DE1792550C3

DE1792550C3 - Verfahren zur Herstellung von 2-Thiouridylsäure

Info

Publication number: DE1792550C3
Application number: DE1792550A
Authority: DE
Inventors: Koyoshi Sagamihara Nakayama; Haruo Machida Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-09-21
Filing date: 1968-09-18
Publication date: 1974-12-05
Also published as: GB1184156A; US3562111A; DE1792550A1; DE1792550B2; FR1581401A; CS158225B2

Description

2-Thiouridylsäure ist ein biochemischer Wirkstoff und kann an Stelle von 2-Thiouracil benutzt werden. 2-Thiouridylsäure ist in vivo eine aktive Form von 2-Thiouracil.

Bisher wurde 2-Thiouracil als Heilmittel für die Basedowsche Krankheit, gegen Herzanfälle und gegen congestive Herzbeschwerden verwendet. Es ist auch als Beschleuniger für die Gewichtszunahme von Tieren durch Zusatz zu deren Futter verwendet worden.

Es sind bereits Verfahren zur synthetischen Herstellung von 2-Thiouridylsäure beschrieben worden. Diese Verfahren können jedoch nicht im industriellen Maßstabe angewendet werden, und zwar auf Grund der hohen Kosten und der niedrigen Ausbeuten, die sich dabei ergeben. Es ist auch bekannt, daß 2-Thiouridylsäure aus der Ribonucleinsäure des Tabakmosaikvirus erhalten werden kann, wenn dieser mit 2-Thiouracil behandelt wird (vgl. hierzu z. B. J. American Chcm. Soc, 82 [I960], S. 752 und 753, und Biochim. Biophys. Acta, 11 [1953], S. 438). Es is; jedoch bisher nicht gelungen, eine erhebliche Menge von 2-Thiouracil durch Stoffwechselreaktionen von lebenden Organismen in 2-Thiouridylsiinre umzuwandeln.

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 2-Thiouridylsäure durch Fermentation, das vorteilhaft in industriellem Maßstabe in einfacher und wirtschaftlicher Weise und mit hohen Produktausbeuten durchgeführt werden kann.

Dieses Ziel wird gemäß der Erfindung dadurch erreicht, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC 21084, Arthrobacter sp. ATCC 21 085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5 in einem wäßrigen Nährmedium, das etwa 0,5 bis 10 mg/ml 2-Thiouracil oder 2-Thiouridin als Zusatzstoff enthält, züchtet und aus der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit die 2-Thiouridylsäure auf übliche Weise isoliert.

Die Züchtung der angegebenen Mikroorganismen wird in einem üblichen synthetischen oder natürlichen Nährmedium vorgenommen, das die für das Wachstum des verwendeten Stammes notwendigen Nährstoffe enthält. Dazu gehören eine Kohlenstoff auelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und gegebenenfalls spezielle Zusatzstoffe, wie Aminosäuren, Vitamine und Biotin.

Das 2-Thiouracil oder 2-Thiauridin wird dem verwendeten Züchtungsmedium während der Züchtung entweder zu einem einzigen Zeitpunkt oder in zeitlichen Abständen zugegeben.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, z. B. als aerobe Schüttelkultur oder als Submerskultur unter Belüftung und Rühren bei der angegebenen Temperatur und dem angegebenen pH-Wert. Die Dauer der Züchtungszeit wird bestimmt an Hand der durch Analyse festegestellten 2-Thiouridylsäure-Bildung. Erhebliche Mengen 2-Thiouridylsäure reichern sich im allgemeinen in der Kulturflüssigkeit während 2 bis 8 Tagen an.

Die Isolierung der 2-Thiouridylsäure aus d«r KuI-turflüssigkeit kann wirksam ausgeführt werden durch Adsorption der 2-Thiouridylsäure an ein stark basisches Ionenaustauscherharz und anschließende EIuierung der Verbindung von dem Harz mit einer wäßrigen Lösung einer Säure oder eines Gemisches aus einer Säure und einem Salz. Zur Elution können sowohl anorganische als auch organische Säuren henutzt sverden. Als Salze können bei dem Elutionsverfahren verschiedene anorganische oder organische Salze verwendet werden, wie z. B. Natriumchlorid und Ammoniumformiat.

Die 2-Thiouridylsäure kann weiter gereinigt werden, z. B. durch Adsorption an Kohlepulver, durch Kationenaustauscherharz-Behandliing. durch Konzentrieren oder durch Ausfällen.

In den folgenden Beispielen bezichen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro Liter Wasser, falls es nicht anders angegeben ist.

Beispiel I

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 wurde als Einsaatstamm verwendet. Es wurde 24 Stunden lang bei 30° C in einem hinsaatmedium gezüchtet, welches 2 <Vo Glukose, 1 % Pepton. 1 °/o Hefeextrakt. 0.3 <Vn NaCl und 30 ug/1 Biotin enthält, um eine Einsaatkultur zu erhalten.

Die sich ergebende Einsaatkultur wurde im Verhältnis von 10 Volumprozent in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingeimpft, der 20 ml eiivs Züchtungsmediums enthielt, das wie folgt zubereitet wurde:

Glukose 100 g

Harnstoff 6 g

KH₂PO₄ 10 g

MgSO₄-7H₂O 10 g

CaCl,-2H,O 0,1 g

Biotin 30 iig

Hefeextrakt 10 g

wurden in 1 1 Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mittels NaOH auf 8,0 eingestellt. 20-ml-Anteile der Lösung wurden in 250-ml-Kolben gegossen und dann 10 Minuten lang in einem Autoklav bei 1 kg/cm² sterilisiert.

Die Züchtung wurde dann als aerobe Schüttelki.:tur bei 30° C durchgeführt.

Nach 72stündiger Züchtung wurde 2-Thtouracil zu der Züchtungsflüssigkeit hinzugesetzt, um eine Kon-

zentration von 3 mg/ml zu erhalten. Die Züchtung wurde dann weitere 48 Stunden lang fortgeführt. Als Ergebnis wurden in der Züehtungsflüssigkeit 2,04 mg/ml 2-ThiouridyIsäure angereichert.

Ein Liter der Lösung, erhalten durch Entfernung der Bakterienzellen aus der Züchtungsflüssigkeit, wurde mit Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und durch eine Säule laufen gelassen, die mit einem stark basischen Polystyrol-Anionenaustauscherharz gefüllt war, um die 2-Thiouridylsäure an dem Harz zu absorbieren. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen. Danach wurde die Elution in der angegebenen Reihenfolge mit 0,01 n-HCI, 0,02 n-HCI, 0,05 m-HCl und 0,1 n-HCl durchgeführt. Die Fraktionen von 2-ThiouridyIsäure, die mit 0,1 n-HCI eluiert worden waren, wurden bis zur Trockne konzentriert, in Wasser gelöst und durch eine Säule aus stark saurem Polystyrol-Kationenaustauscherharz geschickt. Das erhaltene Eluat wurde konzentriert, und es wurde Äthanol hinzugefügt, um die 2-Thiouridylsäure auszufällen. Der Niederschlag wurde ab filtriert und getrocknet. Die Ausbeute betrug 0.8 g mit einer Reinheit von 80»/₀. Ein reines 2-Thiouridylsäure-Produkt wurde erhalten durch Behandlung mit Kohlepulver und Umkristallisieren aus Wasser und Äthanol.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abwandlung, daß Corynebactcrium sp. Nr. 3485 ATCC 21084 als Einsaatstamm verwendet wurde. Die Menge an 2-Thiouridylsäure, die in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit produziert worden war, betrug 1,8 mg/ml,

Beispiel 3

Unter Verwendung der gleichen Medien und der gleichen Züchtungsbedingungen, wie in Beispiel t beschrieben, wurde die Züchtung mit Arthrtbacter sp. 3486 ATCC 21085 als Einsaatstamm durchge führt. Die Menge an in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit produzierter 2-Thiouridylsäure betrug 1,8 mg/ml.

Beispiel 4

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 1 und bei Anwendung der dort angegebenen Züchtungsbedingungen wurde Micrococcus sodenensis ATCC 15932 als Einsaatstamm an Stelle von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 verwendet. Die Menge an in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit produzierter 2-Thiouridylsäure betrug 1,3 mg/ml.

Beispiel 5

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Abwandlung, daß dem Züchtungsmedium an Stelle von 2-Thiouracil 2-Thiouridin hinzugesetzt wurde. Die verwendeten Medien und die Züchtungsbedingungen entsprachen denjenigen von Beispiel 1. Die Menge an in der erhaltenen Züchtungsflüssigkeit produzierter 2-Thiouridylsäure betrug 1,3 mg/ml.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 2-ThiouridyI-säure, dadurch gekennzeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, Corynebacterium sp. ATCC 21 084, Arthrobacter sp. ATCC 21 085 oder Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40" C und *° einem pH-Wert von etwa 4,0 bis 9,5 in einem wäßrigen Nährraedium, das etwa 0,5 bis 10 mg/ml 2-ThiouracH oder 2-Thiouridin als Zusatzstoff enthält, züchtet und aus der erhaltenen Züchtungsfliissigkeit die 2-Thiouridylsöure auf übliche Weise isoliert.