DE2135246A1

DE2135246A1 - Verfahren zur Herstellung von L Tyrosin auf mikrobiologischem Wege

Info

Publication number: DE2135246A1
Application number: DE19712135246
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Sagamihara Kana gawa Hagino Hiroshi Tokio Yoshida Hajime Sagamihara Kanagawa Nakayama, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1970-07-17
Filing date: 1971-07-14
Publication date: 1972-01-20
Also published as: IT946259B; GB1361413A; US3787287A; CA952051A; DE2135246C3; FR2101759A5; JPS5546717B1; DE2135246B2

Description

" Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin auf mikrobiologischem λ Wege »

Priorität: 17. Juli 1970, Japan, 2\^Tr. 62062/70

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin durch Fermentation eines L-Tyrosin produzierenden Stammes coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien.

Coryneforme Glutaminsäure bildende Bakterien können in die Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter oder Microbacterium eingeordnet werden. Coryneforme Glutaminsäure bildende Bakterien bilden eine taxonomisch eng verwandte Bakteriengruppe (vgl. Abe et al,, J. General and Applied Microbiology, Band 13 (1967), S. 279 bis 301).

Da L-Tyrosin eine als Putterzusatz geeignete Aminosäure ist, wurde intensiv nach einem relativ billigen, in industriellem Masstab durchführbaren Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen gesucht. Bisher wurde L--Tyrosin z.B. durch Fermentation eines Phenylalanin-abhängigen Stammes von Corynebacterium glutamicum hergestellt (vgl. die japanische bekanntgemachte Patentanmel-

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ORIGINAL (NSPECTED

dung 14395/63). Es ist jedoch wünschenswert, L-Tyrosin in höheren als den rrach dem bekannten Verfahren erhaltenen Ausbeuten herzustellen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein billiges und in industriellem Masstab durchführbares Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin auf mikrobiologischem Wege zur Verfügung zu stellen, bei dein hohe L-Tyrosin-AusbeUten erhalten werden. Diese Aufpabe v/ird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin auf mikrobiologischem Wege, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen gegen mindestens eine der Verbin-L-

dungen/'Tyrosin, Phenylalanin oder deren Analoge reaistenten L-Tyrosin produzierenden Stamm coryneformer Glutaminsäure produzierende Bakterien in einem Kährmedium fermentiert und das in der Kulturbrühe angereicherte L-Tyrosin isoliert. .

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lässt sich L-Tyrosin in industriellem Hasstab mit ausgezeichneten Ausbeuten herstellen.

Die im erfindungsgemässen Verfahren einsetzbaren coryneformen Glutaminsäure bildenden Bakterien, wie Corynebacterium glutami-

L—

cum, weisen die vorstehend genannte Resistenz auf. /Tyrosin- und Phenylalanin-Analoge sind z.B. 3-Aminotyrosin, 2-Aminotyrosin, p-Aminophenylalanin, «.-Methyltyrosin, D-Tyrosin, p-Pluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin, o-Fluorphenylalanin, ß-2-Thienylalanin, 3-Hydroxytyrosin, ß-2-Pyrrolylalanin, ß-3-Purylalanin, 314-Dihydroxyphenylalanin, o-Hydroxyphenylalanin, m-Hydroxyphenylalanin, i-Hydroxy-a-pyridylalanin, p-Methy!phenylalanin,

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p~L^Titrophenylalanin, m-Nitrophenylalanin, ß-2-liaphth.ylalanin, ß-2-Pyriaylalanin, 3-Thionaphthenylalanin, ß-3~Thiazolylalanin und Tyroainhydroxamat. Es v/urde auch gefunden, dass beträchtliche L-Tyrocinmengen von Stämmen gebildet und angereichert werden, die zusätzlich zu einer Phenylalanin-Abhängigkeit (einschliesolich des sogenannten "lealcy"-Typs, der nicht absolut Phonylalanin-abhänpig ist), eine Resistenz pepen L-Tyrosin, Phenylalanin oder deren Analoge aufweisen. Ein und dieselbe Verbindung kann sowohl zu L-Tyrosin als auch zu Phenylalanin analog sein, wie dies z.B. für p-Fluorphenylalanin der Fall ist.

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzten Stämme sind gewisse Mutanten coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum, die die vorstehend genannten Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise werden im Verfahren der Erfindung als !-Glutaminsäure produzierende Bakterien Stämme der Gattungen Brevibacterium flavum, Brevibacterium glutanigenum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacteriura sp., Corynebacteriura callunae, Corynebacteriiun acetoacidophilum, Corynebacterium nielassecola, Coi'ynebacterium herculis, Corynebacterium sp., Hicrococcus sp., Microbacterium ammoniaphilum, Microbaeterium flavum var. glutamicum, Arthrobacter globiformis, Arthrobacter citreus und Arthrobacter sp. verwendet. Insbesondere sind zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens die Stämme Corynebacterium glutamicum ATCC 21562, Corynebacterium glutamicum ATCC 215631 Corynebacterium glutamicum ATCC 21564, Corynebacterium glutamicum ATCC 21565, Corynebacterium gluta-

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micum ATGC 21566, Corynebacterium glutamicum ATCC 21567, Corynebacterium glutamicum ATCC 21568, Corynebacterium glutamicum ATCC 21569, Corynebacterium glutamicum ATCC 21570, Corynebacterium glutamicum ATCC 21571, Corynebacterium glutamicum ATCC 21572 und Corynebacterium glutamicum ATCC 21573 geeignet.

Das Wachstum der im Verfahren der Erfindung verwendeten, gegen mindestens eine der Verbindungen^Tyrosin, Phenylalanin oder deren Analoge resistenten Stämme wird in Gegenwart der vorstehend genannten Verbindungen nicht gehemmt, während das Wachstum der Wildtypen oder der Elternstämme gehemmt vird. Die Resistenz wird gewöhnlich dadurch bestimmt, dass man prüft, ob ein Stamm

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in einem etwa 500 ^/ml 'Tyrosin, Phenylalanin oder deren Analoge enthaltenden Medium wachsen kann, wobei die Konzentration in Abhängigkeit von dem verwendeten Stamm und von der zur Prüfung verwendeten Verbindung variiert.

Die genannte Resistenz kann ein Stamm durch Mutation erhalten, die durch übliche Methoden, wie Bestrahlen mit ultravioletter Strahlung, Röntgenstrahlung, Kobalt -Strahlung und chemische Behandlung mit mutagenen Agentien, hervorgerufen wird. Wenn ein Stamm gegen eine der vorstehend aufgeführten Verbindungen resistent ist, weist er manchmal auch eine Resistenz gegen andere Verbindungen auf. Eine solche "Kreuzresistenz" wird häufig gegen p-Fluorphenylalanin und m-Pluorphenylalanin oder o-KLuorphenylalanin beobachtet. Eine Kreuzresistenz gegen 3-Aminotyrosin und p-Fluorpheny!alanin, 3-Aminotyrosin und m-Eluor— phenylalanin, 5-Amino tyrosin und p-Aminophenylalanin und gegen 3-Aminotyrosin und ß-2-Thienylalanin ist jedoch selten. Wenn man

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einen Stamm herstellen will, der gegen zwei oder mehr der vorstehend aufgeführten Verbindungen resistent ist, wird deshalb der Elternstamm einer Reihe von Mutationsbehandlungen unterworfen, wobei die gewünschte Resistenz Schritt für Schritt erhalten wird.

Die im Verfahren der Erfindung eingesetzten resistenten Stämme produzieren eine mehrfache bis über 1Ofache I-Tyrosinmenge, verglichen mit dem in der bekanntgemachten japanischen Patentanmeldung 14395/63 beschriebenen Verfahren. t

Die Herstellung von L-Tyrosin erfolgt im erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise durch Fermentation unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium in Schüttelkultur oder belüfteter und gerührter Submerskultur. Zur Erreichung hoher Ausbeuten wird die Fermentation vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 40 C und bei p„-Werten in der Nähe des Neutralpunktes durchgeführt, wobei die Temperatur— und p_H~Werte entsprechend dem verwendeten Bakterienstamra variieren können.

Im Verfahren der Erfindung können sowohl synthetische als auch komplexe Nährmedien unter der Voraussetzung verwendet werden, dass sie geeignete Mengen einer Kohlenstoff- und einer Stickstoff quelle, anorganische Verbindungen und Spuren solcher Elemente und Verbindungen enthalten, die für das Wachstum des verwendeten Stammes erforderlich sind. Als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle können sämtliche assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle können z.B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccarose, Maltose, Mannose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melas-

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se, und organische Säuren, wie'Brenztraubensäure, Milchsäure, Essigsäure und Fumarsäure, verwendet v/erden. Als Stickstoffquelle können z.B. Ammoniak oder anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, oder Harnstoff und andere stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, NZ-Arninej Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Fischmehl oder verdautes Fischmehl, entwässerter Sojabohnen-Presskuchen oder das durch Verdauen daraus erhaltene Produkt und Chrysalis hydrolysat verwendet v/erden.' Als anorganische Verbindungen können z.B. Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihyarogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Sisen(II)-sulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat verwendet werden. Wenn der im Verfahren der Erfindung verwendete Stamm eine spezifische Wuchsstoff abhängigkeit, z.B. von Vitaminen oder Aminosäuren, hat, müssen diese Wuchsstoffe ebenfalls in dem Nährmedium vorhanden sein. Wenn diese Wuchsstoffe bereits in den im iiährmedium vorhandenen Komponenten enthalten sind, ist eine spezifische Ergänzung des Nährmediums mit diesen Verbindungen nicht notwendig.

Vorzugsweise wird vor dem Beimpfen des Kulturmediums der verwendete Stamm in einem Anzuchtmedium angezogen. Das Anzuchtmedium wird unter für das Wachstum des Stammes günstigen Bedingungen solange inkubiert, bis eine geeignete Bakterienpopulation gewachsen ist. Die typische Inkubationszeit beträgt etwa 24 Stun-

Vor

den. Die so erhaltene ^kultür wird zum Beimpfen des bei der Fermentation verwendeten Nährmediums benutzt. Die Fermentation wird solange durchgeführt, bis eine beträchtliche L-Tyrosinmenge gebildet und in der Kulturbrühe angereichert worden ist. Dies ist

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in allgemeinen nach 2- bis 5tägiger Fermentation der Pail. Nach, beendeter Fermentation werden die Bakterienzellen entfernt, und das L-Tyrosin v/ird aus dem Kulturfiltrat nach üblichen Methoden, z.B. durch Konzentration, Ausfällen oder Ionenaustausch, isoliert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

lic wird eine Vorkultur des gegen 3-Aminοtyrosin resistenten Stammes Corynebacterium glutamicum (ATCC 21568) durch 24stündiges Inkubieren bei 30 C in einem 2 Prozent Glucose, 1 Prozent Pepton, 1 Prozent Hefeextrakt und 0,3 Prozent !Natriumchlorid enthaltenden Anzuchtmedium hergestellt. 10 ml eines Fermentationsmediums jn einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben werden mit 1 ml dieser Vorkultur beimpft. Das Fermentationsmedium enthält 10 Prozent Rohrzucker, 0,05 Prozent K₂HPO., 0,05 Prozent KlI₂PO/, 0,025 Prozent HgSOi.7H₂O, 2 Prozent Ammoniurasulfat, 0,5 Prozent NZ-Amin (Caseinhydrolysat), 30 ^ig Biotin/liter und 2 Prozent CaCO^. Der p„-V/ert des Fermentationsmediums be- ™ trägt 7,2. Nach 4tägiger Fermentation unter Schütteln bei 30⁰C enthält die Kulturbrühe 5,7 mg L-Tyrosin/ml.

Nach beendeter Fermentation wird 1 Liter der Kulturbrühe mit wässriger Ammoniaklösung auf p^ 10 eingestellt und anschliessend zentrifugiert, wobei die Bakterienzellen und das CaCO, abgetrennt werden. Der Überstand wird sodann unter vermindertem Druck auf 50 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird mit Salzsäure auf p„ 7,0 eingestellt und bei niedriger Temperatur stehengelassen. Die ausgefallenen L-Tyrosinkristalle werden abfiltriert.

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Die Ir-Tyrosin-Ausbeute beträgt 3,8 p.

Beispiel2

Es v/erden die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Stämme von Corynebacterium glutamicum "benutzt. Diese Stämme, die gegen zwei oder drei Tyrosin-Anal ο ge resistent sind, v/erden durch mehrfache mutagene Behandlung erhalten. Die Phenylalanin-Abhängigkeit wird vor der Resistenz hervorgerufen. Diese Stämme werden 24 Stunden unter Schütteln in einem Anzuchtmodium gemäss Beispiel 1 inkubiert. 10 ml eines Fermentationsmediums in einem grossen Reagenzglas werden mit 1 ml der so hergestellten Vorkulturen beimpft. Das Fermentationsmedium enthält 10 Prozent Rohrzuckermelasse (berechnet als Glucose), 0,05 Prozent K₂HPO₄, 0,05 Prozent KH₂PO₄, 0,025 Prozent KgSO₄^H₂O, 2 Prozent Ammoniumsulfat, 0,5 Prozent Maisquellwasser und 2 Prozent CaCO-z« Der p^-Wert des Ferment at ionsmediums beträgt 7,2. Die Fermentation wird 4 Tage bei 30 C dur> sind in der Tabelle zusammengestellt.

Fermentation wird 4 Tage bei 30 C durchgeführt. Die Ergebnisse

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Tabelle

Stamm

Phe , 3AT^R (ATGC 21567) The", 3AT^R, PFP^R (ATCC 21569) Phe~, 3AT^R, MEP^R (ATCC 21570) Phe", 3AT^R, PAP¹¹ (ATCC 21571) Phe"", 3AT¹¹, TA^R (ATCG 21572) Phe", 3AT^R, PPP¹¹, PAP¹¹ (ATCG 21573) Phe", MFP^R (ATCC 21562) Phe", 0]?P^R (ATCO 2Ϊ564) Phe", PFP^R (ATCC 21565) PPP¹¹ (ATCC 21566) MPP^R (ATCC 21563) gebildete L-Tyrosin-Menge, mg/ml

6,7 10,3

8,1

7,4

7,7 12,3

5,8

6,0

5,8

4,9

4,3

Phe 3AT¹¹ Pi¹P¹¹ MFP¹¹ PAP¹¹ TA^R Oi¹P¹¹

Phenylalanin-abhängig
resistent gegen 3-Aminotyrosin
resistent gegen p-3?luorphenylalanin resistent gegen m-Fluorphenylalanin resistent gegen p-Aminophenylalanin resistent gegen B—2-Thienylalanin
resistent gegen o-Fluorphenylalanin

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- ίο -

B e i s ρ i e 1 3

Es wird der Phenylalanin-abhängige, gegen 3-Aminotyrosin und p-Fluorphenylalanin resistente Stamm Corynebacterium glutamicum (Al¹CC 21569) verwendet·. Dieser Stamm wird in einem Anzuchtmedium 24 Stunden inkubiert. Das Anzuchtmedium entnält 7 Prozent Rohrzuckermelasse (berechnet als Glucose), 0,3 Prozent Maisquellwasser, 0,1 Prozent K₂HPO., 0,1 Prozent KH-,PO.,

-Preßkuchen / 0,05 Prozent MgSO^.7H₂O und 0,9 Prozent Sojabohnemiydrolysat

-Press, ' -Press

(berechnet als Sojabohnerrkuchen; das Sojabohnerrkuchenhydrolysat

-Press, wird durch Aufschliessen von Sojaboimenkuchen mit 6n HpSO. und Neutralisieren mit wässriger Ammoniaklösung erhalten). 3 Liter eines Fermentationsmediums in einem 5 Liter-Glasferr/ienter werden mit 300 ml der so erhaltenen Vorkultur beimpft. Das Fermentati onsrnedium enthält 15 Prozent Rohrzuckermelasse (berechnet als Glucose), 0,1 Prozent Maisquellwasser, 0,1 Prozent 0,1 Prozent K₂HPO,, 0,05 Prozent MgSO..7H₂O und 0,9 Prozent

-Press -Press,

Sojabolincnlcucheniiydrolysat (berechnet als Sojabohnenlcuchen). Der pjj-Wert des Permentationsmediums beträgt 7,2. Die Fermentation wird 72 Stunden bei 30⁰C unter Zufuhr von 3 Liter Luft/Minute und unter Rühren mit einer Rührgeschwindigkeit von 600 UpM durchgeführt. Nach der vorgenannten Zeit enthält die Kulturbrühe 15,6 mg L-Tyrosin/ml.

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Claims

- li - Pat e η t a η s ρ r ü c he

1. Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin auf mikrobiologischem V/ege, dadurch gekennzeichnet, dass man einen gegen mindestens eine der Verbindungen L-Tyrosin₃ Phenylalanin oder deren Analoge resistenten, L-Tyrosin produzierenden Stamm coryneformer Glutaminsäure produzierender Bakterien in einem Hährmedium fermentiert und das in der Kultur-"brühe angereicherte L-Tyrosin isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Corynebacterium glutamicum fermentiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen gegen 3-Aminotyrosin, p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin, p-Aminophenylalanin, ß-2-Thienylalanin oder o-Pluorphenylalanin resistenten Stamm fermentiert.

4· Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Phenylalanin-abhängigen Stamm von Corynebacterium glutamicuia fermentiert.

!5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Corynebacterium glutamicum (ATCC 21568), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21567), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21569), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21570), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21571), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21572), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21573), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21562), Corynebacterium glutamicum (ATCC 21564),Corynebacterium glutamicum (ATCC 21565),

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Corynebacterium giutamicum (ATCC 21566) und Corynebactcriura glutamicum (ATCC 21563) fermentiert.

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