DE2402956A1 - Antibioticum a-287 und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Antibioticum a-287 und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft das neue antibiotische Gemisch A-287, das aus mikrobiologisch wirksamen, strukturell verwandten
Faktoren A und B besteht und hergestellt wird, indem man Actinoplanes utahensis NRRL 5614 submers unter aeroben
Bedingungen züchtet, worauf man das A-287-Gemisch durch
Extraktion der Kulturbrühe isoliert. Die einzelnen Faktoren werden chromatographisch und durch Gegenstromverteilung
getrennt und isoliert. Das Gemisch A-287 und die Einzelfaktoren wirken antibakteriell, antifungal,
parasiticid und wachstumsfördernd.
Das erfindungsgemäße antibiotische Gemisch, welches willkürlich
als Antibioticum A-287 bezeichnet wurde, besteht aus zwei Peptidantibiotica. Die zwei Einzelantibiotica,
die getrennt und charakterisiert wurden, werden als Antibioticum A-287 Faktoren A und B bezeichnet.
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Das Antibioticum A-2 87 wird hergestellt,, indem man einen
neuen Stamm Actinoplanes utahensis NRRL 5614 submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis ein
entsprechend hoher Spiegel an antibiotischer Wirksamkeit gebildet wurde. Die Antibiotica A-287 werden aus der Fermentationsbrühe
mit einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Das Lösungsmittel wird eingeengt, wodurch
man ein Öl des antibiotischen Gemisches erhält, und dieses Öl extrahiert man mit einem wässrigen Puffer, der
einen pH-Wert von etwa 7 hat. Das antibiotische Gemisch wird abschließend hieraus mit einem polaren organischen
Lösungsmittel extrahiert. Der organische Extrakt wird zum Antibioticum A-287 eingedampft, das man säulenchrommatographisch
weiter reinigt. Die einzelnen Faktoren von A-287 werden in bekannter Weise voneinander getrennt und
als Einzelantibiotica isoliert, und zwar beispielsweise durch Gegenstromverteilung oder Dünnschichtchromatographie.
Die Antibiotica A-287 hemmen das Wachsen von Organismen, die als Krankheitserreger für Tier und Pflanze gelten, und
sie stellen besonders interessante Antibiotica dar, da sie gegen grampositive Organismen wirken, wie Staphylococcus
aureus und Streptococcus pyogenes. Das Antibioticum A-287 und seine Einzelfaktoren wirken darüberhinaus noch gegen
Parasiten und sind wachsturnsfördernd.
Die erfindungsgemäßen antibiotisch wirksamen Faktoren von A-287 sind strukturell zueinander verwandt und weisen
chemische, physikalische sowie Spektraleigenschaften auf, die denjenigen der Peptide ähneln. Diese antibiotischen
Faktoren werden während der Fermentation gemeinsam gebildet, und man erhält sie in Form eines Gemisches. Die
Faktoren lassen sich wie später beschrieben voneinander trennen und als Einzelverbindung isolieren. Das Gemisch
der A-287-Faktoren ist ein weißes Pulver, welches sich in
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Wasser und niederen Alkohlen löst, jedoch praktisch unlöslich ist in vielen organischen Lösungsmitteln.
Die physikalischen sowie Spektraleigenschaften der zwei A-287-Faktoren, die soweit charakterisiert wurden, werden
im folgenden beschrieben.
Das Antibioticum A-287 Faktor A ist eine weiße amorphe
Verbindung, die bei Temperaturen unter etwa 220 C nicht schmilzt. Eine Elementaranalyse des Faktors A ergibt
folgende prozentuale Zusammensetzung: Kohlenstoff 44,98 %, Wasserstoff 6,15 %, Stickstoff 10,28 %, Sauerstoff 26,37 %
und Asche 4,15 %.
Der Faktor A hat ein scheinbares Molekulargewicht im Bereich von 1500 (1475,73), und zwar bestimmt in Methanol
durch Osmose unter Verwendung einer Apparatur zur Molekulargewichtsbestimmung von Hitachi-Perkin-Elmer, Modell
115.
Das Infrarotspektrum des Faktors A in Mineraölmull geht aus Figur 1 der anliegenden Zeichnung hervor. Es lassen
sich folgende Absorptionsmaxiiua (Mineralölbande bei 3,42
und 3,50 Mikron) feststellen: 3,05 (mittel), 6,05 (mittelstark),
6,59 (mittel), 6,84 (mittel) und 7,27 (mittel) Mikron.
Der Faktor A absorbiert im ültraviolettbereich des
Spektrums und weist Absorptionsmaxima in Wasser bei
λ» max. 220 m,u (£9500; Schulter) und 273 m,u ( £, 2700);
auf. Es gibt keine Verschiebung in einer Base oder einer Säure.
Das Antibioticum A-287 Faktor B ist eine weiße amorphe
Verbindung, die keinen ausgeprägten Schmelzpunkt hat, jedoch bei etwa 200 0C verkohlt. Eine Elernentaranalyse
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_ 4 —
des Faktors B ergibt folgende Prozentualzusammensetzung: Kohlenstoff 49,96 %, Wasserstoff 6,98 %, Stickstoff 9,90 %,
Sauerstoff 23,86 % und Asche 4,66 %.
Der Faktor B hat ein scheinbares Molekulargewicht im Bereich von etwa 2800 (2781,28), und zwar bestimmt in
Methanol durch Osmose mit der Molekulargewichtsapparatur von Hitachi-Perkin-Elmer, Modell 115.
Das Infrarotspektrum von Faktor B in Mineralölmull geht aus Figur 2 der anliegenden Zeichnung hervor.
Es lassen sich folgende Absorptionsraaxima (Mineralölbande
bei 3,45 und 3,52 .Mikron) feststellen: 3,06 (mittel), 6,09 (stark), 6,60 (mittel), 6,89 (mittel) und 7,30 (mittel)
Mikron.
Der Faktor B absorbiert im Ultraviolettbereich des Spektrums und weist Absorptionsmaxima in Wasser bei Λ» max.
220 m ,u (£"9200; Schulter) und 273 m,u (6 3200) auf. Es
gibt keine Verschiebung in Säure oder Base.
Eine elektrometrische Titration der Faktoren A-2 87
zeigt einen konstanten Verbrauch von Base, was auf cyclische Peptide hinweist.
Die Faktoren A-287 und ihre Gemische sind praktisch löslich in Wasser und in niederen Alkoholen, wie Butanol
und Methanol. Sie sind unlöslich in vielen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Diäthyläther.
Die Faktoren A und B des Antibioticums A-287 haben in den unten angegebenen papierchromatographischen Systemen
folgende Rf-Werte, und zwar unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341
oder Staphylococcus aureus ATCC 6538 als Detektionsorganismen: 409830/1049
Rf-Wert
0,17 0,88 Mit Wasser gesättigtes Butanol
0,70 0,88 . Mit Wasser gesättigtes Butanol
plus 2 % p-Toluolsulfonsäure
(p-TSA)
0,39 0,90 Mit Wasser gesättigtes Butanol
plus 2 % p-TSA und 2 % Piperidin
0,72 0,86 80 % Äthanol mit 1,5 % NaCl.
Das Papier ist mit einer Lösung aus 0,95 m Na-SO. und
0,05 m NaHSO4.H2O imprägniert
0,68 0,89 · Methanol : 0,1 η HCl (3:1)
Die Aminosaureanalysen der Faktoren A und B des Antibioticums
A-287 sind sehr ähnlich, wobei jeder etwa die im folgenden ge-, zeigten Verhältnisse ergibt:
Serin 1
Glutaminsäure 1
Glycin . ' 2
Alanin 1
Valin 2
Cystein 1
Isoleucin 1
Leucin . 2
Tryptophan 1
Unbekannt 2
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"~ D —
Das Antibiotica A-287 und seine Einzelfaktoren hemmen das
Wachsen pathogener Mikroorganismen von Tieren und Pflanzen. Das Antibioticum A-2 87 und seine Einzelfaktoren wirken darüberhinaus
parasiticid und wachstumsfördernd.
Das antibiotische Gemisch und die Einzelfaktoren sind besonders
wirksam gegen pathogene grampositive Bakterien, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo, und sie lassen
sich daher zur Behandlung und Steuerung von Krankheiten einsetzen, die durch diese Mikroorganismen verursacht werden.
In der folgenden Tabelle I sind die Minimalinhibierungskonzentrationen
(MIC) der Faktoren A und B von A-2 87 für mehrere typische Organismen zusammengestellt, und zwar bestimmt
nach dem Standard-Agar-Verdünnungstest.
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Styphylococcus aureus Staphylococcus albus Bacillus subtilis
Mycobacterium avium Proteus vulgaris Shigella paradysenteriae
Bruce11a bronchiseptica Vibrio metschnikovii Erwinia amylovora
Agrobacterium turaefaciens Xanthomonas malvacearum
Xanthomonas phaseoli Pseudomonas solanacearum
Pseudomonas syringae Corynebacterium insidiosum Alternaria oleracea
Ceratostome11a fimbriata Glomerella singulata
Pullularia sp. VerticiIlium albo-atrum
Mic (
Faktor A Faktor B
| 6,25 | 12,5 |
| 6,25 | 6,25 |
| 12,5 | 3,13 |
| 100,0 | 12,5 |
| 50,0 | 50,0 |
| 100,0 | 25,0 |
| 100,0 | 12,5 |
| 50,0 | 25,0 |
| 100,0 | 100,0 |
| 100,0 | 100,0 |
| 50,0 | • 50,0 |
| 25,0 | 25,0 |
| 50,0 | 6,25 |
| 100,0 | 100,0 |
| 100,0 | 100,0 |
| 25,0 | 12,5 |
| 50,0 | 50,0 |
| 100,0 | 100,0 |
| 25,0 | 12,5 |
| 100,0 | 100,0 |
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Der Faktor B des Antibioticums A-2 87 ist in dem antibiotischen
Gemisch A-2 87 in geringerer Menge vorhanden. Wie aus Tabelle I hervorgeht, sind die in vitro Aktivitätsmuster der Faktoren A
und B von A-287 ziemlich ähnlich. Die beiden Faktoren müssen daher nicht getrennt werden, wann man sie zur Behandlung und
Steuerung von durch Organismen hervorgerufenen Krankheiten oder als wachstumsfordernde Mittel verwendet. Bei den folgenden
Untersuchungen bezieht sich die Angabe Antibioticum A-287 auf das antibiotischa Gemisch A-2 87, das aus etwa 95 bis 98 %
Faktor A und etwa 2 bis 5 % Faktor B besteht.
Die akute Toxizität des Antibioticuras A-287 beträgt 1370 mg/kg,
und zwar bestimmt durch intraperitoneale Verabreichung an
Mäuse und ausgedrückt als LD50* Bei einer oralen Verabreichung
des Antibioticuras A-2 87 an Mäuse in einer Dosis von 1250 mg/kg werden keine Tiere getötet.
Die in vivo antimikrobiell Wirkung wird ermittelt, indem man
Antibioticum Ä-2 87 entweder parenteral oder oral an Mäuse verabfolgt. Die ED5 -Werte (effektive Dosis, bei der 50 %
der Versuchstiere geschützt werden, wenn rr.an 2 Dosen verwendet)
für typische Infektionen sind wie folgt:
Staphylococcus aureus 50 mg/kg
Streptococcus pyogenes 1 mg/kg 400 rng/kg
Diplococcus pneumoniae 25 mg/kg
Eine weitere nützliche Eigenschaft des Antibioticum A-287 ist seine Fähigkeit, das Wachsen von Tieren zu fördern. Setzt
man A-2 87 dem Futter wachsender Hühnchen in einer klenge von 45,4 g pro Tonne zu, dann beträgt die mittlere Gewichtszunahme
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nach 10 Tagen 159,9 g. Für eine Vergleichsgruppe liegt die mittlere Gewichtszunahme demgegenüber bai nur 146,1 g.
Der Futterumwandlungswert (Futter/Gewichtszunahme) "für mit Antibioticum A-287 gefütterte Hühnchen beträgt 1,43. Der
Futterumwandlungswert für die Vergleichsgruppe liegt demgegenüber bei 1,52.
Die Fähigkeit von Antibioticum A-287 Gewichtszunahmen zu
stimulieren machen dieses Antibioticum besonders geeignet zur Verbesserung der Viehproduktion. Bei Verwendung als
wachstuxnsförderndes Mittel mischt man das Antibioticum am
besten in geeigneter Konzentration in die normale Futterration der Tiere ein. Antibioticum A-287 ist besonder wirksam
als wachsuiasforderndes Mittel, wenn man es Tieren in
Mengen zwischen etwa 10 und etwa 1000 g pro Tonne Futter verabreicht.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die parasiticide Wirkung des Antibioticum A-287. A-287 ist besonders
wirksam zur Behandlung von Rückfallfieber, das durch
die Spirochäte Borrelia novyi hervorgerufen wird. Nach einem von M. C. McCowen, M. E. Callender, J. F. Lawlis Jr. und
M. C. Brandt in Amer. J. Trop. Hed. Kyg. 2, 212-218 (1953)
beschriebenen Untersuchungsverfahren v/erden Mäuse mit der Rückfallfieberspirochäte geimpft und nach 6 Stunden mit der
Testverbindung behandelt. Nach 24 sowie 48 Stunden werden Blutproben entnommen und auf das Vorhandensein der Spirochäte
untersucht. Eine wirksame Steuerung von Borrelia erhält man durch intraperitoneale Verabfolgung von 10 mg/kg
Antibioticum A-287.
Zum Schutz gegen Parasiten, wie Borrelia, eignet sich Antibioticum
A-237 besonders nach parenteraler Verabreichung an Tiere in einer Dosis zwischen etwa 10 und etwa 500 mg/kg.
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Den vorstehend genannten Eigenschaften kann entnommen werden, daß sich Antibioticum A-237 zur Unterdrückung des Wachstums
pathogener Organismen verwenden läßt. Neben den oben beschriebenen Δην/endungs ar ten läßt sich A-2 87 auch als Oberf lächende
sin fektionsnit te 1 verwenden. Lösungen mit nur 2 % des Antibioticuns
stellen wirksane Desinfektionsmittel dar. Derartige Lösungen, die vorzugsweise ferner ein Detergens oder ein
sonstiges Reinigungsmittel enthalten, eignen sich zum Desinfizieren
von Gegenständen, wie Glas, Zahninstruinenten oder chirurgischen Instrumenten, und Oberflächen, wie Wänden, Gängen
und Tischen, in Bereichen, in denen sterile Bedingungen wichtig sind, beispielsweise in Krankenhäusern, oder in
Räumen, in. denen Nahrungsmittel hergestellt werden.
Die neuen erfindungsgemäßen Antibiotica werden hergestellt, indem man einen A-2 37 produzierenden Stamm eines Actinoplanes
Organismus submers unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium solange züchtet, bis das Kulturmedium eine
wesentliche Menge antibiotischer Aktivität enthält. Die Antibiotica werden in üblicher und dem Fachmann geläufiger Weise
anhand verschiedener Isolier- und Reinigungsverfahren gewonnen.
Der zur Herstellung des Antibioticums A-2 37 geeignete Mikroorganismus
ist eine Species der Art Actinoplanes aus der Familie der Actinoplanaceae. Die Mikroorganismen aus der
Familie der Actinoplanaceae gehören der Ordnung Actinomycetales an, und sie wurden zuerst von Couch /J. Elisha Michell
Sei. Soc, 65, 315-318 (1949); 66, 87-92 (1950); Trans. New
York Acad. Sei., 16, 315-318 (1954); J. Elisha Mitchell Sei.
Soc, 71, 148-155 und 269 (1955); "Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology," 7. Auflage, 825-829 (1957); J. Elisha Mitchell Sei. Soc, 79, 53-70 (1963]_/ beschrieben.
Eine Probe der zur Herstellung des Anitbioticums A-2 87 geeigneten Kultur von Actinoplanes wurde ohne Beschränkung
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ihrer Verfügbarkeit in der Kultursammlung der Northern
Utilization Research and Development Division, U.S. Dept.
of Agriculture, Peoria, Illinois 61SO4 hinterlegt, wo sie
öffentlich unter der Nummer NRRL 5614 zu beziehen ist.
Die A-287-produzierende Kultur wurde taxonomisch von Dr. Paul J. Szanisslo als neuer Stara.i von Actinoplanes
utahensis Couch klassifiziert. Die für diese taxonomisehen
Studien verwendeten Verfahren ähneln denjenigen, die vom International Streptomaces Project empfohlen werden, und
zwar zusammen mit anderen ergänzenden Untersuchungen, die in der Taxonoiriie üblich sind /Ώ. B. Shirling und D. Gottlieb:
"Methods for Characterization of Streptomyces Species". International
Bull. Systemic Bacteriol., 16, 313-340 (1966J/.
Morphologie Vegetatives Mycelium
Die Hyphen auf synthetischem und semxsynthetischera Agarmedium
sind lang, verzweigt, septiert und haben einen Durchmesser von 0,2 bis 1,2 ,um. Auf der Oberfläche des Agars bildet das Mycelium
einen kompakten, leicht erhobenen und etv/as lederartigen Bewuchs. Auf keinem Medium v/erden Lufthyphen gebildet. Dicht
unter der Oberfläche des Agars sind reichlich Vertikalhyphen vorhanden. Jede Vertikalhyphe entspringt von einer horizontalen
Trägerhyphe, die es tiefer im Agar in reichlichem Maße gibt, und endet an der Oberfläche des Agars unter Bildung
eines Sporangiums.
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Auf einem Agar aus Czapek-Lösung (Difco Laboratories, Detroit,
Michigan) werden reichlich Sporangien gebildet. Sie erscheinen nach etwa 7-tägiger Inkubation bei 22 bis 25 °C.
Mit alternder Kolonie bedeckt sich die ganze Oberfläche der Kolonie mit einer dichten Sporangienmatte. Die Sporangien
werden einzeln an sehr kurzen Sporangiophoren (Endteil vertikaler Hyphen über der Agaroberflache) geboren. Gelegentlich
verzweigt sich ein Sporaniophor unter Bildung eines zweiten und selten auch eines dritten Sporangiums. Die
Sporangien sind in typischer Weise sphärisch oder subsphärisch und können 8 bis 10 ,um groß sein. Die Sporangien enthalten
etwa 35 bis 50 subsphärische Sporangiosporen, die in einer oder mehreren herausragenden Spiralen im Sporangium angeordnet
sind. Die Sporangiosporen haben bei ihrer Reife einen Durchmesser von etwa 1f0 ,um. Durch die fast totale Zersetzung
der Sporangialwand scheint eine Sporangialdehiscenz vorzuliegen. 10 oder 15 Minuten nach Einlegen der Sporangien
in iiasser beginnt normalerweise das Verfahren einer Sporenliberation.
Die Sporen sind normalerweise nicht sofort motil, sie werden jedoch innerhalb von 5 Minuten aktiv motil durch
ein Büschel polarer Flagella.
Aussehen auf Medien Agar aus Czapek-Lösung:
Gutes Wachsen. Ein Punktinoculum bildet in 4 Wochen eine Kolonie von etwa 1 cm Durchmesser. Keine Lufthyphen feststellbar.
Die Kolonie ist im allgemeinen abgeflacht mit einem leichten Hügel in der Mitte. Die Farbe der Kolonie ist
zuerst hellorange, und sie ändert sich in mattorange, wenn
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sich Sporangien bilden und die Mycelien bedecken.
Leidliches Wachsen. Ein Punktinoculum bildet in 4 Wochen eine
Kolonie von etwa 0,5 cm Durchmesser. Keine Lufthyphen feststellbar.
Die Kolonie ist im allgemeinen flach, diffus und leicht mucoid. Die Farbe der Kolonie ist matt bräunlichorange.
Es werden keine Sporangien gebildet.
Leidliches Wachsen. Ein Punktinoculum bildet in 4 Wochen eine Kolonie von etwa 0,5 cm Durchmesser. Keine Lufthyphen feststellbar.
Die Kolonie ist gebirgsartig, und sie hat einen scharfen Peak in der Mitte mit scharfen Rändern, die sich
bis zum Rand der Kolonie erstrecken. Die Kolonie ist hellorange bis gelborange gefärbt. Im älteren Teil der Kolonie
werden in großer Zahl Sporangien gebildet, jedoch nicht in dem Ausmaß, in dem sie auf Czapek-Lösung-Agar entstehen.
Actinoplanes utahensis NRRL 5614 besitzt eine Zellwandchemie,
die den Stämmen von Actinoplanes utahensis (Szaniszlo und Gooder, 1967) sehr ähneln. Automatische Aminosäure- und Aminozuckeranalysen
der Zellwandrückstände, die nach 18-stündiger Hydrolyse mit 1 ml 6 η Salzsäure bei 100 0C zurückbleiben,
zeigen, daß Glucosamin, Muraminsäure, Glycin, Alanin und
2,6-Diamino-3-hydroxypimelinsäure (HDAP) in den Wänden in hohen Konzentrationen vorhanden sind. 2,6-Diaminopimelinsäure
(DAP) läßt sich nur in geringer Konzentration feststellen.
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Ein Vergleich der Aminosäuremolverhältnisse der Zellwand
(die Glutaminsäure wird als Einheit betrachtet) von Actinoplanes utahensis NRRL 5614 und A. utahensis (Szaniszlo
and Gooder) geht aus Tabelle II hervor.
Organismus
Aminosäuren
Glutaminsäure Glycin Alanin HDAP DAP
Actinoplanes
utahensis NRRL 5614
1 ,00
1,14
0,74 0,61 0,15
Actinoplanes utahensis (Szaniszlo und Gooder)
1,00
1,18
0,93 0,53 0,11
Papierchromatographische Analysen von Rückständen, die nach 2-stündiger Hydrolyse mit 2 ml 2 η Schwefelsäure bei
100 C zurückbleiben, zeigen, daß die Monosaccharide Glucose,
Galactose, Mannose, Arabinose, Xylose und Rhamnose in feststellbaren
Mengen in den Zellwänden vorhanden sind. Diese Zucker werden allgemein in den Zellwänden von Stämmen von
A. utahensis gefunden.
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KulturCharakteristiken auf verschiedenen Agar-Medien
(Inkubationstemperatur 30 0C)
Medium
Glucose-Asparagin
Menge an vegetativem Mycelium
4+ Aerialmorphologie oder
Sporulation
Sporulation
Sporangien; keine
Luftmycelien beobachtet
Luftmycelien beobachtet
Umkehrfarbe
M&P Code
2)
ICNB Name
10C7
mäßig gelblich pink
4^ Emerson
ο
ο
CD
00
CO
00
CO
cd Benett
4+
3+ keine Sporangien; keine Luftmycelien beobachtet
Sporangien; keine
Luftmycelien beobachtet
Luftmycelien beobachtet
11B12
stark orange
12C7 hellbraun
Tomatenpaste-Hafermehl
1 + keine Sporangien; keine Luftmycelien beobachtet
keine Farbzuordnung *
Czapek
Nährmedium
Tyrosin
Hafermehl
3-4+
2+
2+
3+ Sporangien; keine
Luftmycelien beobachtet
Luftmycelien beobachtet
keine Sporangien; keine Luftmycelien beobachtet
keine Sporangien; keine Luftmycelien beobachtet
Sporangien; leichter Flaum
| 13D7 | N) |
| hellbraun | CD |
| 11B2 | CO |
| schwach gelb | cn CJ) |
| 13B7 | |
| hellbraun | |
| 12C3 | |
| gräulich gelb | |
Glycerin-Glycin
keine Sporangien; leichter Flaum
12B9 bräunlichorange
Hefeextrakt
Sporangien; leichter Flaum
12B9 bräunlichorange
anorganische
Salze-Stärke
Salze-Stärke
3-4+ reich an Sporangien; leichter Flaum
12A9 bräunlichorange
Glycerin-Asparagin 4+
Calciummalat 4+
Hefeextrakt-Malzextrakt reich an Sporangien; leichter Flaum
keine Sporangien; leichter Flaum
Sporangien;
leichter Flaum
leichter Flaum
9C3 mittelorange
9C3 mittelorange
2)
Bezogen auf A. Maerz and M. Rea Paul, "A Dictionary of
Color, "McGraw-Hill, New York, N.Y.
Color, "McGraw-Hill, New York, N.Y.
The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary
of Color Names, National Bureau of Standards Circular
553, U.S. Government Printing Office
of Color Names, National Bureau of Standards Circular
553, U.S. Government Printing Office
Aufgrund der vorstehenden taxonoraisehen Beschreibung des
A-287 produzierenden Stammes wurde der Mikroorganismus als
ein neuer Stamm von Actinoplanes utahensis Couch klassifiziert. Der A-287 bildende Organismus ist leicht verschieden
von Actinoplanes utahensis Couch, wie von Couch in J. Elisha Mitchell Sei. Soc. 79, 53-66 (1963) beschrieben. Auf Czapek-Lösung-
Agar produziert der neue Stamm reichlich Sporangien und ist hellorange bis matt bräunlichorange gefärbt. Der
publizierte Organismus bildet demgegenüber keine bis wenig Sporangien und ist leuchtend apricoorange gefärbt. Dieser
Farbunterschied läßt sich auch auf Pepton-Czapek-Agar feststellen. Ein Farbunterschied von hellbraun (neuer Stamm)
gegenüber orange (publizierte Beschreibung) kann auch auf Tyrosin-Agar beobachtet werden. Diese Unterschiede stellen
jedoch nur Stammunterschiede dar. In allen anderen Beziehungen stimmen die Charakteristiken mit der publizierten
Beschreibung dieser Species überein.
Wie bereits erwähnt, kann Actinoplanes utahensis NKRL 5614
in einem Kultumedium unter Bildung der Antibiotica A-287
gezüchtet werden. Als Kulturmedium läßt sich irgendein Medium verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen
Herstellung, einer maximalen Ausbeute und einer leichten Isolierbarkeit der Antibiotica werden jedoch
bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Molasse stellt daher eine der bevorzugten Kohlehydratquellen dar, und Sojabohnenmehl
ist eine der bevorzugten Stickstoffquellen.
Dem Kulturmedium sollten anorganische Nährsalze zugegeben werden, und hierunter fallen die üblichen Salze, die Natrium,
Kalium, Ammonium, Kalzium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat oder Carbonat ergeben. Mit Vorteil können
ferner Quellen von Wachstumsfaktoren, wie destiller's
solubles und Hefeextrakte, zugegen sein. In dem zum Wachsen
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_ 1 α _ — Io
der erfindungsgemäß verwendeten Actinoplanes spacies eingesetzten
Kulturmedium sollten ferner essentielle Spurenelemente vorhanden sein, wie dies auch für das Wachsen und
die Entwicklung anderer Mikroorganismen gilt. Solche Spurenelemente werden normalerweise als Verunreinigungen gleichzeitig
mit der Zugabe anderer Bestandteile des Mediums geliefert.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums läßt sich variieren. Vor der Beinipfung mit dem Organismus sollte man den pH-Wert
des Kulturmediums zweckmäßigerweise jedoch auf pH 6,8 bis
7,5 einstellen, und zwar je nach dem besonderen verwendeten Medium. Der End-pH-Wert wird zumindest teilweise bestimmt
durch den Ausgangs-pH-Wert des Mediums, die im Medium vorhandenen
Puffer sowie die Zeitspanne, während der man den Organismus wachsen läßt.
Zur Bildung wesentlicher Mengen der Antibiotica A-287 bedient
man sich vorzugsweise einer submersen aeroben Fermentation in Tanks. Geringe Mengen an Antibioticum erhält man
durch Kultivierung in einer Schüttelflasche. Wegen der durch
die Beimpfung großer Tanks verbundenen Zeitverzögerung in der Produktion von Antibioticum mit der Sporenform des
Organismus verwendet man vorzugsweise ein vegetatives Inoculum. Das vegetative Inoculum wird hergestellt, indem
man ein kleines Volumen Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelfragmenten des Organismus beimpft, wodurch
man eine frische aktiv wachsende Kultur des Organismus erhält. Das vegetative Inoculum überträgt man dann in
einen größeren Tank. Das zum Wachsen des vegetativen Inoculums verwendete Medium kann das gleiche sein wie
dasjenige, das man für größere Fermentationen einsetzt, man kann hierfür jedoch auch andere Medien verwenden.
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Den A-287 produzierenden Organismus kann man bei Temperaturen
zwischen etwa 20 und etwa 35 C wachsen lassen. Zu einer optimalen Produktion an A-287 scheint es bei einer
Temperatur von etwa 30 0C zu kommen.
Wie bei üblichen aeroben Submerskulturverfahren, so wird
auch im vorliegenden Fall Luft durch das Kulturmedium geblasen. Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und
eine entsprechende Produktion an A-287 Antibiotica sollte das in den Tank zur Bildung der A-287 Antibiotica einge- ■>
brachte Luftvolumen vorzugsweise über 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium betragen. Ein optimales
Wachsen erfolgt dann, wenn das Volumen an eingesetzter Luft zwischen 0,6 und 1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen Kulturmedium
beträgt.
Die Bildung an Antibiotica Iäj3t sich während
der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe bezüglich ihrer antibiotischen Aktivität gegen Organismen
untersucht, deren Empfindlichkeit gegen Antibiotica man kennt. Ein zur Prüfung der erfindungsgemäßen Antibiotica
geeigneter Versuchsorganismus ist Sarcina lutea ATCC 9341.
Der Bioversuch wird zweckmäßigerweise nach dem Papier-Scheiben-Verfahren auf Agarplatten durchgeführt.
Im allgemeinen kommt es innerhalb von 2 bis 6 Tagen entweder bei einer Großtankfermentation oder einer Schüttelflaschenfermentation
zu maximaler Antibioticabildung. Eine maximale Produktion an antibiotischer Aktivität vollzieht
sich normalerweise innerhalb von 20 bis 96 Stunden.
Nach ihrer Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen
lassen sich die beschriebenen A-287 Antibiotica aus der Fermentationsbrühe durch in der Fermentationstechnik
übliche Verfahren isolieren. Die während der Fermentation des A-287 produzierenden Organismus entstandene antibiotische
Aktivität tritt in der antibiotischen Brühe auf. Die zur Herstellung der A-287 Antibiotica verwendeten Isoliertechniken
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müssen demzufolge so ausgelegt sein, daß sich eine maximale
Menge der Antibiotica aus der Brühe gewinnen läßt. Mycelien
und ungelöste Feststoffe werden daher beispielsweise aus der Fermentationsbrühe in üblicher Weise, wie durch Filtrieren,
entfernt, und die A-2 37 Antibiotica werden aus der filtrierten Brühe durch Techniken wie Extraktion oder
Absorption gewonnen.
Bei Anwendung der erwähnten Bedingungen bildet der oben beschriebene und als NRRL 5614 bezeichnete Stamm von Actinoplanes
das Antibioticum Faktor A als den überwiegenden Faktor. Der Faktor A macht im allgemeinen etwa 95 bis 98 %
der gesamten gewonnenen antibiotischen Aktivität aus. Der
Faktor B bildet praktisch den Rest der antibiotischen Aktivität.
Zur Extraktion der filtrierten Brühe eignen sich niedere Alkohole wie Butanol oder Pentanol. Eine weitere Reinigung
der A-2 37 Antibiotica erfolgt durch zusätzliche Extraktionsund Absorptionsverfahren. Mit Vorteil lassen sich Absorptionsmittel
wie Sephadex G-25 oder G-50 oder Tonerde verwenden.
Die antibiotischen Faktoren A und B werden durch bekannte Verfahren, wie Gegenstromverteilung, präparative Dünnschichtchromatographie
oder Säulenchromatographie, voneinander getrennt und als Einzelverbindungen isoliert. Zur Auftrennung
der Faktoren A und B bedient man sich beispielsweise der präparativen Dünnschichtchromatographie über Silicagel mit
Butanol!EssigsäurerWasser (4:1:1), wobei man jede der
Verbindungen durch Eluieren mit Methanol gewinnt. Für großtechnische Auftrennungen empfiehlt sich eine Säulenchromatographie.
Typische Absorptionsmittel für Säulenauftrennungen sind: 1) Aluminiumoxid, wobei man den Faktor
B mit Methanol und den Faktor A mit 2 % Ammoniak in Methanol eluiert, 2) DEAE-Cellulose, und zwar durch Gradientenelution
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mit 0,001 m bis 0,2 m Natriumacetatpuffer vom pH 5f6,
und 3) Kationenaustauscherharz (XE-S4 im Wasserstoffcyclus),
wobei man mit 0,05 m Citratpuffer mit einer Gradientenvariation im pH-Wert von 5,2 bis 5,8 eluiert. Die Gegenstromverteilung
wird zur Auftrennung bevorzugt. Mit dieser Methode erhält man gute Ergebnisse, wenn eine Phase ein polares,
nicht mit Wasser mischbares Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelgemisch ist, und die andere Phase eine Pufferlösung
mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 8,5 darstellt. Zu optimalen Ergebnissen gelangt man dann, wenn
eine Phase ein Lösungsmittelsystem ist, wie beispielsweise Methylisobutylketon:Butanol oder Äthylacetat :ilthanol, und
die andere Phase eine Pufferlösung mit einen pH-Wert zwischen etwa 6,8 bis 7,9 darstellt.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 A. Fermentation von A-287 in der Schüttelflasche
Eine Kultur von Actinoplanes utahensis NRRL 5614 wird
hergestellt und auf Schrägagar folgender Zusammensetzung gehalten:
| Bestandteile | Menge |
| Hafermehl (vorgekocht) | 65 g |
| Agar | 20 g |
| deionisiertes Wasser | q. s. 1 Liter |
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Der Schrägagar wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 5614
beimpft und 10 bis 14 Tage bei 30 0C inkubiart. Im Mycelium
wird ein Pigment gebildet, das von orange zu orangebraun schwankt. Die Kultur sporuliert auf diesem. Medium normalerweise
nicht, und :aan muß die Mycelmatte daher mit
einer abgeflachten scharfen Inoculiernadel macerieren, um so die Anzahl möglicher WachstumsZentren zu erhöhen. Die
macerierte reife Kultur wird mit sterilem Wasser bedeckt und
sorgfältig mit einem sterilen Stab abgekratzt, wodurch man eine .lycelsuspension erhält. Diese Suspension wird durch
Lyophilisieren konserviert. Sin Sechstel der so hergestellten
Schrägagarkultur wird zur Beimpfung von 50 ml eines vegetativen
Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:
Hafermehl (vorgekocht) 20,0 g
Trypton 5,0g
getrocknete Hefe 2,5 g
deionisiertes Wasser q. s. 1 Liter
Der Anfangs -pH-Wert des vegetativen llediuras beträgt etwa
7,2. Mach 72 Stunden liegt der pH-Wert bei etwa 6,6 bis 7,0. Das vegetative Medium wird inoculiert und in einem
250 ml-Kolben 72 Stunden bei 30 C auf einem Rotationsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Die
am Ende erhaltenen Feststoffe (die das Wachstum wieäergeben) machen 20 bis 30 % aus.
B. Tankfermentation von A-2 37
Das wie oben beschrieben hergestellte vegetative Medium (1,25 1)
wird zur Inoculierung von 25 1 sterilem Produktionsmedium folgender Zusammensetzung verwendet:
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Menge
- 23 -
Saccharose Soj abohnenmehl Melasse
Enzyinatisches Hydrolysat
von Casein K2HPO4
MgSO4
MgSO4
Dow Corning Antischaummittel
1)
Czapek-Mineralgemisch
Leitungswasser
Czapek-Mineralgemisch hat die folgende Zusammensetzung:
| 10,0 | g |
| 10,0 | g |
| 30,0 | g |
| 4,0 | g |
| 1,0 | g |
| 1,0 | g |
| 0,2 | g |
| 5,0 | ml |
| q.s | . 25 Liter |
Bestandteile
KCl
FeS047H2O'
deionisiertes Wasser
| Menge | g | (gelöst in 2 ml konz. HCl) |
| 100 | g | Liter |
| 100 | g | |
| 2 | ||
| 1 | ||
Der pH-Wert des Mediums beträgt nach Sterilisation durch Behandeln im Autoklaven bei 120 0C während 30 Minuten bei
6,8 bis 9,07 kg Druck 7,2. Das inoculierte Produktionsmedium läßt man 5 Tage bei einer Temperatur von 30 0C
in einem 30 Liter Fermentationstank fermentieren. Das
Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von 1 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium
pro Minute belüftet und mit üblichen Rührern bei 400 Umdrehungen pro Minute gerührt.
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Beispiel 2
Nach äen Verfahren von Beispiel 1 stellt man A-2 87 Antibiotica
her, wobei man jedoch abweichend davon ein Schrägagarmedium folgender Zusairunensetzung verwendet:
| Hafermehl (vorgekocht) | 60,0 | g |
| Hefe | 2,5 | g |
| Agar | 20,0 | g |
| K2HPO4 | 1,0 | g |
| Czapek Mineralgemisch | 5,0 | ml |
lösliche Fermentationsbestandteile1 * 5,0 g
BY 500 aus ainer Butanolferxnentation; erhältlich von
Commercial Solvents Corp., Terre Haute, Indiana.
Beispiel 3 Isolierung der A-287 Antibioticumfaktoren
Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fermentationsbrühe (etwa 25 Liter) wird mit einer Filterhilfe (Hyflo Super-cel, einer von
Johns-ManviHe Products Corp. verkauften Diatomeenerde) filtriert.
Das Brühenfiltrat wird mit verdünnter Salzsäure auf etwa pH 6,5 eingestellt und dann zweimal mit 1-Butanol
extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl löst man in Natriumphosphatpuffer
(0,1 m, pH 7,0), und die Pufferlösung wird dreimal mit 1-Butanl extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter Vakuum
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zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst,
und zum Ausfällen des antibiotisehen Gemisches wird
Äther zugesetzt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und über Vakuum zu einem lohfarbenen Pulver (etwa
50 bis 65 % Ausbeute aus dem ursprünglichen Filtrat) getrocknet. Dieser Rückstand wird weiter gereinigt und gefärbt
durch Chromatographie über Sephadex G-25 in Wasser. Wach
chromatographischer Reinigung fällt man das aktive Material erneut aus Methanol aus, und zwar unter Verwendung von Äther,
worauf man wie oben erwähnt abtrennt und so 3 g A-287 Antibioticageniisch
erhält.
Die Antibiotica A-287 Faktoren A und B v/erden durch Gegenstromverteilung
getrennt, und zwar unter Verwendung von fünfzehn 500 ml Scheidetrichtern mit 250 ml einer jeden Phase
und Bewegen der unteren Phase. Die obere Phase besteht aus Methylisobutylketon: 1-Butanol (3:2), und die untere Phase
ist 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH 6,8. Der Faktor A
bewegt sich mit der unteren Phase. Der Faktor B bleibt in der oberen Phase des ersten Trichters. Eindampfen unter
Vakuum ergibt 0,1 g Faktor B. Der Faktor A wird aus der Pufferphase durch Extraktion mit 1-Butanol gewonnen. Der
Butanolextrakt wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft.
Den so erhaltenen Rückstand löst man in Äthanol, wobei man wiederum Äther verwendet, um so 2,9 g Faktor A auszufällen.
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Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung des Antibioticuras A-287,
das aus einen Faktor A und/oder einem Faktor B besteht, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes utahensis
NRRL 5614 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlehydrat, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält,
submers unter aeroben Fermentationsbedingungen solange züchtet, bis dieser Organisraus in dem Kulturmedium eine wesentliche
antibiotische Aktivität gebildet hat, und das A-287-Antibioticageiuisch
aus den Kulturmedium abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Faktor A aus dem A-287-Antibioticagemisch abtrennt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man den Faktor B aus dem A-287-Antibioticageiaisch abtrennt.
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2402356
4. Antibioticum A-2 87 Faktor A, der a) eine weiße amorphe Verbindung ist,
b) nicht unter etwa 220 C schmilzt,
c) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 44,98 % Kohlenstoff, 6,15 % Wasserstoff, 10,28 % Stickstoff, ■
26,37 % Sauerstoff und 4,15 % Asche hat,
d) ein scheinbares Molekulargewicht im Bereich von 1500 (1475,73) besitzt, und zwar bestimmt in Methanol nach
dem osmometrisehen Verfahren unter Verwendung der
Molekulargewichtsbestimmungsapparatur von Hitachi-Perkin-Elmer,
Modell 115,
e) in Mineralölmull ein Infrarotabsorptionsspektrum besitzt, wie es aus Figur 1 der Zeichnung hervorgeht,
f) in Wasser im Ultraviolettbereich des Spektrums bei folgenden Maxima absorbiert:
Λ, raax. 220 m,u (€9500; Schulter)
7\, max. 273 m.u (£2700),
g) allgemein löslich ist in niederen Alkoholen und in Wasser,
h) allgemein unlöslich ist in vielen organischen Lösungsmitteln,
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- 23 -
i) ein ungefähres Anxnosaureverhaltnis wie folgt hat:
Serin (1), Glutaminsäure (1), Glycin (2), Alanin (1),
Valin (2), Cystein (1), Isoleucin (1), Leucin (2), Tryptophan (1) und Unbekannte (2),
j) in den unten angegebenen papierchromatographischen
Systemen unter Verwendung von Bacillus subtilis
ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341 oder Staphylococcus
aureus ATCC 653 8 als DetectionsOrganismen folgende
Rf-Werte hat:
Rf-Werte Lösungsraittelsystem
0,17 mit Wasser gesättigtes Butanol
0,70 mit Wasser gesättigtes Butanol plus
2 % p-Toluolsulfonsäure (p-TSA)
0,39 mit Wasser gesättigtes Butanol
plus 2 % p-TSA und 2 % Piperidin
0,72 80 % Äthanol mit 1,5 % NaCl, wobei
das Papier mit einer Lösung aus 0,95 m Na3SO4 und 0,05 m NaHSO4-H2O
imprägniert ist
0,68 Methanol: 0,1 η HCl (3:1).
5. Antibioticum A-2 87 Faktor B, der a) eine weiße amorphe Verbindung ist,
b) bei etwa 200 0C verkohlt,
c) eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 49,96 % Kohlenstoff, 6,98 % Wasserstoff, 9,90 % Stickstoff,
23,86 % Sauerstoff und 4,66 % Asche hat,
409830/1049
d) ein scheinbares Molekulargewicht im Bereich von 2800 (2781,28) besitzt, und zwar bestirorat in Methanol durch
das osmometrische Verfahren unter Verwendung einer MoIekulargewichtsbestiinmungsapparatur
von Hitachi-Perkin-Elmer, Modell 115,
e) in Mineralölmull ein Infrarotabsorption:spektrum wie in
Figur 2 der anliegenden Zeichnung gezeigt besitzt,
f) in Wasser im Ultraviolettbereich des Spektrums bei folgenden Maxima absorbiert:
/L max. 220 ra ,u (£9200; Schulter)
273 m,u (£.3200)
g) im allgemeinen in niederen Alkoholen und in Wasser löslich ist,
h) im allgemeinen in vielen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist,
i) ein ungefähres Aminosäureverhältnis wie folgt besitzt:
Serin (1), Glutaminsäure (1), Glycin (2), Alanin (1), Valin (2), Cystein (1), Isoleucin (1), Leucin (2),
Tryptophan (1) und Unbekannte (2);
j) in den unten angegebenen papierchromatographischen Systemen
unter Verwendung von Bacillus subtilis ATCC 6633, Sarcina lutea ATCC 9341 oder Staphylococcus aureus ATCC 6538 als
Detectionsorganismen folgende Rf-Werte hat:
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Rf-Werte Lösungsmittelsystem
0,88 mit Wasser gesättigtes Butanol
0,88 mit Wasser gesättigtes Butanol plus
2 % p-Toluolsulfonsäure (p-TSA)
0,90 mit Wasser gesättigtes Butanol plus
2 % p-TSA und 2 % Piperidin
0,36 80 % Äthanol mit 1 ,5 % ilaCl, wobei
das Papier mit einer Lösung aus
0,95 m Na3SO4 und 0,05 m NaHSO..H3O imprägniert ist
0,95 m Na3SO4 und 0,05 m NaHSO..H3O imprägniert ist
0,89 Methanol : 0,1 η HCl (3:1).
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|---|---|---|---|
| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: SPOTT, G., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANW., 800 |
|
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |