DE2609611A1 - Verfahren zur herstellung eines neuen antibiotikums - Google Patents

Description

CiBA-GEiGY

ClBA-GElGY AG, Basel, Schweiz

Case 4-9824/1+2/+

Deutschland

Verfahren zur Herstellung e_vines neuen Antibiotikums

Die Erfindung betrifft das neue wasserunlösliche Antibiotikum Papulacandin, das in Form seiner Hauptkomponenten A und B sowie mehrerer Nebenkomponenten, darunter Komponenten C, D und E, oder von Mischungen von 2 oder mehreren dieser Komponenten vorliegt (solche Mischungen werden der Einfachheit halber im folgenden als "Papulacandin" [Antibiotikum A 32283] bezeichnet), und Derivate des Antibiotikums sowie Präparate, welche diese Verbindungen enthalten, und Verfahren zur Herstellung dieser Stoffe.

Das Antibiotikum Papulacandin entsteht bei der Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der in unseren Laboratorien unter der Bezeichnung A 32283 aufbewahrt wird. Der Stamm A 32283 ist der Art Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel, früher als Arthriniutn phaesospermum (Corda) Ellis bezeichnet, zuzuordnen. Die Art ist von Ellis in Ellis M.B." Dematious Hyphoaiycetes" 1971, p. 569 unter Arthrinium

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phaeospermutn eingehend beschrieben. Der Stamm A 32283 wurde beim Northern Regional Research Lab. US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois unter der Nr. NRRL J-8086 deponiert.

Das Antibiotikum Papulacandin wird bei der Züchtung der Art Papularia sphaerosperma, insbesondere des Stammes NRRL 8086 gebildet. Zur Herstellung von Papulacandin wird Papularia sphaerosperma oder eine Papulacandin bildende Mutante in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthaltenden Nährlösung aerob gezüchtet, bis die Nährlösung eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt, und das Antibiotikum Papulacandin hierauf isoliert. Das Antibiotikum Papulacandin bildende Mutanten können z.B. unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden. Vorzugsweise verwendet man den Stamm NRRL 8086 (A 32283).

Als Kohlenstoffquelle sind beispielsweise zu nennen: assimilierbare Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Mannit, Stärke, Glycerin, ferner Inosit. Als

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stickstoffhaltige K'ährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte* wie.'Pcpton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekornern, wie Mais und YJeizen, von.DestillationsrUcksC'a'nden der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohr.en, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwallpflanze usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali- oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Ober flä'chenkul tür oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schutte.lkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 18 und 40⁰C, vorzugsweise ca. 23°C. Eine wesentliche anuifungische Wirkung zeigt

die nährlösung dabei im allgemeinen nach 1 1/2 bis 5 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d.h. man stellt zunächst eine -oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Na'hrmcdium her, die dann in das eigentliche Pro-

• *

duktionsmedium, z.B. im Verhältnis 1:20, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispielsweise,*-.indem "man ein durch ca. 14-tligiges Wachstum auf einem festen Nährboden erhalte-

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•-26096.Π

nes versportes Mycel in ein flüssiges Medium überimpft'und 48 Stunden wachsen l'dsst. '. . *

. Die Isolierung des Antibiotikums aus dem Kulturmedium erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften des Antibiotikums.

So kann das Anti-biotikum beispielsweise aus der unfiltrierten Kulturbrühe mit einem mit Wasser wenig mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. Essigester, extrahiert v?erden. Dieses sogenannte "whole-broth"-Verfahren wird vor-. zugsweise .angewendet, weil sich'das Anti-biotikum sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat befindet. Das Antibiotikum sammelt sich in der wasserhaltigen organischen Phase, z.B. im Essigester, an und diese Phase wird von der extrahierten Kulturflüssigkeit und dem "Schlamm" (extrahiertes Mycel· und Kährlösungsfestbestandteile) abgetrennt. Der bei der Extraktion erhaltene Rückstand kann einer oder mehreren erneuten Extraktionen mit dem gleichen oder einem anderen Lösungsmittel unterworfen werden. ·

Man kann auch das z.B. mit Filterhilfsmitteln abfiltrierte Mycel oder das Kulturfiltrat allein extrahieren. Das mit Wasser gewaschene Mycel (mitsamt dem Filterhilfsmittel) wird vorzugsweise mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. einem Niederalkanol mit

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1-4 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Aethanol, Propanol, Isopropanol, ferner Dimethylsulfoxid, Formamid, Dimethylformamid, Methylacetamid, Dioxan, Tetrahydrofuran, Aceton, oder mit Mischungen dieser Lösungsmittel mit Wasser, insbesondere ir.iL wasserhaltigem Methanol, extrahiert. Das Kulturfiltrat wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel z.B. mit Essigester, mit Wasser nicht mischbaren Alkohol wie n-Butanol, höheren aliphatischen Ketonen z.B. Methylisopropylketon, extrahiert.

Zur Reinigung des nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltenen Rohproduktes kann man sich z.B. der Extraktion, der Fällung, der Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittel phasen oder der Absorption, vor aller« Cliroir.atngraphie bedienen. So können aus dem Rohprodukt, z.B. Essigesterextrakt: der KulturbrUhe, erhebliche Anteile an Begleitstoffen durch aufeinanderfolgende einfache Reinigungsprozesse wie Extraktion des getrockneten oder gelösten Rohproduktes mit Lösungsmitteln, in denen das Antibiotikum unlöslich ist, z.B. Kohlenwasserstoffen wie Petrolä'ther, Cyclohexan, oder wasserfreien halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, entfernt werden. Man kann auch das Rohprodukt lösen, z.B. in Methanol, und durch Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, Kieselgel, Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Mischungen davon oder Adsorptionsharze, z.B.

609839/1031 ."·■-"

vernetzte Dextranc wie "Sephadex" (der Fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) von Beglcitstoffen abtrennen. Beispielsweise kann das Rohprodukt -durch wiederholte Sä'ulenchrc.natographie unter Verwendung von Kieselgel, zwecknüissig mit geringen Zus'atzen von Aktivkohle, gereinigt v:erden. Das Antibiotikum wird vorzugsweise nach dem Gradientenverfahren mit Mischungen von Chloroform oder Tetrakohlenstoff und Methanol eluiert, wobei der prozentuale Gehalt des stärker polaren Lösungsmittels stufenweise gesteigert wird. Wenn man den durch Extraktion der Kulturbrühe gewonnenen Extrakt an einer Mischung von Kieselgel mit z.B. 5 Gew.Prozent Aktivkohle'und z. Chloroform/Methanol als ElutionsflUssigkeit chromatographisre_} findet man nahezu die gesamte Menge des aus der Kulturbrlihs extrahierten Antibiotikums auf die Eluate der Methanolkonjsentrationen 5 - 20% verteilt.

Die oben erwähnte Verteilung zwischen nicht-mischbaren Lösungsmittelphasen kann auch als Gegenstromverteilung mit einer Craig-Apparatur vorgenommen werden. Als Lö'sungsmittelsystem dient beispielsweise eine Mischung von Essigester, Cyclohexan, Methanol und Wasser.

Zur Gewinnung der einzelnen einheitlichen Komponenten des Antibiotikums kann ihre Trennung und Isolierung z.B. nach der Methode der präparativen Dünnschichtchromatographie

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unter den für den analytischen Nachweis beschriebenen Bedingungen erfolgen. Vorteilhafter ist die Trennung» mittels Säu-enchror.-.r.tograhie, wobei als Adsorptionsmittel z.B. Kieselgel mit einem Gehalt von 1-5 Prozent Aktivkohle benutzt und eic Elution vorzugsweise- nach dem Gradientenverfahren mit einer 'Mischung von Chloroform und Methanol bewirkt wird..Die Steigerung der Konzentration des polareren Lösungsmittels erfolgt zweckmä'ssig in kleineren prozentualen Abstufungen, z.B. 5-20 Methanol, oder man arbeitet nach der kontinuierlichen Gradient enelutionsmethode. Das Antibiotikum wird vorzugsweise bei einer Methanolkonzentration von 10% eluiert. Das Reinigungsverfahren kann gegegebenenfalls wiederholt werden.

Bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel (z.B. mit Chloroform-Methanol oder mit Essigester-Aceton-Wasser als Elutionsmittel) und Bioautographie mit Candida albicans kann man mindestens fünf antibiotisch aktive Komponenten isolieren, deren Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel in Tabelle I angegeben sind: System 1 bezeichnet Chloroform-Methanol (4:1), zweimaliges Durchlaufen; System 2 bezeichnet Essigester-Aceton-Wasser (72:24:4), zweimaliges Durchlaufen.

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	Tabelle I	• • « System 2.	0,41
Substanz	System 1	•	0,32
Papuläcandin		0,28
Komponc-ntCi A	0,35	0,74
Komponente B	0,27	0,51
Komponente C	0,24'
Komponente D	0,45
Komponente E	0,47

Ca. 75% des Antibiotikums besteht aus der Hauptkomponente B, ca. 10%.aus der Komponente Ä.

» a

Für die Komponenten A und B wurden im Reihenverdlinnungs-• test mit Candida albicans als Testorganismus minimale Hemmkonzentratioiien (MIC) zv?ischen 0,006 und 0,1 γ/ml gefunden.

Zum Testieren der Antibiotikawirkung in den einzelnen Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium - eignet sich als TestOrganismus besonders gut Candida albicans.

Das Antibiotikum besteht - der Elementaranalyse der Hauptkcmponenten A, B, D und E zufolge - nur aus den Elementen C, H und 0.

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Das Antibiotikum Papulacandin B weist folgende

chemische und physikalische Eigenschaften auf:

Es ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz. Sie ist löslich in Alkoholen, z.B. Niederalkanolen wie Methanol, Aethanol, n-Propanol, sowie in Ketonen, z.B. Diniederalky!ketonen wie Aceton, Methylisobutylketon, ferner in Dimethylformamid und Dimcthylsulfoxid; sie ist schwer löslich in' Essigester und chlorierten Kohlenwasserstoffen wie Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff (10 - 100 mg/Liter); in Wasser, Petroläther, Aether, .Hexan .ist die Verbindung praktisch unlöslich. F. 193-197° (Zers.).

Elementaranalyse (berechnet für C, 7H,., Oi 7) C ber. 62,65%; gef. 61,28%,
H ber. 7,16%; gef. 7,18%.

[_a] = + 50,0 + 1° (c= 0,46 in Methanol) UV-Spektrum in Aethanol:

rj max 232 nm (£ = 42 000)

240 nm (έΓ - 42 400)

268 nm (üt = 44' 800)

300 nm (£ = 31 200).
IR-Spektrum in KBr, s. Beispiel 3
100 MHz - NMR-Spektrum, s.Fig. 1.

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Aufgrund der dampfdruck-ostnometrischen Molekulargewichtsbestimmung des Acetylderivats kann das Molekulargewicht zu etwa 900 - 950 geschätzt werden. Das Antibiotikum besitzt keine freien Carboxyl- und keine O-Methylgruppen. Im Massenspektrum, sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein Molekülion fehlt. Im C-NMR.-Spektrum sind die Signale von 45 - 48 C-Atomen feststellbar. Zusammen mit den Ergebnissen der Elementaranalyse und der Abbauversuche von Papulacandin lässt sich folgende Bruttoformel berechnen ^C47^H64°17·

Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnten mehrere Hydroxylgruppen, davon 2 phenolische, acetyliert werden. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich spektroskopisch nur schwer abschätzen. Im 100 MHz -NMR-Spektrum sind bei ca. 2 ppm die Signale mehrerer Acetylgruppen sichtbar. Aufgrund der Abbauversuche dürften 9 Acetylgruppen vorhanden sein. Das Molekulargewicht wurde osmometrisch zu 1267 bestimmt. Für das Acetylderivat wurden folgende physikalisch-chemische Daten erhalten

Elementaranalyse (berechnet für ^C65^Hgo⁰26 ^ C: ber. 61,02% gef. C = 6Q,74%
H: ber. 6,46 gef. H = 6,50%
UV-Spektrum (in Aethanol)

tfmax ^216nm ^ = ^{23 20}°) ... 242 nm (£ = 25 600)

268 nm (£ » 27 600) . .

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295 nm (Schulter).

IR-Spektrum, s. Beispiel 6. >

[α]?;⁰ = -6 + 1° (c= 0,765 in Chloroform).

Bei der Hydrierung von Papulacandin B wurden 7 Mol Wasserstoff aufgenommen. Im H-NMR.-Spektrum des Hydrierungs-'produktes sind alle Signale von olefinischen Protonen verschwunden. Zwei aromatische Protonen bei 6,3 ppm sind noch sichtbar. Das IR-Spektrum in KBr ist in Beispiel 7 angegeben. Das Hydrierungsprodukt weist folgende physikalisch-chemische Daten auf:

Elementaranalyse (berechnet flir ^αί^ίοΡλί) C: ber. 61,69% gef.: 60,94%
H: ber, 8,59% gef.: 8,56%
O: ber. 29,72% gef.: 30,10%

F. 125-130⁰C ·

UV-Spektrum (in Aethanol)
/) max. 270 nm (£ = 3100)
[a]^ = + 7 + 1° (c= 0,214 in Methanol).

Das Antibiotikum Papulacandin Komponente A weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf: Es ist eine schwach saure, in kristalliner Form weisse Substanz, die die gleichen Löslichkeitseigenschaften wie die Komponente B aufweist.
F. 171 - 173° C (Zersetzung)

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Elementaranalyse

C gef. 61,88% .

H gef. 7,34% ' . ■'

UV.-Spektrum (in x\ethanol):
η max 232 nm Schulter

242 nm (E = 425)
265 nm (E = 520)
IR-Spektrum in KBr, s. Beispiel 3
[ct]^° = + 30 + 1° (c= 0,419 in Methanol). Die Figur 2 zeigt das 100 MHz-NMR. -Spektrum. .Papulacandin A besitzt keine freien Carboxyl- und 0-Methylgruppen. Im Massenspektrum sind nur kleinere Fragmente erkennbar. Ein MolekUlion fehlt. Folgende Bruttoformel ist wahrscheinlich für Papulacandin A C^_n „Η,λ ,.0,^ ,„.

Mit Essigsäureanhydrid und Pyridin konnten verschiedene Hydroxylgruppen acetyliert werden. Das IR-Spektrum des Acetylderivates in Methylenchlorid ist im Beispiel 9 angegeben. Die Anzahl der Acetylgruppen lässt sich nur schwer abschätzen. Vermutlich sind 9.-11 Acetylgruppen vorhanden. Das Acetylderivat von Papulacandin A. weist folgende physikalischchemische Eigenschaften auf:
Elementaranalyse:
C gef.: 61,91%

H gef.: 7,22% -

0 gef.: 30,81%

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UV-Spektrum (in Aethanol)

/? max 240 nm (E = 270)

^v max '

■ ^{262 nm} (^Emax - ^33O>

[_a]²⁰ = -15 + 1° (c= 0,249 in Chloroform) Bei der Mikrohydrierung von Papulacandin. A werden 7 Mol Wasserstoff aufgenommen.

Das Antibiotikum Papulacandin Komponente D weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf. Es ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz, die ähnliche Löslichkeitseigenschaften wie die Komponente B hat. F. 127 - 130⁰C.
ElementaranaIyse C gef. 62,32%
H gef. 7,59%.
UV.-Spektrum (in Aethanol)

/9 max 230 nm (E - 340) ■■ max

235 nm Schulter

^{261 nra} (¹W " ^32O) [«Iß⁰ + ⁷ ± 1° ( c = 0,250 in Chloroform)

Das IR-Spektrum in KBr ist in Beispiel 5 angegeben.

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Das Antibiotikum PapuLacandin Komponente E weist folgende chemische und physikalische Eigenschaften auf: Eg ist eine schwach saure, in Pulverform weisse Substanz,-die ähnliche Lö'slichkeitseigenschaften wie die Komponente B hat. Elementaranalyse
C gef.: 64,71%
H gef.: 8,43%
UV. -Spektrum (in Aethanol)
/? max: 230 nm (E_1nI_x 270) . ■

237 nm (Schulter)

267 nm (^_x 300)

292 nm (Schulter)
Das IR.-Spektrum in Methylenchlorid ist in Beispiel 5 angegeben.

Strukturaufklärung von Papulacandin B

Bei der alkalischen Hydrolyse von Papulacandin B in 0,5 N.-methanolischer Kaliumhydroxid-Lösung lassen sich 3 Bruchstücke isolieren.

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Formelschema 1 Alkalische Hydrolyse von Papulacandin B

Papulacandin B

ROOC £. 4-Ib: R = CH₃ 1^306

6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca-1,3,7,9-tetra-en-carbonsäure

.0,5 N KOH

CH₃OH/H₂O 2 Std./RT

^ ^C19^H26°13

2a: · R-H

2b: R=CH

säure

1)

carbonsäure-methylester

, 5-trien-carbon-

7,9-tetra-en-

Die Verbindung wurde durch Extraktion der Reaktionslösung mit Essigester bei pH 7,5'und anschliessende Veresterung mit Diazomethan erhalten.

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- . COPY

Die Struktur dieser 4-fach ungesättigten C-16-Fett-Sciure v.'urda folgonderr.assen bewiesen (s. Formelschema* 2):

Formelschcnm 2: Abbau vor» 6-Hydroxy-7 ,13-diir_:ethyl-pentadeca-

1,3 .T^-tetra-en-carbonsäure-taethylester.

CH_O0C

H_

OAc (

CH.

CH_qOOC

OH.·

"⁴3

Ib

• M⁺ :

-7O°C

2)

(CH COO)₀ + CH
8

CH.

CH

CH OGC(CH ) CH-C OAcl

f ,CHCtLCH. Pi 2 j CK,

M : 356 (CII₅CO).

CHXOC (CH ) CH-CH (CH₂) CHCH CH, OH CH CH

Wj

M⁺ :

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',!609611

Acetyl5.c-rung des Mcthylestiers ll> ergab das Monoacetat 5^ mit der Masse 34S. Die 13-Stellung der Methylgruppe ergab sich aus der Interpretation des C-NMR.-Spektrums von J5. Das Hydrierungsprodukt JS' von 5^ zeigte im MS ein Molekül ion bei m/e 356. Hydrierung des Methylesters lb_ anderseits ergab 7-Hydroxy-8,14-dimethyl-palmitinsäuremethylester 7_, dessen Molekül ion im MS bei m/e 314 gefunden wurde. Dessen Monoacetat war wiederum identisch mit der oben beschriebenen Verbindung j>. Die postulierte Struktur des aliphatischen Restes wurde dann durch einen .Ozon-Abbau des Methylesters lb_ bewiesen. Dabei konnten aus dem Reaktionsgeraisch gaschromatographisch Oxalsäuredimethylester 8> und 4-Methylcapronsäüre-methylester 9_ durch Vergleich mit authentischem Material nachgewiesen werden. "...

2) 7-Hydroxy-nona-l_>3,5-trien-carbonsä"uremethylester

Die Verbindung wurde durch Extraktion der Reak· • tionslösung mit Essigester bei pH 2,5 und anschliessende • Veresterung mit Diazomethan erhalten.. Mit Hilfe von UV.-, IR-, und MasseiiSpektrum (MS, mit Hochauflb'sung) und NMR.-Spektroskopie (mit Doppelresonanzversuchen) des Methylesters konnte die oben postulierte Struktur aufgestellt werden.

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Die Struktur dieser 3-fach ungesättigten Fettsäure wurde durch Oxidation des Methyl estors mit
sprechenden Keton 4_ bestätigt:

Oxidation des Methylestors mit CrO (Jones-Reagens)» zum ent-

I)CrO /H

\y\*A^\*/\ ^Aceton

■ a. Jh ^2)ch ₂V

11* lh 3 M :

^Cll^Hl6°5 M⁺ : 196 "

In MS acs Ketons ist ein xMolekülion bei m/e 194 vorhanden. Im .VMR-Spektruni ist das Proton in 7-Stellung verschwunden.

3) Zuckerteil C^_g ^H26°13

Dieses Bruchstück wurde aus der restlichen Reaktionslb'sung nach Neutralisation, auf pH 7,5 durch Chromatographie an Sephadex - LH-20 erhalten.

Die Interpretation des MS, der 100 MHz- und 360 MHz-

' 13 '

HbIR. -Spektren und des C-NMR-Spektrums mit off-Resonanz-Entkopplung des Acetats IQa (siehe Formelschema 3)

609839/1031 ' '

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Formelschema 3: Abbau des ZuckerbruchstUcks

2: R = H

CH N 2 2

CH OH/Ae

30 Min. / O⁰C

_{]Oa: R}

. ₈₄₀

10b: R = COCO, M : 867 3

OR

13a; R «= H : o-D-For« 13b; R - H : ß-D-Form 14a:" R «= COCH,: a-D-Form

14b: R = COCH,: ß- · 0

11: R - H

12: R:- COCH : K 784

1,5 N HCl / abs. CH 48 Std. / RT 6 Std. / 50°C

J5? R - H: M - 328 IB: R - -COCH : M⁺: 496

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-- 20 -

spricht für die vorgeschlagene Struktur. Im MS des Acetats IQa wird ein Moleklilion bei m/e 840 gefunden. Acetylierung mit Deutero-Essigsäureanhydrid ergab 10b, dessen Molekülion im MS bei m/e 867 gefunden wurde.. Damit ist die Anwesenheit von 9 Acetylgruppen bewiesen.

Die Methanolyse von J3 ergab keine befriedigenden Ergebnisse. Vor allem konnte das aromatische Bruchstück nicht isoliert werden. Daher wurde 3_ ¹¹¹^t Diazomethan in das Dimethylderivat 11. übergeführt, das nach Acetylierung ein Hepta-acetat 12_ mit M⁺ bei m/e 784 lieferte. Methanolyse . von 11 lieferte dann 3 Bruchstücke, nämlich Methyl-a-D-galactopyranosid 13a, wenig Methyl-B-D-galacto-pyranosid 13b, deren Tetraacetate 14a und 14b mit authentischem Material identisch waren, und Verbindung 15, die im MS ein Moleklilion bei m/e 328 (Hochauflö.sung: C, Λ^λΟο) lieferte. Acetylierung von 1J5 lieferte das Tetraacetat Ij5 mit M bei m/e 496. •Perjodatspaltung schliesslich von 15 mit Perjodsäure ergab Verbindung \J_, die im MS ein Molekülion bei m/e 194 zeigte. Auf Grund der Interpretation des 360-MHz-NMR.-Spektrums von IQa ist der Galactoserest ß-glycosidisch mit dem restlichen Teil des Moleküls verknüpft.

Addiert man die Bruttoformeln der 3 gefundenen Bruchstücke unter der Annahme, dass die beiden Fettsäuren esterartig mit dem Zuckerbruchstück verknüpft sind, kommt man zu folgender Bruttoformel für Papulacandin B: ^C47^H64°i7 *** ⁹⁰⁰· Sie stimmt mit den Ergebnissen der Elementaranalyse überein.

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4J

α	•	cd
co
	O)	(U
bO	1U
4J	C	g
U
cd
Vi	Q)	O
(U	bO	O
4-J
(O	,—<
		ω
	O	C
•D	» Vi	d
	Ό
	^>	Cu
(O	I	Zi
C	Vi	Jg
O)		V-I
^)		O)
d	O	>
co	d
4J	Nl	(U
4-1	T3
(U
	4J
CM	O

O II.

X O

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Struktur von Papulacandin A

Nach spektroskopischen Vergleichen von Papulacandin A und Papulacandin B und präliminären Hydrolyseversuchen enthält Komponente A ebenfalls 6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca-1,3,7,9-tetraen-carbonsäure und das gleiche Zuckerbruchstück und unterscheidet sich vermutlich in der zweiten Fettsäure durch 1 zusätzliche Methyl- und 3-4 zusätzliche Methylengruppen^

Unter Derivaten d&s Antibiotikums sind im vorangehenden v?ie im folgenden Ester und Aether sowie Hydrie- rungsprodukte und deren Ester und Aether zu verstehen. Ester sind beispielsweise solche, in denen die alkoholischen Hydroxylgruppen mit Carbonsäurren oder Thiocarbonsäuren mit 1-20 Kohlenstoffatomen verestert sind. Solche S£ s5.nd vor allein gegebenenfalls substituierte Niederaikansciuren mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propion sMure, Pivalinsäure, ferner gegebenenfalls substituierte ir.ono- oder bicyclische aromatische oder araliphatisch^ Säuren wie Bcnuoesüure, Thiobenzoesäure, Naphthalinsäure, Phcnylniederalkans'a'uren v.-ie Phenylesslgs'a'ure, PhenylpropionsSure. Substituer ton der Säuren sind beispielsweise Halogen wie Fluor, Chlor, Brom-, Jod, Trifluormethyl, Nitro, freie, veresterte oder ver-

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Hthertc Hydroxylgruppen, z.B. .Niederalkanoyloxy* wie .Acecoxy, Niederalkoxy wie Methoxy, Niederalky!mercapto wie Methylmercapto, freie oder funktionell abgewandelte Carboxylgruppen, z.B. Niederalkoxy carbonyl v?ie Methoxycarbonyl, Carbamoyl, Cyan, gegebenenfalls substituierte Aminogruppen, z.B. mono- oder di-niecc" alkylierte oder N-acylierte Aminogruppen, z.B. Methylamino, Dimethylamine), Niederalkanoylamino, z.B. Acetylatnino.

Aether sind insbesondere Verbindungen, in denen eine oder 'beide phenolische Hydroxylgruppeimit Alkoholen, in erster Linie "".: Niederalkanolen, vor allem Methanol, veräthert sind.

Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate weisen neben ihrer antifungischen Wirkung auf Fadenpilze (Hyphornyceten) wie z.B. Trichoderma mentagrophytes, -----

vor allem eine sehr gute spezifische Wirkung gegenüber verschiedenen Arten hefeartiger Pilze wie Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata, und Hansenula anomala auf. So betragt z.B. bei der in vitro-Prüfung im Gradienten-Platten-Strichtest (W- Szibalski, Science 116», 46 [1952] gegenüber ca. 20. verschiedenen klinisch vorkommenden Stammen von Candida albicans die minimale Hemmkonzentration 0,005 bis 0,1 γ/ml. Papulacandin zeichnet sich

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ORIGINAL INSPECTED

durch sehr geringe Toxität im Vergleich zu bekannten antifungisch wirkenden Antibiotika aus. Das neue Antibiotikum und seine Derivate können daher zur Bekämpfung von Infektionen, die

durch die genannten Pilze, insbesondere Candida albicans, hervorgerufen werden oder als Desinfektionsmittel verwendet werden.

Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate können, wie erwähnt als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die topische, enterale oder parenterale Applikation'geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Betracht, dia mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z.B, Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol, oder andere bekannte Arzneimittelträ'ger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Suppositories oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Cremen oder Salben vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie kön-

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nen auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Die Figuren stellen dar:

Fig. ;1 : H-NMR-Spektrum in Methanol mit schwerem Wasserstoff, CDoOD, von Papulacandin B Fig. 2 : NMR-Spektrum in CD₃OD von Papulacandin A

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Beispiel 1:

Ein gut; bewachsenes Schrägagarröhrchen des Päpularia

sphaerosperr«:a a 32233 wird mit 5 ml 0,2-m. " Phosphatpuf fer pH 7 aufgeschwemmt. 3 Erlenmeyerkclben mit 1 Schikane .(Einbuchtung, "baffle")mit je 100 ml Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 20 g Sojabohnenmehl· und 20 g Mannit enthält und deren pH vor der Sterilisation mit 1-n. Natronlauge auf 8,5 eingestellt wurde, werden mit je 5 ml der Papularia-Suspension beimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schilt, telrcaschine mit 250 upm bei 23° inkubiert. Je 25 ml der so gewonnenen Kultur werden in 6 2-Liter Erlenrneyerkolben mit 4 Schikanen und 500 ml der obigen Nährlösung geimpft. Die Kolben werden anschliessend bei 23°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit 120 upm 48 Standen Inkubiert.

1,5 Liter der Kultur aus den 2 Liter-Kolben werden in einen 50-Liter Fermenter, der 30 Liter der obigen Nährlösung enthält, Übertragen und 48 Stunden bei 23° inkubiert. Dann werden 15 Liter der Kultur in einen Fermenter mit 300 Liter der obigen Nährlösung übertragen. Dieser Fermenter v/eist ein Totalvolumen von 500 Liter· auf und besitzt einen 6-blättrigen TurbinenrUhrer und 4 Schikanen (Prallbleche "baffles'). Die ZUchtungsbedingungen im Fermenter sind: Druck 1 atll, RUhrgeschwindigkeit 450 -uprn, Temperatur 23°C, Luftdurchsatz 1 Liter V/V/Min. Die Bedingungen entsprechen einer in Sulfitlösung

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gemessenen Sauerstoffabsorpticnsrate von 200 rcM Orjl/h. Die optimale"Bildung des Antibiotikums A 32283 erfolgt nach ca. 60. Stunden Inkubation. Die Kulturlösung weist dann-'ein pH von 0,7 auf. Sie hat eine Aktivität von 10-12 mm Hemmhof im Agardiffusionstest mit Candida albicans unter Verwendung Von VJhatmsnn A discs 0 6 mm.

Beispiel 2:

600 Liter der nach Beispiel 1 erhaltenen Kulturlösung werden unter Zugabe von 2% Filterhilfsmittel "Decalite" (D5.atomeenerde) filtriert. 560 Liter Kulturf iltrat werden mit Katronaluge auf pH 8,6 gestellt und auf einem kontinuierlichen Extraktor zweimal mit Essigester im Verhältnis 2:1 extrahiert. Das inaktive wässerige Raffinat wird verworfen. 600 L'iter Essigesterphase worden im Vakuum konzentriert. Es resultiert ein Konzentrat von 45 Litern.

91 kg Mycel aus obiger Filtration werden 1 χ mit 200 -Liter und 1 χ mit 100 Litern Methanol verrUhrt und jeweils filtriert. Das inaktive Myeel wird verworfen. 300 Liter Methanolextrakt werden, im Vakuum konzentriert. Es resultiere ein wässeriger Mycel-Extrakt von 33 Litern, der mit NaOH auf pH 8,4 gestellt und 2 χ mit je 66 Litern Essigester extrahiere wird.. Das inaktive wässerige Raffinat wird verworfen.

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120 Liter Mycel-Essigesterextrakt werden mit obigen 45 Liter Kulturfiltrat-Essigester-Extrakt vereinigt und im Vakuum konzentriert. Es resultieren 1,85 Liter Es-s'igesterextrakt-Konzentrat, die mit 2 Liter 85%igem Methanol versetzt und 3 κ mit je 2 Liter Petroläther extrahiert werden. Die inaktiven Petrolätherphasen werden verworfen und die Methanolphase wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Es resultieren 51 g dunkelbrauner, zähflüssiger Rückstand, der in 200 ml 85%igem Methanol gelöst und 2 χ mit je 300 ml Heptan extrahiert wird. Die inaktiven Heptanphasen werden verworfen. ,Die Methanolphase wird eingedampft und im Hochvakuum getrocknet. Es resultieren Al,8 g Extrakt-Rückstand.

Beispiel 3:

Von dem nach Beispiel 2 erhaltenen Extrakt-Rückstand werden 18 g auf einer Säule (0 5,4 cm, h = 140 cm), welche aus einer (95:5 Gew.:Gew.)-Mischung von 1000 g Silicagel (Merck Korngrösse 0,05 - 0,2 mm) und 50 g Aktivkohle Noriu besteht, chrornatographiert. Die Mischung von Silicagel-Akt i^wkohle wurde vorher 3 mal mit Methanol und an- . schliessend 3 mal mit Chloroform aufgeschlämmt und filtriert:. Die 12,3 g Extrakt-Rückstand werden in 50 ml Methanol gelöst:, mit 50 g Silicagel vermischt und das Gemisch wird zur Trockne eingedampft. Der getrocknete pulverige Rückstand wird auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgt in Fraktionen zu je

609839/1031-

L Liter mit Chlorofortn-Methanolraischungen unter stufenweiser Steigcrung der Konzentration von Methanol. Man beginnt mit einem McthanoLgehaLi: von 4 % und hört auf mit 507» Methanol. Die Durchlaufgeschwindigkeit betragt 500 ml/Std. Die Fraktionen werden im Vakuü-.n eingedampft und der Rückstand im Hoch-. vakuum getrocknet. Die Fraktionen werden dann aufgrund dünnschichtchroraatographisdi er und bioautographisch«jr Prüfung vereinigt. Die Fraktionen 1-16 (eluiert mit 1-4% Methanol)

sind nur schwach aktiv und werden verworfen. Die Fraktionen 17-23 (eluiert mit 4 bis 7% Methanol) enthalten Papulacandin D und £ (weitere Reinigung siehe Beispiel 5). Die Fraktionen 24 27 (eluiert mit 7% Methanol) enthalten Papulacandin A. Die Fraktion 28 (eluiert mit 10% Methanol) enthält ein Gemisch von Papulacandin A und B. Die Fraktionen 29-31 (eluiert mit 10% Methanol) enthalten Papulacandin B. Die Fraktionen 32 und 36 (eluiert mit 10 - 20% Methanol) enthalten neben Papulacandin B auch Papulacandin C mit kleinerem Rf-Wert. Die restlichen Fraktionen (eluiert mit 20-50% Methanol) enthalten noch weitere aktive Substanzen in kleinen Mengen.

Zur Isolierung von Papulacandin B wird der Rückstand der Fraktionen 29-31 (1,86'g) aus Aceton/Aether gefällt. Es resultieren 1,5 g reines Papulacandin B als farbloses Pulver vom F. 193-197°C (Zersetzung). Zur Isolierung von reinem Papulacandin A wird der Rückstand der Fraktionen 24-27 (1,5 g) aus Aceton/Aether kristallisiert. Es resultieren 1,2 g reines Papulacandin A als farbloses Pulver vom F. 171-173°C.

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Papulacandin B

Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: · C: 60,457ο H = 6,99% 0 = 32,62%. Das Antibiotikum zeigt im IR-Spektrum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2975, 2925,. 2875, 1690, 1640 (Schulter), 1615, 1465, 1380, 1345,. 1300, 1260, 1180, 1150, 1070, 1035, 1005, 970, 865 und 845 cm"¹. Im UV-Spektrum in Aethanol sind folgende Maxima vorhanden: ^{232 nm (ε} " ⁴²⁰⁰°)> ^{240 nm} <£ " ⁴² 400), 268 nm

(£ = 44 800), 300 nm (£ = 31 200). Die optische Drehung beträgt [a]_D = + 50 + 1° (c= 0,458 in Methanol). Die Bruttoformel lautet C, η Yi,₍ 0,·7·

Das H-NMR-Spektrum in CD₃OD ist in Fig. 1 gegeben. Im DUnnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselfertigplatten F₂₅/ der Fa. Merck) im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der Rf-Wert =0,4 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit UV, Jod oder konz. Schwefelsäure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 7 Aequivalente Wasserstoff verbraucht,

Papulacandin A

Die Elementaranalyse ergibt folgende Werte: C = 62,98% H = 7,45% 0 =-29,09%.

Das Antibiotikum zeigt im IR.-Spektrum in Kaliumbromid Banden bei 3450, 2950, 2870, 1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155, 1075, 1035, 1010, 975, 860

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und 845 cm . Im UV-Spektrum in Aethanol sind die folgenden

Maxima vorhanden: A> ( E ¹^ ): 232 nm (Schulter) ,

max ^N lern ·

242 nm (E = 425) und 265 nm ( E = 520). Das ¹H-NiQl. -Spektrum in CD OD ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die

20

Verbindung zeigt eine optische Drehung.[α]_β = + 31 + 1°

•(c = 0,451 in Methanol). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel (Kieselgelfertig^platten F₂₅₄ der Fa. Merk ) im System Chloroform-Methanol (4:1) ist der Rf-Wert = 0,50 bei dreimaligem Durchlaufen. Nachweis mit W, Jod oder konz. Schwefnls'äure und Erhitzen. Bei der Microhydrierung werden 6-7 Aequ. Wasserstoff verbraucht. Die ungefähre Bruttoforiviel lautet C50-53^72-78°L7-Γ9'

Beispiel 4:

Von den nach Beispiel 3 erhaltenen Fraktionen 67-70, • die Papulacandin B enthalten, werden 2,1 g auf eine Säule (0=4 cm, h = 50 cm), gefüllt mit Sephadex^-LH-20 (5,5 Liter) chromatographiert. Sephadex-LH-20 (alkyliertes vernetztes Dextran),wurde vorher 4 Stunden in Methanol gequollen. Die 2,1 g Papulacandin B werden in 5 ml Methanol gelöst und auf die Säule gegeben: Die Elution erfolgt mit Methanol in Fraktionen von 22 ml. Die Geschwindigkeit betragt 90 ml/Stunde. Die Fraktionen werden im Vakuum vom

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Lösungsmittel befreit und der Rückstand im Hochvakuum ge trocknet. Die Eluate der Fraktionen 1-15 (120 mg) sind nur schwach aktiv und werden verworfen. Die Fraktionen 16-27 enthalten 1,9 g reines Papulacandin B, die aus Aceton/Aether gefällt wird. Eigenschaften siehe Beispiel 3.

Beispiel* 5:

Die nach Beispiel 4 erhaltenen Fraktionen 17-23 .(1,5 g), die in kleinen Mengen Papulacandin D und E enthalten, werden in Aceton gelöst. Nach längerem Stehen bei 0⁰C kristallisiert eine inaktive Substanz aus. Die Mutterlauge enthält angereichertes Papulacandin D und E. Durch präparative Dickschichtchromatographie auf Kieselplatten (100 cm χ 20 cm, 1 mm Schichtdicke) im System Essigester-Aceton-Wasser-(72:24:4) können die beiden Komponenten voneinander getrennt werden. Papulacandin D und E wird aus Aceton/Aether/Hexan als farblose Substanz gefällt.

Papulacandin D: Das IR-Spektrum zeigt u.a. Banden bei 3500, 2950, 2870, 1705, 1675, 1640, 1620, 1465, 1385, 1350, 1300, 1260, 1205, 1150, 1070, 1035, 1005, 975 cm"¹. Weitere phys.· ehem. Eigenschaften, siehe im allgemeinen Teil der Beschreibung.

Papulacandin E: Das IR-Spektrum weist u.a. folgende Banden auf: 3500, 2950, 2870, 1710, 1640 (Schulter), 1615, 1465,

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1385, 1350, 1300, 1240, 1185 (Schulter), 1150, 1070, 1040, 1010, 975 cm . Weitere phys.-chem. Eigenschaften, siejie im allgemeinen Teil der Beschreibung.

Beispiel 6:

Papulacandin B wird wie folgt acetyliert: 250 mg Papulacandin B werden mit je 2 ml. Pyridin und Essigsäureanhydrid während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und an 30 g Kieselgel mit Chloroform, welches 1% Methanol enthält, chromatographiert. Es werden 300 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, welches zweimal aus Aether und Hexan gefällt wird. Im IR-Spektrum in Methylenchlorid des Acetylderivats sind folgende Banden vorhanden: 2970, 2870, 1755, 1645, 1620, 1425, 1375, 1225, 1195, 1125, 1080, 1050, 1015, 970 und 890 cm"¹. Das UV,Spektrum in Aethanol weist Maxima bei 216 nm (C = 23200), 242 nm (E= 25600), 268 nm (£ = 27600) und 295 nm (Schulter) auf. Die Elementaranalyse ergibt: C = 60,74% H = 6,51%. Osmometrisch wird ein Molekulargewicht von 1250 gefunden.

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Beispiel 7:

Papulacandin B wird wie folgt hydriert. Zu 50·rag Platinoxid, die in 15 ml Aethanol in einer Hydrierungsapparatur vorhydriert wurden, gibt man 250 mg Papulacandin B. Es werden 44 ml Wasserstoff aufgenommen, was 6,8 Aequivalenten entspricht. Nach Filtration und Eindampfen des Filtrates werden 243 mg farbloser Rückstand erhalten, der an 50 g Kieselgel mit Chloroform, welches 8% Methanol enthält, chromatographiert wird. Es werden 106 mg reines Hydrierungsprodukt erhalten.

Das IR.-Spektrum (in KBr) zeigt Banden bei : 3500, 2950, 2860, 1720, 1610, 1465, 1385, 1250, 1185, 1150, 1095, 1070, 1030, 1005, 980 cm"¹. Im ¹H-IJMR.-Spektrum sind die Signale der olefinischen Protonen der Komponente B verschwunden. - ..

Weitere physikalisch-chemische Eigenschaften: siehe den allgemeinen Teil der Beschreibung.

Beispiel 8:

Das Antibiotikum Papulacandin B wird wie folgt methy-

liert: 200 mg Komponente B*, gelöst in 2 ml Methanol wird bei 0⁰C während mit einer Lösung von Diazomethan in Aether stehen gelassen. Nach Eindampfen werden 210 mg Rückstand erhalten.

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Das Methylätherderivat wird durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Silicagel-Dickschichtplatten im System Chloroform-Methanol (5:1) erhalten. Es werden 106 mg farbloser, amorpher Papulacandin B-Monomethyläther erhalten, welcher aus Aceton/Aether/Hexan gefällt wird. Im IR-Spektrum (in KBr) sind folgende Banden vorhanden: 3450, 2950, 1700, 1640 (Schulter), 1610, 1460, 144O₅ 1345, 1300, 1260; 1155, 1070, 1030, 1010 cm"¹. Das UV-Spektrum in Aethanol weist folgende Maxima auf:

pi _a_, (tmax.): 235 (37 600), 267 (39-000), 295 (Schulter). • max

Aufgrund des H-NMR. -Spektrums ist eine phenolische- Methylgruppe vorhanden.

Als weiteres Produkt wird auch Papulacandin B-dimethyläther erhalt en, in welchem auf Grund des H-NMR- Spektrums beide phenolischen Hydrox}^Tlgruppen methyliert worden sind.

Beispiel 9:

Das Antibiotikum Papulacandin A wird wie folgt acetyliert: 100 mg Papulacandin A werden mit je 1 ml Pyridin und EssigsMureanhydrid während 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und an 20 g Kieselgel mit Chloroform, welches 1% Methanol enthält, chromatographiert. Es werden 75 mg farbloses, amorphes Acetat erhalten, welches zweimal aus Aether und Hexan gefällt wird. Im IR.-Spektrum (in Methylenchlorid) des Acety!derivates sind folgende Banden vorhanden:

2920, 2S60, 1755, 1690, 1640, 1605, 1510, 1460, 1370,

965 cm" . Das I

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1225, 1175, 1125, 1040, 965 cm"¹. Das UV.-Spektrum

Vi

in AethanoL weist Maxima bei 242 nm ( E ι ° — 240)

1 cm

und 262 (E ?^ = 370) auf. Die Anzahl der Acetylgmppen

.'1 liess sich nicht eindeutig bestimmen. Aufgrund des H-NMR.

Spektrums sind 9-11 Acetylgruppen anzunehmen.

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Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, dass man Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel oder eine das Antibiotikum Papulacandin bildende Mutante in einer wässerigen, eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthalten Nährlösung aerob züchtet, bis diese eine wesentliche antibiotische Wirkung aufweist, und das Antibiotikum Papulacandin hierauf isoliert und, wenn erwünscht, in seine Komponenten auftrennt und/oder in Derivate überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Papularia sphaerosperma (Pers.) Höhnel NRRL 8086 ( A 32283) züchtet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass, man zur Prüfung auf Anwesenheit des Antibiotikums Candida albicans verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturfiltrat mit einem mit Wasser nur wenig mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturfiltrat mit Essigester extrahiert wird.

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6.- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Myeel mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon mit Wasser extrahiert wird. -

7-* Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Kycel mit wässerigem Methanol extrahiert wird.

8._s " Verfahren nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie gereinigt wird.

9:.«. . Verfahren nach den -Ansprüchen 1 - 8, dadurch gekennzeichnet _>t dass das Antibiotikum durch Chromatograhie an Kieselgel·, gegebenenfalls in Mischung mit Aktivkohle, gereinigt " wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 - 9_y dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikuni durch Chromatographie an Adsorptions-

- harzen gereinigt wird. " ·

11. Verfahren nach Anspruch 1 - IQ., dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an vernetzten Dextranen gereinigt wird. ' . - .

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12. Verfahren nach den Ansprüche 8-11, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum mit Mischungen von Chloroform und Methanol eluiert.

13"i Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum durch Chromatographie an Kieselgel, gegebenenfalls in Mischung mit Aktivkohle, in die Komponenten aufgetrennt wird.

14. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Papulacandin und/oder seiner Komponenten und Derivate wie in den Beispielen beschrieben.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente B des Antibiotikums Papulacandin isoliert und, wenn erwünscht, in seine Derivate überführt.

16.. Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente A des Antibiotikums Papulacandin isoliert un.d, wenn erwünscht, in seine Derivate überführt.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 1-12,· dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente C des Antibiotikums Papulacandin isoliert und, wenn erwünscht, in seine Derivate überführt .

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18· Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente D des Antibiotikums, Papulacandin isoliert und, wenn erwünscht, in seine Derivate überführt.

19* Verfahren nach den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponente E des Antibiotikums Papulacandin isoliert und, wenn erwünscht, in seine Derivate überführt .

20. Das Antibiotikum Papulacandin und seine Derivate.

21· Die Komponente B des Antibiotikums Papulacandin und seine Derivate.

22· Die Komponente A des Antibiotikums Papulacandin und seine Derivate.

23. Die Komponente C des Antibiotkums Papulacandin und seine Derivate.

24·· Die Komponente D des Antibiotikums Papulacandin und seine Derivate.

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• - 4L -

25. Die Komponente E des Antibiotikums Papulacandin

und seine Derivate.

26.· Die in den Beispielen beschriebenen neuen anti-

biotisch aktiven Verbindungen.

"27· Pharmazeutische Präparate, enthaltend das Antibiotikum Papulacandin oder seine Komponenten oder Derivate dieser Verbindungen.

28. Die Verwendung des Antibiotikums Papulacandin als

antifungisches Mittel.

Der Stamm Papularia sphaerosperma (Pers) Hb'hnel NRRL 8086 (A 32283) und dessen das Antibiotikum Papulacandin bildende Mutanten.

CIBA-GEIGY AG

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