bezogen auf die Gesamtanzahl an untersuchten Mäusen. 100%. 60%. 0% und 0% bei den Dosiswerten von 50 mg/kg. 25 mg/kg, 12.5 mg/kg bzw. 6,25 mg/kg an Substanz SF-1771-B pro Maus lagen. Bei

35 der Dosis von 12,5 mg/kg der Substanz SF-1771-B überlebten alle untersuchten Mäusen nach dem Test, während bei der Dosis von 12,5 mg/kg eine 60% der Gesamtzahl der Testmäuse entsprechende Anzahl an Mäusen bei Verwendung der Substanz SF-1771 starben, was zeigt, daß die Substanz SF-1771-B Im Vergleich zu der Substanz SF-1771 eine signifikant verminderte, akute Toxizität besitzt.

Die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B wird als zu den Antibiotika vom Bleomycln-Phleomycin-Typ gehörend angesehen. Es ist bekannt, daß Bleomycin d-Mrch eine Rohenzymlösung inaktiviert werden kann, welche aus der überstehenden Flüssigkeit besteht, die durch Zentrifugieren eines Rattenleberhomogenates bei 100 000 G erhalten wird.

Um abzuschätzen, in welchem Ausmaß die Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz SF-1771-B In vivo im Tier Im Vergleich zu Bleomycin A_; Inaktiviert werden kann, wurde der folgende Tesi durchgeführt: 10 mg der Substanz SF-1771-B als Substrat wurden bei 37° C mit 2 ml einer Rohenzymlösung (pH = 7,2) umgesetzt, welche aus Rattenleberhomogenat In der obenbeschriebenen Weise hergestellt worden war. Am Ende von 1 Stunde, 3 Stunden, 6 Stunden, 10 Stunden und 24 Stunden nach dem Beginn der enzymatischen Reaktion wurden Proben aus dem Reaklionsgemisch entnommen und auf ihre antibakterielle Potenz gegenüber dem Untersuchungsorganismus. Escherichia coli NIHJ. untersucht. Die Prozentsätze der zurückbleibenden, antibakteriellen Potenz dieser Proben, bezogen auf die anfängliche, antibakterielle Potenz, bestimmt zu Beginn der Reaktion (Reaktionszeit = 0 Stunden) wurde berechnet. Das Ausmaß der Inaktivierung (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:

_ zurückblsibende, antibakterielle Potenz
anfängliche, antibakterielle Potenz

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX zusammengestellt:

Tabelle IX

Substrat

45

50 Ausmaß der Inaktivierung (%)

Reaktionszeit (h)

1 3 6 10 24

SF-1771-B
Bleomycin A₂

(von Kupfer befreites

Derivat)

0 0 20 48 72 24 36 60 66 >94

Aus den Ergebnissen dieser Tabelle IX ist ersichtlich, daß die Substanz SF-1771-B wesentlich schwieriger durch die enzymatischen Reaktionen als Bleomycin A. Inaktiviert werden kann, so daß die Substanz SF-1771-B bei Tieren in vivo eine viel höhere Aktivität als Bleomycin A.. zeigen kann.

Darüber hinaus wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B eine Hemmaktivität gegenüber dem Wachstum von Zellen von Hella S^ aufweist und eine minimale Degenerierungskonzentration von 3.9 ug/ml gegenüber diesen Zellen bei der mikroskopischen Beobachtung danach einer Inkubation bei 37" C während 48 Stunden zeigt. Darüber hinaus zeigt die Substanz SF-1771-B eine Antltumoraktlvltäi gegenüber Tumorzellen von Sarcoma 180. So wurde eine wäßrige Suspension

(0,05 ml) von Sarcoma-180-Tumorzellen bei mehreren Gruppen von Mäusen, wobei jede Gruppe aus fünf Mäusen von ICR-Stamm (männlich, etwa acht Wochen alt) bestand, bei einer Dosierung von 10,4x10* Zellen pro Maus intraperitoneal eingeimpft. 24 Stunden nach der (i. p.) Einimpfung der Tumorzellen wurden 16 mg/kg, 8 mg/kg, 4 mg/kg, 2 mg/kg und 1 mg/kg der Substanz SF-1771-B pro Maus durch intraperitoneale Injektion einmal täglich während drei Tagen gegeben. Zum Vergleich wurden 40 mg/kg, 20 mg/kg, 10 mg/kg und 5 mg/kg an Bleomycin bei der Vergleichsgruppe der Mäuse in der

10 gleichen Weise wie die Substanz SF-1771-B gegeben. In jeder Gruppe wurden fünf mit Tumorzellen geimpfte Mäuse verwendet. Die mittlere Anzahl der Überlebenstage bei den behandelten Mäusen, die prozentuale Zunahme der Lebensspanne (abgekürzt als ILS %) gegenüber den Kontrollmäusen und das Bauchwasservolumen wurden zur Abschätzung der Antltumoraktivität der Substanz SF-1771-B und von Bleomycin gemessen. Der Wert von ILS (%) wurde nach folgender Gleichung berechnet:

mittlere Überlebenstage der behandelten Mäuse

f ■ " IJ X IUU

mittlere Überlebenstage der Kontrcllmäuse Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X zusammengestellt: Tabelle X

Testverbindung	Dosis (mg/kg)	mittl. Anzahl der Überlebens tage	ILS (%)	Bauchwasser volumen (ml)	60 Tage überlebende Mäuse
SF-1771-B	16	8,8	- 50	0	0/5
	8	31,4	78.4	0,1	0/5
	4	36,8	109,1	13.0	0/5
	2	37,2	111.4	19,2	0/5
	1	29,0	64,8	21.8	0/5
Bleomycin (Vergleichs verbindung)	40 20 10	45.8 36,8 35,0	160,2 109,1 98,9	13,0 20.2 21.4	2/5 0/5 0/5
	5	19,8	12,5	26.4	0/5
Kontrolle	0	17,6		23,8	0/5

Wie aus der Tabelle X ersichtlich, ergibt die Dosis von 2 mg/kg an SF-1771-B den maximalen Wert ILS von 111.4%, was nahelegt, daß eine optimal wirksame Dosis der Substanz SF-1771-B im Bereich von 2 bis 4 mg/kg für die therapeutische Behandlung von Sarcoma-180-Tumorzellen (Wasserbauchsucht) tragenden Mäusen Ist. und daß die Substanz SF-1771-B bei niedrigeren Dosismengen als Bleomycin wirksam ist.

Daher ist die erfindungsgemäße Substanz SF-1771-B als AnUtumormittel in ähnlicher Weise wie Bleomycin anwendbar und kann in den bekannten, pharmazeutisehen Formen formuliert und in der gleichen Weise wie Bleomycin appliziert werden.

Bezüglich der Verwendung der Substanz SF-1771-B gemäß Anspruch 3 sei darauf hingewiesen, daß die tatsächlich verwendeten Mengen der Substanz SF-1771-B entsprechend der besonderen, formulierten Zusammensetzung, der Applikationsart und dem besonderen Situs und dem besonderen, zu behandelnden Organismus variieren können. Zahlreiche Faktoren, welche die Wirkung der Arzneimittels modifizieren, können von dem Fachmann in Rechnung gezogen werden, z. B. Alter. Körpergewicht, Sex, Diät, Applikationszeil. Applikationsweg. Geschwindigkeit der Exkretion. Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeiten und Schwere der Krankheit. Die optimalen Applikationsmengen für eine vorgegebene Zustandskombination können von dem Fachmann unter Anwendung der konventionellen Bestimmungstests für die Dosismenge unter Berücksichtigung der zuvor gegebenen Richtlinien bestimmt werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, wobei das Beispiel 1 allerdings nur die Herstellung des Hydrochlorids der Substanz SF-1771 beschreibt.

Beispiel 1

35 1 eines Kulturmediums mit pH = 7.0, welches 4.0' Saccharose. 1.0¹O Sojabohnenöl. 3.0% Sojabohnenmehl. 2,0% Weizenkeime. 0.6% Natriumchlorid und 0,003% Kupfersulfat enthielt, wurden in einem Standgefäßfermentator mit einem Fassungsvermögen von 50 I eingegeben und durch Erhitzen sterilisiert. In dieses sterilisierte Kulturmedium wurde eine Saatkultur von Streptomyces toyocaensis. Stamm SF-1771 (ATCC 31248). die zuvor in einem Schrägagarmedlum Inkubiert worden war. eingeimpft. Das beimpfte Kulturmedium wurde bei 28'¹ C während 114 Stunden unter Belüftung und Rühren (Rührgeschwindigkeit 300 Upm) inkubiert.

Die so erhaltene Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmiuel filtriert und es wurden etwa 20 1 Brühenfiltrat aufgefangen. Dieses Brühenfiltrat wurde durch eine Säuie \on 2 1 adsorbierendem Harz In Form eines synthetischen, adsorbierenden Harzes, das aus einem mikroporösen Copolymerisat aus Styrol und Divinylbenzol bestand (Amberlite XAD-2). zur Adsorption der aktiven Subsiun/ durch das Harz geschickt. Das Harz wurde mit 20 I Was-

ser gewaschen, dann wurde es mit 10 1 50%lgem wäßrigem Aceton (einem Gemisch aus Aceton-Wasser, 1 : 1 in Volumen) gewaschen und anschließend mit 50%lgem wäßrigem Aceton (pH = 3, angesäuert durc h Zugabe von Salzsäure) zur Herbeiführung der Desorption der aktiven Substanz elulert.

Das Eluat wurde In Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 N wäßriger Nafriumhydroxidlö.cung neutralisiert; hieran schloß sich eine Konzentration unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons an. Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säuie von 250 rnl eines Gelfiltrationsmittels, in Form eines carboxy methylsubstituierten, vernetzten Dextrangels (CM-Sephadex C-25) (H⁺) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Gelsäule wurde mit 215 1 Wasser und dann mit 0,5 1 einer 0,1 M wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, anschließend wurde mit 0,2 M wäßrigem Natriumchlorid entwikkelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml aufgefangen, wobei gefunden wurde, daß die Fraktionen 124 bis 198 die aktive Substanz enthielten. Das Gesamtvolumen dieser aktiven Fraktionen betrug ungefähr das zehnfache bis zwölffache des Volumens des Gels bei der Gelfiltration (CM-Sephadex-Gel). Diese aktiven Fraktionen wurden durch eine Säule von 100 ml eines synthetischen, adsorbierenden Harzes In Form eines mikroporösen Copolymerisates aus Styrol und Dlvinylbenzol (Diaion HP-20) zur Adsorption der aktiven Substanz durchgeschickt. Das Harz wurde mit 200 1 Wasser gewaschen, anschließend wurde mit 400 ml von 15%lgem wäßrigem Methanol (15% Methanol in Wasser) zum Entsalzen elulert und dann mit 500 ml 30%igem wäßrigem Methanol (30% Methanol in Wasser) zur Desorption der aktiven Substanz eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 100 ml aufgefangen. Die Fraktionen 1 bis 5, welche die aktive Substanz enthielten, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, um ein grün gefärbtes Rohpulver der Substanz SF-1771 zu erhalten.

Dies rohe Pulver (320 mg) wurde In 10 ml Wasser aufgenommen und die erhaltene, wäßrige Lösung wurde durch eine Säule von 50 ml des zuvor verwendeten Dextrangels (H⁺) (CM-Sephadex C-25) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Das Dextrange! wurde mit 500 rnl Wasser gewaschen und dann mit 0,15 M wäßriger Natriumchlorldlösung entwickelt. Das Eluat wurde In Fraktionen von 18 ml aufgefangen und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 82 bis 122) wurden miteinander vereinigt, wobei das Gesamtvolumen dieser aktiven Fraktlonen etwa das dreißigfache des Volumens des Dextrangels betrug, und dann wurden sie wiederum durch eine Säule von 50 ml des synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20) zur Adsorption der Substanz SF-1771 durchgeschickt. Nach dem Waschen mit 100 ml Wasser wurde das Harz mit 100 ml Wasser und dann mit 100 ml 15%lgem wäßrigem Methanol zum Entsalzen elulert und abschließend mit 30%lgem wäßrigem Methanol zur Desorption der Substanz SF-1771 elulert. Das Eluat wurde In Fraktionen von 35 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen, die vom Natrlumchlorldgehalt befreit waren (Fraktionen 2 bis 7) wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 42 mg eines grünlich-blau gefärbten, rohen Pulvers der Substanz SF-1771 (etwa 60% Reinheit) erhalten wurden.

Diese 42 mg des rohen Pulvers der Substanz SF-1771 wurden In 2 ml 90%lgem wäßrigem Methanol (90% Methanol In Wasser) aufgenommen, und die erhaltene.

wäßrige Lösung wurde auf einer Säule von 350 ml eines Gelfiltrationsmittels, bestehend aus einem Derivat von Dextransulfat (Sephadex LH-20) chromatografiert, mit 90%igem wäßrigem Methanol entwickelt, wobei 12 ml der blau gefärbten, aktiven Fraktion anfielen. Diese biau getärbte Fraktion wurde zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein blau gefärbtes und reines Produkt des Hydrochlorldes der Substanz SF-1771 (enthaltend die chelatlerte Kupferkomponente) erhalten wurden. Ausbeute = 24 mg.

Beispiel 2

(a) 3001 eines Kulturmediums (pH = 7,0), welches 4,0% Saccharose, 1,0% Sojabohnenöl, 3,0% Sojabohnenmehl, 2,0% Weizenkeime, 0,6% Natriumchlorid und 0,003% Kupfersulfat enthielt, wurden in einen Tankfermentator mit einem Fassungsvermögen von 570 1 eingegeben und dann durch Erhitzen sterilisiert. In dieses sterilisierte Kulturmedium wurde eine Kultur des Stammes SF-1771 (ATCC 31248), die zuvor in einem 0,501 Becherfermentator gezüchtet worden war, eingeimpft. Das Inkubieren wurde bei 28° C für 144 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsstoff filtriert. Das erhaltene Brühenfiltrat (etwa 1901) wurde durch eine Säule von 18 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Amberllte XAD-2) zur Adsorption der aktiven Substanz filtriert Das Harz wurde mit 1801 Wasser und dann mit 40 1 50%lgem wäßrigem Aceton (Aceton-Wasser, 1 : 1 in Volumen) gewaschen, hieran schloß sich die Elutlon mit 501 50%igem wäßrigem Aceton (pH = 3, angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) an. Das Eluat wurde In Fraktionen von 5 1 aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 bis 9) -wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 N wäßriger Natrlumhydroxldlösung neutralisiert und unter vermindertem Druck durch Abdampfen des Acetons eingeengt.

Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Säule von 1 1 des in Beispiel 1 verwendeten Dextrangelflltratlonsmittels (CM-Sephadex C-25) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Säule wurde mit 5 1 Wasser und dann mit 2 1 0,1 M wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, anschließend folgte die Entwicklung mit 0,2 M wäßriger Natriumchlorldlösung, so daß die aktive Substanz elulert wurde. Das Eluat wurde In Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 82 bis 240) wurden durch eine Säule von 1 1 des In Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Dlalon HP-20) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt, diese Harzsäule wurde dann mit 2 1 Wasser zum Entsalzen gewaschen und dann mit 1 1 30%igem wäßrigem Methanol zur Herbeiführung der Desorption der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 2 bis 5) wurden erneut durch eine Säule von 200 ml des zuvor verwendeten Dextrangelflltratlonsmlttels (CM-Sephadex C-25) zur Adsorption der aktiven Substanz geschickt. Die Gelsäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,2 M wäßriger Natriumchlorldlösung zur Herbeiführung der Desorption der Substanz SF-1771 elulert. Das Eluat wurde In Fraktionen von 18 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 98 bis 256) wurden durch eine Säule von 600 ml des zuvor verwendeten synthetischen, adsorbierenden Harzes (Dlalon HP-20) geschickt, danach wurde mit 21 Wasser zum Entsalzen gewaschen und anschließend mit 1 I

30%lgem wäßrigem Methanol zur Desorption der Substanz SF-1771 eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 bis 5) wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde zur Trockne eingeengt, wobei etwa 3 g eines grün gefärbten, rohen Pulvers der Substanz SF-1771 (Reinheit = 48%) erhalten wurden.

Diese 3 g rohes Pulver der Substanz SF-1771 wurden In 7 ml 90%lgem wäßrigem Methanol aufgenommen, und die erhaltene, methanolische Lösung wurde einer Verteilungschromatographie auf einer Säule von 1,5 I des zuvor verwendeten Dextransulfatgels (Sephadex LH-20) unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus Butanol-Methanol-Wasser (4:1:2 In Volumen) als Entwicklerlösungsmittel unterworfen. Das Eluat wurde in Fraktionen von 15 ml aufgefangen, und die blau gefärbten, aktiven Fraktionen (Fraktionen 32 bis 44) wurden gesammelt. Diese aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei 1,2 g eines partiell gereinigten Pulvers der Substanz SF-1771 (Reinheit = 90%) erhalten wurden. Dieses Rohprodukt der Substanz SF-1771 (1,2 g) wurde In 6 ml 90%igem wäßrigem Methanol aufgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde auf einer Säule von 1,21 des Dextransulfatgels (Sephadex LH-20) unter Verwendung von 90%igem wäßrigem Methanol als Entwicklerlösungsmittel chromatografiert. Das Eluat wurde In 16 ml Fraktionen gesammelt, und die blau gefärbten, aktiven Fraktionen (Fraktionen 26 bis 31) wurden in einem Gesamtvolumen von 98 ml erhalten. Diese aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771 als blau gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 1 g.

(b) 150 mg dieser Substanz SF-1771 wurden in 15 ml Methanol aufgelöst, und in die erhaltene, meihanoüsche Lösung wurde gasförmiger Schwefelwasserstoff eingeleitet, bis die Lösung nicht mehr die blaue Farbe zeigte (etwa 4 Minuten). Während dieses Einleltens lagerte sich ein Niederschlag von Kupfersulfid ab. Der Niederschlag ^o wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde zu einem Volumen von etwa 4 ml unter vermindertem Druck eingeengt. Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wurde auf einer Säule von 1 I des Dextransulfalgels (Sephadex LH-20) unter Verwendung von 90%igem wäßrigem Methanol als Entwicklerlösungsmittel chromatografiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 18 ml gesammelt, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 22 bis 27) wurden in einem Gesamtvolumen von 112 ml erhalten. Die vereinigten, aktiven Fraktionen wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B als weiß gefärbtes, amorphes Pulver erhalten wurde. Ausbeute = 107 mg.

Beispiel 3

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35 1 eines Kulturmediums (pH = 7,0), welches 4,0% Saccharose, "1,0% Sojabohnenöl, 3,0% Sojabohnenmehl, 2,0% Weizenkeime, und 0,6% Natriumchlorid enthielt, wurden in einen Tankfermentator mit einem Fassungsvermögen von 50 I eingegeben. Nach der Sterilisation des Kulturmediums durch Erhitzen wurde das sterilisierte Kulturmedium mit einer Impfkultur des Stammes SF-1771 (ATCC 31248), die zuvor inkubiert worden war, beimpft. Die Kultivierung wurde bei 28⁰C für 114 Stunden unter Belüften und Rühren durchgeführt. Die Fermentationsbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde als Filtrationshilfsmittel filtriert, so daß etwa 201 des Brühenfiltrates erhalten wurden.

Durch das Brühenflltrat wurde gasförmiger Schwefelwasserstoff für etwa 40 Minuten bei Umgebungstemperatur durchgeleitet, danach wurde die Reaktionslösung durch Einblasen von Luft zur Entfernung des überschüssigen Schwefelwasserstoffs aus der Reaktlonslösrng gespült. Die Lösung wurde dann durch eine Säule von 2 1 des in Beispiel 1 verwendeten, synthetischen, adsorbierenden Harzes (Amberllte XAD-2) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B geschickt.

Die Harzsäule wurde mit 20 1 Wasser und dann mit 101 50%lgem wäßrigem Aceton gewaschen und schließlich mit 50%lgem wäßrigem Aceton (pH = 3, angesäuert durch Zugabe von Salzsäure) eluiert. Das Eluat wurde In Fraktionen von 500 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 3 bis 12) wurden miteinander vereinigt und durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde unter vermindertem Druck durch Abdestlllieren des Acetons eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde dann durch eine Säule von 250 1 des In Beispiel 1 verwendeten, vernetzten Dextrangels (H*) (CM-Sephadex C-25) zur Adsorption der aktiven Substanz durchgeschickt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 0,2 M wäßriger Natriumchloridlösung zur Desorption der aktiven Substanz eluiert.

Das Eluat wurde In Fraktionen von 18 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 68 bis 126) wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde mit 100 ml eines synthetischen, adsorbierenden Harzes (Diaion HP-20) zur Adsorption der Substanz SF-1771-B behandelt. Die Harzsäule wurde mit 300 ml Wasser gewaschen, dann mit 500 ml 60%igem wäßrigem Methanol zur Desorption der aktiven Substanz eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 520 mg eines rohen Pulvers der Substanz SF-1771-B erhalten wurden Dieses rohe Produkt wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, weiter gereinigt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771-B erhalten wurde. Ausbeute = 86 mg.

Beispiel 4

Das Hydrochlorid der Substanz SF-1771 (200 mg) wurde In 20 ml 0,2%iger Natriumsulfidlösung in Wasser aufgelöst und für 10 Minuten gerührt, bis die blaue Farbe sich zu der dunkelbrauner Farbe des ausgefällten Kupfersulfids umgewandelt hatte. Das ausgefällte Material wurde durch Filtration entfernt und verworfen.

Das Filtrat wurde mit 1 N Salzsäure neutralisiert und auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit dem zuvor verwendeten synthetischen, adsorbierenden Harz (Diaion HF-20 Harz) entsalzt.

Die Eluatfraktlonen wurden miteinander vereinigt, anschließend wurde zur Trockne eingeengt, wobei etwa 188 mg eines farblosen, rohen Pulvers der Substanz SF-1771-B erhalten wurden.

Beispiel 5

350 mg des Hydrochlorides der Substanz SF-1771 wurden in 30 ml 0,1 N Salzsäure aufgelöst und wiederholt mit 0,5% Dithlzon enthaltendem Chloroform extrahiert, bis keine rötlich-violette Färbung mehr zurückblieb.

Nach der Entfernung der Chloroformphase wurde die zurückbleibende, wäßrige Lösung wiederholt mit Chloroform gewaschen. Die wäßrige Lösung wurde mn einem Anionenaustauscherharz (ΟΉΤ) (Amberllte IR-45) neutralisiert und im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei

ein gelbliches Rohpulver (342 mg) der Substanz SF-1771 B erhalten wurde. Dieses Produkt der Substanz SF-1771-B (342 mg) wurde In 4 ml 90%igem wäßrigem Methanol aulgenommen, und die so erhaltene Lösung wurde auf einer Säule von 700 ml des zuvor verwendeten DextransulfatgeU 'Sephadex LH-20) unter Verwendung von 90'vigem wäßrigem Methanol als Entwlcklerlösungsmlttel chromatograflert.

Das Eluat wurde In Fraktionen von 10 ml aufgefangen, und die aktiven Fraktionen (Fraktionen 30 bis 36) wurden zu einem Gesamtvolumen von 72 ml vereinigt und Im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1771 -B als farbloses, amorphes Pulver erhalten wurde. Ausbeule = 287 mg.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Substanz SF-1771-B, eine farblose oder schwach gelb gefärbte Polypeptldverbindung in Form eines amorphen Pulvers, welches basisch und löslich in Wasser ist und eine antibakterielle Aktivität sowie eine Antiiumoraktivltät aufweist, deren Hydrochlorid sich langsam nach braun bei 180° C verfärbt und sich bei 212° C unter Schäumen zersetzt, deren Hydrochlorid in Wasser leicht löslich ist, in Methanol löslich ist, in Äthanol und Butanol gering löslich ist, jedoch in den anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, deren Hydrochlorid bei den Reaktionen mit Ninhydrinreagens, Ehrlich-Reagens, Kaliumpermanganatreagens und Greig-Leiback-Reagens positiv ist und bei der Reaktion mit Sakaguchi-Reagens negativ ist, deren Hydrochlorid ein Molekulargewicht von etwa 1600, gemessen nach der Barger-Methode, besitzt und eine spezifische optische Drehung von U]^⁰ = -18,4° (c=l, HO) aufweist, deren Hydrochlorid bei der Elementaranalyse folgende Werte zeigt: C = 41,36%, H = 5,53%, N = 14.19%, S = 3,64% und O = 28,93%, deren Hydrochlorid eine charakteristische Absorptionsspitze bei 288 bis 290 nm (EJ"_cm= 84) im UV-Absorptions-Spektrum, aufgelöst in Wasser, zeigt, und charakteristische Absorptionsbanden, wie sie in Flg. 5 gezeigt sind, im IR-Absorplionsspektrum als Tablette in Kaliumbromid zeigt und weiterhin bei der protonenmagnetischen Resonanz ein Absorptionsspektrum, wie es in Flg. 6 dargestellt ist, aufgelöst in Deuiero-Wasser. aufweist, und außerdem bei der kupferhaltlgen Vorläufersubstanz SF-1771 dessen Hydrochlorid ein Gradlentenelutionsmuster auf einem lonenaustauschergel-Filtrationsmittel Im Vergleich zu dem Elutlonsmuster von Ammonlum^formiat aufweist, wie es in der Fig. 3 dargestellt ist, sowie pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Substanz SF-1771-B, wobei die Fig. 3, 5 und 6 Bestandteil dieses Anspruchs sind.

2. Verfahren zur Herstelking der Substanz SF-1771-B des Anspruchs 1. dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Streptomyces loyocaensis ATCC 31248 In einem Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Kulturmedium bei einer Temperatur von 25 bis 35" C unter aeroben