CH649306A5 - Traegergebundenes immunglobulin-spaltprodukt und seine verwendung fuer immunologische analysenverfahren. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Spaltprodukt eines Immunglo- ihnen nur Rheumafaktoren der IgM-Klasse nachgewiesen bulins mit immunologisch intaktem Fc-Teil, das adhäsiv oder werden können, und dass eine Differenzierung zwischen
3 649 306
Rheumafaktoren, die sowohl mit dem Fab2-Teil von Immun- Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Diagnostikum,
globulinen und solche, die mit dem Fc-Teil zu reagieren ver- das das Fc-Fragment von Immunglobulin G adhäsiv oder mögen nicht möglich war und dass falsch positive Ergebnisse chemisch, im allgemeinen Kovalent an einen Träger gebun-
durch solche Serumproteine auftraten, die mit dem Fc-Teil den ist.
von Immunglobulinen zu reagieren vermögen. Dies ist bei- 5 Dieses Diagnostikum wird entsprechend dem erfindungs-
spielsweise von C1 q des Komplementsystems bekannt. gemässen Verfahren mit der zu prüfenden wässrigen Lösung,
Der Nachteil der bislang durchgeführten Doppelantikör- vorzugsweise einer Serumprobe eines Probanden, in Kontakt perbindungsmethoden ist, dass sie aufgrund von Kreuzreak- gebracht, danach ausgiebig gewaschen und nachfolgend bei-
tionen entweder auf den Nachweis von Rheumafaktoren der spielsweise mit einem markierten Antikörper, der gegen den
Klasse IgM oder IgA beschränkt sind, wenn menschliches io Rheumafaktor gerichtet ist und mit dem Fc-Fragment nicht
IgG als Antigen an den Träger gebunden ist oder dass, wenn reagiert, zusammengebracht.
anstelle von menschlichem IgG als Antigen Immunglobuline Geeignete Antikörper sind vorzugsweise solche, die gegen einer anderen Spezies, z.B. vom Kaninchen, verwendet wer- die L-Ketten, Fab- oder F(ab)2-Fragmente menschlicher Im-
den, nur kreuzreagierende Rheumafaktoren nachzuweisen munglobuline gerichtet sind und deren Fab2- oder Fab-Spalt-
sind. i5 stücke.
Es ist weiter beschrieben, dass für die Diagnose der rheu- Geeignete Markierungsmittel sind Fluoreszenzfarbstoffe,
matischen Arthritis der mit dem Fc-T eil von Immunglobuli- Enzyme oder radioaktive Moleküle, die nach beschriebenen nen reagierende Anteil des Rheumafaktors von Bedeutung Verfahren zur Antikörpermarkierung eingesetzt werden, z.B.
ist. Es ist auch schon beschrieben, dass die Reaktion des nach Wiek et al., Immunfluoreszenz, Med. Verlagsgesell-
Rheumafaktors mit dem Fc-Teil des Immunglobulins nur 20 schaft Marburg, 1976; Nakane et al., J. Histochem. Cyto-dann stattfindet, wenn das betreffende Immunglobulin im Fe- ehem. 22,1977,1048.
Teil zur Bindung an das Antigen oder durch Adsorption an Der Nachweis und die Bestimmung des gebundenen oder einen Träger oder durch Denaturierung eine sterische Verän- des nicht gebundenen Markierungsmittels gibt Auskunft über derung erfahren hat (Gell, Coombs, Lachmann, Clinical As- das Vorhandensein und die Menge des gebundenen und somit pects of Immunology, 3. Auflage, Blackwell 1975). 25 einen Rückschluss auf die Menge des vorhandenen Rheumafaktors in der Lösung,
Bestimmungen von Clq oder C3d erfolgten bislang in Prä- Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet, wie erwähnt,
zipitationsmethoden unter Verwendung von spezifisch gegen auch andere Fc-Reaktanten, z.B. Clq- und C3d-Komponen-
Clq oder C3d gerichteten Antikörpern. Von Clq und C3d ist ten des Komplementsystems, nachzuweisen. Dann müssen an bekannt, dass sich beide an das Fc-Teil von Immunglobulin 30 Stelle der Verwendung von Anti-Rheumafaktor-Antikörpern binden, wenn das betreffende Immunglobulin durch Bindung gegen Clq oder gegen C3d gerichtete Antikörper verwendet an sein Antigen, an einem Träger oder durch Denaturierung werden.
(z.B. Hitzezaggregation) eine sterische Veränderung erfahren Spaltprodukte des Immunglobulins mit intaktem Fc-Teil hat. im Sinne der Erfindung sind beispielsweise die nach dem be-
Es wurde nun überraschend gefunden, dass sowohl Rheu- 35 kannten Verfahren von Franek, F. (1961), Biochem. Biophys.
mafaktoren als auch Komplementfaktoren wie z.B. Clq sich Res. Comm. 4,28, isolierten H-Ketten von Immunglobulinen an das isolierte Spaltprodukt des Immunglobulinmoleküls, oder die nach enzymatischer Behandlung, beispielsweise mit das sogenannte Fc-Fragment von IgG binden, wonach die Papain, Plasmiti oder Pepsin aus Immunglobulinen nach be-
oben erwähnten Nachteile, wie sie bei der Verwendung von kannten Verfahren gewinnbaren Fc-Fragmente (Bennich, H.,
Immunglobulinen auftreten, überwunden werden können. 40 Turner, M.W., Biochem.
Einer der Gegenstände der Erfindung ist demnach ein Biophys. Acta 175,388,1969; Reid, K.B.M., Immunolo-Verfahren zur Bestimmung von Fc-Reaktanten, insbesondere gy, 1971,20,649; Porter R.R., The Biochemical Journal,
des Rheumafaktors sowie des Clq- und des C3d- Faktors des 1959,73,119; Haupt, H., Heide, K., 1969, Klin. Wschr. 47,
Komplements, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Flüs- 270).
sigkeit im allgemeinen eine wässrige Lösung, die den zu be- 45 Das Verfahren zur Herstellung der trägergebundenen Fc-
stimmenden Stoff enthält, in Kontakt bringt mit einem Trä- Fragmentes ist wie folgt allgemein zu beschreiben.
ger, an welchem ein Spaltprodukt eines Immunglobulins mit Ein Spaltprodukt des Immunglobulins mit immunolo-
immunologisch intaktem Fc-Teil adhäsiv oder chemisch ge- gisch intaktem Fc-Teil, z.B. das aus IgG isolierte Fc-Frag-
bunden ist, danach den Träger abtrennt und den am Träger ment wie von Haupt und Heide (Klin. Wschr. 1969,47,270)
gebundenen Fc-Reaktanten mit einem Antikörper, der mit 50 oder Porter (The Biochemical Journal, 1959,73,119) be-
dem Fc-Reaktanten reagiert, ohne mit dem Spaltprodukt des schrieben, wird an eine feste Phase adhäsiv oder kovalent ge-Immunglobulins kreuzzureagieren, in Kontakt bringt und da- bunden.
nach die Menge des Antikörpers bestimmt. Zur adhäsiven Beschichtung kann der Träger in Anleh-
Diese Bestimmung kann mit literaturbekannten Metho- nung an die Methodik von Deeler et al., Exp. Parasitology,
den erfolgen, wie beispielsweise durch Verwendung eines ein 55 1977,41,133, mit dem Fc-Fragment behandelt werden. Es
Markierungsmittel tragenden Antikörpers, gerichtet gegen wird z.B. in einer Verdünnung von 1 g bis 1 (ig/ml, vorzugs-
den Fc-Reaktanten und Bestimmung des trägergebundenen weise 20 ng/ml in wässriger Lösung (z.B. phosphatgepufferter oder freien Markierungsmittels oder durch Messung der Kochsalzlösung (PBS), pH 8,4) 1 Minute bis 5 Tage, vorzugs-
Komplementbindung des mit dem Fc-Reaktanten reagieren- weise 24 Stunden lang, in Kontakt gebracht und anschlies-
den Antikörpers. 60 send das überschüssige Fc-Fragment durch Waschen mit Puf-
Als Markierungsmittel sind Enzyme wie Peroxydase, fer (z.B. PBS, pH 7,2) entfernt.
fluoreszierende Substanzen wie Fluoreszeinisothiocyanat
(FITC) oder radioaktive Substanzen wie Jod 131 bekannt. Kovalente Bindungen des Fc-Fragmentes können mit den
Die Komplementbindung kann durch die dem Fachmann unterschiedlichen Trägern nach in der Literatur beschriebebekannte Komplementbindungsreaktion (KBR) nachgewie- 65 nen Verfahren durchgeführt werden (z.B. Orth et al., Angew. sen werden. Sie ist z.B. beschrieben in Kurzes Lehrbuch der Chemie, 1972,84,319 ff.; Silman et al., Am. Rev. Biochem. Immunologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1971, von J. 1966,35,873 ff; Howard and Weetall, Immobilized Enzymes, Humphrey, R.G. White. Antigens, Antibodies and Peptides, Marcel Dekker, Inc.,
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New York 1975; Becht et al., J. Immunology, 1968,101,18 bulins adhäsiv oder chemisch gebunden ist. Danach wird der ff). Träger abgetrennt, mehrfach gewaschen und schliesslich mit
Das Bestimmungsverfahren wird normalerweise wie folgt einem ein Markierungsmittel tragenden Antikörper, welcher durchgeführt: gegen antigene Determinanten des Fc-Reaktanten gerichtet
Der mit dem Fc-Fragment entweder adhäsiv oder kova- 5 ist, in Kontakt gebracht und nach abermaligem Waschen das lent beschichtete Träger wird 10 sec. bis 48 Stunden, Vorzugs- trägergebundene oder freie Markierungsmittel bestimmt,
weise 1 Stunde, mit der Testprobe, in der Regel Blutserum, in Das auf diese Weise durchgeführte Bestimmungsverfah-
einer Verdünnungsreihe, vorzugsweise 1:1,1:4,1:16,1:32 ren zeichnet sich darüber hinaus durch eine besonders hohe usw., bei 4 °C bis 37 °C, vorzugsweise bei 20 °C, inkubiert Empfinglichkeit des Nachweises aus.
und nachfolgend zur Entfernung nicht gebundener Serumbe- ic Fc-Reaktanten im Sinne der Erfindung sind solche Verstandteile gewaschen. bindungen, welche den sogenennten Fc-Teil eines immunolo-Anschliessend wird der so behandelte Träger mit einer gisch veränderten Immunglobulinmoleküls zu binden vermö-Lösung eines mit einem Markierungsmittel versehenen Anti- gen. Bevorzugt sind es der Rheuma-Faktor (RF), der Kom-körpers, der gerichtet ist gegen L-Ketten, Fab- oder F(ab)2- plementfaktor (Clq) und Antikörper gegen immunologisch Fragmente von Immunglobulinen oder gegen Clq oder gegen 15 im Fc-Teil verändertes Immunglobulin.
C3d, in Kontakt gebracht. Eine geeignete Verdünnung wird in Der das Markierungsmerkmal tragende Antikörper wird
Vorversuchen in einem Testansatz ermittelt, welcher den ge- so ausgewählt, dass er immunologisch nicht kreuzreagieren suchten Fc-Reaktanten nicht enthält. Es ist die geringste Ver- darf mit dem auf dem Träger befindlichen Spaltprodukt des dünnung, bei welcher der markierte Antikörper nicht mit dem Immunglobulins.
Träger, beschichtet mit dem Fc-Fragment, reagiert. Sie liegt 20 Die nachfolgende Messung des Markierungsmerkmals er-
bei 1:1 bis 1:500, vorzugsweise 1:100. Die Inkubation wird bei laubt über eine Mengenbestimmung des an den Träger gebun-
4 °C bis 37 °C, vorzugsweise bei 20 °C, 10 sec. bis 48 Stunden, denen bzw. des in der zu analysierenden Flüssigkeit ver-
vorzugsweise 1 Stunde, durchgeführt. Anschliessend wird der brauchten Fc-Reaktanten eine Rückbeziehung auf die vorlie-
nicht gebundene Antikörper durch Waschen mit Verdün- gende Menge von Antigen-Antikörperkomplexen, Antikör-
nungsflüssigkeit, z.B. PBS, pH 7,2, entfernt und das am Trä- 25 peraggregaten und Antikörperspaltprodukten.
ger befindliche Markierungsmittel oder das freie Markie- Antikörper gegen immunologisch im Fc-Teil verändertes rungsmittel nach an sich bekannten Verfahren bestimmt. Immunglobulin werden durch Immunisierung von Tieren mit Es wurde weiter festgestellt, dass mit Hilfe von trägerge- einem immunologisch veränderten Immunglobulin oder dem bundenen Spaltprodukten von Immunglobulinen eine hoch isolierten Fc-Teil gewonnen. Die immunologische Verände-empfindliche Methode zur Bestimmung von Antigen-Anti- 30 rung im Fc-Teil kann beispielsweise bewirkt werden durch körper-Immunkomplexen, Antikörper-Aggregaten und Anti- Bindung des Immunglobulins an einen Träger, an ein Antigen körperspaltprodukten aufgebaut werden kann. Es hat sich oder durch Reaktion mit sich selbst, d.h. durch Aggregatnämlich gezeigt, dass für die Analyse von Antigen-Antikör- bildung.
per-Immunkomplexen, Antikörperaggregaten und Antikör- Im Sinne der Erfindung geeignete Träger, an welche perspaltprodukten anstelle des bisher hierfür in der Regel ver-35 Spaltprodukte des Immunglobulins gebunden sind und die wendeten RF auch Antikörper gegen immunologisch verän- mit Fc-Reaktanten in Form einer Agglutination reagieren dertes Immunglobulin benutzt werden können. Die Spezifität können, sind insbesondere anorganische und organische der Antikörper muss gerichtet sein gegen das Immunglobulin, Formkörper. Die anorganischen Formkörper bestehen z.B.
das durch Bindung an einen Träger, an ein Antigen oder aus Glas, die organischen Formkörper z.B. aus Homo, oder durch Reaktion mit sich selber eine immunologische Verän- 40 Copolymeren von Vinylverbindungen, wie Olefinen, Vinyl-
derung aufweist. Sie kann auch gerichtet sein gegen Spaltpro- acetat, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Tetrafluoräthylen,
dukte des Immunglobulins, die den Fc-Teil des Immunglobu- Styrol, Acrylsäure oder Methacrylsäure, ferner aus Polyme-
lins enthalten oder die Fragmente des Fc-Teils darstellen. ren von Formaldehyd und cyclischen Acetalen sowie aus Po-
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demnach ein lykondensaten, wie Polyestern, Polycarbonaten oder Poly-
Verfahren zur Bestimmung von immunologisch verändertem 45 amiden. Auch vernetzte Kohlenhydrate und vernetzte Protei-
Immunglobulin, vor allem von Antigen-Antikörperkomple- ne sind geeignet. Die Formkörper sind vorzugsweise Kugeln xen, Antikörperaggregaten oder Antikörperspaltprodukten oder Ellipsoide. Es kommen ferner planparallele und auch in Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer anders gestaltete Formkörper, vorzugsweise optisch klare
Flüssigkeit, die den zu bestimmenden Stoff enthält, einen Fe- Körper wie Objektträger, nicht zuletzt Reagenzgläser in Fra-
Reaktanten im Überschuss hinzufügt, das Reaktionsgemisch 50 ge. Die organischen Formkörper können auch biologischen in Kontakt bringt mit einem Träger, an welchen ein Spaltpro- Ursprungs sein. Als solche werden die roten Blutkörperchen dukt des Immunglobulins mit immunologisch intaktem Fe- des Menschen oder von Tieren bevorzugt. Auch amorphe
Teil adhäsiv oder chemisch gebunden ist, danach den Träger Materialien sind als Träger einsetzbar.
abtrennt und schliesslich den freien oder gebundenen Fc-Re- Zur Bestimmung von immunologisch verändertem Im-
aktanten bestimmt. 55 munglobulin, ist der Fc-Teil des Immunglobulins, vorzugs-
Wird der Fc-Reaktant selbst markiert, kann über die Be- weise einen optisch klaren Formkörper, gebunden.
Stimmung des Markierungsmittels zunächst der Schluss auf Die Herkunft der zur Herstellung dieser Spaltprodukte die Menge des Fc-Reaktanten und daraus auf das inuminolo- notwendigen Immunglobuline richtet sich nach der Spezies, gisch veränderte Immunglobulin gezogen werden. Obwohl bei welcher immunologisch verändertes Immunglobulin dieses Verfahren sehr einfach durchzuführen ist, erfordert es 60 nachgewiesen werden soll. Als optimal hat sich das homologe die Reindarstellung der Fc-Reaktanten mit den damit ver- System erwiesen, d.h. die trägergebundenen Spaltprodukte bundenen Schwierigkeiten. stammen von der gleichen Spezies wie die zu bestimmenden Bevorzugt wird das Verfahren durch die indirekte Bestim- immunologisch veränderten Immunglobuline. In dem erfin-mung des Fc-Reaktanten durchgeführt. Dazu gibt man den dungsgemässen Verfahren sind jedoch auch Spaltprodukte Fc-Reaktanten im Überschuss zu der Flüssigkeit, die das zu 65 von anderen Spezies einsetzbar, sofern bei ihnen eine immu-bestimmende, immunologisch veränderte Immunglobulin nologische Kreuzreaktion zu dem Fc-Teil der zu bestimmenenthält. Das Reaktionsgemisch wird in Kontakt gebracht mit den Antikörperverbindungen oder Antikörperfragmente be-einem Träger, an welchem ein Spaltprodukt des Immunglo- steht. Ein Beispiel solcher zu Kreuzreaktionen befähigtem
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Spezies-Paare ist die Kombination Kaninchen/Mensch.
Der Komplementfaktor Clq kommt in der Natur vor. Er kann beispielsweise aus Blutserum isoliert werden. Seine Isolierung aus dem Serum des Menschen, des Kaninchens oder des Rindes sind beschrieben.
Der Rheuma-Faktor RF ist ein Protein, das im Serum von Menschen, seltener im Serum anderer Spezies, bei bestimmten rheumatoiden Erkrankungen vorkommt. RF kann «künstlich) durch Immunisierung mit Antigen-Antikörper-komplexen oder Antikörperaggregaten gebildet werden. Derartige Antikörperaggregate sind beispielsweise durch Erhitzen gereinigter Immunglobuline für einige Minuten bei Temperaturen um 60 °C zu erhalten. RF wird auch gebildet durch Immunisierung mit Fc-haltigen Antikörperfragmenten wie H-Ketten von Immunglobulinen oder mit Fc-Fragmenten, erhalten durch Papain-, Plasmin- oder Pepsin-Behandlung von Immunglobulinen oder von Fragmenten des Fc-Teiles von Immunglobulinen. Nach Ausbildung der betreffenden Antikörper wird aus dem Serum der immunisierten Tiere die antikörperhaltige Fraktion nach bekannten Verfahren isoliert und gewünschtenfalls angereichert.
Selbstverständlich ist für die Erfindung nur derjenige RF geeignet, welcher eine imminologische Spezifität sowohl gegen das in der zu prüfenden Flüssigkeit nachzuweisende immunologisch veränderte Immunglobulin als auch gegen die an Träger gebundenen Spaltprodukte von Immunglobulinen besitzt. Ein gegebenenfalls zu verwendender, ein Markierungsmittel tragender Antikörper gegen den Fc-Reaktanten darf nicht mit den am Träger gebundenen Spaltprodukten von Immunglobulinen reagieren. Das wird entweder dadurch gewährleistet, dass das trägergebundene Spaltprodukt und der RF von unterschiedlichen Spezies stammen und/oder dass ihre antigenen Determinanten immunologisch nicht kreuzreagieren. So wählt man beispielsweise einen Antikörper aus, der gegen die L-Ketten von RF gerichtet ist, und ein Spaltprodukt des Immunglobulins für die Bindung an einen Träger, welches keine L-Ketten enthält.
Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Bestimmung von Rheumafaktoren
In Polystyrolröhrchen (Fassungsvermögen 400 |xg) werden 100 p.g einer Lösung von Fc-Fragment von humanem IgG, hergestellt nach Haupt und Heide (Klin. Wschr., 1969, 47,270) in einer Konzentration von 20 |xg/ml in Natrium-phosphatpuffer, pH 8,3, nach Sörensen eingefüllt und bei 20 °C gelagert. Nach 18 Stunden wird die Lösung abgesaugt. Die Röhrchen werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1 % (f/V) Polyoxyäthy-lensorbitanmonolaurat (Tween 20), durch Einfüllen und Absaugen gewaschen. In die entleerten, beschichteten Röhrchen werden jeweils 100 g der Rheumafaktor-haltigen Probe, 1:4, 1:8 und 1:16 verdünnt mit PBS, enthaltend 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), eingefüllt und bei 20 °C stehen gelassen. Nach 2 Stunden wird die Lösung abgesaugt. Die Röhrchen werden dreimal mit PBS, enthaltend Tween 20 (I mg/ ml), durch Einfüllen und Absaugen gewaschen. Nachfolgend wird in die Röhrchen 100 nl eines mit Peroxydase nach dem Verfahren von Nakane und Kawave, J.Histochem. Cyto-chem., 1972,22,1084, markierten Kaninchen-Anti-Human-L-Ketten-Antikörpers eingefüllt, der verdünnt ist (1:200 entsprechend 25 mg Antikörperprotein/ml) mit PBS, pH 7,2, enthaltend 50 mg/ml BSA. Nach Lagerung über 1 Stunde bei 20 C werden die Röhrchen wiederum dreimal mit PBS, enthaltend Tween 20, gewaschen. Anschliessend werden pro Röhrchen 100 |il einer frisch zubereiteten 0,1 %igen o-Pheny-lendiamin-Lösung in Zitrat-Phosphatpuffer (5 ml 0,1 M Zitronensäure +5 ml 0,2 M Na2HP04), versetzt mit 0,1 ml einer l%igen (v/v) H202-Lösung, einpipettiert. Nach ca. 30 Min. Lagerung der Röhrchen im Dunkeln wird die Reaktion durch Zugabe von 100 )xl einer 2N H2S04-Lösung gestoppt und die s Extinktion der in den Röhrchen befindlichen Reaktionslösung bei 490 nm mit Hilfe eines Photometers gemessen.
Die Ergebnisse von 48 Seren von Patienten mit rheumatischen Erkrankungen sind im Vergleich zu einem solchen, die io keinen Rheumafaktor hatten, in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabelle 1
Nachweis von RF mit trägergebundenem Fe is RF Serum Nr. (Peroxydasereaktion) (Verdünnung 1:4) E490
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Wertung
157
0,253
+
1
0,449
+
2
0,239
+
8
0,289
+
9
0,247
+
10
0,091
—
11
0,255
+
12
0,432
+
14
0,128
—
15
0,215
+
16
0,371
+
17
0,154
—
18
0,322
+
19
0,380
+
20
0,523
+
21
0,281
+
22
0,187
-/+
24
0,154
25
0,137
—
26
0,168
—
27
0,375
+
28
0,435
+
29
0,194
+/-
31
0,153
39
0,692
+
43
0,384
+
45
0,219
+
51
0,367
+
54
0,318
+
56
0,460
+
59
0,404
+
60
0,220
+
62
0,364
+
66
0,179
+/-
68
0,241
+
72
0,448
+
73
0,407
+
75
0,256
+
77
0,201
+
103
0,311
+
105
0,209
+
120
0,163
—
122
0,164
—
123
0,335
+
130
0,170
—
147
0,193
+
149
0,208
+
155
0,323
+
tive Kontrolle
0,158
—
(Kein Rheumafaktor enthalten)
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Beispiel 2
Bestimmung des Komplementfaktors Clq
Polymethylenmethacrylatfolie mit Amidgruppen, eingefügt nach dem Verfahren von Lynn (Immobilized Enyzmes, Antigens, Antibodies and Pepetides, Roward and Weetall, Marcel Dekker, Inc., New York 1975,32) wird in eine Lösung von 10 mg/ml Fc-Fragment von humanem IgG in PBS, pH 7,2,24 Stunden lang bei 4 °C gegeben und nachfolgend dreimal durch Eintauchen in PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ ml BSA, gewaschen.
Derart beschichtete Folien werden in verschiedene Patientenseren für 2 Stunden bei 20 °C eingetaucht.
Zum Vergleich wird eine PBS-Lösung, pH 7,2 und eine zweite Lösung, enthaltend 50 Hg/ml Clqund 10 mg/ml BSA mitgeführt. Nachfolgend wird die Folie dreimal durch Eintauchen in PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, gewaschen und anschliessend in einer Lösung von Kaninchen-An-ti-Clq-Antikörpern, FITC-markiert, in einer Konzentration von 0,5 mg/ml PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, 2 Stunden bei 20 °C eingetaucht, nachfolgend zweimal mit PBS, pH 7,2, enthaltend 10 mg/ml BSA, durch Eintauchen gewaschen und anschliessend in destilliertem Wasser gewaschen. Nach Lufttrocknen wird die Folie mit einem Klebstoff (Eukitt, fluoreszenfrei) auf einen Glasobjektträger geklebt und die Fluoreszenz im Vergleich zu einem Standard (Uranyl-glas) in einem Fluorimeter (Axiomat, Fa. Zeiss) gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Sie zeigen deutlich den Nachweis von Clq in Seren von Patienten mit chronischen Entzündungen im Vergleich zu jeweils einer Positiv- oder Negativkontrolle.
Tabelle 2
FOTC-Fluoreszenz im Vergleich zu Uranylglas-Standard
Negativ-Kontrolle (Kein Clq)
Positiv-Kontrolle
Clq 50 ng/ml
Patientenserum
(chron. Entzündungen)
1
2
3
4
5
11
49,3+6,0
23,9 17,2 22,6 23,4 22,1
Beispiel 3
Durch Spaltung des humanen Immunglobulin G mit Papain und nachfolgende gelchromatographische Auftrennung der Spaltprodukte gemäss dem Verfahren nach Porter, R.R., The Biochemical Journal 72,1959, wird das Fc-Fragment isoliert und in 1 %iger phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH 8,3 gelöst.
Eine 50 h dicke Folie aus Polymethacrylat (80 x 250 mm) wird 15 min. bei 90 °C mit Hydrazinhydrat behandelt, mit
Methanol, dem etwas Essigsäure hinzugefügt wurde, gespült und anschliessend mit Wasser gewaschen. Die Folie wird in eine Lösung von 1000 ml Eiswasser, 500 ml Salzsäure und 120 ml Natriumnitritlösung eingebracht. Nach 15 min. wird s die Folie mit Eiswasser neutral gewaschen und in einer Gefriertrocknungsanlage getrocknet.
Eine derart aktivierte Polymethylmethacrylat-Folie wird in die 1 %ige Lösung des Fc-Fragmentes in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 8,3 eingetaucht und in der Lösung für io 48 Stunden bei 4 °C belassen. Anschliessend wird die Folie 3 mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung von pH 7,2 gewaschen und in Teile zerschnitten.
Für die Bestimmung immunologisch veränderter Immunglobuline in Form von Immunkomplexen wird eine Verdün-15 nungsreihe der zu untersuchenden Lösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Dazu werden jeweils 40 jil, der Verdünnung einer Verdünnungsreihe mit je 40 jj.1 eines menschlichen Serums, das einen hohen Anteil an RF enthält (Titer von 1:1500 in der RF-Latex-Agglutination) ver-20 mischt und das Gemisch 10 min. lang bei Raumtemperatur belassen. Nachfolgend wird in jedes Gemisch eine wie beschrieben mit Fc-Fragmenten kovalent beschichtete Folie eingetaucht und 2 Stunden bei 20 °C inkubiert. In einer Kontrollreihe wird statt des RF-haltigen Serums eine 0,9%ige 25 Kochsalzlösung eingesetzt.
Nach 3maligem Waschen der Folien in gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, werden sie in eine 1 %ige Lösung des Ka-ninchen-Anti-Human-Immunglobulin-L-Ketten-Antikör-pers, der mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) markiert ist, 30 eingetaucht und dort bei Raumtemperatur 2 Stunden belassen. Nachfolgend werden die Folien zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, und anschliessend einmal mit destilliertem Wasser gewaschen.
In einem Gerät für die quantitative Immunfhioreszenz-35 Bestimmung (Axiomat, Carl Zeiss, Oberkochen) wird die Fluoreszenzintensität auf einem festgelegten Ausschnitt der Folie bestimmt. Sie ist ein Massstab für die an das Fc-Fragment gebundene Menge von RF. Diese wiederum ist um so geringer, je mehr RF an Immunkomplexe gebunden ist.
Mit dem beschriebenen Verfahren lassen sich in immun-komplexhaltigen Präparaten diese noch in einer Verdünnung von 1:8 000 nachweisen.
Eine vergleichsweise hohe Empfindlichkeit ist zu errei-45 chen, wenn statt des Kaninchen-Anti-Human-Immunglobu-lin-L-Ketten-Antikörpers ein Antikörper gegen Fc-Fragmen-te von Kaninchen-Gammaglobulin verwendet wird und/oder wenn anstelle von RF ein Antikörper gegen das durch Pa-painspaltung von Immunglobulin erhaltene Fc-Fragment so eingesetzt wird.
Anstelle von RF können auch humanes Clq und anstelle von FITC-markierten Kaninchen-Anti-Immunglobulin-L-Kettenantikörpern FITC-markierte Kaninchen-Anti-Clq-Antikörper eingesetzt werden.
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C
Claims (14)
- 649306 2PATENTANSPRÜCHE chemisch an einem Träger gebunden ist. Weiterhin betrifft die1. Spaltprodukt eines Immunglobulins mit immunolo- Erfindung ein immunologisches Analysenverfahren zur Be-gisch intaktem Fc-Teil, das adhäsiv oder chemisch an einen Stimmung von Fc-Reaktanten im allgemeinen in wässrigen Träger gebunden ist. Lösungen vor allem in Körperflüssigkeiten wie Plasma oder
- 2. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 5 Serum. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestim-dass der Träger ein optisch klarer Formkörper ist. mung der Fc-Reaktanten Rheumafaktor und Komplement-
- 3. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, faktoren Clq und C3d.dass es das Fc-Fragment von Immungobulin G ist, das adhä- Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestim-siv oder chemisch an einen Träger gebunden ist. mung von immunologisch verändertem Immunglobulin, ins-
- 4. Verfahren zur Bestimmung von Fc-Reaktanten, da- io besondere von sogenannten Immunkomplexen. Das sind durch gekennzeichnet, dass man eine Flüssigkeit, die diesen Komplexe, die durch Reaktion eines Antigens mit einem Anenthält, in Kontakt bringt mit einem an einem Träger gebun- tikörper entstehen. Sie betrifft ein Verfahren zur Bestimmung denen Spaltprodukt eines Immunglobulins gemäss Anspruch der Immunkomplexe Vorzugsweise in Körperflüssigkeit. Da 1, danach den Träger abtrennt und den am Träger gebunde- sich Antikörperaggregate und Antikörperspaltprodukte innen Fc-Reaktanten mit einem Antikörper, der mit dem Fe- 15 folge der Veränderung des Immunglobulins ähnlich wie Im-Reaktanten reagiert, ohne mit dem Spaltprodukt des Immun- munkomplexe verhalten, kann das Verfahren auf deren Be-globulins kreuzzureagieren, in Kontakt bringt und danach Stimmung ausgedehnt werden.den Antikörper bestimmt. Es ist bekannt, dass die Bestimmung von Antikörpern,
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, Antikörper-Antigen-Komplexen und Antigenen in biologi-dass der mit dem Fc-Reaktanten reagierende Antikörper ein 20 sehen Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten wie Markierungsmittel trägt und dessen am Träger gebundene Harn oder Serum wichtige Hinweise auf die Diagnose und für oder dessen ungebundene Menge bestimmt wird. die Therapie von verschiedenen Erkrankungen, insbesondere
- 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, von Infektionserkrankungen, Tumorerkrankungen oder im-dass der Fc-Reaktant Rheumafaktor RF oder der Komple- munologischen Entgleisungen liefert. Es besteht deshalb ein mentfaktor Clq oder ein Antikörper gegen immunologisch im 25 Bedarf an einem genauen und einfach durchzuführenden Ver-Fc-Teil verändertes Immunglobulin ist. fahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Immunkom-
- 7. Verfahren nach Anspruch 4 zur Bestimmung von plexen.Rheumafaktoren, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit Verfahren zum Nachweis von Antikörper-Antigenkom-dem Fc-Reaktanten reagierenden Antikörper ein Antikörper, plexen oder von Antikörperaggregaten sind bereits bekannt, der gegen L-Ketten oder Fab-Fragmente von Immunglobuli- 30 Den bekannten Verfahren liegt die Erkenntnis zugrunde, dass nen gerichtet ist, verwendet. sowohl der Rheuma-Faktor (RF) als auch die Clq-Kompo-
- 8. Verfahren nach Anspruch 4 zur Bestimmung von Kom- nente des Komplementsystems (sog. Fc-Reaktanten) die Ei-plementfaktor Clq, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit genschaft haben, sich an Fc-Teile von Immunglobulinen, die dem Fc-Reaktanten reagierenden Antikörper ein Antikörper, mit einem Antigen oder die miteinander verbunden sind, ander gegen Clq gerichtet ist, verwendet. 35 zulagern. Es wurden deshalb entweder Clq oder RF mit ei-
- 9. Verfahren nach Anspruch 4 zur Bestimmung von Kom- nem Markierungsmittel versehen oder die Präzipitation von plementfaktor C3d, dadurch gekennzeichnet, dass man als mit Antigen-Antikörperkomplexen mit einem der fraglichen dem Fc-Reaktanten reagierenden Antikörper ein Antikörper, Testproteine oder die Agglutination von Immunglobulin-be-der gegen C3d gerichtet ist, verwendet. schichteten Latexpartikeln oder von Immunglobulin-be-
- 10. Verfahren zur Bestimmung von immunologisch verän- 40 schichteten Erythrozyten durch RF oder Clq und deren Inhi-dertem Immunglobulin, dadurch gekennzeichnet, dass man bition durch Antigen-Antikörperkomplexe für die Bestim-zu einer Flüssigkeit, die den zu bestimmenden Stoff enthält, mung eingesetzt.^einen Fc-Reaktanten im Überschuss hinzufügt, das Reak- Es ist auch bekannt, dass der Rheumafaktor von Autoan-tionsgemisch in Kontakt bringt mit einem an einen Träger ge- tikörpern repräsentiert wird, die gegen die homologen Im-bundenen Spaltprodukt eines Immunglobulins gemäss An- 45 munglobuline gerichtet sind. Der Nachweis ist von grosser sprach 1, danach den Träger abtrennt und schliesslich den Bedeutung für die Diagnose und Prognose von rheumati-freien oder gebundenen Fc-Reaktanten bestimmt. sehen Erkrankungen.
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich- Die Bestimmung von Komplementfaktoren, vor allem net, dass der Fc-Reaktant markiert ist und durch Bestim- von Clq und C3d haben ihre Bedeutung bei entzündlichen Er-mung des Markierungsmittels bestimmt wird. . _ 50 krankungen insbesondere bei Autoimmun- und Immunkom-
- 12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich- plexerkrankungen. Eine Verringerung ist durch erhöhten Ver-net, dass man den trägergebundenen Fc-Reaktanten mit ei- brauch, eine Erhöhung durch verstärkte Bildung der Fakto-nem ein Markierungsmittel tragenden Antikörper in Kontakt ren bedingt.bringt, welcher gegen die antigenen Determinanten des Fe- Es war nun bekannt, dass die Rheumafaktoren den unter-Reaktanten gerichtet ist und nicht mit dem auf dem Träger 55 schiedlichen Immunglobulinklassen zugehören können. Der befindlichen Spaltprodukt des Immunglobulins kreuzre- Nachweis wurde bisher durchgeführt mit denaturierten, im-agiert, wonach man das trägergebundene oder freie Markie- munkomplexgebundenen oder an Flächen adsorptiv gebun-rungsmittel bestimmt. denen Immunglobulinen in Agglutinationsverfahren oder in
- 13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich- der sogenannten Doppelantikörperbindungstechnik unter net, dass der Fc-Reaktant Rheumafaktor RF oder Komple- 60 Verwendung eines gegen den Rheumafaktor als Erstantikör-mentfaktor Clq oder ein Antikörper gegen immunologisch im per gerichteten, mit einem Markierungsmittel versehenen Fc-Teil verändertes Immunglobulin ist. Zweitantikörpers (vgl. Knees, Reimer, J. Immunol. Methods
- 14. Diagnostikum, enthaltend das Produkt gemäss An- 1977,18,105-121; Hettenkofer u. Müller, Ärztl. Lab., 1975, sprach 3. 21,174-181; Johnson u. Faulk, Clin. Inm. Immunopathol.65 1976,6,414-430).Der Nachteil dieser Agglutinationsmethoden ist, dass mit
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