DE2344020A1 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephemimycin - Google Patents

Description

Priorität: 31. August 1972, Japan, Nr. 87 339/1972

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephemimycin

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephemimycin. Die Erfindung betrifft insbesondere ein neues mikrobiologisches Herstellungsverfahren für dieses Antibiotikum.

Es wurde nämlich gefunden, daß das Antibiotikum Cephemimycin in einer KuItürbrühe des Mikroorganismus Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. 3008 erzeugt wird. Dieser Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die bei Jumonjitoge, Chichibu, Saitama Prefecture ,Japan gesammelt wurde. Das Antibiotikum kann aus dieser Kulturbrühe isoliert und gereinigt werden. Es ist gegenüber gram -negativen Bakterien, insbesondere gegenüber streptomycin-resistenten, kanamycin-resistenten und multi-resistenten Erregern von Sscherichia, multi-resistenten Erregern von Klebsiella und multi-resistenten Erregern von Proteus hoch wirksam.

Das Antibiotikum Cephemimycin, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt wird, hat die folgende chemische Struktur. Dieses Antibiotikum wurde als die gleiche Substanz identifiziert, wie sie als "antibiotisehe Substanz 1-l6S86l" in der Niederländischen Patentschrift 7oll8o5 und als "antibiotisehe Substanz 842A¹¹ in

4 0 9 810/1188

on®_lNAL

23ΊΌ20

den offengelegten Unterlagen der Japanischen Patentanmeldung 3286/1971 beschrieben wird. Dem Cephemimycin kommt folgende Strukturformel zu:

H₂N-CH(CH )_-C-HN

COOH

OCH

Die morphologischen Eigenschaften des oben genannten Cephemimyci: erzeugenden Stammes Nr. 3008' sind wie folgt:

(1) Bei der Beobachtung unter einem Mikroskop zeigt sich, daß das Luftmycel gut verzweigt ist und eng geschlossene Ipiralen bildet. Es werden jedoch keine Konoid-Ketten beobachtet. Die Sporen haben eine zylindrische Gestalt und eine Größe von 0,6 0,8 χ l,o - l,2,u. Die Sporenoberfläche ist glatt. Sporenkettsen sind in Io - 50 Sporen je Sporenkette. Es v/erden keine Gei3elsporen und Sporandien gebildet. Auf dem Luftmycel befinden sich Sporophoren.

(2) In Tabelle I sind die Ergebnisse zusammengestellt, die bein; Züchten auf verschiedenen Kulturmedien erhalten wurden (die Beobachtung erfolgte nach einer 2-wöchigen Kultivierung bei 28°C, wenn nichts anderes angegeben ist).

	Wachs tum	Luftmycel	Tabelle I	Rückseite	lösliches Pigment
	mäßig	schwach, weiß		weiß	keines
Medium		Substrat- mycel
Saccha- rose- Nitrat- Agar	schwach, farblos

409810/ 1 1 88

BAD

Medium	Wachs tum	Luftmycel	Substrat- mycel	Rückseite	lösliches Pigment
Glucose- Asparagin- Agar	gut	mäßig, braun- grau	schwach, gelb grau	leicht bräun lichgrau	dto.
Glycerin- Asparagin- A gar	mäßig	schwach, weiß	üppig, gelb grau	fahl gelbbraun	dto.
Anorganische Salze-Stärke- Agar	gut	schwach, grau weiß	mäßig, gelb grau	fahlgelb	dto.
Tyrosin- Agar	mäßig	keines	mäßig, farblos	fahlgelb	dto.
Nährstoff- Agar-Medium	gut	schwach, weiß	mäßig, gelbgrau	fahlgelb	dto
Hefeextrakt- Malzextrakt- Agar	üppig	üppig, weiß bis braungrau	üppig, gelbgrau	mattgelb	fahlgelb braun
Hafermehl- Agar	mäßig	keines	mäßig, farblos.	farblos	keines

In Tabelle II sind die physiologischen Eigenschaften des Stammes Nr. 3008 zusammengestellt.

Tabelle II

Temperaturbereich für das Wachstum: l8 - 37°C

Gelatinverflüssigung (l8°C): , kein Wachstum

.Stärkehydrolyse:

Milchkoagulierung: 25⁰C, 7 Tage

37°C, kein Wachstum

Milchpeptonisierung: 25°C, 7 Tage + (pH 6,4)

37°C, kein Wachstum

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- 4 - 23AA 020

Melaninbildung: (in Tyrosin-Agar-Medium)

(in Pepton-Hefeextrakt-Eisenagar-Medium)

Nitratreduktion· —

(4) In Tabelle III ist das Kohlenstoff-Verwertungsmuster des Stammes Nr. 3°°8 auf einem Agar-Medium nach Pridham-Gottlieb zusammengestellt.

Tabelle III

. L-Arabinose	+ Lactose +
D-Xylose	Cellobiose +
D-Glucose	+ Trehalose
D-Galactose	+ Raffinose
D-Mannose	+ Inulin
D-Pructose	Inosit +
L-Rhamnose	+ D-Mannit
Saccharose	+

Aus der Zusammenfassung der obigen Eigenschaften geht hervor, daß der Stamm Nr. 3008 zu der Art Streptomyces gehört. Sein Mycelium bildet dicht enge Spiralen". Die Sporen haben eine zylindrische Gestalt und die Sporenoberfläche ist eben. Auf verschiedenen Medien wird ein farbloses bis gelbgraues Wachstum beobachtet. Es werden weiße bis braungraue Luft-Hyphen gebildet. Lösliche Pigmente werden nur spärlich bisjzu einem Ausmaß gebildet, daß einige fahlgelblich-braune lösliche Pigmente nur in einem Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium beobachtet werden. Auch werden fahlgelbe bis leicht bräunlich-graue Färbungen auf der Rückseite der Kolonie beobachtet. Hinsichtlich der physiologischen Eigenschaften wird keine Melanin-Bildung, Stärkehydrolyse und Milchkoagulierung beobachtet. Wenn man unter den bekannten Stämmen mit den obigen Eigenschaften sucht, dann kann man als den am-nächsten kommenden Stamm den Stamm Actinomyces r.-ru^abilis bezeichnen, der im International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. l8, Nr. 2 148 - 15o (1968)

4098 10/1188 U_00n^ -5-

2 3 A /_; O 2 O

beschrieben wird.

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm Nr. 3008 unterscheidet sich Jedoch vom Stamm ISP Nr. 5169, der der autentische Stamm von Actinomyces mutabilis ist, durch die in der Tabelle IV angegebenen Unterschiede.

Tabelle IV

Natur

Stamm Nr.

Stamm ISP Nr. 5169

Gestalt, Ober- zylindrisch, glatt fläche und Anzahl der Io - 50 Sporen
Sporen

zylindrisch, glatt, 3 - Io Sporen

Spiralen	kompakte Spiral faden	Spiralfäden oder Hakenfäden
Farbe des Luft-, mycels	weiß bis bräunlich grau	weiß bis grau
Coremienbildung	+	-
Spyrophoren	spiralförmig	spiralförmig oder hakenförmig
Kohlenstoff-Ver wertung	D-Xylose, D-Fructose, jedoch keine Verwer tung von D-Mannit	D-Xylose, D-Fructose, D-Mannit verwertet
Antibiotikum-	Cephemimycin
Bildung

Aus den obigen Gründen geht hervor, daß der Stamm Nr. 3008 als eine neue Art identifiziert wurde, die sich ausgeprägt von Actinomyces mutabilis unterscheidet. Er erhielt die Bezeichnung Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. 3°°8· Der Stamm Nr. J5o°8 wurde unter der Hinterlegungsnummer 15^5 beim Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of,International Trade and Industry, Japan und auch unter der Hinterlegungsnummer NRRL-ST¹H beim Northern

SAD OPUQINAL

9 8 10/1188

2 3 A Λ '^: 2 Q

Regional Research Laboratory, Northern Central Region, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, at Peoria, Illinois, U.S.A., hinterlegt..

Bekanntlich sind verschiedene Eigenschaften von Streptomyces nicht definiert, sondern sie können leicht natürlich und künstlich variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Stämme schließen daher sämtliche Stämme ein, die zur Art Streptomyces gehören und die dazu imstande sind, Cephememycin zu erzeugen.

Nachfolgend wird ein Vergleich der verschiedenen Eigenschaften des Stammes Nr. 3008 mit demjenigen von Mikroorganismen gegeben, die das gleiche Antibiotikum Cephemimycin erzeugen. Es handelt sich dabei um Streptomyces clavuligerus gemäß der Niederländischen Patentschrift 7 oll 805 und International Journal of Systematic Bacteriology, 21, 4, 326, 1971 sowie Streptomyces lactamdurans gemäß der offengelegten Japanischen Patentanmeldung Nr. 3286/1971.

(1) Morphologische Eigenschaften (nach einer l4-tägigen Kultivierung

Stamm
Eigenschaften

Streptomyces jumonjinensis

Streptomyces clavuligerus

Streptomyces lactamdurans

Verzweigung des
Luftmycels

monopodiale Verzweigung

sympodiale Verzweigung (keulenförmige Seitenverzweigungen)

gerade mit wenigen Verzweigungen

Spyrophoren	spiralenförmig	gerade bis gebogen	keine
Sporenketten	«je Kette I0-50	1 - 4 je Kette	keine
Geiselsporen	keine	keine	keine

AQ981Q/1188 OFMWNAL INSPEÖTiD

Stamm
Eigenschaften

Streptomyces Streptomyces Streptomyces jumonjinensis clavuligerus lactamdurans

Sporangium

keine keine

keine

Sporenoberfläche

glatt (zylindrisch) glatt (länglich bis
zylindrisch)

keine

Stelle der Sporoforen-Bildung

nur auf dem Luftmycel nur auf dem
Luftmycel

(2) Kultureigenschaften nach verschiedenen Agar-Medien (nach l4-tägiger Kultivierung)

Streptomyces Streptomyces Streptomyces jumonjinensis clavuligerus lactamdurans

Saccharose-Nitrat-Agar

Wachst, mäßig Luftmyc. schwach, weiß Rucks. weiß lösl.Pig. keines spärlich

mäßig

cremeweiß

tief cremefarben

keines

Glucose-Aspa- Wachst, gut

ragin-Agar Luftmyc. gut, olivgrau Rucks. gelbgrau lösl.Pig. keines mäßig
gut, weiß
fahl gelblich grün
keines

Glycerjn-Aspa-Wachst. mäßig ragin-Agar Luftmyc. schwach, weiß Rucks. fahlgelb

lösl.Pig. keines gut

gut, weiß
fahl-gelblichgrün
keines

mäßig

cremefarben golden bis orange

fahlbernsteinfarben

Anorganische Wachst, gut Salze-Stärke- Luftmyc. schwach, hell-Agar grau

Rucks. fahl-gelblichbraun

lösl.Pig. keines üppig mäßig gut, graues weiß bis grün Medium bis zimtfarbig graugelb cremefarbig bis grünlich-orange keines keines

Nährstoff-Me- Wachst, gut dium Luftmyc. schwach, weiß

Rucks. fahl-gelblichbraun

lösl.Pig. keines gut mäßig spärlich, weiß cremefartig fahl-gelblich- golden grün

keines keines

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Streptomyces Streptomyces Streptomyces jumonjinensis clavuligerus lactamdurans

Tyrosin-	Wachst.	mäßig	mäßig	mäßig	weiß	-	mäßig
Agar	Luftmyc.	keines	schwach, gelb-cremefarben und	lohgelb bis		cremefarben
			1ichgrau	orange		orange
	Rucks.	hellgelblich-	fahlgelb	keines	keines
		braun			* Tomatenpaste-Hafermehl-Agarmedium für Streptomyces lactam-
	lösl.Pig.	keines	keines
Hefeextrakt-	Wachst.	üppig	üppig
Malzextrakt-	Luftmyc.	üppig, weiß	üppig, leicht
Agar			grünlich-oliv
	Rucks.	mattgelb	grün-.lichgelb
	lösl.Pig.	keines	keines
Hafermehl-	Wachst.	mäßig	mäßig
Agar *·	Luftmyc.	keines	gut, weiß
	Rucks.	farblos	fahlgelb
	lösl.Pig.	keines	keines

durans

Physiologische Eigenschaften

	Streptomyces Jumonjinensis	Streptomyces clavuligerus	-	nicht beschrie ben	Streptomyces Iac taiiKhir ans
	-	-	-
Tyrosinase-Reaktion	-	-
Nitrat-Reduktion	-	-
Stärkehydrolyse	-	+
Gelatinverflüssigung <	+

Melaninbildung Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar Tryρ t on-He fe brühe

nicht beschrieben

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- 9

Streptomyces Streptomyces Streptomyces jumonjinensis clavuligerus lactamdurans

Milchkoagulierung: 25 C

- (Tempera- nicht betur nicht schrieben kein Wachstum beschrieben)

Milchpeptonisierung:

25°C 37°C

+ (pH 6,4) kein Wachstum

+ (Tempera- + (Alkali) tür nicht (Temperatur beschrieben) nicht beschrieben

(4) Kohlenstoff-Verwertung

Streptomyces jumonjinensis

Streptomyces Streptomyces clavuligerus lactamdurans

D-Glucose L-Arabinose Saccharose L-Rhamnose Raffinose D-Xylose i-Inosit D-Mannit D-Pructose

Aus den oben angegebenen Vergleichsuntersuchungen hinsichtlich der physiologischen und morphologischen Eigenschaften kann eindeutig die Schlußfolgerung gezogen werden, daß der erfindungsgemäß verwendete Stamm Streptomyces Jumonjinensis sich in physiologischer und morphologischer Hinsicht ausgeprägt von dem Stamm Streptomyces lactamdurans unterscheidet. Weiterhin kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus sich ausgeprägt von dem Stamm Streptomyces clavuligerus aufgrund der unterschiedlichen Verzweigung des Luftmycels unterscheidet, welche bei der Klassifizierung von Actinomyceten signifikant ist.

Λ09810/11Θ8

- Io -

Dafür spricht auch die große Unterschiedlichkeit der Kohlenstoff-Verwertung bei beiden Stämmen.

Die Kultivierung kann bei dem Verfahren der Erfindung nach der Methode durchgeführt werden, die allgemein für Streptomyces verwendet wird. Bevorzugt wird eine Schüttelkultur oder eine Submers-KuItür in einem flüssigen Medium.

Als Medium-Komponenten können alle bekannten Nährstoffe für Streptomyces verwendet werden. So können z.B. als assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin, Stärke, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, etc. und als assimilierbare Stickstoff quelle Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Maisquellflüssigkeit, Peptone, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat etc. verwendet werden. Als anorganische Salzekönnen z.B. Natriumchlorid, Phosphate, Calciumcarbonat, etc. verwendet werden. Erforderlichen-' falls kann eine geringe Menge eines Metallsalzes zugesetzt werden.

Bei Durchführung der flüssigen Kultivierung unter Belüftung und Durchbewegungkann geeigneterweise auch ein Antischaummittel, z.B. ein Silikonöl, ein Pflanzenöl oder ein oberflächenaktiver Stoff verwendet werden.

Der pH-Viert des Mediums kann geeigneterweise im neutralen Bereich oder darum herum sein. Die Kultivierungstemperatur kann gewöhnlich im Bereich von 25 - 30⁰C liegen, wobei insbesondere eine Temperatur von etwa 27°C bevorzugt wird.

Zeitliche Veränderungen der Aktivität des Antibiotikums Cephemimycin, das in der Kulturbrühe mit fortschreitender Kultivierung erzeugt wird, können nach dem bekannten Zylinderplatte-Testverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris als Testmikroorganismus durchgeführt werden. Gewöhnlich kann eine maximale Bildung von Cephemimycin erhalten werden, wenn man eine Kultivierung von 4o bis 80 Stunden durchführt. So wurden z.B. in einem Flaschenfermen-

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tator mit einem Volumen von J5o ml in der Kulturbrühe nach 4o Stunden ^o/Ug/ml Cephemimycin erzeugt.

Cephemimyein ist in Wasser leicht löslich und liegt vorherrschend in einem flüssigen Teil der Kulturbrühe vor.

Nach Beendigung der Kultivierung werden das Mycel und die anderen Peststoffe durch Filtration entfernt, wobei Diatomenerde und dergleichen als Filterhilfsmittel verwendet werden. Die Entfernung kann auch durch Abzentrifugieren durchgeführt werden. Das in dem Filtrat oder der überstehenden Phase enthaltene Cephemimycin kann isoliert und unter Verwendung seiner physicochemischen Eigenschaften gereinigt werden.

So kann z.B. das Cephemimycin aus der Kulturbrühe durch Verwendung eines Absorptionsmittels gewonnen werden. Als Absorptionsmittel kann z.B. Aktivkohlepulver verwendet werden. Das durch das Aktiv-· kohlepulver adsorbierte Cephemimycin kann mit Methanol-Wasser, n-Butanol-Wasser, wässrigem Aceton und .dergleichen eluiert werden. Da Cephemimycin eine amphotäre Substanz mit einer starken Acidität und einer schwachen Basicität ist, kann es auch an Kationen- oder Anionen-Austauscherharzen adsorbiert und daraus eluiert werden.

Beispiele für geeignete Kationenaustauscher-Harze sind stark saure Kationenaustauscher-Harze wie Dowex 5oW χ k (hergestellt von Dow Chemical Co., U.S.A.), Amberlite IR-12o (hergestellt von Rohm & Haas Co., U.S.A.) und dergleichen. Beispiele für geeignete Anionenaustauscher-Harze sind stark basische Anionenaustauscher-Harze, wie Dowex IxI (hergestellt von Dow Chemical Co.) etc. Vorzugsweise werden jedoch schwach basische Anionenaustauscher-Harze wie Duolite A-2 (hergestellt von Diamond-Alkali Co., USA) verwendet, Ferner kann eine Chromatographie durchgeführt werden, wobei z.B. Silikagel, Avicel (mikrokristalline Cellulose von AsähiKasei Kogyo K.K., Japan) etc. verwendet wird. Das Cephemimycin kann auch durch Dünnschichtchromatographie durch wiederholte Verwendung Jeder beliebigen Kombination von solchen Reinigungsmaßnahmen zu einem

Λ 0 9 8 1 0/1188

einzigen isolierten Zustand gereinigt werden.

Das Cephemimycin besitzt die folgenden physicoehemischen Eigenschaften.

(1) Aussehen
fahl-gelblich-weißes Pulver

(2) Schmelzpunkt

160⁰C (unter Zersetzung)

(3) Elementaranalyse

C : 42,6o# H : 5,76# N : 11,42$ S:5,52#

(4) Spezifische Drehung

[oj²⁰ = + lo2° (c = 1, Wasser) D

(5) Neutralität, Basizität oder Acidität PKa¹ = 2,97, 9,41

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

In Tabelle V sind die Werte der maximalen Absorptionsstellen und von E₁^ entsprechend Pig. I zusammengestellt.

	Tabelle V	114 98 162	Absorptionsmaximum (να αϊ) Ε 1 % ' 1 cm	130 I08
Lösungsmittel	Absorptionsmaximum (m/a) „1 % / El cm		263 263
H2O ο,Ι η' HCl ο,Ι η NaOH	238 244 229 - 230

(7) Infrarot-Absorptionsspektrum

Gemäß Pig. 2 (gemessen mit KBr-Tabletten)

(8) Löslichkeit

Das Antibiotikum ist in Wasser leicht löslich, in Methanol löslich, in Äthanol schwach löslich und in anderen organischen

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Lösungsmitteln unlöslich.

(9) Farbreaktionen

Positiv bei den Ninhydrin-, Benedikt- und Tollens-Reaktionen.

Negativ bei Eisen(lll)-chlorid-, Biuret-, Resorcin-Salzsäure-, Anthron- und Elson-Morgan-Reaktionen.

(10) Stabilität

Die wässrige Lösung des Antibiotikums ist im sauren oder leicht alkalischen Zustand relativ stabil. Bei pH-Werten von 2, 7 und 8 bleiben 9o#, loo$ bzw. 85$ selbst nach einer 3o-minUtigen Wärmebehandlung bei 6o°C unverändert.

(11) Dünnschichtchromatographie

In Tabelle VI sind die Rf-Werte einer Dünnschichtchromatographie (aufsteigende Methode) bei Verwendung eines Cellulose-Chromatogram-Sheet 6065 (hergestellt von Eastman Kodak Co., U.S.A.) zusammengestellt. Zur Erfassung wurde eine Bioautographie. mit Proteus vulgar is oder eine Farbreaktion mit Ninhydrin angewendet.

Tabelle VI

Entwicklungslösungsmittel	■7)	Rf-Wert
n-Butanol : Essigsäure : V/asser .('2I- : 1 : 2)	: V/asser	o,33
4o$ n-Propanol	0,83
3$ Ammoniumchlorid : Methanol (3 : ι	o,5o
n-Propanol : Pyridin : Essigsäure (15 : Io : 3 1 lo)	o,29

Methyläthylketon : n-Butanol : Wasser
(3o : 5 : 65)

- 14 -409810/1188

(12) Hochspannungs-Papier-Elektrophorese Die Elektrophorese wurde 30 Minuten bei 3.300 Volt und 4o mA mit einer Pufferlösung aus Ameisensäure : Essigsäure : Wasser (1 : 3 : ^6) mit einem pH-V/ert von 1,8 unter Verwendung eines Toyo Filterpapiers Nr. 5 mit den Abmessungen 60 cm χ 2o cm (hergestellt von Toyo Roshi K.K., Japan) durchgeführt. Die Erfassung erfolgte in der gleichen V/eise •wie bei der Dünnschichtchromatographie. Die Beweglichkeit des Cephemimyeins ist 0,3, wenn diejenige von L-Alanin l,o ist.

Das pulverförmige Cephemimycin mit den obigen physicochemisehen Eigenschaften wird durch eine Säulenchromatographie wird durch eine Säulenchromatographie weitergereinigt, wodurch ein weißes Pulver erhalten wird, das die gleichen Eigenschaften, wie oben angegeben, mit Ausnahme der untenstehenden physikalischen iligenschaften besitzt.

(1) Elementaranalyse (als Monoarr,moniumsalz)

C * 4i 69^ H * 5 86¹^ N · i4 37^3 s * 6 88/0 berechnet: C : 4l,46^, H : 5,44£, N : 15,ll£, 3 : 6,92^

(2) Spezifische Drehung

]²⁰

(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum

i>]²⁰ = + 135° (c = 1, H
D

Lösungsmittel Absorptionsmaximum E ^l<3

	(nyu)	132 157
H2O 4	242 263	117 133
o,l η HCl	245 263

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Nachstehend sind die biologischen Wirkungen von Cephemimycin angegeben,

(l) Antimikrobielles Spektrum In Tabelle VII sind die minimalen Hemmungskonzentrationen für verschiedene Mikroorganismen zusammengestellt.

Tabelle	TestOrganismus	VII	Il	It	MHK /Ug/ml
Staphylococcus aureus 2o9P JC-2	Medium *	u \ ti	U	> 2oo
S. aureus 56	H	If	tt	2oo
S. aureus 193	It	P. mirabilis GN829 (multi-resistent) "	It	2oo
S. aureus 52-34	It	P. mirabilis GN1973	It	> 2oo
Bacillus subtilis PCI 219	It	P. mirabilis GN1973 R„„2984		12,5
Sarcina lutea PCI lool	Il	...... ijiM (multi*-resistent) Pseudonionas aeruftinosa B 1-1	25 -
Corynebacterium xerosis B58-3	Il	P. aeruginosa oC-8753	25
Mycobacterium smegmatis ATCC 6o7	Il	L·. §RL· sc -S328	>2oo
Escherichia coli NIHJ JC-2	G	12,5
E. coli (SM-resistent) Ej_ coli (KM-resistent) E^ coli GN2645 (multi-resistent) Klebsiella pneumoniae PCI 6o2	H	3,12 o,78 12,5 3,12
G It It It	6,25
K. pneumoniae C-N 2984 (multi-resistent) G	3,12
Proteus vulgaris OX 19	5o
P. rettgeri GIT2S25 (multi-resisten'	3,12
P. mirabilis I?O 3849	• 3,12
12,5
3,12
12,5
> 2oo
> 2oo

4098 1-0/1188 Bad orio - ^l6 -

■· 1β

Testorganismus

	2344020
Medium *	MHK
	/Ug/ml
3	> 2oo
ti	>2oo
η	>2oo
If	>2oo
M	>2oo
M	>2oo
ti	>2oo
K	>2oo
It	>2oo
It	>2oo
Il	>2oo
11	>2oo

Candida albicans YU 12oo
Sjl tropicalis WH 42
Saccharomyces cerevisiae ATCC
Cryptococcus neoformans IVH 15-4
Trichophyton mentagryphytes P 6j>-9
Epidermophyton floccosum ATCC Io227
Penicillium chrysogenum Q 176
Aspergillus oryzae IAM 26j5o
Fusarium miniliforme IAM 5o62
Botrytis cinerea IAM 5126
Piricularia oryzae IAM 5087
Pellicularia sasakii P-J55

* Medium

H: Herζinfusions-Agar

G: " " mit 1% Glycerin S: Sabouraud-Dextrose-Agar

K: Kartoffel-Dextrose-Agar

Kultivierung: Als MHK-Werte wurden diejenigen genommen, welche nach 24-stündiger Kultivierung bei J57°C für Bakterien und nach 48-stündiger Kultivierung bei 28°C für Hefen und Pilze erhalten wurden. Als Ergebnis der MHK-Werte bei Bakterien zeigten sich in einem Herzinfusions-Medium mit lo^o Pferdeserum keine Wirkungen nach der Zugabe des Pferdeserums.

Wie aus Tabelle 711 ersichtlich wird, hat das Cephemimycin eine hohe antibakterielle Aktivität gegen gram -negative Bakterien.

(2) Toxizität

l4 Tage nach Verabreichung von 800 mg/kg des Antibiotikums durch intravenöse Injektion an Mäuser wurden keine unnormalen Erscheinungen festgestellt.

- 17 -

409810/1188

(3) Schutzaktivität

Es wurde festgestellt, daß das Cephemimycin beim Schutztest, der bei der Maus mit Escherichia coil durchgeführt wurde, wirksam ist. Mäuse des ddY-Stamms mit einem mittleren Körpergewicht von etwa 2o g, die in Gruppen zu je Io Tieren auf-

Ύ geteilt waren, wurden mit 1 χ Io Zellen je Maus von Escherichia coil 64o, einem multi-resistenten Stamm inokuliert. Cephemimycin wurde in steriler Natriumchlorid-Lösung mit 6,25 bis 5o mg/kg zweimal subkutan den Tieren verabreicht, und zwar unmittelbar nach der Inokulierung und 4 Stunden nach der Inokulierung. Tabelle VIII zeigt die Zahlen der überleben-. den Mäuse.

Tabelle VIII

Tage nach der Verabreichung

Dosis (mgAg) ο 1 2 3 5 7

O (Kontrollversuch Io 4 O O O O

6,25 Io 7 6 6 6 6

12,5 Io Io 9 9 9 9

25 Io Io Io Io Io Io

5o Io Io Io Io Io Io

Aus der Tabelle VIII wird ersichtlich, daß das Cephemimycin selbst bei einer Dosierung von 6,25 mg/kg seine Schutzwirkung ausüben kann.·

Aus Untersuchungen an bekannten antibiotischen Substanzen mit den oben beschriebenen physicochemischen und biologischen Eigenschaften wurde bestätigt«, daß das erfindungsgemäß hergestellte Cephemimycin mit den oben genannten antibiotischen Substanzen A-16886I und 842A identisch ist.

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele erläutert.

409810/1188 ~ ^l8 -

Die erflndungsgemäße Herstellung kann jedoch in verschiedener Welse entsprechend den hierin beschriebenen Eigenschaften des Cephemimycins durchgeführt werden. Die Erfindung ist daher nicht auf diese speziellen Beispiele beschränkt, sondern umfaßt alle Methoden zur Herstellung, Extraktion und Reinigung des Cephemimycins nach den bekannten Verfahren.

Beispiel 1;

Der Stamm Nr. J5oo8, der auf einem Malzextrakt-Hefeextrakt-Agarmedium kultiviert worden war, wurde auf loo ml eines Mediums (in einem 5oo ml-Sakaguchi-Kolben) gegeben. Das Medium hatte einen pH-Wertjvon 7,2 vor der Sterilisierung und enthielt 2,o% Glucose, l,o# Stärke, o,9^ Hefe, o,5# Polypepton, o,5# Fleischextrakt, o,j$ Calciumcarbonat, o,5# Natriumchlorid und o,o2^ Disfoam CB442 (von Nippon Oils & Fats Co., Ltd., Japan) als Entschäumer. Es wurde 2 Tage lang eine Schüttelkultur bei 27°C durchgeführt, um eine Samenkultur herzustellen. 2oo ml dieser Samenkultur wurden in einem 3o 1-Flaschenfermentator eingebracht, der 15 1 des Kulturmediums mit der obigen Zusammensetzung enthielt. Die Kultivierung erfolgte 4o Stunden bei einer Umdrehung mit 2oo Upm, einer Belüftung mit 15 l/min., einem Innendruck von 1,1 kg/cm und einer Temperatur von 27- IC, wodurch 4o/Ug/ml Cephemimycin hergestellt wurden.

l4 1 der Kulturbrühe wurden unter Verwendung von Diatomenerde (Celite 5^5, Warenzeichen) als Filterhilfsmittel filtriert und mit den wässrigen Waschwässern kombiniert, wodurch 12 1 Filtrat erhalten wurden. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Kulturfiltrat wurden 3oo g Aktivkohlenpulver gegeben und es wurde gerührt. Auf diese Weise wurde das Cephemimycin auf der Aktivkohle adsorbiert. Es wurde erneut ureter Verwendung von Diatomenerde filtriert und mit Wasser gewaschen. Zur Eluierung des Cephemimycins aus der Aktivkohle wurden 8o?£ Aceton in zwei Portionen mit 7*5 1 verwendet, Das Aktivkohle-Pulver wurde abfiltriert'und das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch 25o ml Konzentrat er-

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halten wurden. (4l,3# Aktivitätsäusbeute). Das Konzentrat wurde durch eine Säule geleitet, die mit 4oo ml Duolite A-2 (Cl-Typ) gefüllt war, um das Cephemimycin darauf zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 650 ml Wasser gewaschen und mit ο,Ι η Salzsäure eluiert. 650 ml des aktiven Eluats (Ausbeute 34,3$) wurden mit ο,Ι η wässrigem Ammoniak neutralisiert. Zur Entsalzung wurden 13 g Aktivkohle-Pulver zugesetzt, wodurch das Cephemimycin adsorbiert wurde. Sodann erfolgte zweimal eine Eluierung mit 350 ml 80^-igem wässrigem Aceton. (Ausbeute 17,2$). Das Eluat wurde auf 2o ml unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 95o mg eines rohen Pulvers erhalten (Aktivität 86,2 mcgu/mg). Das rohe Pulver wurde in einer kleinen Menge 80$- igem wässrigem Methanol aufgelöst und auf einer Säule aufgelöst, die mit 300 g Silikagel, Mallinckrodt CC-4 (hergestellt von Mallinckrodt Chemicals Works) in Chloroform : Methanol : Wasser (9 J 9 ϊ 2) hergestellt worden war. Die Eluiering erfolgte mit dem Lösungsmittelsystem der gleichen Zusammensetzung wie oben. 180 ml des aktiven Eluats wurden gesammelt, bei vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, in 50 ml Wasser aufgelöst, zweimal in gleichen Portionen mit Äthylacetat extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen und sodann gefriergetrocknet, wodurch 8l mg Cephemimycin (Aktivität 25o mcgu/mg) als rohes Pulver erhalten wurden (Ausbeute 4,2Ja).

Beispiel 2:

2 1 des nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 aus Duolite A-2 erhaltenen Cephemimycin enthaltenden Eluats (Aktivitätsausbeute 31,2#) wurden mit 1 η wässrigem Ammoniak neutralisiert und auf einer Säule mit 46 g Aktivkohle für die Chromatographie, (hergestellt von Wako Junyaku K.K., Japan) die mit Wasser gepackt war, adsorbiert. Es wurde mit 5ooml Wasser gewaschen und sodann mit 8#-igem wässrigen Aceton eluiert. 1 1 des aktiven Eluats (Ausbeute 22,6;o) wurde durch eine Säule mit 300 ml Dowex 50W χ 4 (das mit o,öl m Natriumeitrat mit einem pH-Wert von 3 ins Gleichgewicht gebracht worden war) geleitet, um darauf das Cephemimycin' zu adsorbieren. Sodann wurde die Säule mit 600 ml der gleichen Pufferlösung

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gewaschen und sodann mit 0,03 m Natriumeitrat mit einem pH-Wert von 3 eluiert. 5oo ml des aktiven Eluats (Ausbeute 18,7$) wurden gesammelt und entsalzt, indem wiederum eine Chromatographie mit Aktivkohle bei den oben angegebenen Bedingungen durchgeführt wurde, 8o ml des Eluats aus 8$-igem wässrigen Aceton wurden auf 2o ml unter vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 79 mg Cephemimycin als fahlgelblich-weißes rohes Pulver erhalten (Aktivität 527 mcgu/mg) (Ausbeute 9

Beispiel 3:

In einem 6oo 1-Permentationstank wurden 3oo 1 eines flüssigen Kulturmediums mit der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung hergestellt. Nach der Sterilisierung wurden 5° 1 einer Impfkultur, die zuvor in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung 24 Stunden lang kultiviert worden war, inokuliert und die Kultivierung erfolgte 45,5 Stunden bei 27°C (Belüftung mit 3oo l/min., Umdrehung mit 190 Upm, Innendruck 1 kg/cm ). 35o 1 der durch die obige Kultivierung erhaltenen Kulturbrühe wurden durch eine Filterpresse unter Verwendung von Diatomenerde als Filterhilfsmittel filtriert, wodurch 3I0 1 des Kulturfiltrats erhalten wurden. Zu dem so erhaltenen Kulturfiltrats erhalten wurden. Zu dem so erhaltenen KuIturfiltrat wurden 6,2 kg Aktivkohle-Pulver und 6 kg Diatomenerde gegeben. Nach dem Rühren wurde filtriert, um das Aktivkohle-Pulver zu sammeln. Der Aktivkohle-Kuchen wurde mit Wasser gewaschen und zweimal mit loo I 8o$-igem wässrigen Aceton extrahiert. I90 1 des Extrakts wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch 42 1 eines Konzentrats erhalten wurden (Aktivitätsausbeute 47,0$). Das Konzentrat wurde auf einen pH-Wert von .8 eingestellt und durch eine Säule mit 25 1 Duolite A-2 (Acetatform) geleitet. Durch diese Maßnahme wurden 80^0 der Aktivkomponente hierdurch geleitet. (Ausbeute 37,6$). Der Abstrom wurde mit der wässrigen Waschflüssigkeit kombiniert, wodurch 92 1 erhalten wurden. Dazu wurden 1,84 kg Aktivkohle-Pulver gegeben. Nach dem Rühren wurde das adsorbierte Cephemimycin zweimal mit 45 1 ^m wässrigen Aceton extrahiert, wodurch 7o 1 Extrakt erhalten

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wurden. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck auf 3 1 konzentriert. (Ausbeute 23,0$). Das Konzentrat wurde mit Wasser auf 6 1 verdünnt, auf einen pH-Wert von 4,15 mit Essigsäure eingestellt und durch eine Säule mit 3 1 Duolite A-2 (Acetatform) geleitet. Nach dem Waschen mit 1,5 1 Essigsäuremit einem pH-Wert von 3,ο wurde das Cephemimycin mit einem o,2 η Pyridin-Essigsäure-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 eluiert. Das aktive Eluat (18 1) wurde auf 9oo ml unter vermindertem Druck konzentriert (pH 3,o, Ausbeute 2o,7$). Aus dem Konzentrat wurde das Cephemimycin erneut auf einer Säule mit 1,65 1 Duolite A-2 (Acetat-Form) adsorbiert. Die Säule wurde sodann mit 7*5 1 Essigsäure mit einem pH von 3*ο gewaschen und mit der oben genannten Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung eluiert. 3 1 des aktiven Eluats wurden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft (Ausbeute 2o,o^). Das rohe Pulver wurde zweimal mit 300 ml Äthanol gewaschen und in 3oo ml V/asser aufgelöst. (Ausbeute 18,4$). 660 mg des Aktivkohle-Pulvers wurden zugegeben und es wurde gerührt und abfiltriert (Ausbeute 17,3^). Das Filtrat wurde auf 3o ml konzentriert. Das Konzentrat wurde durch eine Säule mit 900 ml Amberlite CG-5o (Η-Form) geleitet, um die Spuren des restlichen Pyridins durch Adsorption zu entfernen, Sodann wurde die Säule mit Wasser gewaschen und der Abstrom wurde konzentriert, worauf gefriergetrocknet wurde. Auf diese weise wurden 3,94 g Cephemimycin im reinen Zustand (looo mcgu/mg) mit einer fahlgelblich-weißen Farbe erhalten (Ausbeute

- Patentansprüche -

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Claims (5)

1. Patentansprüche

   1". Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephemimycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces jumonjinensis Stamm Nr. ^008 in einem Nährmedium kultiviert und daß man das Antibiotikum aus der Kulturbrühe gewinnt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung unter aerobischen Bedingungen durchführt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die Kultivierung bei Temperaturen

   im BereLch von 25 bis 3o°C durchführt.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis ^, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung über einen Zeitraum von 4o bis 8o Stunden durchführt.
5. 5. ■" Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzei chnet, daß man ein Medium verwendet, das einen pH-V/ert im neutralen Bereich oder in dessen Nähe aufweist.

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