Die Erfindung betrifft das Tenebrlmycln-Antibiotikum Tenebrimycin Il mit der In Anspruch 1 angegebenen
Kennzeichnung 'und ein Verfahren zu dessen Herstellung (Anspruch 2).
Tenebrimycin II kann als Faktor eines neuartigen antiblotischen Komplexes hergestellt werden, der die sieben
Faktoren Tenebrimycin 1, Γ, 1!, Ill, IV, V und VI
umfaßt, von denen jeder antlbiotlsche Aktivität aufweist. Der Komplex Ist als freie Base In Wasser und in
Dimethylsulfoxid löslich, langsam löslich In Methanol und unlöslich in Aceton, höheren Alkoholen, Dioxan,
Äthylacetat, Dläthyläther, Acetonitril, Methylisobutylkcton
und Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln. Der freie Basen-Komplex Ist stabil bei Gefriertemperaturen, bei
Zimmertemperatur und bei 37° C für die Dauer von wenigstens 8 Wochen innerhalb eines pH-Bereiches von
I bis 11, die unterscheidbaren Banden Im Infrarot-Absorptionsspektrum
über einen Bereich von 2 bis 15 um sind folgende: 3,02 (breit), 3,15, 5,82, 6,26, 7,43, 8,8
(breit) und 9,7 (sehr breit) um, positive Reaktion bei den Ninhydrin-, Anthron- und Elson-Morgan-Tests, beim
Lowry-Proteln-Test geringe positive Reaktion und negative Reaktion beim Biuret- und Sakaguchl-Test. Dieser
Antibiotika-Komplex ist in der DE-PS 16 17 451 beschrieben.
Tenebrimycin II ist eine weiße feste Substanz. Elektrometrische
Titration in Wasser läßt titrierbare Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,7, 6,7, 7,7 und 8,7 erkennen.
Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin
II als ein Mineralöl-Mull wird In der Figur gezeigt. Die
unterscheidbaren Banden Im infraroten Absorptionsspektrum über den Bereich von 2 bis 15 um sind folgende:
5,02, 3,14, 6,05, 6,23, 7,4, 8,5, 8,75, 9,17, 9,65, 10,11, 11,15, 11,7 und 12,6 um.
Tenebrimycin II bildet ein Acetyl-Derlvat, das eine
spezifische Drehung \z]j) von etwa +130° aufweist, wenn
die Konzentration der Verbindung 1 Gew.-% auf das Öl
bezogen In wäßriger Lösung beträgt. Das Derivat hat keine restlichen titrierbaren Gruppen. Die Elementar-Zusammensetzuing
zeigt, wie durch Mikroanalyse festgestellt wurde, daß 4 Acetylgruppen zur Struktur von
Tenebrimycin Il hinzugekommen sind.
Säure-Additlonssalze von Tenebrimycin II können
durch herkömmliche Verfahren zubereitet werden. Es können entweder organische oder anorganische Säuren
zur Salzbildung verwendet werden. Ein bequemes Verfahren zur Herstellung solcher Salze besteht in der Hinzufügung
einer Lösung der salzbildenden Säure zu einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums. Im Falle von unlösliehen
Säure-Addltionssalzen scheidet sich das Salz aus
der Lösung ab und läßt sich leicht trennen mittels der herkömmlichen Arbeltsweisen, wie Filtration oder Zentrifugieren.
Sollte es vorkommen, daß das erwünschte Additionssalz nicht ohne weiteres ausfällt, kann man die Ausfällung
fördßrn. Indem man entweder die Lösung auf kleineres
Volumen konzentriert oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel zugibt, wie Aceton oder dergleichen.
Das Säure-Addltionssalz kann bequem wieder zur freien
Basenform des Antibiotikums umgewandelt werden, indem man eine wäßrige Lösung des Salzes über ein
anionisches Austauscherharz im Hydroxylkreislauf führt. Tenebrimycin II kann von den verschiedenen Faktoren,
die den erwähnten Tenebrimycin-Komplex bilden.
und von anderen Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften
durch paplerchromatographische Verfahren unterschieden werden, wie z. B. durch das folgende: Die Chromatographie
wurde In der herkömmlichen absteigenden Weise durchgeführt bei 230C ± 1 auf Whatmann Nr. 1
Papier vom Format 190x464 mm.
Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt. Die Wanderungskonstante
für jedes der angeführten Antibiotika drückt man besser mit einer Rf-Konstante aus, als durch
den herkömmlichen R,-Wert. Der R,.-Wert drückt das Verhältnis der Entfernung, die vom Antibiotikum durchmessen
wurde, in bezug auf das Blattende und nicht auf die Lösungsmittelfront aus.
Dieses Verfahren, die Konstante auszudrücken, wurde
gewählt im Hinblick auf die Talsache, daß die Lösungsmittelfront
über das Blattende hinaus, während des Zeitraumes, der für die meisten Lösungsmittelsysteme ungewandt
wurde, vorgedrungen war.
Tabelle I
Papier-Chromatographie der Tenebrimycine
und bekannter Antibiotika 'nit ähnlichen Eigenschaften
Losungsmittel-System 1 und R^-Werte ABCD
Tenebrimycin-Komplex |
- |
- |
- |
0,65 |
0,32 |
0 |
0 |
Tenebrimycin I |
0,20 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Tenebrimycin Γ |
0,27 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Tenebrimycin II |
0,40 |
0,17 |
0,32 |
- |
- |
- |
- |
Tenebrimycin III |
0,40 |
0,34 |
0,41 |
- |
- |
- |
- |
Tenebrimycin IV |
0,49 |
0,20 |
0,32 |
- |
- |
- |
- |
Tenebrimycin V |
0,55 |
0,22 |
0,35 |
- |
- |
- |
- |
Tenebrimycin VI |
0,71 |
0,31 |
0,38 |
- |
- |
- |
- |
Kanamycin |
0,35 |
0,35 |
0,4 i |
0,65 |
0.42 |
0 |
0 |
Kanamycin B |
0,57 |
0,26 |
0,32 |
0,70 |
0,29 |
0 |
0,05 |
|
|
0,51 |
0,39 |
|
|
|
|
Gentamycin |
0,83 |
0,75 |
0,62 |
- |
0,51 |
0 |
0,1 |
|
|
0,95 |
|
|
|
|
|
Catenulin |
0,44 |
0,25 |
0,34 |
0,65 |
0,35 |
0 |
0 |
Neomycin |
0,60 |
0,12 |
0,19 |
_ |
|
0 |
0,05 |
Die angewandten Lösungsmittelsysteme und die Dauer der Chromatographie sind unten angegeben.
A = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2% p-Toluol-
sulfonsäure, für 40 Stunden
B = 80% wäf3ilges Äthanol, plus 1,5% Natriumchlorid, für 40 Stunden, auf Papier gepuffert, mit 0,95 SuI-
fat-Bisulfat
C = Propanol, Pyrldln, Essigsäure und Wasser
(15: 10:3: 12) für 40 Stunden
D = Wasser mit Methylisobutylketon gesättigt, plus 1%
p-Toluolsulfonsäure für 6 Stunden
E = Propanol und Wasser (1:1) für 24 Stunden auf
Papier gepuffert mit 0,75 m Phosphat, pH 4,0
F = n-Butanol mit Wasser gesättigt, für 18 Stunden
G = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2% p-Toluolsulfonsäure
und 2% Piperidin, für 18 Stunden.
Diese chromatographischen Daten zeigen folgendes: Während bei jedem einzelnen Lösungsmittelsystem
einige der Faktoren, die den Tenebrimycin-Komplex ausmachen, als untereinander identisch oder identisch mit
anderen bekannten Antibiotika erscheinen, beweist die Chromatographie mit einer Vielzahl von Lösungsmittelsystemen
deutlich Ihre Nicht-Identität.
Tenebrimycin II besitzt eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, die tierischem
oder pflanzlichem Leben gegenüber pathogen sind. Die Hemm-Konzentratlonen des Tenebrlmycins II gegen eine
Anzahl von Organismen werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Die Minimal-Hemm-Konzentratlonen wurden
ciurch das Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt.
Tabelle II
Test-Organismus |
minimale
Hemmkonzentration")
^g/ml.)
Tenebrimycin II |
Staphylococcus aureus 3055 |
6,25 |
Bacillus subtilis |
< 1,56 |
Mycobacterium avium |
< 1,56 |
Streptococcus faecalis |
3,12 |
Lactobacillus casei |
50 |
Leuconostoc citrovorum |
50 |
Escherichia coli No. 1 |
25 |
Escherichia coli No. 2 |
50 |
Proteus sp. No. 1 |
100 |
Proteus sp. No. 2 |
25 |
Pseudomonas sp. No. 2 |
25 |
Pseudomonas sp. No. 5 |
12,5 |
Klebsiella-Aerobacter No. 14 |
12,5 |
KJebsiella-Aerobacter No. 15 |
12,5 |
Salmonella sp. No. 1 |
25 |
Vibrio metschnikovii |
12,5 |
Agrobacterium tumefaciens |
25 |
bfwinia amylovora |
< 1,56 |
Pseudomonas solanacearum |
25 |
Xanthomonas phaseoli |
12,5 |
') Die minimale Hemmkonzemration wurde bestimmt mi! der freien
Base.
Die akuie Toxlzltät des Tenebrimycin II wurde an
Mäusen bestimmt.
Der LD5i)-Wert, ausgedrückt in mg/kg der freien Base,
für Tenebrimycin II, das Mäusen Intravenös verabreicht wurde, ist 385.
Der Tenebrimycin H enthaltende antlblotlsche Komplex wird hergestellt durch Züchtung eines bestimmten
Actinomyceten-Stammes unter aeroben Bedingungen In einem geeigneten Züchtungsmedium, so lange, his dieses
Medium wesentliche antibiotische Aktivität enthält. Das Tenebrimycin II kann gewonnen werden durch Anwendung
bestimmter Isollerungs- und Reinigungsmaßnahmen (vgl. Anspruch 2).
Wegen der Unsicherheit taxonomlscher Untersuchungen bezüglich der Galtung Sireptornyccs, bleibt immer
ein Element des Zweifeis an der Klassifizierung eines neuentdeckten Organismus haften. Dennoch - soweit es
bewiesen werden kann - gleicht der Organismus, der zur Herstellung des Antibiotikums verwendet wird, nicht
einer Streptomyces-Gattung, die von Waksman in »The Actinomycetes«, Vol. II, The Williams and Wllkens
Company (1961), beschrieben sind, um kultur-Vergleiche zu garantleren.
Der Organismus Ist ein spiralförmiger, hitzeertragender,
aerober bis mlkroaerophiler Streptomyces mit länglichen glattwandigen Sporen. Er ist Insofern einmalig, als
er durch verhältnismäßig niedrige Intensitäten künstlichen Lichts gehemmt wird. Wegen dieser seiner Eigenschaft
wurde der Name Slreptomyces tenebrarlus sp. n. für diesen Organismus gewählt.
Der Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem
Wasser suspendiert und die Suspensionen auf Nähr-Agar ausgestrichen wurden. Die Einsaat-Nähr-Agarplatten
wurden bei 25 bis 35 C inkubiert, bis Wachstum sichergestellt war. Am Ende der Inkubationszeit wurden Kolonien
der Antibiotikum produzierenden Organismen mit einer sterilen Impföse aus Platin auf Schrägagar übertragen.
Der Schrägagar wurde dann inkubiert, um geeignete Impfmengen für die Herstellung des Antibiotikums zu
erhalten. Der Stamm des Organismus, der für die Herstellung des antiblotischen Komplexes verwendet
wurde, ist bei der American Type Culture Collection in Washington, D.C. hinterlegt worden unter der Kultur-Nummer:
ATCC 17920.
Die bei den taxonomischen Versuchen über S. tenebrarius
ATCC 17920 angewandten Verfahren sind die gleichen, wie sie gewöhnlich bei der Taxonomie von Actinomyceten
gehandhabt werden. Züchtungsmerkmale wurden nach 14tägiger Inkubation beobachtet. Die Morphologie
wurde besiimmi auf Ctapek's-Peptonagar und
Bennetfs-Agar während einer 2- bis 7tägigen Inkubation. Wirkung auf Milch und die Reduzierung von Nitrat
wurde nach 7 und 14 Tagen beobachtet, Schwefelwasserstoffproduktion
nach 24 bis 48 Stunden und Kohlenstoff-Verwertung nach 10 Tagen. Wenn nicht anders angegeben,
wurden die Züchtungen bei 37° C inkubiert. Kohlenstoff-Verwertungsuntersuchungen
wurden durchgeführt gemäß dem Verfahren, das von Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, 107 (1948) beschrieben wurde.
Die Ergebnisse der taxonomischen Versuche sind In den folgenden Abschnitten zusammengefaßt. Die Zahlen
in Klammern beziehen sich auf die Farbblocks nach Maerz und Paul, »Dictionary of Color«, McGraw Book
Company (1950). Die Farben, welche durch die Farbblocks versinnbildlicht werden, sind in die ISCC-NBS
Farbnamen abertragen worden, wie sie im »Circular 553«, U.S. Department of Commerce, National Bureau of
Standards, 1955, enthalten sind.
Mikroskopische Morphologie, Züchtungscharakteristika und Physiologie von S. tenebrarlus ATCC 17920
Morphologie:
Auf Czapek's Peptonagar bilden sich verzweigte Sporenformen in unregelmäßigen Klümpchen auf dem
Luftmycel. Isolierte Sporen sind selten. Das intakte
ίο Luftmycel kann leicht vom Substrat gelöst werden. Reife
Sporenketten bilden gewöhnlich 5 bis 6 offene Spiralen. Die Sporen sind länglich bis zylindrisch. Unter dem
Elektronenmikroskop betrachtet erscheinen die Sporen glatt und messen 0,7 bis 1,3 zu 2,0 bis 2,1 Mikron. ScIerollen
wurden auf Bennett's-Medium beobachtet.
Kolonie Merkmale auf:
Czapek's-Agar:
Wachstumsmenge gering, Luftmycel dürftig; blaß orangegelb (11-A2); Sporulatlon gut; Rückseite blaß
orangegelb (11-A2); lösbares Pigment leicht rosa (1-Bl)
CzapekVPepton:
Wachstum reichlich; Luftmycel reichlich; hellgelblichbraun mit weißen Stellen (11-A4); Sporulatlon
reichlich; Rückseite hellgraurot (4-Hl); lösbares Pigment graurosa (4-Bl)
Calclummalat-Agar:
Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig; blaß orangegelb (11-A2); Sporulatlon mäßig; Rückseite graurosa
(4-Dl); lösliches Pigment graurosa (4-Bl).
Tyrosin-Agar:
Wachstum spärlich, Luftmycel spärlich; blaß orangegelb (9-B2); Rückseite blaß rotgelb (10-B3); spärliche
Sporulatlon; kein lösliches Pigment. Anorganlsche-Salze-Stärke-Agar:
Wachstum maßig, Luftmycei mäßig, bräuniichrosa
mit weißen Stellen (11-A4); Sporulatlon reichlich; Rückseite blaß gelb (1Ί-Β2); lösliches Pigment blaß
■to gelb (11-B2).
Glucose- Aspa>-agin-Agar:
Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig, blaß gelb (9-D2) mit weißen Stellen (10-Al); mäßige Sporuiation;
Rückseite blaß gelb (11-B2); kein lösliches Pig-5 ment.
Tomatenmark-Hafermehl:
Wachstum reichlich, Luftmycel reichlich, hellgelblichbraun
(12-B5); reichliche Sporulatlon; Rückseite dunkel graurötlichbraun (40-J2); lösliches Pigment
dunkelpurpurrot (47-H1).
Hefeextrakt:
Reichliches Wachstum, reichliches Luftmycel, blaß orange-gelb (11-A2) mit weißen Stellen; reichliche
Sporulatlon; Rückseite mäßig gelb (11-J6); kein lösliches
Pigment.
Nähragar:
Wachstum dürftig, dürftiges weißes (10-Al) Luftmycel; dürftige Sporulation; Rückseite graugrünlichgelb (12-12); kein lösliches Pigment.
Bennefs Agar:
Wachstum mäßig; mäßig weißes (10-Al bis 10-Bl)
Luftmycel; mäßige Sporulatlon; Rückseite blaß gelb (10-C2); kein lösliches Pigment.
Wirkung auf Milch:
Dunkelgelber Wachstumsring an der Oberfläche;
Koagullerung und Peptonisatlon beobachtet. Nitratreduktion:
Positiv.
37 C
Wachstum
reichlich
43' C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr
reichlich
50 C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr reichlich
55 C Spärliches Wachstum
60 C Kein Wachstum
Thermaler Totpunkt:
Sporen von einer Sporen-Suspension auf 75° C erhitzt bleiben 15 MIn. lang lebensfähig. Wurde die
Sporen-Suspension auf 100° C 15 Min. lang erhitzt, waren keine Sporen mehr lebensfähig.
Sauerstoff-Spannung:
Wachstum entweder aerob oder mlkroaerophll In Stickkulturen.
Elsenlonen-Effekt:
Ein rotes lösliches Pigment wird nur bei Vorhandensein
von EisendIDlonen produziert und die Intensität der Pigmentation Ist proportional zur Konzentration
der EisendIDlonen in einem gegebenen Bereich.
H;S-Produktion:
Negativ.
Nährgelatine - völlige Verflüssigung nach 14 Tagen. Temperatur-Erfordernisse für Czapek's Peptonagar:
20 C kein Wachstum
26 C gutes Wachstum, kein Luftmycel
30' C Wachstum und Luftmycel mäßig, aber keine Sporulation
Luftmycel und Sporulation sehr
20
25 Effekt der Wasserstoff-Ionenkonzentration auf Czapek's Peptonagar beobachtet:
Kein Wachstum unter pH 5,0; von pH 5,0 bis 6,0 Wachstum und Luftmycel gui; Wachstum und Sporulation
sind bei pH 7,0 reichlich; von pH 8,0 bis 8,6 sind Wachstum und Luftmycel gut. Das lösliche
Pigment Ist am intensivsten bei pH 5,0 bis 6,0 und ist gering bis nicht vorhanden von pH 6,5 bis 8,6.
Lichtreaktion, beobachtet aul Czapek's-Agar:
Wachstum und Sporulation sind im Dunkel reichlich. Wenn Platten-Züchtungen 48 cm entfernt von
einer 15-WaU-Standard-Fluorescenz-Kaltlichtquelle
inkubiert werden. Ist das Wachstum spärlich und kein Luftmycel vorhanden. Wachstum und Luftmycel
sind mäßig, wenn die Züchtungen 38 cm von einer gekühlten mattierten 60-Watt-Wolfram-Glühlampe
inkubiert werden.
In der Tabelle, welche die Ergebnisse der Kohlenstoff-Verwertungs-Versuche
zusammenfaßt, die mit S. tenebrarius ATCC 17920 durchgeführt wurden, haben die verwendeten Zeichen folgende Bedeutung:
+ = positiv
(+) — wahrscheinlich
(-) = fraglich
— = keine (nichts)
Tabelle III
Kohlenstoffverwertung von S. tenebrarius Stamm ATCC 17920
Kohlenstoffquelle
Ansprechen
Kohlenstoffquelle
Ansprechen
L(+) Arabinose -
L(+) Rhamnose —
D(-) Ribose +
D(+) Xylose -
D(—) Fructose +
D(+) Mannose +
D(+) Glucose +
Lactose (—)
Maltose +
Saccharose (+)
S. ienebrarlus ATCC 17920 erzeugt auch das bekannte
anlifungale Antibiotikum Caerulomycin, das auch erzeugt wird von Streptomyces caeruleus (Cand. J. Microbiol. 5, 317 [1959]). Untersuchung einer Züchtung des
letztgenannten Organismus ergäbe, daß er kein Tenebrimycin erzeugt unter den Bedingungen, die für seine
Züchtung beschrieben wurden; auch unter veränderten Bedingungen kann er nicht dazu Induziert werden.
Ein zweiter Stamm der neuen Art Streptomyces tenebrarius sp. n. wurde ebenfalls isoliert und charakterisiert.
Dieser Stamm von S. tenebrarius, der nur die Tenebrlmycine 1, T und 11 erzeugt, erhielt die ATCC Nummer
17921. Stamm ATCC 17921 unterscheidet sich vom Stamm ATCC 17920 prinzipiell dadurch, daß er kein
Luftmycel oder Sporen erzeugt, auf den meisten Medien
auch kein lösliches Pigment. Die Charakterisierungsdaten für diesen Stamm des Organismus sind in den folgenden Abschnitten zusammengefaßt. Die Verfahren, die
D(+) Trehalose +
L(+) Raffinose -
Cellulose -
inulin (■-)
i-inosit +
Mannit —
d-Sorbit (-)
Salicin (+)
Kontrolle (—)
(kein Kohlenstoff)
bei den iaxoncfn'schen Versuchen mit S. tenebrarius
ATCC 17921 angewendet wurden, sind die gleichen wie die vorstehend bei der Beschreibung der Charakterisierung
von S. tenebrarius ATCC 17920 erwähnten; die angewandten Zeichen haben die gleiche Bedeutung wie
oben.
Mikroskopische Morphologie, Kulturcharakteristika und
Physiologie von S. tenebrarius ATCC 17920
Morphologie:
Weder Luftmycel noch Sporen sind vorhanden; die Vegetations-Mycelfragmente in geringer Menge.
Kolonle-Charakteristika auf:
Czapek's-Agan
Vegetatives Wachstum gut, gelblichweiß (9-Bl); kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.
Czapek's-Pepton:
Vegetatives Wachstum reichlich, graugelb (12-B3); kein Luftmycel; leicht bräunliches lösliches Pigment.
Calclummalat-Agiir:
Vegetatives Wachstum mäßig, graugelb (12-B2);
kein Luftmycel; leicht graubraunes lösliches Pigment.
Tyrosin-Agar:
Vegetatives Wachstum mäßig, graugelb (11-B2); weder Luftmycel noch lösliches Pigment.
Anorganische-Salze-Stärke-Agar:
Vegatatlvmycel gut, hell gelbbraun (13-C6); kein Luftmycel; hellbraunes lösliches Pigment.
Glucose-Asparagln-Agar:
Vegetativwachsium mäßig, graugelb (11-D2); kein
Luftmycel oder lösliches Pigment.
Tomatenmark-Hafermehl:
Vegetatlvmycel mäßig, blaß gelb (10-B2); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.
Hefe-Extrakt:
Vegetatlvmycel mäßig, hellgelbbraun (12-E5); kein
Luftmycel oder lösliches Pigment.
Nähragar:
Vegetativwachstum mäßig, hellgelb (9-K4); kein
Luftmycel oder lösliches Pigment.
Bennett's-Agar:
Vegetativwachstum mäßig, graugelb (12-E4). kein
Luftmycel oder lösliches Pigment.
Wirkung auf Milch:
Rötlichgelber Wachstumsring an der Oberfläche.
Koagullerung und Peptonisation beobachtet.
Nitrat-Reduktion:
Positiv
H.S-Produktion:
Negativ
Nährgelatine:
Völlige Verflüssigung in 7 Tagen
Sauerstoff-Spannung:
Wachstum entweder aerob oder mikroaerophil in
Stickkulturen
Temperaturerfordernisse für Benett's-Medium:
Wachstum ist mäßig bei 26. 30, 43, 49 und 55 C und sehr reichlich bei 37; C. Kein Wachstum bei
60 C. Das Vegetatlvmycel ist blaß gelbbraun bei unter 37' C und leicht rötlichbraun bei und über
43 C. Weder Luftmycel noch lösliches Pigment wurde bei irgend einer Temperatur beobachtet.
Tabelle IV
Kohlenstoff-Verwertung durch S. tenebrarius Stamm ATCC 17921
Kohlenstoffquelle
Ansprechen
KohlenstolTquelle
Ansprechen
L(+) Arabinose
L(+) Rhamnose
D(-) Ribose
D(+) Xylose
D(—) Fructose
D(+) Mannose
D(+) Glucose
LacKose
Maltose
Zur Herstellung des Tenebrimycin II dienen zweckmäßigerweise
Züchtungsmedien, die relativ einfache Nährquellen enthalten. Zum Beispiel enthalten Medien, die
für die Produktion von Tenebrimycin brauchbar sind, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Glucose.
Fructose, Mannose. Maltose. Starke und dergleichen. Eine besonders be\ orzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose.
Außerdem enthalten die verwendbaren Medien eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Peptone, hydrolysiertes
Casein, Hefe, Aiminosäuren und dergleichen. Im vorliegenden Falle werden als Stickstoffquellen bevorzugt:
Pepton, hydrolisliertes Casein und Glutamin.
Mineralsalze, z. B. diejenigen, welche Calcium-, Magnesium-, Nairium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat-, Phosphat-
und Carbonat-Ionen liefern, können mit gutem Erfolg
den Medien einverleibt werden, wenngleich ein Überschuß an Phosphat vermieden werden sollte, da er
die Ausbeute an Antibiotikum herabzusetzen scheint. Eine Quelle von Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder
Hefeextrakt, kann ebenfalls mit guter Wirkung dem Me- *>5
dium zugefügt werden.
Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen nötig ist, sollten auch wichtige SpuSaccharose
(—)
Trehalosc (+)
Raffinose —
Cellulose —
i-Inosit +
Mannit (—)
d-Sorbit (-)
Salicin (—)
Kontrolle —
(ohne Kohlenstoff)
renelemente dem Züchtungsmedium zugesetzt werden zur Förderung des Wachstums der erfindungsgemäß
angewendeten Organismen. Solche Spurenelemente sind meistens als Verunreinigungen vorhanden, als zufällige
Begleitstoffe beim Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums.
Submerse aerobe Züchtungsbedingungen sind tür die Produktion von Tenebrimycin speziell bevorzugt. Für die
Herstellung relativ kleiner Mengen können Schüuelkolben und Oberflächenkulturen verwendet werden. Für
die Herstellung großer Mengen jedoch ist die submerse aerobe Züchtung in sterilen Behältern vorzuziehen. Das
Medium im sterilen Behälter kann mit einer sporulierten Suspension beimpft werden, aber wegen der Wachstumsverzögerung, die man bei Verwendung einer sporulierten
Suspension als Inoculum festgestellt hat, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. So vermeidet man die
Wachstumsverzögerung und erreicht eine wirkungsvollere Ausnutzung der Fermentationsvorrichtungen.
Dementsprechend Ist es ratsam, zuerst ein vegetatives Inoculum des Organismus durch Beimpfung einer verhältnismäßig
geringen Menge des Züchtungsmediums mit der Sporenform des Organismus herzustellen, und
dann, wenn ein junges aktives Vegetativ-Inoculum erhalten
wurde, dieses vegetative Inoculum steril in den großen Behälter zu überführen. Zweckmäßig wird ein
Bruchteil des vegetativen Inoculums, etwa 4% der Masse
des Mediums, in das es eingeführt wird, verwendet. Das Fermentationsmedium, in dem das vegetative Inoculum
hergestellt wird, kann entweder gleich oder verschieden von dem Medium sein, welches für die großtechnische
Produktion von Tenebrimycin verwendet wurde.
Der Organismus wächst Innerhalb eines relativ weiten Temperaturbereichs. Dennoch scheinen die Organismen
am besten bei Temperaturen zwischen 30 und 50° C zu wachsen. Eine optimale Produktion von Tenebrimycin
erfolgt bei Temperaturen zwischen 37 und 43D C. Die
Organismen, die Tenebrimycin erzeugen, sind lichtempfindlich und wachsen bei dessen Vorhandensein nur
schlecht.
Somit sind Fermentationen, bei welchen die Organismen verwendet werden, möglichst ohne sichtbares Licht
auszuführen. Übereinstimmend mit der bei submersen Züchtungsvorgängen gebräuchlichen Praxis wird sterile
Luft über das Züchtungsmedium geleitet. Zu einem wirkungsvollen Wachstum der Organismen und Tenebrlmyclnherstellung
beträgt das Luftvolumen bei der Tank-Produktion von Tenebrimycin über 0,1 Volumen Luft
pro Minute pro Volumen des Züchtungsmediums, liegt aber vorzugsweise wesentlich höher. Wirkungsvolles
Wachstum der Organismen und optimale Ausbeuten an Tenebrimycin erhält man, wenn die verwendete Luftmenge
wenigstens ein Volumen Luft pro Minute pro Volumen Züchtungsmedium beträgt.
Die Konzentration von Tenebrimycln-Aktlvität im Fermentationsmedium kann bequem verfolgt werden
während des Ablaufs der Fermentation, indem man Proben des Züchtungsmediums auf ihre hemmende Aktivität
gegenüber dem Wachstum von Organismen hin prüft, die dafür bekannt sind, daß sie In Gegenwart von Tenebrimycin
gehemmt werden. Zwe! der Organismen, die so bei der Verfolgung der Produktion von Tenebrimycin
angewandt wurden, sind Klebsieila pneumoniae und Mycobacterium butyricum.
Der erstere Organismus wird hauptsächlich bei der wohlbekannter. Trübungsmessung verwandt, während
der letztere beim Schalen-Platten-Verfahren verwertet wird.
Im allgemeinen tritt Maximaiproduktion des Antibiotikums innerhalb von 4 bis 7 Tagen nach der Beimpfung
des Züchtungsmediums ein, wenn submerse aerobe Züchtung oder Schüttelkolben-Züchtung angewandt
wird, und nach einer etwas längeren Zeit, wenn Oberflächenkulturen
benutzt werden
Das Mycel und unaufgelöste Rückstände werden von der Fermentationsflüssigkeit durch herkömmliche Mittel,
wie Filtration oder Zentrifugierung, entfernt. Die antlbiotische Aktivität ist in der gefilterten Flüssigkeit
enthalten und kann daraus gewonnen werden durch Anwendung von Adsorptionsverfahren. Die Adsorptionsmittel
sind die Kationen-Austauscherharze vom Typ »IRC-50« (schwach saures Polymethacrylatcarbonsäure-Harz).
Im allgemeinen ist das Verfahren zur Gewinnung des Tenebrimycins aus der Fermentationsflüssigkeit folgendes:
Die gesamte Flüssigkeit wird filtriert mit einem Filterhilfsmittel,
nachdem der pH-Wert der Mischung auf etwa pH 2 gesenkt wurde durch Zusatz einer Säure, wie
Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoff und dergleichen. Der pH-Wert des Flltrats wird auf einen Wert
von etwa 5,5 eingestellt durch Zusatz einer konzentrierten Base, und dann wird die Mischung noch einmal filtriert.
Das Flltrat wird durch eine Ionenaustauschersäule geführt, die mit IRC-50 im Ammonium-Kreislauf
gepackt ist. Die Säule wird dann mit destilliertem Wasser
gewaschen und die antlbiotische Aktivität mit verdünnter Säure eluierl. Die Fraktionen, welche die antiblotlsche
Aktivität enthalten, werden vereinigt und auf ungefähr 1/20 des ursprünglichen Volumens konzentriert. Der pH-Wert
des Konzentrats wird erhöht auf etwa 11 durch Zusatz von konzentrierter Base, und das basische Konzentrat
wird dann in etwa 6 Volumen Aceton gegossen, gut gemischt und gekühlt. Der mikrobiologisch inaktive
Niederschlag, der sich abtrennt, wird durch Filtration entfernt. Der pH-Wert des Filtrats wird auf etwa 3,5
gesenkt durch Zusatz von 20%iger Schwefelsäure unter gründlichem Mischen. Der Tenebrimycin-Komplex fällt
aus in Form des Sulfatsalzes, während das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation in der überstehenden
Schicht zurückbleibt, die verworfen wird.
Tenebrimycin Il wird gewonnen durch weitere Fraktionierung
des Tenebrimycin-Komplexes. Für die Fraktionierung wird das Tenebrimycin als ein Säure-Addltionssalz
verwendet, vorzugsweise In der Form des Sulfates. Gefärbte Verunreinigungen können entfernt werden,
indem man die Lösung mit etwa 5% (Gewicht/Volumen) Aktivkohle verrührt. Wirksame Entfärbung erhält man
gewöhnlich, indem man die Mischung, welche die Kohle enthält, ungefähr eine Stunge lang rührt. Dann wird die
Mischung filtriert, und mit dem Flltrat, welches das Tenebrlmycinsulfat enthält, wird eine Säule, gepackt mit
IRC-50 im Ammonium-Kreislauf, beladen. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und die einzelnen Antibiotika,
die den Tenebrimycin-Komplex bilden, werden nach und nach mit 0,1 η Ammoniumhydroxid eluier'.
Allgemein geht die Elution äußerst langsam vor sich, und eine sehr große Anzahl von Fraktionen ist gewöhnlich
nötig, um die Fraktionierung des Komplexes zu bewerkstelligen. So erfordert z. B. die vollständige Fraktionierung
von etwa 250 g Tenebrimycin-Komplex etwa 700 Fraktionen, von denen jede etwa 900 ml des Eluats
ausmacht. Die ersten aktiven Fraktionen, die man erhält, enthalten die Tenebrimycin I, Γ und II. Darauf folgt eine
Reihe aktiver Fraktionen, in denen Tenebrimycin II das einzige Antibiotikum ist.
Beispiel 1
Herstellung des Tenebrimycin-Komplexes durch Fermentation von S. tenebrarius ATCC 17920
Eine sporulierte Kultur von S. tenebrarius ATCC 17920 wird erzeugt, indem man den Organismus auf
einem modifizierten Bennett^s-Schräg-Agar-Medium wachsen läßt, das die folgende Zusammensetzung hat:
55
|
Dextrin |
1 |
g |
|
Hefe-Extrakt |
2 |
g |
|
hydrolysiertes Casein |
1 |
g |
|
Fleischextrakt |
0,01 |
g |
60
|
CoCl2 · 6H2O |
20 |
g |
|
ausgewaschener Agar |
1000 |
g |
|
deionisiertes Wasser auf |
ml
|
|
Der pH-Wert des Mediums wird vor dem Autoklavieren auf pH 7 eingestellt. Der Schrägagar wird beimpft mit
Sporen von S. tenebrarius ATCC 17920 und fünf Tage lang bei 37° C und ohne sichtbares Licht inkubiert. Das
Wachstum auf dem Schrägagar wird mit Wasser bedeckt
und vorsichtig abgeschabt, um die Sporen zu entfernen und eine wäßrige Sporensuspsnsion zu erhalten.
Die so erzleite Sporeniuspension wird zur Beimpfung
von 800 ml eines Mediums verwendet, das folgende Zusammensetzung hat:
Dextrose 0,05 %
Nährmehl (enthält 35-45% dispergier- 1,5 %
bares Protein)
Dextrin 700 1
(Kartoffeldextrin mit
niedrigem Chlorgehalt)
Kaliumchlorid 0,1 %
hydrolysiertes Casein 0,3 %
KH2PO4 0,05 %
MgSO4 · 7H2O 0,5 %
CaCl2 · 2H2O 0,025%
deionisiertes Wasser
Das beimpfte vegetative Medium wird bei 37° C Stunden lang auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
inkubiert, die mit 250 U.p.M. arbeitet und einen
Hub von 63,5 mm hat.
Ein 50-ml-Anteil der vegetativen Züchtung wird verwendet,
um einen 44-l-Einsatzbehälter z-u beimpfen, der
ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung enthält:
10
15
20
Dextrose
Sojabohnenkörner
KH2PO4
MgSO4
KCl
CaCl2 · 2H2O
Antischaummittel
Dextrose
raffiniertes Sojabohnenöl
Sojamehl
NH4Cl
CaCl2
MgSO4
NH4NO3
hydrolysiertes Casein
Antischaummittel
deionisiertes Wasser
4,0% 3,0% 3,0% 0,5% 0,3% 0,2% 0,1% 0,5% 0,2%
25
30
1 % 1,5 % 0,05 %
0,5 %
0,1 % 0,025% 0,025%
40
Das Medium des Einsaatbehälters wird bei 120D C etwa
Min. lang sterilisiert. Das Rühren mit einer Geschwindigkeit von 370 U.p.M. beginnt man unmittelbar nach
der Beimpfung, und eine Belüftung mit einem Durchsatz von 0,0226 m' pro Min. wird während der ganzen Inkubationszeit
aufrechterhalten. Nach Beendigung der Inkubationsperiode wird der Inhalt des Einsaatbehälters dazu
verwendet, einen 1130-Liter-Fermenter zu beimpfen, der
ein Medium folgender Zusammensetzung enthält:
50
55
Vor der Bclnipfung wird das Fermentationsmedium Min. lang bei 120° C sterilisiert. Die Fermentation
wird durchgeführt bei 37^ C unter Belüftung mit einem
Durchsatz von 0,48 m1 pro Min. während der gesamten
Zelt von der Beimpfung an bis zur Ernte. Das Rühren wird mit 125 U.p.M. begonnen und bis zu 180 U.p.M.
nach 12 Stunden gesteigert. Die Fermentation wird
5 Tage lang fortgesetzt. Die fermentierte Züchtungsflüssigkeit
wird abfiltriert, um das Mycel und andere unaufgelöste Feststoffe zu entfernen. Die filtrierte Flüssigkeit
enthält Tenebrimycin in einer Konzentration von 680 Einheiten pro ml.
Beispiel 2
Herstellung von Tenebrimycin I, Γ und II
durch Fermentation von S. tenebrarius ATCC 17921
Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird S. tenebrarius ATCC 17921 als Antibiotikum-erzeugender
Organismus benutzt. Die abfiltrierte Fermentationsflüssigkeit, die man gewinnt, enthält vorwiegend Tenebrimycin
H nut geringeren Anteilen der Tenebrimycine I
und Γ.
Beispiel 3
Isolierung des Tenebrimycin-Komplexes
Der pH-Wert '/on 880 Litern antlblotlscher Fermentationsflüssigkeit,
wie In Beispiel 1 beschrieben, gewonnen, wird auf etwa pri 2 gesenkt durch Zusatz von ungefähr
10 bis 20 Litern 20%iger wäßriger Schwefelsäure.
Nachdem 45 kg eines handelsüblichen Flltrlerhllfsmittels
der angesäuerten Flüssigkeit zugesetzt wurden, wird gründlich durchgemischt und filtriert. Der Filterkuchen
wird mit Wasser gewaschen und die Waschlösung dem
Flltrat zugesetzt.
Der pH-Wert des Filtrats wird auf pH 5,5 eingestellt
durch Zusatz von 509blgem wäßrigen Natriumhydroxid. Etwa 4 kg eines handelsüblichen Flltrierhllfsmlttels wird
zugesetzt und die Mischung gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird durch eine lRC-50-Säule mit den
Abmessungen von 10,2 cm zu 1,83 m geschickt. Die Säule wird mit dem Harz im Ammonium-Kreislauf bis
zu einer Betthöhe von 112 bis 114 mm gepackt. Nachdem
das gesamte Flltrat die Säule durchlaufen hat, wird diese mit etwa 200 Litern destillierten Wassers gewaschen.
Die antlblotlsche Aktivität wird dann während eines Zeltraumes von 12 bis 15 Stunden mit etwa 150 bis
175 Litern 0,1 η Schwefelsäure eluiert und das Eluat in
10-Llter-Fraktlonen abgenommen. Antiblotische Aktivität
ist Im Eluat erkennbar, wenn dessen pH-Wert auf etwa pH 4 oder wenig darunter absinkt.
Während die Elutlon fortschreitet, fällt der pH-Wert des Eluats welter, bis er einen Wert von etwa pH 1,5
erreicht. Die Fraktionen, welche antlbiotlsche Aktivität enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem
Druck auf etwa 1/20 des Originalvolumens konzentriert.
Der pH-Wert des konzentrierten Eluats wird auf pH 11
eingestellt durch Zusatz von 50%lgem wäßrigen Natriumhydroxid, und das basische Konzentrat wird dann zu
6 Volumeneinheiten Aceton hinzugefügt. Die Mischung wird gekühlt und abgestellt, damit sich der Niederschlag
ohne antlblotlsche Aktivität abtrennt. Die Mischung wird filtriert und der Filterkuchen, der Inaktiven Niederschlag
enthält, wird mit Wasser gewaschen und verworfen. Der pH-Wert des Filtrats wird auf pH 3,5 unter
gründlicher Vermischung des Zusatzes von 20%lger wäßriger Schwefelsäure eingestellt. Der Tenebrimycln-Komplex
scheidet sich als Sulfat während der Behandlung aus und wird praktisch völlig abgeschieden, wenn der pH-Wert
de- Lösung 4 oder einen geringfügig darunter liegenden Wert erreicht. Die Mischung wird filtriert und
das Filtrat, das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation enthält, wird verworfen. Der Filterkuchen, der
das Tenebrimycinsulfat enthalt, wird in einer möglichst geringen Menge Wasser gelöst und gekühlt. Alle Festbestandteile,
die sich nicht leicht auflösen, werden verworfen, wie z. B. sämtliche Feststoffe, die während des
Abkühlens ausfallen oder auskristallisieren. Die klare Lösung des Tenebrimycinsulfats wird über ein Dowex
1 χ I-Harz-Bett von 10,2 cm zu 2,13 mm im basischen Kreislauf geführt. Die antibiotische Lösung wird auf die
Säule gegeben und nachfolgend 40 bis 50 Liter destillierten Wassers. Der Abfluß wird in 10-Liter-Fraktionen
abgenommen, die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben und unter Vakuum zu einem dicken Syrup
konzentriert, der getrocknet wird und den trockenen Tenebrimycin-Komplex ergibt.
Beispiel 4
Abtrennung der Tenebrimycln-Faktoren
Tenebrimycinsulfat wird erhalten durch Einstellen des pH-Wertes einer 20%lgen wäßrigen Lösung, die 258 g des
Tenebrimycinkomplexes in freier Basenform enthält, auf 4,5, indem man konzentrierte Schwefelsäure hinzusetzt.
Die Lösung des so hergestellten Tenebrimycinsulfats wird durch etwa einstündiges Rühren mit 5%lger
(Gew./Volumen) Aktivkohle entfärbt. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat durch eine Säule von 9 χ 105 cm
geschickt, die mit etwa 7 Liter lRC-50-Harz im Ammonium-Kreislauf
gepackt worden ist. Nachdem das Flltrat, das das antibiotische Salz enthält, die Säule durchlaufen
hat, wird diese mit etwa 17 Litern deionisiertem Wasser ausgewaschen. Die Elution der auf der Säule zurückgehaltenen
antibiotischen Aktivität beginnt mittels 0,1 η Ammoniumhydroxidlösung bei einer Fließgeschwindigkeit
von etwa 20 ml pro Min. Das Eluat wird in Fraktionen
von etwa 900 ml aufgefangen, und jede Fraktion wird hinsichtlich ihrer mikrobiologischen Aktivität
geprüft. Die den gleichen antibiotischen Faktor enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert,
um die einzelnen getrockneten Tenebrlmycine zu erhalten. Dabei erscheint das Tenebrimycin Il wie folgt:
Fraktionen |
vorliegendes Antibiotikum |
1-34 |
inaktiv |
35-53 |
Tenebrimycin I, Γ und Il |
54-77 |
Tenebrimycin II |
|
Beispiel 5 |
Herstellung des Hellanthats des Tenebrimycin Il
Selbstverständlich kann man auch das Tenebrimycln-II-Helianthat
herstellen:
Eine Lösung von 2 g von Tenebrimycin 11 in 22 ml Wasser wird hergestellt und durch Zusatz von 50%
Schwefelsäure auf pH 5 eingestellt. Eine heiße 10%ige
wäßrige Lösung von Methylorange wird dann der antibiotischen Lösung zugesetzt. Das Hellanthat von Tenebrimycin
II trennt sich als Niederschlag ab und wird durch Filtration entfernt. Das feste Salz wird gründlich
mit heißem Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und ergibt 3,5 g Tenebrimycin-11-Hellanthat.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen