DE2126128A1 - Medizinisches Testverfahren, Reagens und Additiv zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Pharmacia AB
Upsala / Schweden

ivleaizinisches Q?e st verfahren, Reagens und Additiv zur Durchführung des Verfahrens

Die vorliegende JBrfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Tests mit Proben nienschlisehen Ursprungs, bei welchem ein Antigen und ein gegen das Antigen gerichteter Antikörper in einer immunologischen Reaktion in vitro miteinander reagieren. Die Erfindung betrifft ferner ein Reagens und ein Additiv zur Durchführung des Verfahrens.

'Ilests der obigen Art sind allgemein bekannt und werden praktisch durcngeführt. Die Durchführung erfolgt beispielsweise anhand von Proben, die aus menschlichem Gewebe, Blut, Blutplasma oder Blutserum stammen. Beispiele für auf derartigen immunolo-

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gischen Reaktionen basierende Tests sind beispielsweise Tests zum Nachweis von Antikörpern im menschlichen Blut, welche Antikörper gegen bestimmte Allergene gerichtet sind, in Verbindung mit der Diagnose allergischer Zustände, der Nachweis von Gonadotropin beim Schwangerschaftstest und der Machweis •oder die Bestimmung anderer Proteine (unter die Bezeichnung "Proteine" fallen gemäß vorliegender Beschreibung auch Polypeptide) in menschlichen Körperflüssigkeiten, z.B. Serum oder Plasma. Dem Fachmann sind verschiedene Varianten dieser Tests bekannt. _tEs liegt auf der Hand, daß die oben erwähnten Tests in der Praxis von außerordentlicher Bedeutung sind, da sie zum nachweis und/oder zur Bestimmung von Substanzen verwendet werden können, die Antigene oder Antikörper sind, Solche Tests werden daher in der Medizin in großem Umfang durchgeführt. Bs wurde jedoch festgestellt, daß bei Durchfürirung von Tests der oben beschriebenen Art in zahlreichen Fällen Fehlanzeigen auftreten, und zwar sowohl negativer wie positiver Art. Beispielsweise wurden bei Agglutinations-Tests mit Serum von nicht-schwangeren Frauen in zahlreichen Fällen positive Ergebnisse ermittelt. Sogar männliche Serumproben ergaben gelegentlich bei diesen Schwangerschaftsstests ein positives Ergebnis.

Bei der Suche nach der Ursache dieser Fehlanzeigen wurde nun beobachtet, daß zahlreiche Personen einen bestimmten Typus von Antikörpern besitzen (die in der weiteren Beschreibung als "heterophile Antikörper" bezeichnet werden), welche gegen

T-Globulin tierischen Ursprungs gerichtet sind, und daß diese heterophilen Antikörper, falls bei einem der obigen Tests vorliegend, mit dem T'-Globulin tierischen Ursprungs im Testsystem reagieren können, wobei diese Reaktion zu den Fehlanzeigen führt. Es wurde nun gefunden, daö diese, die Fehlanzeigen verursachende Reaktion unterdrückt werden kann, indem man die immunologische Testreaktion in Gegenwart von

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^- Globulin tierischen Ursprungs durchführt, gegen welches menschliche heterophile Antikörper (die natürlicherweise in der Probe vorliegen) gerichtet sind, so daß diese hetero— philen Antikörper blockiert werden.

Beispiele für tierische ' tf'-Globuline sind ^-Globulin von Pferden, Schafen und Hindvieh wie z.B. Kühen.

Die vorliegende Erfindung besteht somit im wesentlichen darin, daß man zur Vermeidung von Fehlanzeigen als Ergebnis der Anwesenheit menschlicher heterophiler Antikörper während der Reaktion diese in Gegenwart von ^Globulin nicht-menschlichen Ursprungs, gegen welches die menschlichen heterophilen Antikörper, die für den Test selbst unerheblich sind, gerichtet sind, durchführt.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist somit ein Verfahren zur Durchführung von Tests an Proben menschlichen Ursprungs, bei welchem ein Antigen (I) und ein gegen das Antigen gerichteter Antikörper (II) in einer immunologischen Reaktion in vitro miteinander umgesetzt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Vermeidung von Fehlanzeigen als Ergebnis der Anwesenheit menschlicher heterophiler Antikörper (III) während der Reaktion diese in Gegenwart von ^-Globulin nichtmenschlichen Ursprungs, gegen welches die für den Test unerheblichen heterophilen Antikörper (III) gerichtet sind, durchführt.

Die Menge an tierischem ^T-GIobulin, die eingesetzt werden muli, um die Möglichkeit einer Fehlanzeige auszuschließen, läßt sich vom Fachmann leicht experimentell ermitteln.

Beispiele von Proben, die unter Anwendung des erfindungsgernäßen Verfahrens untersucht werden können, sind menschliches

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Gewebe, Blut, Blutplasma oder Blutserum. In den meisten Fällen enthalten die Proben Wasser, und die immunologische Reaktion wird vorzugsweise in vs/ässrigem Medium durchgeführt.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann entweder das Antigen oder der gegen das Antigen gerichtete Antikörper unlöslich gemacht werden. Dies kann erfolgen, indem man das Antigen oder den Antikörper durch Adsorption oder mittels kovalenter Bindungen mit Hilfe eines Vernetzungsmittels an einen festen Träger bindet. Als feste Träger eignen sich z.B. Polymere mit Hydroxyl- und/oder Aminogruppen, beispielsweise Mischpolymere aus Dextran und üpichlorhydrin oder Cellulose, die die Form eines runden Papierblättchens aufweisen können. Der Träger kann auch die Form sines Gehäuses Behälters aufweisen, und beispielsweise ein aus dem bindungsfähigen Material, z.B. einem Kunststoff, hergestelltes Rohr sein. Methoden zur derartigen Bindung von Antigenen oder Antikörpern sind in der britischen Patentschrift 1 223 281 und in der französischen Patentschrift 1 595 332 beschrieben.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform können entweder das Antigen oder der gegen das Antigen gerichtete Antikörper mit einem nachweisbaren Atom oder einer nachweisbaren Gruppe markiert sein. Durch die Markierung kann häufig die Empfindlichkeit des Tests gesteigert werden, ferner ergibt sich die Möglichkeit zur Bestimmung sehr geringer Mengen an Antigen oder Antikörpern. Beispiele für nachweisbare Atome oder Gruppen sind radioaktive Isotope, z.B. radioaktives Jod, sowie Gruppen mit einem radioaktiven Isotop. Die Markierung kann ferner durch farbbildende oder fluor4sa.erende Gruppen, z.B. durch €t*e eine Fluorescein enthaltende Gruppe_/ erfolgen.

Gemäß einer wichtigen Ausführungsform der Erfindung kann die "

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immunologische Reaktion in Verbindung mit einem Radio-immunolo gischen Test durchgeführt werden.

Sine weitere wertvolle Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Durchführung der immunologischen Reaktion' in Verbindung mit einem Agglutinationstest.

Sine weitere nützliche Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Durchführung der immunologischen Reaktion in Verbindung mit Tests auf Antikörper gegen Allergene. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren dann eingesetzt werden, wenn die immunologische Reaktion zur Bestimmung von Proteinen oder Peptiden in S Proben menschlichen Ursprungs dient.

bereits erwähnt, ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die immunologische Reaktion zur Schwangerschaftsbestimmung von besonderer Bedeutung. Die immunologische Reaktion kann in Verbindung mit Agglutinationstests durchgeführt werden, wobei die Tests auf der Immun-Reaktion zwischen Gonadotropin in der flüssigen Probe und Antikörpern gegen Gonadotropin beruht, wobei letztere an sehr kleine Teilchen gebunden sind.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ferner ein Reagens zur Verwendung im vorstehend beschriebenen Verfahren. Das Reagens enthält ein Antigen (I) tierischen Ursprungs, welches entweder aus tierischem ^Globulin besteht oder solches enthalt, wobei das Reagens dazu bestimmt ist, mit der zu untersuchenden Probe vereinigt zu werden und ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß es JT-Globulin nicht-menschlichem Ursprungs enthält, gegen welches die heterophilen menschlichen Antikörper, (III), weiche in der Probe vorliegen, gerichtet sind.

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Bine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Reagens zur Durchführung des vorstehenden Verfahrens, welches Antikörper (II) tierischen Ursprungs enthält, das zur Vereinigung mit der zu untersuchenden Probe bestimmt ist und dadurch gekennzeichnet ist, daß es ferner ίΓ-Globulin nicht-menschlichen Ursprungs enthält, gegen welches die in der Probe vorliegenden menschlichen heterophilen Antikörper (HIj gerichtet sind. Der im Reagens enthaltene Antikörper (II) kann gemäß einer Ausführungsform auch besonders gereinigt oder an einen festen Träger gebunden sein.

Gegenstand der .!Erfindung ist ferner ein zur Verwendung in vorstehendem Verfahren brauchbares Additiv. Dieses ist im "wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß es nicht-menschliches If-Globulin enthält, gegen welches, heterophile Antikörper (III) menschlichen Ursprungs, die in der Probe vorhanden sind, gerichtet sind. Das Additiv kann aus einer Lösung bestehen, die das nicht-menschliche ίΓ-Globulin enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise auf einen direkten Agglutinationstest zum Schwangerschaftsnachweis angewendet werden. Der Test kann als üblicher Schwangerschaftstest, basierend auf dem direkten Agglutinationsprinzip, durchgeführt werden, unter Verwendung von Polymerteilchen (z.B. Latexteilchen) welche mit Antikörpern (tierischen Ursprungs) überzogen sind, die gegen menschliches Chorion-Gonadotropin gerichtet sind. Für diesen Zweck werden die Teilchen in einer Reagenslösung suspendiert. i5in Tropfen der Suspension wird mit einem Tropfen menschlichen Serums oder Urins innerhalb eines vorgegebenen Bereichs auf einem festen Substrat, z.B. einer Glasplatte, in Berührung gebracht. Die Reagenslösung und Testflüssigkeit werden dann durch vorsichtiges Schütteln der Glasplatte während 2 bis 3 Minuten vermischt.

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Bei Durchführung des Tests mit menschlichem Serum erweisen sich etwa Λ0..0 der positiven Ergebnisse als falsch. Diese falschen Ergebnisse können nun gemäß vorliegender Erfindung vollständig eliminiert werden, indem man der Reagenslösung o,1 lag x^ro ml Rinder- & -Globulin oder r-'inderserum in solaher Menge'zugibt, daß das Serum in der Reagenslösung auf das 5°~ fache verdünnt wird.

Beispiel 1

Jnterdrückung falscher positiver Ergebnisse· bei der Bestimmung von gagen tierigches Allergen QCah-Epithel) gerichtetem Re a-

A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundenem Allergen.

Als ü-isgangsmaterial wurden feine Teilchen eines Mischpolymeren aus Dextran und üpichlorhydrin verwendet, wobei das Dextran dvirch Glycerin-Ätherbrücken vernetzt war ("Sephadex", Teilchengröße 1 bis 1o Mikron). Das Mischpolymer ist in Wasser unlöslich, jedoch quellbar, wobei die Substanz etwa 2,5 g Wasser pro Gramm. Trockengewicht absorbiert. Das Ausgangsmaterial wurde zunächst mit Bromcyan aktiviert (siehe Axen et al., Nature, Bd. 214 (1967) S. 15o2), wobei 2oo ml einer wässrigen, 5 g Bromcyan enthaltenden Lösung zu 5 g des Polymeren zugesetzt und der pH-Wert 2 Minuten lang unter Zutropfen von 1n-Natriumhydroxyd bei 1o,5 gehalten wurde. Dann wurden die Teilchen des aktivierten Mischpolymeren gewaschen. Ein handelsüblicher Allergen-iSxtrakt aus Rinder-Epithel wurde zu einer wässrigen Suspension der Teilchen zugegeben, wobei dieser Extrakt o,2 mg Allergen pro ml enthielt. Das Mischungsverhältnis betrug 1 ml Allergen-Extrakt pro I00 mg aktiviertes Polymer. Das Allergen

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reagierte sodann mit dem durch. Bromcyan aktivierten Mischpolymer, wobei man eine kovalente Bindung zwischen Allergen und Polymer erhie.lt. Anschließend wurden die Allergen-haltigen

Mischpolymerteilchen zentrifugiert und 2 χ mit 1o ml o,5-molarer Natriumbic arbonatlosung (pH etwa 8,2), 0,1-molarem Natriumacetat-Sssigsäure-Puffer(pH etwa 4), ο,Ι-molarem Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäure-Puffer (Tris-HCl) mit 1% Rinder serum-Albumin (pH etwa 7,2) gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in ο,Ι-molarem Tris-Puffer mit 1% Rinderserum-Albumin suspendiert.

B. Herstellung von Reagin-Ig

Von den Immunoglobulinen IgA, IgD, IgG- und igM im wesentliche^ freies Reagin—Ig wurde aus dem Serum eines iVlyeloma-Patienten mit hohem Gehalt an Reagin-Ig im Blut gewonnen. Das Reagin-Ig wurde aus dem Serum durch Salzfällung, Gelfiltration und Ionenaustausch-Chromatographie wie folgt isoliert: Proben von aufgetautem oder frisch gewonnenem Plasma eines Patienten mit jyjyelomatose wurden mit o,15-molarer Natriumchloridlösung auf einen Gehalt von etwa 15 mg pro ml bzgl. der M-Komponente (Reagin-Ig) verdünnt. Die Ausfällung mit wasserfreiem Natriumsulfat (18 g pro 1oo ml) erfolgte bei 25°C. Nach 1 Std. wurde der Niederschlag durch Zentrifagieren gesammelt (1o ooo χ g, 2o Minuten, 25°C). Das Sediment wurde gesammelt und mit Natriumsulfatlösung (18 g pro 1oo ml) gewaschen und dann in o,8 Volumenteilen o,1-molarem Natriumphosphatpuffer vom pH 7»5 gelöst. Dann wurde nochmals wie oben beschrieben ausgefällt. Nach der letzten Ausfällung wurde das Sediment in o,1-molarem Tris-HOl-Puffer von pH 8,ο (2o°G) gelöst und auf eine mit DJiiAB-Sephadex^^R^A-5o gefüllte Säule (3,2 χ 3o cm), welche mit dem gleichen Puffer getränkt war, aufgebracht. Die iJluierung erfolgte mit kontinuierlich von o,1-m nach 1-m ansteigendem Tris-HGl bei konstantem pH-v/ert von 8,ο bei 2o°C. Die Heagin-

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Ig enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert und auf eine mit Sephadex ^ G 15o gefüllte Säule (3 »2 χ 95 cm) aufgebracht, welche mit o,1-m Tris-HCl - o,2 m NaGl — o,oo2 m JJi¹DiDAlTa₂ (pH 7,7)_y enthaltend o,o2% Natriumazid, equilibriert war. Das Material wurde 3 x- durch die Säule geleitet (Kreis- ' lauf-Chr'omatographie). Die Reagin-Ig enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und durch Jltrafiltration (Visking-Rohr 8/81,3 cm) bei 4° C konzentriert.

Das so hergestellte Reagin-Ig war mit weniger als o,1% Protein oder anderen Immunoglobulinen (IgA, IgD, IgG und IgM) insgesamt verunreinigt. Dieses gereinigte Reagin-Ig ergab einen einzigen Peak bei der Elektrophorese bei pH 8,6 I » o,o5» der in die 3 - /*-Region wanderte. Untersuchungen mit der ultrazentrifuge ergaben eine einzige Grenzlinie_/und die Sedimentationskonstante S on w^{1 0ΘΓΘ0Ληθ}*^θ sich zu 8,2o S. Das Molekulargewicht von Reagin—Ig berechnete sich auf 2oo ooo + 5 ooo, ausgehend von einem spezifischen Volumen von o,713 cnr/g, bestimmt auf der Grundlage der Aminosäure- und Kohlehydratmensetzung. Die Diffusionsk

x 1o ' cm /sek. berechnet.

zusammensetzung. Die Diffusionskonstante Do_{n m}, wurde mit

O p £IU,W

Reduktionsreaktionen ergaben, daß Reagin—Ig aus zwei Arten von Polypeptidketten besteht, und damit anderen Serum—Immunoglobulinen ähnlich ist. Das Vorliegen von zwei leichten Polypeptidketten vom Molekulargewicht 22 6oo konnte sichergestellt werden. Das Molekulargewicht der schweren Polypeptidketten, der sogenannten J3-Ketten, einschließlich deren prosthetisehen Kohlehydratgruppen, wurde zu etwa 77 4oo berechnet, unter der Annahme eines molaren Verhältnisses von 1:1 zwischen schweren und leichten Polypeptidketten im ursprünglichen Reagin-Ig. Die Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung ist aus Tabelle 1 ersichtlich:

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Tabelle 1

Aminosäuren- und Kohlehydratzusammensetzung von Eeagin-Ig

Aminosäure Aminosaurerest

• g/1 oo g Protein

Tryptophan 3»67

Lysin 4,2o

Histidin , 2,16

Amid-N 1,34

Arginin 5,63

Asparaginsäure 6,73

Threonin 9,o1

Serin 8,52

Glut aminsäure 8,93

Prolin 5,24

Glycin 3,13

Alanin 3,92

Cystein 2,15

Valin 5,59

Methionin 1,17

Isoleucin 2,29

Leucin 6,o8

Tyrosin 4,63

Phenylalanin 3,91

88,29

Kohlehydrat Kohlehydratrest, g/1oo g Protein

N-Acetyl-glucosamin 4,6o

Hexose (Galactose + Mannose) 5»34

L-Fucose o,51

N-Acetyl-neuraminsäure 1,26

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G. Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-Ig

Ein Gemisch, aus 2 mg B-Ketten in o,5 ml o,15-molarer Natriumciiloridlösung und o,5 ml Freund¹ s-Hilfsmittel (Freund-Hilfsmittel^ wurde zur Intensivierung der Antikörperbildung verwendet·, siehe z.B. Cabat und Mayers: Experimental Immunochemistry 1961) wurde Schafen intramuskulär injiziert. Die Immunisierung wurde in Abständen von 3 Wochen wiederholt, wobei insgesamt 5 Injektionen verabreicht wurden. Bekanntlich wird die Bildung von Antikörpern durch wiederholte Injektion der Antigene gesteigert. Nach 14 Tagen wurden die Schafe entblutet und das Antiserum wurde aus dem Blut gewonnen, indem man diesem koagulierte und den geronnenen Anteil entfernte β

Das Antiserum wurde durch Adsorption während 1 Std. bei 37 G und 16 Stunden bei 4° G spezifisch gemacht, indem 1 Teil normales menschliches Serum zu 1 Teil Antiserum zugesetzt wurde. Nach dem Zentrifugieren wurde das Antiserum durch Immuno-jSlektrophorese gegen normales menschliches Serum und durch Ouchterlony-Geldiffusionsanalyse gegen reines Immunoglobulin A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteinen getestet, wobei es sich als spezifisch gegen Ε-Ketten und Reagin-Ig erwies. Das Antiserom wurde als Antikörper im Bestimmungsverfahren eingesetzt.

B. Herstellung von markiertem Reagin-Ig

Nach der Methode von Hunter und Greenwood, Nature 194 (1962), S. 495 wurde Reagin-Ig mit ^²^I markiert. Die Markierung kann auch wie folgt vorgenommen werden: Jod-125 ohne Träger wurde verwendet, und zwar in Form von Natriumiodid, in o,1-molarer

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Natriimhydroxydlösung gelöst, frei von Reduktionsmitteln.

Nach dem Verfahren von J.L. Izzo, W.F. Bale, M.J. Izzo and A. Roncone* J. Biol. Chein. 239 Nr. 11 (1964) 3742 warde Jodmonochlorid hergestellt, and dessen Jodgehalt warde darch Redaktion von sämtlichem Jod mit Arsentrioxyd zam Jodid and anschließende Titration mit o,1-molarer Silbernitratlösang bestimmt. Die Jodmonochlorid-G-randlösang enthielt 2,54 mg Jod pro ml in o,o2-m KGl, 2,o-m NaGl and 1,o-m HGl, sie ist bei Raamtemperatur mindestens 19 Monate lang beständig. Vor der Verwendung wird diese Grundlösung aaf die erforderliche Konzentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wird eine HGl-NaGl-Lösung zubereitet, deren Konzentration für jeden Versach so eingestellt wird, daß sie oberhalb den «liniuialkonzentrationen von Chlorwasserstoff and Natriumchlorid, mit denen Jo dmo no Chlorid beständig ist, liegt (R. V/. Helmkamp, M. A. Gontreras and W.F. Bale: Int. J. Appl. Radiat. Isotopes, 18 (1967) 737).

Die Jodierung erfolgt nach der Helmkamp¹sehen Modifizierung des Verfahrens von McFairlane (A.S. McFairlane, Nature, 182 (1958) 53) mit zusätzlichen Modifizierungen (J.L. Izzo, W.F. Bale, M.J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Ghem., 239, Nr. 11 (1964) 3743, W.F. Bale, R.W. Helmkamp, T.P. Davis, M.J. Izzo, R.L. Gooland, M.A. Contreras und J.L. Spar, Proc. Soc. Bxp. Med., 122 (1966) 4o7 und R.Vi. Helmkamp, M.A. Gontreras und W.F. Bale, int. J. Appl. Radiat. Isotopes, 18 (1967) 737)· 1oo/Ug Reagin-Ig wurden mit einem Molverhältnis von Jodmonochlorid zu Reagin-Ig von 2:1 und von Jodmonochlorid zu

-^I von 1:1 markiert. Folgende Lösungen wurden verwendet:

Lösung I: Reagin-Ig wird in o,2-molarem l'ris-HG 1-Puff er mit einem pH-Wert 8 auf eine Konzentration von 11,17 mg pro ml gelöst. Das Präparat enthielt 3v<> Reagin-Ig-Aggregat und o,5/o IgG.

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Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die Jodmonochlorid-Grundlösung wurde hergestellt durch Lösen von 2,92 g Natriumchlorid in 12,5 ml 2,o-molarer HGl und 87,5 ml destillierten Wassers.

Lösung III: Die endgültige Jodmonochloridlösung wurde hergestellt durch Verdünnen von 1oo ,\x 3
lösung mit 53?55 Jnl &er Lösung II.

stellt durch Verdünnen von 1oo ,u 1 der Jodmonochlorid-Grund-

Lösung IV: 17, 9/U 1 des Radiojodids (3,ο mGi) wurden zu 45/U der Lösung III zugegeben und vor Verwendung in einem Eisbad aufbewahrt. Sämtliche Lösungen wurden kalt gehalten und die Jodierungsreaktion erfolgte bei Bistemperatur. Die Reagentien wurden in folgender Reihenfolge eingesetzt: Zu 2oo ,xx 1 Borat-Gar bonat-Puff er (o,4 m, pH 9,1) und 8,95/U 1 Lösung I (1oo,u g Reagin-Ig) in einem kleinen G-lasrährchen wuäen 5°/^a 1 Lösung IV zugegeben und das Gemisch wurde kräftig gerührt. Wach 6o Sekunden wurden 2> ,\x. 1 o,1-m NapSoO^, 5o/U 1 2% KI und 2oo /U 1 *j-/o menschliches Serum-Albumin-Blau (HSA-Blau) zugesetzt. Das HSA-Blau wa? nach der Methode von Melani(l.Melani, K.M. Bartelt, R. Conrads, E.F. Pfeiffer, Z. Klin Chem., 4 Jahrg. 1966, Art. 4).zubereitet worden. Es wurde zugegeben zur Verminderung einer Zersetzung durch Strahlung und Adsorption von Reagin-Ig an den Glaswänden. Mit Jod-125 aocLiertes Reagin-Ig kann unter Verwendung von vernetztem Dextran (Sephadex, eingetragenes Warenzeichen) oder durch Agaros-Gelfiltration (Sepharose, eingetragenes Warenzeichen) oder mit Ionenaustauscher (z.B. Dowex: oder Amberlite, eingetragene Warenzeichen) gereinigt werden. Aus der Säule wurden Fraktionen bei etwa +4⁰C in o,1-m Tris-HCl-Puffer, pH 7,72, mit 5% menschlichem Serum-Albumin, gewonnen· Die markiertes Reagin-Ig enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in eingefrorenem Zustand gelagert. Nach dieser Methode werden 83% der gesamten Jodmenge an das

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Reagin-Ig gebunden. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom Jod-125 und etwa 1 Atom Jod-127 pro Molekül (Molekulargewicht 2oo ooo) und besaß eine spezifische Aktivität von ca. 12 mOi/mgo

E. Bestimmungsverfahren

Die Analysen wurden in Glas- oder Kunststoffrohren von 5ox1o mm durchgeführt„

1. o,5 ml einer'Teilchensuspension mit chemisch gebundenem Allergen (siehe Absatz A) wurden in jeweils 2 Teströhrchen eingeführt. Die Suspension enthielt 1 mg Teilchen pro ml.

2. o,o5 il des zu untersuchenden Serums wurden einem der beiden Röhrchen zugesetzt.

3. o,o5 ml eines Vergleichsserums nicht-allergischer Herkunft wurden in das zweite Röhrchen zugegeben,

4. Der Inhalt der Röhrchen wurde 2o Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Gefäße langsam auf vertikaler Ebene rotiert wurden.

5· Die Teilchen wurden bei 3 ooo Umdrehungen pro Minute 1 Minute lang zentrifugiert, dann wurde die überstehende Flüssigkeit .entfernt»

6. Die Teilchen wurden 3 x mit o,1-m Tris-Puffer (pH 7A) mit 1 Gewichtsprozent Rinderserumalbumin gewaschen, die Suspen^ sion wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Waschen abgesaugt. Es wurde sichergestellt, daß beim Absaugen keine Feststoffteilchen mitgerissen wurden.

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7. o,1 ml des nach Absatz G hergestellten Antiserums (Verdünnung 1:5oo) wurden zu jedem Röhrchen zugegeben.

8. Der Inhalt der Röhrchen wurde wie in Stufe 4 inkubiert.

9. Dann wurde wie in Stufe 5 zentrifugiert.

10. Danach wurde wie gemäß Stufe 6 gewaschen.

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11. o,1 ml einer Lösung enthaltend ^I-Reagin (Herstellung

siehe Absatz D) mit einer Radioaktivität von 5o ooo Ausschlägen pro Minute wurden in die Röhrchen eingefüllt.

12. Dann wurde wie in Stufe 4 inkubiert.

13. Danach wurden die Teilchen wie in Stufe 5 zentrifugiert.

14. Danach erfolgte eine Waschstufe gemäße Stufe 6.

15· In einem Scintillationsde.tektor wurde die e"-Strahlung bestimmt.

Zur Auswertung wurde die Intensität der Strahlung des ersten Röhrchens verglichen mit der Intensität der Strahlung des zweiten Röhrchens,welche das Vergleichsserum eines nicht-allergischen Patienten enthielt.

Als Alternative kann auch nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen überführt werden, worauf man die ^-Strahlung

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von freiem ^I-Reagin in der Losung bestimmen kann.

Für quantitative Bestimmungen können o,o5 ml des Testserums

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- 1ÄT - .

in verschiedenen Verdünnungen in Stufe/in die entsprechende Anzahl von Teströhrchen zugegeben werden. Gleichzeitig werden Vergleichspro.ben mit Standard-Serum hergestellt. Die Aktivität kann dann im Verhältnis zu der eines Standard-Serums ausgedrückt werden.

Bei Anwesenheit von gegen das an Teilchen gebundene Allergen (Rinder-Epithel-Allergen) gerichtetem Reagin-Ig in der Serumprobe des allergischen Patienten ist die von diesem Röhrchen abgegebene Strahlung hoch, während die Strahlung des das Vergleichsserum der nicht-allergischen Probe enthaltenden Röhrchens sehr niedrig war. Es wurde jedoch beobachtet, daß bei Verwendung eines handelsüblichen Rinder-Epithel-Allergenextrakts mit dem das Vergleichsserum enthaltenden Röhrchen ein hohes Ausmaß an Strahlung erhalten wurde. Wurde das Verfahren unter Zusatz von 0,05 ml Rinderserum, auf 1:5o in o,15-molarer Natriumchloridlösung verdünnt, zu den Röhrchen in Stufe 2 und 3 wiederholt, so wurde bei dem das Serum des allergischen Patienten enthaltenden Röhrchens keine Veränderung der Strahlung beobachtet, jedoch ergab das Röhrchen mit dem Vergleichsserum der nicht-allergischen Person eine sehr niedrige Strahlung.

Beispiel 2

Unterdrückung falscher positive Ergebnisse bei der Bestimmung von gegen tierisches Allergen (Pferde-Epithel) gerichteteen Reagin-Ig.

A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundem Allergen ^einteiliges, durch Glycerin-At herb rücken vemetztes Dextran

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(Sephadex G 25, superjün), welches durch Isothiocyanat-phenoxyhydroxypropylgruppen substituiert war (R. Axen und J. Porath, Acta Chem. Scan. 18 (1964-), S. 2193) wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Zu einer Suspension von 1oo mg der leuchen in einer wässrigen Natriumbicarbonatlösung wurde 1 ml der Allergenlö'sung (handelsüblicher All er gen extrakt) mit etwa der· gleichen Konzentration wie in Beispiel 1 zugegeben. Das Gemisch wurde dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei es ständig langsam in vertikaler Ebene rotiert wurde. Die Teilchen wurden dann abzentrifugiert und 2 χ mit «jeweils 0,5-molarer Natriumbicarbonatlösung, o,1-molarem Acetatpuffer und 0,1-molarem Iris-Puffer mit 1% Rinder-Serum-Alumin gewaschen. Die Teilchen wurden darauf homogenisiert und in a,1-molarem Tris—Puffer mit 1% Rinder-Serum-Albumin suspendiert.

B. Isolierung von !Fragmenten Reagin-Ig-haltiger, klassenspezifischer Determinanten (sogenannten Fc-Fragmenten).

1oo mg Reagin-Ig (Herstellung siehe Beispiel 1B) in o,1-molarem Natriumphosphat-Puffer (pH 7,o) mit 1-m Cystein wurden 4- Std. lang mit 1 mg Pepsin bei 37°0 inkubiert, worauf die.Reaktion durch Zusatz einer Jodacetamidlösung in einer Endkonzentration von o,o5-m abgebrochen wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Gelfiltration unter Verwendung eines Mischpolymeren aus Dextran und Epichlorhydrin (Sephadex G 15o) fraktioniert, wobei die Wasserrückgewinnung 15 g pro Gramm Feststoff betrug. Die Miierung der Gelschicht erfolgte mit o,1-m Tris-HOl, o,2-m NaCl-Puffer (pH 7,7)· Die Fc-Fragmente enthaltenden Fraktionen wurden analytisch ermittelt und für Immunisierungszwecke gesammelt.

0. Herstellung von Antikörpern gegen das Fc-Fragment von Reagin-Ig.

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Die Herstellung des Antiserums erfolgte analog dem Verfahren von Beispiel 10» Gegen das Fc-Fragment gerichtete Antikörper wurden aus diesem Antiserum wie folgt isoliert: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-Ig wurden mit 34- ml einer Lösung vermischt, welche etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt (isoliert aus Antiserum gegen Fc-Sragmente durch Ionenaustausch-chromatographie). Die dabei erhaltene Suspension wurde bei pH 7 und 4°C 2 Stunden lang aktiviert, dann wurde sie zentrifugiert (2o ooo χ g, 2o Minuten, +1o°C). Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit o,15 m NaOl - 8-m Harnstoff, pH 6-7, gewaschen, dann wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. Der Waschvorgang wurde solange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit proteinfrei war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9 ml o,1-m Glycin-HCl-Puffer (pH 3»1) zugegeben, dann wurde unter Rühren 4o Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die gesamte Lösung wurde sodann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 12oo ml o,o1-m Tris-HOl o,1-m NaGl (pH 7»Ό ^o Stunden lang bei 4-⁰C d-ialysiert. Diese Lösung enthielt Antikörper in einer Menge von 1 mg pro ml, die spezifisch sind gegen das Fc-Fragment von Eeagin-Ig, und somit auch gegen das gesamte Reagin-lg. Dieses Material reicht für einige 1o Millionen Bestimmungen aus·

D. Markierung der Antikörper.

Dieses "Verfahren wurde wie in Beispiel 1 für Reagin-Ig oder gemäß Beispiel 5 für Antikörper gegen Reagin-Ig beschrieben durchgeführt.

E. Bestimmungsverfahren.

1. o,5 ml einer Teilchensuspension mit chemisch gebundenem

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.Pferdeepithel-Allergen, Herstellung siehe Absatz A₁ wurden in jeweils 2 Teströhrchen eingefüllt, die Suspension enthielt jeweils 1 mg Teilchen pro ml.

2. o,o5 ml des zu untersuchenden Serums wurden in eines der Röhrchen eingegeben.

3. o,o5 ml eines Vergleichsserums nicht-allagischer Herkunft wurden in das andere Röhrchen eingefüllt.

4. Der Inhalt der Röhrchen wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Röhrchen langsam in vertikaler Ebene rotiert wurden.

5. Dann wurde bei 3 ooo Umdrehungen pro Blinute 1 Minute lang zentrifugiert, danach wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt.

6. Die Teilchen wurden 3 χ mit o,1-m Tris-Puffer pH 7,4» 1% Rinderserum-Albumin gewaschen. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach jedem Zentrifugieren abgesaugt. Dabei wurde sichergestellt, daß keine festen Teilchen beim Absaugen mitgerissen wurden»

?. o,1 ml der gemäß Absatz C erhaltenen Lösung mit Antikörpern gegen die Pc-Fraktion von Reagin-Ig, mit <Jod-125 markiert, wurden in sämtliche Röhrchen gegeben.

8. Dann wurde 15 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Röhrchen langsam in vertikaler Ebene rotiert wurden.

9. Dann wurde 1 Minute lang bei 3 ooo Umdrehungen pro Minute

V .ifugiert, darauf wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt

1098G0/ 12 4 8

- Iß -

10 2T26128

Ιο. Die Teilchen wurden 3 x mit o,1-m Tris-Puffer (pH 7 mit 1 Gewichtsprozent Rinderserum-Albumin gewaschen, wobei nach jedem Waschvorgang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt wurde. Dabei wurde sichergestellt, daß beim Absaugen keine festen Teilchen mitgerissen wurden.

11. Im Scintillations-Detektor wurde die ^T-Strahlung gemessen.

Die endgültige Bestimmung erfolgte dann durch Vergleich der Strahlungsintensität zwischen dem Röhrchen mit der zu untersuchenden Probe und dem Röhrchen mit Vergleichsserum.

Gemäß einer Variante kann man nach dem Zentrifugieren gemäß Stufe 8 ein bestimmtes Volumen der überstehenden !Flüssigkeit in Zählröhrchen überführen, worauf Tdie ^T-Strahlung in der Lösung messen kann.

Für quantitative Bestimmungen werden o,o5 ml des Testserums in verschiedenen Verdünnungen in Stufe 2 einer Vielzahl von Teströhrchen zugesetzt. Gleichzeitig werden die Vergleichsröhrchen mit Standardserum bereitgestellt. Die Ergebnisse werden durch Aktivitätsvergleich erhalten.

Ist in der Serumprobe des allergischen Patienten gegen das gefundene Allergen gerichtetes Reagin-Ig vorhanden, so erhält man eine starke Strahlung, während das Röhrchen mit Serum nicht-allergischer Herkunft eine sehr schwache Strahlung ergibt Es wurde jedoch gefunden, daß bei Verwendung von handelsüblichem Pferdeepithel-Allergenextrakt auch das Röhrchen mit dem Vergleichsserum eine starke Strahlung liefert. Wiederholt man das Verfahren unter Zusatz von o,o5 ml einer Lösung zu jedem der Röhrchen in Stufe 2 und 3, die o,1 mg pro ml ^-Globulin

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von Schafen oder Pferden in o,15-molarer Natriumchloridlösung enthält, so verändert sich die Strahlung des RöhrGhens mit dem Serum des allergischen Patienten nicht, während andererseits das Röhrchen mit dem Vergleichsserum nur eine sehr geringe Strahlung ergibt.

Beispiel 3

Markierung von Antikörpern gegen Reagin-Ig Antikörper gegen Reagin-Ig

Diese wurden hergestellt durch Immunisierung von Schafen mit Reagin-Ig gemäß der Vorschrift von Beispiel 2G.

Jod-125 ohne Träger wurde in Form von Natriumiodid in o,1-molarer, von Reduktionsmitteln freier Natriumhydroxydlösung verwendet.

Jodmonochlorid wurde nach der Methode von J.L. Izzo,- \tf.S¹, Bale, M.J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Chem. 239, Nr. 11 (1964) 374-2 hergestellt, der Jodgehalt wurde durch Reduktion des gesamten Jods zum Jodid mit Arsentrioxyd und anschließende 'J'itration mit o,1-molarer Silbernitratlösung bestimmt. Die Jodmonochlorid-Grundlösung enthielt 2,54- nig Jod pro ml in o,o2-m KCl, 2,o-m WaGl und 1,o-m HGl, sie ist bei Raumtemperatur mindestens 18 Monate lang beständig» Vor der Verwendung wurde die Jodmonochlorid-Grundlösung auf die erforderliche κ.oxizentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde eine Gin Lorwasserstoff-Natriumchloridlösung zubereitet, deren Konzentration von Fall zu Fall wie in Beispiel 1 beschrieben eingesbellt wurde.

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1ooyu g Antikörper gegen Reagin-Ig wurden mit einem Molverhältnis von Jodmonochlorid zu Antikörpern von 2:1 und von Jodmonochlorid zu Jod-125 von 1:1 markiert (bezüglich der Vorschriften BeL siehe die in Beispiel 1 angeführte Literatur). Folgende Lösungen wurden verwendet:

Lösung I: Antikörper gegen Reagin-Ig wurden in o,2-m Tris-HCl-Puffer, pH 8, auf eine Konzentration von 1o,o mg pro ml gelöst.

Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die Jodmonochlorid-Grundlösung wurde durch Lösen von 5 j84a Natriumchlor id in 35 ml 2,o m-Salzsäure und 65 ml destillierten Wassers zubereitet.

Lösung III: Die endgültige Jodmonochloridlösung wurde durch Verdünnen von I00/U 1 der Jodmonochlorid-Grundlösuiig mit 2o,2 ml der Lösung II hergestellt»

Lösung IV: 44,29/U 1 des Radiojodids (4,ο mCi) wurden zu 25/U der Lösung III zugegeben und vor Verwendung in einem Eisbad stehen gelassen. Sämtliche Lösungen wurden kalt gehalten und die Jodierungsreaktion erfolgte bei Sistemperatur. Die Reagentien wurden in folgender Reihenfolge eingesetzt: In ein kleines Glasröhrchen wurden 2oo/u 1 Borat-Carbonat-Puffer (o,4 m, pH 9,1) und IO/U 1 der Lösung 1 (I00/U g Antikörper gegen Reagin-Ig) eingefüllt, und dazu wurden 5°/U 1 der Lösung IV zugesetzt, dann wurde das Gemisch sofort kräftig bewegt. Nach 60 Sekunden wurden 2o/u 1 o,1-m Έ^^^®?,* 5o/U 1 2% KI und 2oO/U 1 5%iges menschliches Serum-Albumin-Blau zugesetzt. Das HSA-Blau war nach der Methode von Melani (F.Melani, K,H. Bartelt, R. Conrads, B.F. Pfeiffer, Z. klin. Chem. , 4. Jahrpr. 1966, Art. 4) hergestellt worden. Sein Zusatz erfolgte zur Verminderung von Zerstörung durch Strahlung und Adsorption von

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Antikörpern an den Glaswänden. Das Präparat kann durch Gelfiltration (Agarosegel) an vernetztem Dextran (Sephadex oder Sepharose, eingetragene Warenzeichen) oder mit Ionenaustauschern (Dowex oder Amberlite, eingetragene Warenzeichen) gereinigt werden. Aus der Säule wurden Fraktionen bei etwa 4⁰O in Oji-m.Tris-HCl-Puffer.pH. 7»72, enthaltend 5 % HCA gewonnen. Die markierte Antikörper gegen Reagin-Ig enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in gefrorenem Zustand aufbewahrt.

Nach dieser Methode werden 81,3% der gesamten Jodmenge an die Antikörper gebunden. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom Jod-125 und etwa 1 Atom Jod-127 pro Molekül (Molekulargewicht 15o ooo) und wies eine spezifische Aktivität von etwa 16 mCi/mg auf.

Beispiel 4

Das "Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde als Polymer feinkörnige mikrokristalline Cellulose verwendet.

Beispiel 5

Unterdrückung falscher positiver Ergebnisse bei Schwangerschaftstests.

Der verwendete Test basierte auf der Agglutination von Latexteilchen, welche in einem Lösungsmittel suspendiert und mit gegen menschliches Choriongonadotropin (HCG) gerichtetenAntikörper nicht-menschlichen Ursprungs überzogen waren. Die Suspension wurde mit menschlichem Serum auf einer Glasplatte in Berünrung gebracht, und bei hohen HGG-Werten des Serums erhielt

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man auf der Platte ein körniges Agglutinat. Diese Form läßt sich leicht von der gleichmäßigen Suspension unterscheiden, die man erhält, wenn keine Agglutinierung erfolgt.

Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt: Ein Tropfen Lösungsmittel (o,9 % WaGl, o,o5-m Phosphatpuffer, pH 7,4-, o,o5 % NaN₇,) wurde auf eine Glasplatte getropft, dann wurde ein Tropfen menschliches Serum zugegeben. Serumprobe und Lösungsmittel wurden gut vermischt. Sodann wurde 1 Tropfen einer Suspension von Latexteilchen, an welche HCG-Antikörper von Schafen gebunden waren, im obigen Lösungsmittel zugesetzt, dann wurde gut mit Serum und Lösungsmittel gemischt, die Glasplatte wurde 2 Minuten lang leicht geschüttelt.

Bei Anwesenheit von HOG in höheren Konzentrationen wurden die Latexteilchen agglutiniert.

Bei der Untersuchung zahlreicher Serumproben von Frauen, die mit Sicherheit nicht schwanger waren, sowie von Serumproben von Männern, ergaben mehrere Proben einen falschen positiven Nachweis. Um diese Fehlergebnisse auszuschalten, wurde folgender Test durchgeführt:

1 Tropfen Lösungsmittel (siehe oben), welches zusätzlich o,1 mg pro ml Rinder- T-Globulin enthielt, wurde auf eine Glasplatte gegeben, dann wurde 1 Tropfen menschlichen Serums zugesetzt. Serum und Lösungsmittel wurden gemischt. Dann erfolgte Zusatz von 1 Tropfen einer Suspension der Latexteilchen mit gebundenen HCG-Antikörpern von Schafen in o,9% NaCl, o,o5-m Phosphatpuffer, pH 7,4, 0,05% NaN;,, dann wurde gut gemischt. Die Glasplatte wurde 2 Minuten lang mäßig geschüttelt. In allen Fallen, in denen vorher falsche positive Ergebnisse erzielt worden waren, blieb der Nachweis nun negativ. In keinem Fall wurde durch den Zusatz des Rinder- T -Globulins der richtip^erweise positive Nachweis gestört.

10 9 8 ;.: il / 1 2 U 8

Beispiel 6 Bestimmung von Ιτηττηιηοglobulin E (IgE) in Serum

A. Herstellung von Antikörpern gegen Immunoglobulin B

Schafen wurde intramuskulär ein Gemisch aus ο,5 mg IgE (hergestellt aus Serum eines Patienten mit IgB-Myeloma) in o,2 ml o,15m-Natriumchloridlösung und o,8 ml Freund's-Hilfsmittel injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14- Tagen und dann 1 χ wöchentlich 3 Wochen lang wiederholt. Nach Ablauf von 1o Tagen danach wurden die Tiere entblutet und das Antiserum wurde gewonnen, indem man das Blut koagulierte und den Blutkuchen entfernte.

Das Antiserum wurde durch Adsorption mit sogenannten leichten Polypeptidketten aus Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteinen währen«
macht.

während 1 Stunde bei 37°O und 16 Stunden bei 4-°0 spezifisch ge-

Die Antikörper-Fraktion wurde aus dem Antiserum durch Behandeln mit einer gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung ausgefällt, wobei 2,5 ml der Lösung pro 5 ml Serum zugesetzt wurden·

Der Hiedersahlag wurde abzentrifugiert, dann in Wasser gelöst, worauf die Ausfällung mit Ammoniumsulfatlösung 2 χ wiederholt wurde. Nach der dritten Ausfällung wurde der Niederschlag in 5 ml wässriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, worauf Dialyse gegen o,1 m-Natriumbicarbonatlösung erfolgte.

B. Herstellung von Teilchen mit kovalent gebundenen Antikörpern. 1o g eines Mischpolymeren, hergestellt durch Umsetzung von Dextra:

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mit Epichlorhydrin (Sephadex G-25 superfein) wurden unter Rühren 3 Minuten lang in 2oo ml einer BromEyanlösung gequollen, die 1o g Bromcyan pro 1oo ml Wasser enthielt. Dann wurde eine 5m-Natriumhydroxydlösung unter Rühren bis zur Erreichung eines pH-Werts von 1o,7 zugesetzt» Dieser pH-Wert wurde 8 Minuten lang konstant gehalten, die' Temperatur wurde während des gesamten Verfahrens bei 2o°C gehalten. Das Gemisch wurde dann auf Glasfilter übertragen und sorgfältig mit Wasser neutral gewaschen. Die abgetrennten Teilchen wurden durch Waschen mit Aceton geschrumpft, dann sorgfältig getrocknet, worauf sie gelagert werden konnten, beispielsweise bei -2o°C. 5 g der derart mit Bromcyan aktivierten Teilchen wurden in 3o ml wässriger o,1~m-Natriumbicarbonatlösung gequollen. Unter Bewegung des Gemische wurden dann 5 ml der dialysierten Antikörperlösung gemäß Absatz A zugetropft. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei 2o°C gerührt, dann filtriert, der Filterrückstand wurde mit o,5 m-Natriumbicarbonatlösung gewaschen, um nicht gebundenes Material zu entfernen. Das Produkt kann dann vorsichtig getrocknet werden, z.B. durch Lyophilisierung.

0. Herstellung von markiertem Immunoglobulin E.

Immunoglobulin E wurde mit Jod-125 wie folgt markiert:

125
2 mC I in Form von Natriumiodid wurde mit Chloramin T in Gegenwart von 2o ,u g IgE nach der Methode von Hunter und Greenwood (s. Nature/London, Bd. 194 (1962*), S. 495) oxydiert. Nach der Markierung wurde Natriumdithionit zugesetzt, um die restliche Jodmenge in lösliches Jodid zu überführen. Das mit Jod 125 markierte IgE wurde von niedermolekularen Produkten durch Gelfiltration an einem Mischpolymer aus Dextran und Epichlorhydrin (Sephadex G 15o) abgetrennt. Es wies eine spezifische Aktivität von 2o bis 3o mO pro mg auf. Ein Milliliter der markierten'Proteinfraktion wurde in ein kleines Gefäß überführt,

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Α.?

welches 1/2 ml einer Lösung von Rinder-Plasma-Albumin (5o mg pro ml) enthielt. Das markierte IgB wurde in der Kälte aufbewahrt und vor Verwendung verdünnt.

D. Bestimmung

Die Analysen werden zweckmäßig in Glas- oder Kunststoffröhrchen von 5o x 1o mm ausgeführt.

1. 1 ml einer Suspension von Polymerteilchen (z.B. 1 mg pro ml), an welche Antikörper gebunden sind, wird in jedes der Röhrehen eingefüllt.

2. o,25 ml der Serumprobe in verschiedenen Verdünnungen werden in die einzelnen Röhrchen eingefüllt.

5. o,25 ml einer Standard-Lösung mit verschiedenen Konzentrationen an IgE₁ z.B. I000, 5oo, 25o, I00, 5o, 15» 12,5 und 6,1 ng/ml und O ng/ml werden in die einzelnen Röhrchen zugegeben.

4. Die Inkubation erfolgt während 2o Stunden bei Raumtemperatur, wobei die Röhrchen langsam rotiert werden.

125

5. o,1 ml der "X-IgE (ca. 15 Nanogramm pr. ml) enthaltenden

Lösung werden in die einzelnen Röhrchen eingefüllt.

6. Dann wird wie gemäß 4, jedoch nur 4 Stunden lang, inkubiert.

7. Es wird mit 3000 Umdrehungen pro Minute 5 Minuten lang ζ entrifugiert.

8. Dann werden die Teilchen 2 χ mit einer o,9%igen wässrigen Nat^-ruinchloridlösung gewaschen. Wach der letzten Entfernung

1 O 9 Q Γ» ΰ / m 8

der überstehenden Flüssigkeit durch Absaugen werden die Röhrchen in Zählrohre zur Bestimmung der iT-Strahlung überführt.

9« Die Zählrate von standardisierten Röhrchen während einer bestimmten Zeit wird auf linear-logaritmisches Papier gegen die Dosis aufgetragen, wobei man-aus dem Diagramm die Menge an IgB in unbekannten Proben berechnen kann.

Als Alternative kann nach dem Zentrifugieren gemäß ötufe 7 ein Milliliter der überstehenden Flüssigkeit in ein Zählröhrchen überführt werden, worauf die ^-Strahlung des markierten IgB bestimmt werden kann. Die Zählwerte dieser Standardröhrchen können ebenso wie oben beschrieben zur Herstellung einer vSS'wendet werden.

10 0 8 r; j /1 ? u 8

Claims (17)

1. Pat entansprüche

   1 · Verfahren zur Durchführung von Tests an Proben menschlichen Ursprungs, bei welchen ein Antigen (I) und ein gegen das Antigen gerichteter Antikörper (II) in einer immunologischen Beaktion in vitro umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Vermeidung von Fehlanzeigen als Ergebnis der Anwesenheit menschlicher heterophiler Antikörper (III) während der Reaktion diese in Gegenwart eines ff-Grlobulins nichtmenschlichen Ursprungs, gegen welches die für den Test unerheblichen heterophilen Antikörper (III) gerichtet sind, durchführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe menschlichem Gewebe, Blut, Blutplasma oder Blutserum entstammt*
3. 3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen (I) oder der gegen das Antigen gerichtete Antikörper (II) unlöslich gemacht worden ist.
4. 4, Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Antigen (I) oder Antikörper (II) durch ein^nachweisbares Atom oder eine nachweisbare Gruppe markiert sind.
5. 5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Atom oder die Gruppe ein radioaktives Isotop oder eine ein radioaktives Isotop enthaltende Gruppe ist,
6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das nachweisbare Atom oder die Gruppe farbstoffbildend od«r fluoreszierend ist. ' ~ ' '■ "*

   109*60/1248

   - 3ο -
7. 7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge- kennzeichnet, daß die immunologische Reaktion in Verbindung mit einem radioimmunologischen Test durchgeführt wird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktion in Verbindung mit einem Agglutinationstest durchgeführt wird.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß.die immunologische Reaktion in Verbindung mit Tests auf JSSfi^ßLlergene gerichtete Antikörper durchgeführt wird»
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologisch© Reaktion in Tests zur Bestimmung von Proteinen oder ^eptiden durchgeführt wird.
11. 11· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktion in Schwangerschaftstests durchgeführt wird·
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktion in Verbindung mit Schwangerschaftstests durchgeführt wird, die auf der Iamunoreaktion zwischen Gonadotropin in. der zu untersuchenden l>robe und Antikörpern gegen Gonadotropin, welch· an kleine Teilchen gebunden sind, basiert*

    «en»
13. 13· Real**·» zur Verwendung im Verfahren gemäß einem der Anspruch· 1 bis 12, enthaltend ein Antigen (I) tierischen Ursprungs» welches aus tierischem IT-Globulin besteht oder dieses enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner fr-Globulin nicht tierischen Ursprungs enthält, gegen welches in der zu untersuchenden Probe vorhandene menschliche heterophil· Antikörper (III) gericht»t sind.

    109850/1248

    - an -
14. 14. Reagens zur -Durchführung des Verfahrens nach einem der
    Ansprüche 1 "bis 12, enthaltend Antikörper (II) tierischen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner T-Globulin
    nicht-menschlichen Ursprungs, gegen welches in der zu untersuchenden Probe vorhandene humane heterophile Antikörper (III) gerichtet sind, enthält.
15. 15· Reagens gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper spezifisch gereinigt oder an einen festen Träger gebunden sind.
16. 16. Additiv zur Verwendung im Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es 2^-Globulin nichtmenschlichen Ursprungs enthält, gegen welches in der zu untersuchenden Probe enthaltene heterophile Antikörper (III) menschlichen Ursprungs gerichtet sind.
17. 17. Additiv gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es
    aus einer Lösung besteht, welche das V-Globulin nicht-menschlichen Ursprungs enthält.

    Für Pharmacia AB

    Uppsala / Schweden

    (Rechtsanwalt)

    109850/1248