DE2164564C2

DE2164564C2 - Antibiotikum A-201A und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2164564C2
Application number: DE2164564A
Authority: DE
Inventors: Robert L. New Ross Ind. Hamill; Marvin Martin Indianapolis Ind. Hoehn
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1970-12-24
Filing date: 1971-12-24
Publication date: 1984-04-05
Also published as: HK54676A; YU35620B; DK129465B; CH547351A; IL38479A; FR2119086A1; GB1315430A; DE2164564A1; DE2167325C2; JPS5530839B1; MY7600252A; DK129465C; NL174959B; YU324971A; AU3729471A; NL174959C; FR2119086B1; NL7117796A; IL38479A0; CY869A

Description

O = C CH₃-C

CH

CH₃O

OH

CH,-O

OCH₃

Petroläther gibt, den dabei entstandenen Niederschlag abfiltriert, im Vakuum trocknet und in Chloroform löst, an einer Kolonne mit Kieselgel chromatographiert und das Antibiotikum A-201 A durch Umkristallisieren aus kaltem Aceton weiter reinigt

die in Alkoholen, Aceton, Chloroform und Äthylacetat löslich und in Wasser, Kohlenwasserstoffen und Äther unlöslich ist,
beil 70 bis 172°C schmilzt,

eine Zusammensetzung aus 55,20% Kohlenstoff, 6,72% Wasserstoff. 10,45% Stickstoff und 28,05% Sauerstoff hat,

ein Molekulargewicht von 8,02, bestimmt nach der Felddesorptionsmassenspektrometrie, aufweist,
ein Ultraviolettabsorptionsmaximum bei 208 nm mit einem Extinktionskoeffizienten von E H = 535 und ein Absorptionsmaximum bei 275 nm mit einem Extinktionskoeffizienten von £ j 1=490 aufweist und

bei Auflösung in Chloroform folgende unterscheidbare Banden im Infrarotabsorptionsspektrum zeigt: 2,96 (breit), 3,45, 3,53, 5,89, 6,06, 6,26, 6,33, 6,40, 6,67, 6,92,7,06,7,15, 7,28,7,46,7,60, 7,76,7,92,8,10,8,30,8,60, 8,87,9,06,9,14,9,32,9,54,9,65,10,12,10,23,10,59,11,01, 11,30,11,60 und 12,00 Mikron.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A-201 A nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces capreolus NRRL 3817 in einem wäßrigen Nährmedium unter submersaeroben Bedingungen züchtet, die filtrierte Fermentationsbrühe auf pH 8,5 einstellt und mit Chloroform extrahiert, das Chloroform im Vakuum abdampft, den Rückstand in Methanol löst und filtriert, die filtrierte Methanollösung im Vakuum zur Trockne einengt, den Rückstand in Chloroform löst und zu

Eine Reihe von Krankheiten bei Mensch und Tier ist auf den Einfluß von Mikroorganismen, zu denen sowohl Bakterien als auch Pilze gehören, zurückzuführen, und diese Krankheiten lassen sich daher durch Antibiotika bekämpfen, die das Wachstum der jeweils ursächlichen Mikroorganismen unterdrücken und hemmen. Zu diesem Zweck gibt es bereits die verschiedensten Antibiotika mit unterschiedlicher Wirkungsrichtung und Wirkungsstärke. Die Mikroorganismen haben nun jedoch die Fähigkeit, daß sie im Laufe der Zeit gegenüber einem bestimmten Antibiotikum eine Resistenz entwickeln können, so daß sie dagegen unempfindlich werden und hiermit nicht mehr bekämpft werden können. Allein aus diesem Grunde besteht ständig Bedarf an der Schaffung neuer Antibiotika. Wegen der Vielfalt der als Krankheitserreger in Frage kommenden Mikroorganismen ist mit den bekannten Mitteln zudem keine dem jeweiligen Problemorganismus optimal gerecht werdende Wirksamkeit möglich, so daß auch deshalb stets nach weiteren Antibiotika gesucht wird. Ein besonders heikles Problem, das bis heute noch nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte, ist die Bekämpfung von Akne. Diese Hautkrankheit dürfte hauptsächlich auf Propionibacterium acnes zurückzuführen sein, bei dem es sich um den in Verbindung mit Akne am häufigsten vorkommenden anaeroben Mikroorganismus handelt. Ein Mittel, durch das sich vor allem Propionibacterium acnes und auch andere einschlägige anaerobe Organismen erfolgreich bekämpfen ließen, wäre daher sehr von Vorteil.

Obigen Ausführungen zufolge gibt es bisher kein-Antibiotikum, durch das sich die für Akne ursächlichen Mikroorganismen ausreichend wirksam bekämpfen lassen, und Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Antibiotikums, welches sich außer seiner Eignung zur Bekämp^cung einer Reihe verschiedenster Mikroorganismen mit besonderem Erfolg gerade zur Behandlung der für Akne verantwortlichen anaeroben Organismen einsetzen läßt. Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das aus den Ansprüchen hervorgehende neue Antibiotikum A-201 A und seine Herstellung gelöst.

Das Antibiotikum A-201 A ist strukturmäßig mit dem bekannten Antibiotikum Puromycin verwandt. Im Hemmverhalten unterscheiden sich beide Antibiotika jedoch grundlegend voneinander, so daß Puromycin zur Behandlung von Akne überhaupt nicht geeignet ist. Ein Vergleich der Struktur, physikalischen Eigenschaften und der Wirkungsspektren dieser beiden Antibiotika geht aus R. J. Suhadolnik, Nucleosides as Biological Probes, Wiley-Interscience, Seiten 89 bis 102 (1979) hervor. Durch das Antibiotikum A-201 A wird daher vor allem auch ein neues Mittel zur Behandlung von Akne bereitgestellt, das gerade auch gegenüber dem strukturmäßig nahe verwandten Puromycin eine ganz überraschende Bereicherung der Technik mit sich bringt.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum A-201A hat die im Patentanspruch 1 enthaltene Formel und weist die

dort zum Teil angegebenen physikalischen Daten auf. Sein Infrarotspektrufii geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. In 67%igem Dimethylformamid zeigt das Antibiotikum A-201A einen Anfangs-pH-Wert von 7,8 und ergibt keine titrierbaren Gruppen im pH-Bereich von 3,5 bis 13,5. Ein Pulverröntgenbeugungsdiagramm von kristallinem A-201A unter Anwendung von vanadiumgefilterter Chromstrahlung und einer Wellenlänge von 2,2896 χ 10-^l0m zur Berechnung der Netzebenenabstände ergibt folgende Werte:

Lösungsmittelsystem

RpWert

l/l

14,0	0,20
9,5	0,05
6,7	1,00
5,0	0,50
4,5	0,05
4,2	0,10
3,8	0,05
3,5	0,10

Kristallines A-201A zeigt bei papierchromatographischen Untersuchungen unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1 und Bioautographie mittels Sarcina lutea in den angegebenen Lösungsmittelsystomen folgende RcWerte:

Lösungsmittelsystem

Rr-Wert

0,87 0,89 0,88

4 0,44

5 0,47

6 0,48

7 0,70

8 0,87

9 0,88

10 0,13

11 0,83

Lösungsmittelsysteme:

1. Mit Wasser gesättigtes Butanol.

2. Mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2 % para-Toluolsulfonsäure.

3. Mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2 % para-Toluolsulfonsäure plus 2 % Piperidin.

4. Nit Wasser gesättigtes Methylisobutylketon.

5. Mit Wasser gesättigtes Methylisobutylketon plus 2 % para-Toluolsulfonsäure.

6. Mit Wasser gesättigtes Methylisobutylketon plus 2 % Piperidin.

7. Wasser/Methanol/Aceton (12:3: 1); diese Lösung wird mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mit H₃PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt.

8. 80%iges Ethanol mit 1,5% NaCI; Papier wird mit Im Natriumsulfatlösung imprägniert.

9. Methanol/0,1 η HCl (3:1)

10. Mit Wasser gesättigtes Benzol.

11. Wasser/Ethanol/Essigsäure (70 :24:6).

Dünnschichtchromatogramme von kristallinem A-201A, die auf Kieselgelplatten entwickelt wurden, ergeben folgende Ri-Werte:

Lösungsmittelsystem

Nachweis

Ethylacetat/Ethanol (4:1) E thy lace tat/E thanol (1:1)

Naphthoresorcin-Reagens
H₂SO₄, UV-Licht oder
Bioautogramm

Der spezifische Drehwert von A-201A beträgt [λ] V = - 129,6° (C= 1, Methanol).

Das NMR-Spektrum von kristallinem A-201 A zeigt die Anwesenheit von 4 bis 5 Methylgruppen, aromatischen Bindungen und Hydroxylgruppen. Acetyliertes A-201A enthält etwa 21,17% Acetylgruppen, und das NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von Triacetyl-A-201A.

Das Antibiotikum A-201A wird durch Züchtung von Streptomyces capreolus NRRL 3817 und Isolierung nach dem im Patentanspruch 2 beschriebenen Verfahren gewonnen. Der Stamm NRRL 3817 ist ohne Beschränkung der Abgabe an Dritte bei der ständigen Kulturensammlung des Northern Utilization Research and Development Laboratory, Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und von dort unter der Nummer NRRL 3817 frei beziehbar. Der Stamm wurde aus einer aus Venezuela stammenden Bodenprobe isoliert. Zur Isolierung des Organismus aus der Bodenprobe wurden Teile der Probe in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde in Streifen auf Nähragar aufgestrichen. Die beimpften Nähragarplatten wurden bei 25 bis 35⁰C inkubiert, bis Wachstum beobachtet wurde. Am Ende der Inkubationsdauer wurden Kolonien der A-201 A-bildenden Organismen mit Hilfe einer sterilen Platinschlinge auf Schrägagar übertragen. Die Schrägagarkulturen wurden dann zur Erzeugung geeigneter Mengen

bo Inokulum für die Produktion von A-201 A inkubiert.

Die hauptsächlichen morphologischen Merkmale dieses Stammes von Streptomyces capreolus sind: ovale bis leicht zylindrisch geformte glatte Sporen sind in langen gewellten verschlungenen Ketten angeordnet,

b5 die im allgemeinen 10 bis 50 Sporen pro Kette aufweisen, wobei einige Ketten mehr als 50 Sporen pro Kette haben. Die Sporen haben Abmessungen von 1,005 bis 2,01 um χ 0,67 bis 1,05 μΐη. Die Sporenfarbe in Masse

reicht von weiß bis gelb oder rot auf verschiedenen Medien [Shirling, E. B. und Gottlieb, Inter. Bull. Systematic Bacteriol., 16,313-340(1966)]. Diese Kultur kann unter die weiße, gelbe und rote Gruppe nach Tresner und Backus, Applied Microbiology, 11, 335 bis 338 (1963) eingeordnet werden. Zellwandanalysen nach der Methode von Becker et al., App. Microbiol. 12, 421 -423 (1964) zeigen die Anwesenheit des Mesoisomeren von Diaminopimelinsäure. Die Kuitur ist melaninnegativ. Die Kultur ist zu gutem Wachstum bei Inkubationstemperaturen von 35°C oder mehr fähig.

Andere ähnliche Arten des Genus Streptomyces sind Streptomyces alboflavus und Streptomyces canescus. Streptomyces alboflavus bildet jedoch ein Melaninpigment und Streptomyces canescus kugelförmige Sporen.

Für die taxonomischen Untersuchungen von Streptomyces capreolus NRRL 3817 wurden die Methoden angewandt, die für das internationale Streptomyces-Projekt zur Charakterisierung von Streptomyces-Arten empfohlen wurden (Shirling und Gottlieb, ibid). Die Ergebnisse der taxonomischen Untersuchungen sind im folgenden zusammengefaßt. Farbbezeichnungen wurden nach der Methode von Inter Society Color Council, National Bureau of Standards (ISCC. NBS) [Kelly, K. L. und Judd, D. B., U.S. Department of Commerce, Circ. 553 (1955)] zugeordnet. Die Buchstaben in runden Klammern beziehen sich auf Farbblöcke und die unterstrichenen Buchstaben und Zahlen auf Farbplättchen nach Tresner und Backus, ibid. Die Zahlen in eckigen Klammern beziehen sich auf Farbblöcke nach Maerz und Paul, Dictionary of Color, McGraw Hill, New York (1950). Die ISP-Zahlen beziehen sich auf die Medien des internationalen Streptomyces-Projekts, deren Zusammensetzung in der Veröffentlichung von Shirling und Gottlieb, ibid, angegeben ist. Die Beobachtungen wurden nach 14 Tage langer Inkubation bei 30°C vorgenommen, wenn nichts anderes angegeben ist.

Mikroskopische Morphologie,
Kulturmerkmale und Physiologie von
Streptomyces capreolus NRRL 3817

Mikroskopische Morphologie

Die Sporen haben ovale bis schwach zylindrische Form und sind in langen, gewellten, verschlungenen Ketten mit 10 bis 50 Sporen pro Kette oder mehr angeordnet. Die Oberfläche der Sporen ist glatt, wie im RlektronenrnikroskQⁿ beobachtet wird. Die Abmessungen der Sporen reichen von 1.005 bis 2,0 Mikron χ 0,67 bis 1,005 Mikron.

Bennett-Agar:

Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite mäßig rot [3HlO]. Kein lösliches Pigment.
Nähragar:

Mittleres Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite hell-gräulich-braun. Kein lösliches Pigment.

Emerson-Agar:

ίο Gutes Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite dunkel-gräulich-gelb [13K3]. Kein lösliches Pigment.

Glucose-Asparagin-Agar:

Gutes Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen, Unterseite stark gelblich-rosa. Kein lösliches Pigment.

Calcium-Malat-Agar:

Das Wachstum auf diesem Medium ist so schlecht, daß keine Farbzuordnung durchgeführt wurde.
Tyrosin-Agar:

Mittleres Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (Y) blaß-gelb 2db [11Cl]. Unterseite blaß-gelb-grün [10BI]. Kein lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr. 2:

Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite gräulich-rötlich-orange [ 11A8]. Kein lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr. 3:

Mittleres Wachstum mit mittlerem Luftmycel und Sporen (R) gräulich-geiblich-rosa 5cb [4A9]. Kein lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr.4:

Spärliches Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (W) weiß b. Unterseite Blaß-gelb-grün [10Bl]. Kein lösliches Pigment.

ISO-Medium Nr. 5:

Das Wachstum auf diesem Medium ist so schlecht, daß keine Farbzuordnung durchgeführt wurde.

4u Physiologische Merkmale

Gelatineverflüssigung negativ

Nitratreduktion positiv
Melaninpigmentbildung

(a) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar negativ

(b) Trypton-Hefeextrakt-Brühe negativ

Temperaturanforderungen

Kultureigenschaften

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar:

Gutes Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (W) weiß b. Unterseite hellgraugelblichbraun [13B5]. Kein lösliches Pigment

Czapek's-Agar:

Gutes Wachstum mit spärlichem Luftmycel und Sporen (R) blaß-orange-gelb 3ca, [10B3J. Unterseite blaß-gelb [10B2]. Kein lösliches Pigment

Hefeextrakt-Agan Reichliches Wachstum ohne Luftmycel oder Sporen. Unterseite kräftig gelblich-rosa [2P9]. Kein lösliches Pigment

Zwischen 26 und 30⁰C wird nur vegetatives Wachstum beobachtet. Bei 37° C zeigt sich gutes vegetatives Wachstum. Bei 43 bis 49°C werden gutes vegetatives Wachstum und gutes Luftmycel beobachtet Kein Wachstum bei 55° C

Reaktion der Substratfarbe auf pH-Änderung:
unbeeinflußt

In Tabelle I sind die Ergebnisse der Kohlenstoffverwertungstests zusammengefaßt, die mit dem A-201 -bildenden Stamm von Streptomyces capreolus NRRL durchgeführt wurden. Die in der Tabelle verwendeten Symbole haben folgende Bedeutung:

+ = Verwertung positiv

(+) = Verwertung wahrscheinlich

(—) = Verwertung fraglich

— = keine Verwertung

Tabelle 1

Kohlenstoffverwertung von S. capreolus,
Stamm NRRL 3817

Kohlenstoffquelle

Beurteilung

L-Arabinose (-)

Cellobiose +

i-Inosit (-)

D(+)-Xylose +

DJdannit

D(-)-Fructose (-)

D(+)-Raffinose

Saccharose (-)

L(+)-Rhamnose

Dextrose +

Kontrolle (kein Kohlenstoff)

Als Kulturmedium zur Züchtung von Streptomyces capreolus NRRL 3817 und Bildung des Antibioticums A-201A kann eines von vielen verschiedenen Medien verwendet werden. Zur Erzielung wirtschaftlicher Produktion, maximaler Ausbeute und leichter Isolierung werden jedoch bestimmte Medien bevorzugt. Im allgemeinen bietet ein Mehrkomponentenmedium, in dem verschiedene Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff zur Verfügung stehen, das beste Wuchsmedium. Kohlenstoff stammt aus Quellen wie Dextrinen, Melasse, Glucose oder Glycerin. Gute Stickstoffquellen sind Aminosäuremischungen oder Peptone. Sojabohnenmehl liefert sowohl Kohlenstoff als auch Stickstoff.

In den Kulturmedien sind anorganische Nährsalze enthalten, welche die üblichen Salze umfassen, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Nitrat- und Carbonationen und ähnliche Ionen liefern. Der Zusatz von Magnesium- und Eisensalzen, vorzugsweise als Sulfate, hat eine ucsuiiucib günstige Wirkung äüi uic Pföuükiiün uc5 Antibioticums. Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen erforderlich ist, sollen dem Kulturmedium auch wesentliche Spurenelemente zugesetzt werden. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich als zufällige Verunreinigungen bei der Zugabe der anderen Bestandteile des Kulturmediums eingeführt.

Der zur Produktion von A-201A verwendete Mikroorganismus ist in einem weiten pH-Bereich wachstumsfähig. Beispielsweise kann der pH-Wert der verschiedenen Medien von pH 6,2 bis pH 7,2 reichen. Wie es bei den meisten Streptomyceten der Fall ist, wird das Medium während der Wachstumsperiode allmählich alkalischer und kann einen pH-Wert von etwa 6,5 bis 8,0 erreichen. Zur Zeit des Aberntens am Ende der Wachstumsperiode beträgt der pH-Wert jedoch gewöhnlich etwa 6,8 bis 7,2.

Vorzugsweise wird eine submers-aerobe Fermentation in großen tiefen Tanks für die Produktion großer Msngen des Antibiotikums angewandt Kleine Mengen können mit Schüttelkolbenkulturen erzeugt werden. Bei der Produktion wird die Verwendung eines vegetativen Inoculums bevorzugt, da bei Verwendung der Sporenform des Organismus eine zeitliche Verzögerung bei der Inokulation von großen Tanks auftritt Das vegetative Inokulum wird dann in den größeren Tank überführt Das Medium, das zur Züchtung des vegetativen lnokulums verwendet wird, kann das gleiche Medium sein, wie es für große Fermentationen verwendet wird. Es können aber auch andere Medien verwendet werden.

Der A-201A bildende Mikroorganismus kann bei Temperaturen zwischen 30 und 50⁰C gezüchtet werden. Die höchsten Ausbeuten werden offenbar bei einer Temperatur zwischen 35°C und 40°C produziert.

Die Bildung antibiotischer Aktivität während der

ίο Fermentation kann durch Prüfung der Fermentationsbrühe auf antibiotische Aktivität gegen Mikroorganismen, die bekanntermaßen gegen das Antibiotikum empfindlich sind, verfolgt werden. Ein solcher Tastorganismus ist Bacillus subtilis. Der Biotest kann nach der Papierscheibenmethode oder mit Agarplatten durchgeführt werden.

Um ein wirksameres Wachstum des Organismus und eine vermehrte Antibiotikumbildung zu erreichen, wird sterile Luft durch das Kulturmedium geleitet. Das Luftvolumen, das pro Minute durch das Kulturmedium gepumpt wird, beträgt gewöhnlich wenigstens 10,0% des Volumens des Kulturmediums. Im allgemeinen ist das Wachstum um so wirksamer und die Antibiotikumproduktion um so höher, je größer das Luftvolumen ist, das durch das Kulturmedium gepreßt wird, bis hinauf zu der Menge, die zu einer wallenden Bewegung führt. Gewöhnlich wird die maximale Bildung von antibiotischer Aktivität in etwa 72 bis 120 Stunden erreicht.
Das Antibioticum kann durch Filtration, Extraktion und Adsorption von anderen Substanzen, die vorhanden sein können, abgetrennt werden. Die Flüssigkeit, welche die antibiotische Aktivität enthält, wird aus dem Wachstumsmedium durch Filtration abgetrennt. Das feste Mycel wird verworfen. Dabei wird gewöhnlich eine übliche Filterhilfe verwendet. Antibioticum wird aus dem Filtrat in ein übliches, damit nicht mischbares Lösungsmittel extrahiert. Der Überführung der Antibioticummischung in das Lösungsmittel geht eine Einstellung des pH-Werts des Filtrats auf etwa 8,5 mit 5 η

+0 Natriumhydroxidlösung voraus. Nach dem Extrahieren wird die rohe A-201 -Antibiotikummischung durch

\t ι r-- J-- ι =i :*»_i_ : \/-i

VCIUitllipiCll UCa bu^uilganilltcia im * aivuuiu gvnviiu^ii.

Dabei hinterbleibt ein trockener Rückstand, der in Methanol gelöst wird. Die Auflösung in Methanol ist unvollständig und das ungelöste Material wird abfiltriert und verworfen. Die verbleibende Methanollösung wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und der so erhaltene getrocknete Rückstand wird in Chloroform gelöst. Diese Lösung wird zu 5 Volumenteilen Petrolether

so gegeben, wodurch sich ein Niederschlag bildet, der die antibiotische Aktivität enthält. Die ausgefällte rohe Mischung aus Antibiotikum A-201A und A-201 B wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Die Antibiotikummischung wird in 10 Volumenteilen Chloroform

gelöst und an einer Kolonne mit Kieselgelfüllung Chromatographien und dadurch in die Antibiotika A-201 A und A-201 B in praktisch reiner Form getrennt Alternativ kann die Antibiotikummischung an einer Kolonne mit einer chromatographischen Füllung, wie aktiviertem Aluminiumoxid oder Aktivkohle, zur Gewinnung der getrennten einzelnen Antibiotika in praktisch reiner Form chromatographiert werden. Antibiotikum A-201 A, wird durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel weiter gereinigt

Antibiotikum A-201 B ist eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur.

Das chromatographische Verfahren zur Trennung der Antibiotikummischung in ihre einzelnen Kompo-

nenten wird im folgenden ausführlicher beschrieben.

Die rohe Antibiotikummischung, die aus der Petrolether-Chloroform-Verteilung als Niederschlag erhalten wird, wird im Vakuum zur Trockne gebracht, in Aceton gelöst und auf eine Kolonne mit Kieselgel aufgegeben. Die Kolonne wird durch Aufschlämmen des Kieselgels in einer 1 :1-Lösung von Chloroform/Aceton und Absinkenlassen des Kieselgels bei ablaufendem Träger gefüllt. Nachdem sich die Füllung gesetzt hat, wird die Kolonne mit drei Volumenteilen der 1 :1-Chloroform-Acetoii-Lösung gewaschen. Nach Aufgabe der Chloroformlösung der Antibiotikummischung auf die Kolonne wird die Kolonne erneut mit 1 Volumenteil der 1 :1-Chloroform-Aceton-Lösung gewaschen und das Antibiotikum A-201A wird mit Aceton eluiert. Das Eluat wird aus der Kolonne in Anteilen abgenommen und auf äntibiotische Aktivität geprüft. Die Fraktionen, die antibiotische Aktivität enthalten, werden vereinigt, und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in warmem Aceton aufgenommen, die Lösung wird filtriert und das Filtrat wird 8 Stunden auf -20⁰C abgekühlt. Der Niederschlag, der sich in der kalten Acetonlösung bildet, besteht aus Antibiotikum A-210A. Die Kristalle werden abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Die Kieselgelkolonne, aus der die gesamte Aktivität an Antibiotikum A-201 A durch Eluieren mit Aceton entfernt ist, wird mit einer 9 :1 Aceton-Methanol-Lösung eluiert. Das Eluat wird in Anteilen aufgefangen und auf antibiotische Aktivität getestet. Die Fraktionen, die antibiotische Aktivität zeigen, werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand ist eine Flüssigkeit, die mit Aceton gewaschen und erneut zur Trockne eingedampft wird. Die lösungsmittelfreie Flüssigkeit besteht aus Antibiotikum A-201 B, einem farblosen bis hellbraunen öl.

Das neue Antibiotikum zeiciiiici sich — wie bereits erwähnt — durch eine hemmende Wirkung gegen das Wachstum von Mikroorganismen aus. zu denen sowohl Bakterien als auch Pilze gehören, welche für Mensch und Tier pathogen sind. Es ist deshalb zur Unterdrüktv«ing uCS »* sciiStums sOlCiicr v^rgsnisrncn vortcintait, wobei es sich insbesondere zur Bekämpfung von Propionibacterium acnes und anderen aeroben Mikroorganismen eignet und daher mit besonderem Vorteil zur Behandlung von Akne verwendet werden kann.

Die minimale Hemmkonzentration dieses Antibiotikums in μg/ml, die nach der Röhrchenverdünnungsmethode für eine Reihe von repräsentativen Mikroorganismen ermittelt wurde, ist in der folgenden Tabelle H angegeben.

Tabelle II

Mikroorganismus

Minimale Hemmkonzentration
[ig/ml

Staphylococcus aureus 1,56 Streptococcus faecalis 12,50 Erwinia amylovora 12,50 Botrytis cinerea 100,00 Trichophyton mentagrophytes 25,00 Xanthomonas phaseoli SO₁OO Lactobacillus casei 12,50

Mikroorganismus	Minimale Hemm
	konzentration
Leuconostoc citrovorum	0,20
Vibrio metschnikovii	25,00
Mycobacterium avium	1,56
Diplococcus pneumoniae	6,25
Neisseria meningitidis	25,00
Mycoplasma gallisepticum	0,78
Pasteurella hemolytica	50,00
Pasteureila muitocida	3,12
Escherichia coli	50,00
Escherichia insidioa	50,00
Salmonella spp.	50,00

Die besonders überraschende Wirksamkeit des Antibiotikums A-201 A gegenüber dem Mikroorganismus Propionibacterium acnes. nämlich dem anaeroben Mikroorganismus, der am häufigsten in Verbindung mit Akne vorkommt, und auch gegenüber anderen anaeroben Mikroorganismen wird im folgenden belegt. Hierzu wird das Antibiotikum A-201 A unter Anwendung des sogenannten Agar-Verdünnungs-Versuchs untersucht, wie er im einzelnen in Applied Microbiology 23. Seiten 268 bis 275 (1972) näher beschrieben ist. Die dabei für das Antibiotikum A-201 A gegenüber Propionibacterium acnes erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle!!! hervor.

111

Propionibacterium acnes
Stamm Nr.

Minimale Hemmkonzentration von A-201 A (ug/ml) *)

44 79

101 103 104 105 106 107 108

0,5

1,0

<0,125 <O,l25 <0,125 <0,125

0,25
<0,125 <0,125

*) bestimmt nach 24 Stunden langer Inkubation.

Die Wirksamkeit des Antibiotikums A-201 A gegenüber anderen typischen anaeroben Bakterienisolaten unter Anwendung des Agar-Verdünnungs-Versuchs geht aus der folgenden Tabelle IV hervor.

Tabelle IV

Anaerobe Bakterien

Minimale Hemmkonzentration von A-201 A

Actinomyces israelii W 855 <0,5 Ciosindium perfringens 81 1,0

Ciosindium septicum 1128 <0,5

Eubacterium aerofaciens 1235 <0,5

Peptococcus asaccharolyticus 1312 <0,5 Peptococcus prevoti 1281 1,0

Pepiostreptococcus anaerobius 1428 <0,5 Peptostreptococcus intermedius 1264 2

Propionibacterium acnes 79 2

Bacteroides fragilis 111 < 128 Bacteroides fragilis 1877 16

Bacteroides fiagilis 1936 B 16

Bacteroides thetaiotaomicron 1438 8

Bacteroides meianinogenicus 1856/28 4 Bacteroides meianinogenicus 2736 8

Bacteroides vulgaris 1211 8

Bacteroides corrodens 1874 8

Fusobacterium symbiosum 1470 <0,5 Fusobacterium necrophorum 6054 A 2

Aus der folgenden Tabelle V geht die Empfindlichkeit einer Anzahl an anaeroben Kokkenisolaten gegenüber dem Antibiotikum A-201 A hervor, und zwar wiederum bestimmt nach dem Agar-Verdünnungs-Versuch.

Tabelle V

Das Antibiotikum A-201 A weist auch eine Aktivität in vivo gegen Infektionen von Küken durch Mycoplasma gallisepticum auf. Wenn beispielsweise 5 mg A-201 A subkutan in den Hals von infizierten Küken injiziert werden, zeigt sich die Aktivität an der Abnahme der Zahl von Luftsackschäden. Bei oraler Verabreichung in einer Dosis von 100 mg/kg ist das Antibiotikum zur Behandlung von jungen Ratten wirksam, die mit Entamoeba histolytica infiziert sind. Das Antibiotikum

ίο ist ferner bei intraperitonealer Verabreichung von 50 mg/kg auch zur Bekämpfung von Infektionen bei Mäusen durch Borrelia novyi wirksam. Bei subkutaner Injektion an Mäuse ist das Antibiotikum A-201 A in vivo auch gegen infektiöse Organismen wirksam. Hierbei ergeben sich beispielsweise folgende ED50-Werte: Staphylococcus aureus = 6,5 mg/kg; Diplococcus pneumoniae= 100 mg/kg; Streptococcus pyogenes C203= 12 mg/kg. Die Toxizität von A-201 A bei Mäusen (L p.) beträgt LD₅₀=400 mg/kg.

Das Antibiotikum A-201 A hat sich auch zur Wachstumsförderung von Tieren als wirksam erwiesen. Wenn A-201 A dem Grundfutter von 4 Tage alten Küken in einer Menge von 50 g/t zugesetzt wird, zeigt sich, daß die Gewichtszunahme und die Futterverwertung in einer Zeit von 10 Tagen verbessert wird. Küken, die das Antibiotikum A-201 A zusammen mit dem Grundfutter erhalten, weisen eine Gewichtszunahme von 160 g auf, während diejenigen Küken, die nur das Grundfutter erhalten, um 148 g zunehmen. Außerdem wird die Futterverwertung so verbessert, daß diejenigen Küken, die das Antibiotikum A-201 A erhalten, nur 1,38 kg Futter pro kg Gewichtszunahme benötigen, während die Tiere, die nur das Grundfutter fressen, 1,52 kg Futter je kg Gewichtszunahme benötigen.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1

Anaerobe Kokken

Minimale Hemmkonzentration von A-201 A frg/ml)

Peptococcus asaccharolyticus 1302 0,5

Peptococcus asaccharolyticus 1344 <0,06 Peptococcus constellatus 1468 4

Peptococcus magnus 1401 <0,06 Peptococcus magnus 1421 1,0

Peptococcus magnus 1477 1.0 Peptococcus prevoti 1281 0,125

Peptococcus prevoti 1293 0,5

Peptococcus prevoti 1407 0,125

Peptostreptococcus anaerobius 8 <0,06 Peptostreptococcus anaerobius 52 0,125

Peptostreptococcus anaerobius 59 <0,06

Peptostreptococcus anaerobius 1418 <0,06 Peptostreptococcus anaerobius 1451 0,25

Peptostreptococcus anaerobius 1428 0,25

Peptostreptococcus anaerobius 1477 <0,06 Peptostreptococcus intermedius 1264 1,0 Peptostreptococcus intermedius 1524 0,25 Peptostreptococcus intermedius 1624 0,5

Schüttelkolbenfermentation von Antibiotikum A-201 A

Eine Nähragar-Schrägkultur mit folgender Zusammensetzung wird mit Sporen von Streptomyces capreolus NRRL 3817 beimpft.

Hefeextrakt-Agar

Bestandteil

Menge

Glucose

Hefeextrakt

Agar

destill. Wasser

5g 10 g 20 g

11

Die Schrägkulturen werden mit den Sporen von NRRL 3817 beimpft und sechs Tage bei 30⁰C inkubiert Die reifen Schrägkulturen werden dann mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und zur Ablösung der Sporen mit einer sterilen Schlinge abgeschabt Die erhaltene Sporensuspension wird dann zur Erzielung einer gleichmäßigen Verteilung intensiv durchgemischt und 1 ml der Suspension wird zum Beimpfen von 100 ml eines vegetativen Wuchsmediums mit folgender Zusammensetzung verwendet.

Medium für vegetatives Inokulum

Bestandteil

Menge Menge

	15 g	⁵ Bactopeton	15 g
Dextrose	15 g	Glycerin	10 g
Soj abohnenmehl	5g	Milch-Albumin	10 g
Maisquellwasserfeststoffe	2g	Rohrzuckermelasse	10 g
CaCO₃	5g	¹⁰ Getrocknete Maisschlempe	5g
NaCl	11	destill. Wasser	10 g
Leitungswasser		ad 11

Das vegetative Wuchsmedium wird vor dem Beimpfen 30 Minuten im Autoklaven bei 120⁰C sterilisiert.

Das beimpfte vegetative Medium wird 48 Stunden bei 30°C unter ständigem Schütteln auf einer Rotationsschüttelvorrichtung. die mit 250 UpM betrieben wird, wachsen gelassen.

Anteile von 100 ml des Produktionsmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben für das vegetative Inoculum angegeben wurde, werden in 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben und 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Nach Abkühlen werden die Kolben mit Anteilen von 5 ml des inkubierten vegetativen Mediums beimpft, das wie vorher beschrieben erhalten wurde.

Die Produktionskultur wird 72 Stunden bei 30⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung, die mit 250 Upm betrieben wird, geschüttelt. Der pH-Wert des Mediums vor dem Beimpfen beträgt etwa 7,0. Während der Fermentationsdauer steigt der pH-Wert allmählich an und beträgt beim Abernten etwa 7,5. Die antibiotische Aktivität wird aus der Fermentationsbrühe nach der vorstehend beschriebenen Methode extrahiert.

Beispiel 2

A. 946 I Tankfermentation von
A-201-Antibiotika

Eine Nähragar-Schrägkultur mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung wird mit Sporen von Streptomycescapreo!usNRRL3817 beimpft:

Bestandteil

Menge

Glucose

Hefeextrakt

Agar

destill. Wasser

5g
10 g
20 g

ad 11 Der pH-Wert dieses Wuchsmediums wird vor dem Sterilisieren mit 5 η Natriumhydroxid auf 7,0 bis 7,2 eingestellt Nach dem Sterilisieren beträgt der pH-Wert des Mediums 6,5 bis 6,6. Das beimpfte vegetative Wuchsmedium wird 72 Stunden bei etwa 30°C unter ständiger Durchmischung auf einer Rotationschüttelvorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, wachsen gelassen.

Mit einem Anteil von 20 ml des so erzeugten vegetativen Inokulums werden als zweite Stufe 400 ml eines vegetativen Wuchsmediums mit der gleichen Zusammensetzung wie oben angegeben beimpft. Dieses zweite Inokulum wird etwa 48 Stunden bei 30⁰C unter konstanter Durchmischung auf einer Rotationsschüttelvorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, wachsen gelassen.

42 1 eines Saatmediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie oben für das vegetative Wuchsmedium der ersten Stufe angegeben wurde, mit einem Zusatz von 0,2 g eines Entschäumungsniittels pro 1 Medium J5 werden nach 30 Minuten langem Sterilisieren bei 120°C in einen Fermentationstank gegeben. Das Saatmedium wird mit etwa 400 ml des vegetativen Inokulums der zweiten Stufe versetzt. Die Fermentation des Saatwuchsmediums wird etwa 24 Stunden bei etwa 3O⁰C ■to unter Rühren mit einem Rührer mit 135 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,0184 nvVMinute durchgeführt. Nach etwa 24 Stunden langer Fermentation werden etwa 8,01 der Saattankkultur zum Beimpfen von 9461 eines sterilen Produktionsmediums mit 4^r> folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteil

% (Gew./Vol.)

Entschäumer

Dextrose

Sojabohnenschrot

Rohrzuckermelasse

Calciumcarbonat

destill. Wasser

0,02 5,00 1,50 0,30 0,25 ad 100,0

Die beimpfte Schrägkultur wird etwa 5 Tage bei etwa 30⁰C inkubiert. Dann wird eine kleine Menge steriles destilliertes Wasser zugesetzt und die Agaroberfläche wird zur Ablösung der Organismen und Gewinnung einer wäßrigen Suspension vorsichtig mit einer sterilen Platindrahtschlinge abgeschabt.

V2 ml der so erhaltenen Suspension wird zum Beimpfen von 50 ml eines sterilen vegetativen Wuchsmediums mit folgender Zusammensetzung verwendet: bo Die Fermentation wird bei einer Temperatur von etwa 30⁰C mit einer Rührgeschwindigkeit von etwa 250 UpM und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,396 mVMinute etwa 48 Stunden lang durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wird eine sterile Lösung von 47.2 kg Dextrose in 421 Wasser zugesetzt. Die Fermentation wird etwa 48 weitere Stunden fortgesetzt. Dann wird die Fermentation beendet und mit dem Abernten begonnen.

B. Isolierung der Antibiotikummischung

9001 Fermentationsbrühe, die wie unter A beschrieben erhalten wurde, werden unter Zusatz von 27 kg einer üblichen Filterhilfe filtriert und das Filtrat wird mit 5 η Natriumhydroxidlösung auf pH 8,5 eingestellt Das alkalische Filtrat wird zweimal mit 0,5 Volumenteilen Chloroform extrahiert Die Chloroformextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft Der erhaltene Rückstand wird in 21 Methanol gelöst und die unlöslichen Teilchen werden abfiltriert und verworfen. Das Methanolfiltrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 470 ml Chloroform gelöst und zu 101 Petrolether gegeben. Dabei bildet sich ein Niederschlag. Der Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch 82,6 g rohe Antibiotikum A-201 -Mischung erhalten werden.

C. Auftrennung der A-201 -Antibiotikum-Mischung

63 g der rohen Antibiotikum A-201-Mischung, die wie unter B beschrieben erhalten wurde, werden in 500 ml Chloroform gelöst. Eine chromatographische Kolonne

mit den Abmessungen 7 cm χ 60 cm wird mit Kieselgel als Aufschlämmung in einer 1 :1 -Mischung von Chloroform und Aceton gefüllt Der Träger wird abgelassen, wodurch sich das Kieselgel absetzt Die Chloroformlösung der rohen A-201-Antibiotikummischung wird oben auf die Kolonne aufgegeben und die Antibiotikumlösung wird durch die Kieselgelfüllung strömen gelassen. Nachdem 500 ml Chloroform aus der Kolonne abgelaufen sind, wird die Kieselgelfüllung mit 101 einer 1 :1-Chloroform-Aceton-Mischung gewaschen. Der Abfluß und die Waschlösung werden verworfen.

Dann wird Aceton durch die Kolonne geleitet und das Filtrat wird auf antibiotische Aktivität geprüft. Die Fraktionen, die antibiotische Aktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wird mit etwa 500 ml Aceton versetzt. Die Lösung wird erwärmt und dann über Nacht bei -20° C stehengelassen, um das Antibiotikum A-201 A zu kristallisieren. Die Kristalle werden abfiltriert und im Vakuum getrocknet, wodurch 13,3 g Antibiotikum A-201A mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 172° C erhalten werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Antibioticum A-201 A, eine weiße kristalline Verbindung, der Formel

(CH₃)jN

HOCH₂

HNOH