DE1798417A1 - Markierte Reagin-Immunoglobuline (Reagin-Ig) - Google Patents

Markierte Reagin-Immunoglobuline (Reagin-Ig)

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DE1798417A1 DE19681798417 DE1798417A DE1798417A1 DE 1798417 A1 DE1798417 A1 DE 1798417A1 DE 19681798417 DE19681798417 DE 19681798417 DE 1798417 A DE1798417 A DE 1798417A DE 1798417 A1 DE1798417 A1 DE 1798417A1
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Dr Johansson Stig Gunnar Olof
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Description

  • Markierte Reagin-Immunoglobuline (Reagin-Ig) Die Erfindung betrifft Reagin-Immunoglobuline (Reagin-Ig), die durch eine Markierung, die sie zur Aussendung einer Strahlung befähigt, gekennzeichnet sind.
  • Es ist bekannt, daß eine bestimmte Zahl von immunogenen Substanzen, sogenannte Allergene, von denen viele die Natur eines Proteins, Peptids oder Kohlehydrats aufweisen, allergische Reaktionen, wie beispielsweise Asthma oder Heuschnupfen, hervorrufen können. (Solche Allergene sind sehr weit verbreitet und können beispielsweise von tierischen Schuppen, Pflanzenpollen, Mikroorganismen oder einigen Parasiten stammen). In Verbindung damit zeigt sich - in der Regel in sehr niedrigen Konzentrationen - beispielsweise im Blut des Patienten, ein bestimmter Typ von Antikörpern, sogenannte Reagine, welche Immuoglobuline darstellen, und welche spezifisch gegen das Allergen oder die Allergene gerichtet sind; die Antikörper können im Blutserum nachgewiesen werden. Dieee speziellen Immunoglobuline werden im folgenden als Reagin-Immunoglobuline oder Reagin-Ig bezeichnet.
  • Bisher hat man für die Bestimmung Hauttests verwendet, bei welchen ein Testallergen beispielsweise subkutan durch eine Spritze oder Nadel auf die Haut des Patienten gebracht wurde.
  • Ist der Patient hypersensibel (allergisch), so findet in vivo eine Reaktion statt zwischen dem Allergen und den Antikörpern, die gegen das fragliche Allergen gerichtet sind.
  • Durch diese Reaktion treten bestimmte Symptome auf, z.B. eine Rötung oder Schwellung der Haut, an der die Injektion vorgenommen wurde; aus diesen Symptomen kann auf das Ausmaß der Reaktion geschlossen werden.
  • In vivo-Tests sind auch sogenannte Provokationstests, bei welchen der Patient ein Allergen in Form eines Aerosols inhaliert. Ist der Patent gegen das Allergen hypersensibel, so beobachtet man eine Reaktion, die sich beispielsweise in Asthiasymptomen äußern kann. Die beiden vorstehend erwähnten Tests sind zeitraubend und, in bestimmten Fällen, unangenehm und gefährlich für den Patienten. In einer Anzahl von Fällen können keine Tests durchgeführt werden. Außerdem muß eine Vielzahl von in vivo-Tests durchgeführt werden, damit eine Diagnose gestellt werden kann, ob der Patent gegen ein bestimmtes Allergen bzw. gegen bestimmte Allergene hypersensibel ist oder nicht.
  • Die bisher erprobten in vitro-Tests haben keine praktische Bedeutung.
  • Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung läßt sich die Anwesenheit von gegen bestimmte Allergene gerichteten Reagin-Ig in wäßrigen Proben bestimmen. Es ist besonders wichtig, die Anwesenheit von Reagin-Ig in Verbindung mit der Diagnose der Hyperästhesie von Tieren und Menschen festzustellen.
  • Die deutsche Patentanmeldung P 17 98 170. 3 betrifft ein Verfahren und Hilfsmittel zur Bestimmung von gegen bestimmte Allergene wirkenden Reagin-Immunoglobulinen (Reagin-Ig) in wäßrigen Testproben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe, z.B. eine Körperflüssigkeit wie Blutserum oder Blutplasma in vitronit einem wasserunlöslichen Polymer, an welches ein Testallergen gebunden worden ist, zusammenbringt, so daß eine Reaktion zwischen dem Testallergen an dem Polymer und dem entgegenwirkenden Reagin-Ig stattfindet und das Reagin an das an dem unlöslichen Polymer befindliche Testallergen gebunden wird, worauf man das Polymer mit dem Testallergen und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven Atom bzw. einer radioaktiven Gruppe markiert worden sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe markiert worden ist, zusammenbringt, anschließend das unlösliche Polymer mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schließlich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymer mit den daran befindlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der ahgetrennten Flüssigkeit ausgestrSlt wird, mißt oder die Wirkung derselben untersucht.
  • Ist in der Testprobe ein Reagin-Ig vorhanden, das gegen das Allergen gerichtet ist, so wird das markierte Reagenz an die unlösliche Phase gebunden, die anschließend eine Strahlung emittieren wird, die sich mit ansteigender Konzentration der Reagin-Ig in der Testprobe steigert. Die Strahlung der flüssigen Phase wird im Gegensatz dazu bei sich erhöhender Konzentration an Reagin-Ig abnehmen, da mehr markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden wird. Die bei dieser Methode für die Testprobe erhaltenen Strahlungswerte können mit den Werten für die Kontrollproben verglichen werden.
  • Wasserunlösliche Polymere werden als TrägermaterBlien für die Testallergene verwendet, Sie können beispielsweise in Form von Teilchen mit verschiedener Gestalt und Größe vorliegen. Die Polymere können beispielsweise auch die Form von flachen Gegenständen wie Scheiben oder Streifen aufweisen oder in Form von Rohrwänden, z.B. in Form einer Innenauskleidung eines Reagenzrohres vorliegen. Die Bindung zwischen dem Polymer und dem Testallergen sollte derart sein, daß bei normalen Vaschvorgängen das Testallergen sich nicht von dem Polymer ablöst. Damit dies erreicht wird, kann das Testallergen chemisch oder gegebenenfalls auch physikalisch gebunden sein. Bei einer geeigneten Form einer chemischen Bindung liegen zwischen dem Polymer und dem Testallergen Brücken mit kovalentem Charakter vor. Um diese Art der Bindung zu erreichen, wird das Polymer so ausgewählt, daß es entweder geeignete reaktive Gruppen, z.B. Aminogruppen, Hydroxylgruppen oder Carboxylgruppen enthält oder aber mit solchen Gruppen versehen werden kann, die es erlauben, daß das Testallergen leicht an das Polymer gebunden werden kann. Die Bindungsart, bei der zwischen dem Polymer und dem Allergen chemische Bindungen in Form von Brücken mit kovalentem Charakter vorliegen, wird bevorzugt.
  • Es ist besonders günstig, Polymere auszuwählen, die eine dreidimensionale Netzstruktur aufweisen, die durch Bindungen kovalenten Charakters zusammengehalten wird. Solche Polymere sind, obwohl quellbar in Wasser oder wäßrigen Medien, vollständig unlöslich, so daß nichts von dem polymeren Material oder den Substanzen, die daran gebunden sind, während anschließender Waschverfahren abgegeben werden kann. Beispiele für solche Polymere sind Mischpolymerisate, die man durch Vernetzen von Substanzen mit einer größeren Anzahl von Hydroxylgruppen wie Kohlehydraten und Zuckeralkohole, z.B. Dextran, Stärke, Dextrine oder andere Polysaccharide sowie Vinylalkohol mit einer bifunktionellen Substanz, beispielsweise einer bifunktionellen Substanz vom Typ X - R - Z erhält, wobei im letztgenannten Fall X und Z Halogen oder Epoxygruppen und R den Rest der bifunktionellen Substanz, z.B. einen aliphatischen Rest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten.
  • Für die Zwecke der Erfindung kann beispielsweise ein durch Glycerin-Ätherbrücken vernetztes Dextran, welches durch Behandlung von Dextran mit Epichlorhydrin gewonnen wird (Sephadex) verwendet werden. Das Produkt kann beispielsweise in Form kleiner Körner verwendet werden. Dieses Produkt und solche, die in ähnlicher Weise gewonnen worden sind, sind in Wasser quellbar, jedoch unlösliche Gele und können in Teilchenform hergestellt werden. Sie enthalten Hydroxylgruppen, so daß sie leicht mit anderen Gruppen substituiert werden können, z. B. mit Gruppen, die Aminogruppen oder Carboxylgruppen enthalten; diese Gruppen können leicht Brücken in Form von Bindungen kovalenten Charakters zu den Testallergenen bilden.
  • Das Polymer wird vorzugsweise in einer solchen Form verwendet, daß eine große Oberfläche für die Berührung zur Verfügung steht, z. B. in Form von kleinen Teilchen.
  • Das Testallergen wird an das Trägerpolymer unter milden Bedingungen gebunden, damit die gmmunochemische Reaktivität des Allergens nicht nennenswert beeinträchtigt wird.
  • Zur chemischen Bindung des Allergens1 an das Polymer werden reaktive Gruppen wie Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen, Amidogruppen und Carboxylgruppen verwendet, wobei eine BrAeke in Form einer chemischen Bindung mit vorzugsweise kovalentem Charakter zwischen dem Testallergen und dem Polymer gebildet wird, und zwar folgender Art: Allergen - NH - CS - NH - Polymer Allergen - NH - CO - NH - Polymer Allgergen- N = N -$Polymer Allergen - 0 - CO - Polymer Allergen - NH - CO - Polymer Allergen - CO - NH - Polymer Allergen Allergen Polymer Polymer Die Brücke zwischen dem Allergen und dem Polymer braucht ihrer Struktur nach nicht bekannt zu sein und kann verschiedenen Charakter haben; die Brücke muß nur dem Zweck entsprechen, daß das Allergen von dem unlöslichen Polymer nicht weggewaschen werden kann.
  • Das Verfahren zur Bestimmung von Reagin-Ig beruht auf der Beobachtung, daß Reagin-Ig sowohl an das Allergen, gegen welches es spezifisch gerichtet ist, als auch an Antikörper, die im affilgemeinen gegen Reagin-Ig gerichtet sind, gebunden werden kann. Solche Antikörper sind wenigstens zweiwertig, d.h. sie können an wenigstens zwei Moleküle Reagin-Ig gebunden werden. Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, wie auch Reagin-Ig selbst, können mit Atomen oder Gruppen, die eine Strahlung hervorrufXen, markiert werden, z.B. mit radioaktiven Isotopen oder einer fluoreszierenden Gruppe.
  • Im Vergleich zu bekannten Verfahren zur Durchführung von Haut- und Provokationstests weist das mit den vorstehenden Mitteln durchgeführte Verfahren den Vorteil auf, daß die Anwesenheit und auch die Menge von Reagin-Ig, das befähigt ist, mit einer bestimmten Art eines Allergens oder einer bestimmten Gruppe von Allergenen, z.B. Tier- oder Pflanzenallergenen, zu reagieren, in vitro in einer Blutprobe des Patienten bestimmt werden kann, und zwar mit Hilfe eines sehr empfindlichen und einfachen Verfahrens, das für den Patienten vollkommen sicher ist. Es ist wesentlich für das Verfahren, daß das Testallergen, gegen welches das zu bestimmende Reagin gerichtet ist, sehr fest an das wasserunlösliche Trägermaterial gebunden ist. Das Reagin-Ig, welches mit dem Allergen reagiert hat, kann daher leicht von den nicht-Allergen-gebundenen Immunoglobulinen abgetrennt werden. Ferner lassen sich während der weiteren Verfahrensstufen die Antikörper und das Reagin-Ig, die nicht an das Polymer gebunden worden sind, sehr leicht von denjenigen abtrennen, die an das Polymer gebunden worden sind.
  • Das Polymer mit den daran befindlichen Substanzen kann leicht von der Flüssigkeit abgetrennt werden. Die Abtrennung ist unempfindlich gegen Veränderungen des Salz- und Proteingehalts der Flüssigkeit innerhalb der physiologischen Grenzen.
  • Das vollständige Bestimmungsverfahren, dnschließlich der Abtrennung der freien, markierten Antikörper und des Reagin-Ig bzw. der Polymer-gebundenen, markierten Antikörper und des Reagin-Ig, kann beispielsweise in demselben Reagenzrohr ohne Zugabe von Fällungsmitteln oder dergleichen durchgeführt werden.
  • Für das vorstehende Verfahren werden isoliertes Reagin-Ig sowie dagegenwirkende Antikörper benötigt.
  • Reagin-Ig kann aus dem Serum allergischer Patienten sowie in seltenen Fällen aus dem Serum von Patienten, die Reagin-Ig bildende Tumoren im Gewebe aufweisen, gewonnen werden. Reagin-Ig kann nach den verschiedenen Verfahren zur Abtrennung von Proteinen gereinigt werden, z.B. durch Gelfiltration, Ionenaustauscher-Chromatographie und Elektrophorese. Ähnlich wie andere Immunoglobuline kann Reagin-Ig chemisch oder enzymatisch in ein Antigen-bindendes Fragment und ein Fragment, welches die Trägersubstanz für die klassenspezifisch bestimmende Gruppe it, gespalten werden.
  • Die erfindungsgemäßen, markierten Reagin-Ig lassen sich bei Radio-Immunountersuchungsmethoden zur Bestimmung von Reagin-Ig> beispielsweise einer solchen Methode, wie sie vorstehend beschrieben wurde, verwenden.
  • Antikörper gegen Reagin-Ig können nach bekannten Verfahren zur Immunisierung von Versuchstieren hergestellt werden, beispielsweise durch wiederholte subkutane Injektionen kleiner Mengen von Antigenen in Mischung mit einem geeigneten Zusatzmittel, z.B. Freund'scher Mineralölsuspension. Die Antikörper, die von dem Tier, z.B. einem Kaninchen gebildet werden, können aus dem Blutserum des Tieres gewonnen werden.
  • Spezifische Antikörper, d.h. Antikörper, die gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen des Reagin-Ig gerichtet sind, können dadurch erhalten werden, daß man die Zmmunisierung mit den aus dem Reagin-Ig-MolekUlen abgespalteten Fragmenten, die diese bestimmenden Gruppen enthalten, vornimmt, oder indem man die spezifischen Antikörper aus einer Mischung von Antikörpern isoliert, die durch Immunisieren mit nativem Reagin-Ig gewonnen worden sind.
  • Spezifische Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, können ggfs. aus dem Antiserum nach üblichen immunosorbierenden Verfahren isoliert werden; beispielsweise kann Reagin-Ig mit Bromacetylcellulose gekuppelt werden, worauf die Antikörper, die an das gekuppelte Reagin-Ig gebunden sind, durch Herabsetzen des pH-Werts freigesetzt werden.
  • Es ist in einigenFällen vorteilhaft, spezifische Antikörper gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen in dem Reagin-Ig zu verwenden, damit eine besonders hohe Sicherheit und Genauigkeit während der Versuche erreicht werden.
  • Die Markierung von Reagin-Ig und Antikörpern gegen Reagin-Ig mit radioaktiven Isotopen kann in üblicher Weise vorgenommen werden, wobei ein für diesen Zweck geeignetes Isotop z. B. auf 125J besteht (Methode nach Hunter und Greenwood), Auch die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z.B. mit einem Flucreszeinderivat wie Fluoreszeinisothiocyanat.
  • Allergenhaltige Extrakte, z.B. von Hunde- oder Pferdeepithel, Timothygras- oder Birkenpollen, sind im Handel erhältlich.
  • Die Bestimmung der Radioaktivität kann in üblicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise mit Hilfe von Scintillationsdetektoren. Auch die Messung der Fluoreszenz kann nach üblichen Methoden vorgenommen werden Die Menge an Polymeren, an welche Allergere gebunden sind, wird u.a. im Hinblick auf die Empfindlichkeit, die während des Tests erforderlich ist, ausgewählt. Die Menge an Anti körpern gegen das Reagin-Ig, das der Reaktion zugesetzt wird, wird beispielsweise so ausgewählt, daß ein Oberschufo Am Hinblick &uf die Zahl der Haftstellei-i fUr diese Antikörper an c'e-n an die Polymeren gebundenen stanzen vorhanden ist, nachdew die Allergene vollständig mit Reagin-Ig gesättigt wer@@ sind. In drtsprechender Weise wird die Menge an mar-@@@ Bztikörpern und markiertem Reagin-Ig so ausgewählt, das @@ dserschuß mit Bezug auf die maximale Zahl Ger Haftste@@@ @@ den an das Polymer gebundenen Substanzen vorhanden Das Testallergen kann ein einziges Allergen oder ein Gemisch von zwei oder mehr Allergenen sein. Im letzteren Fall bringt das Verfahren den Vorteil mit sich, daß während der Untersuchung ein schneller "ja" oder "nein" auf die Frage möglich it, ob eine Überempfindlichkeit gegenüber einem Allergen oder mehreren Allergenen in einer großen Gruppe von Allergenen existiert. Ist die Antwort "ja", so massen weitere Bestimmungen durchgeführt werden, um festzustellen, gegen welche Allergene die Überempfindlichkeit des Patienten in der großen Gruppe gerichtet ist.
  • Die Hilfsmittel können auch zur quantitativen Bestimmung von Reagin-Ig angewandt werden. Zu diesem Zweck wird eine serienmäßige Verdünnung des Testserums analysiert; das Ergebnis ergibt sich nach einem Vergleich mit der Wirkung einer Standardlösung, die in analoger Weise analysiert wird.
  • Das unlösliche Polymer hat vorzugsweise Teilchenform.
  • Die Hilfsmittel können in einer Testpackung enthalten sein, die zur Untersuchung von Proben, die allergischen Patienten entnommen worden sind, dient.
  • Die Hilfsmittel können aus einer Ampulle oder dergleichen, die die Antikörper gegen das Reagin-Ig, vorzugsweise in getrockneter, z.B. lyophilisierter Form enthält, und einer Ampulle, die markiertes Reagin-Ig> vorzugsweise in getrockneter, z.B. lyophilisierter Form enthält, bestehen.
  • Die Methode zur Bestimmung von Reagin-Ig wird im nachstehenden durch ein Beispiel erläutert, das eingehender erklärt, wie markiertes Reagin-Ig hergestellt und wie es zur Bestimmung von Reagin-Ig verwendet werden kann.
  • Beispiel Bestimmung von Reagin-Ig, welches gegen ein Tierallergen (Hundeepithel) gerichtet ist A. Herstellung von Teilchen mit chemisch gebundenem Allergen Feine Teilchen eines Mischpolymeren von Dextran und Epichlorhydrin wurden als Ausgangsmaterial verwendet; das Dextran war mit Glycerin-Ätherbrücken vernetzt (Sephadex, Teilchengröße 1 - 10 Mikron). Dieses Mischpolymerisat ist in Wasser unlöslich, aber quellbar; die Substanz absorbiert etwa 2,5 g Wasser pro gramm trockener Substanz. Das Ausgangsmaterial wurde zunächst mit Cyanogenbromid in alkalischer Lösung aktiviert, worauf die Teilchen des aktivierten Mischpolymerisats gewaschen wurden. Ein handelsüblicher Allergenextrakt von Hundeepithel wurde zu der wäßrigen Suspension der Teilchen gegeben, so daß der Extrakt 0,2 mg pro ml im Verhältnis von 1 ml Allergenextrakt auf 100 mg aktiviertes Polymer enthält. Das Allergen wurde dann chemisch an das aktivierte Mischpolymerisat gebunden. Im Anschluß an die Umsetzung wurden die Mischpolymerteilchen mit dem daran gebundenen Allergen abzentrifugiert und zweimal mit 0,5 m NaHC03, 0>1 m Acetatpuffer und 0,1 m Trispuffer mit 1% Rinderserumalbumin gewaschen. Die Teilchen wurden homogenisiert und in 0,1 m Trispuffer mit 1 % Rinderserumalbumin suspendiert.
  • B. Herstellung von Reagin-Ig Reagin-Ig wurde aus dem Serum gewonnen, welches einem Myeloma-Patienten entnommen worden war, deren Blut einen hohen Gehalt an Reagin-Ig aufwies. Reagin-Ig wurde aus dem Serum durch Salzfällung, Gelfiltration und Ionenaustauscher-Chromatographie isoliert.
  • Proben von aufgetautem oder frisch gesammeltem Plasma eines Patienten mit Myelomatosis wurde mit 0,15 m Natriumchlorid verdünnt, so daß sich ein Gehalt von etwa 15 mg/ml mit Bezug auf die M-Komponente (Reagin-Ig) ergab. Die Fällung mit wasserfreiem Natriumsulfat (18 g/100 ml) wurde bei 250 C durchgeführt. Nach einer Stunde wurde der Niederschlag abzentrifugiert (10.000 x g, 20 Minuten, 250C). Das Sediment wurde abgetrennt und mit einer Natriumsulfatlösung (18 g/ 100 ml) gewaschen und in 0,8 Volumenteilen einer 0,1 m Natriumphosphatpufferlösung mit pH = 7,5 gelöst. Das Material wurde noch einmal wie beschrieben ausgefällt. Im Anschluß an die letzte Fällung wurde das Sediment in 0,1 m Tris-HCl-Puffer mit pH = 8,0 (200C) gelöst, auf eine Kolonne mit einer Größe von 3, 2 x 30 cm aus einem mit Glycerin-Äthejrbrücken quervernetzten Dextran, das mit Diäthylaminoäthylgruppen substituiert ist, aufgebracht und mit dem gleichen Puffer insGleichgewicht gebracht. Das Eluieren des Materials wurde mit Tris-HCl, dessen Stärke allmählich von 0>1 bis Im zuhahm, bei konstantem pH-Wert von 8,0 bei 200C dur chgefüht. Die Fraktionen, die das Reagin-Ig enthielten, wurden aufgefangen, eingeengt und auf eine Kolonne (3,2 x 95 cm) aus einem mit Glycerin-Xtherbrücken quervernetzten Dextran mit einem Perldurchmesser von 40 - 120 µ und einer Wasseraufnahme von etwa 15 ml Wasser pro Gramm trockner Substanz aufgebracht, die mit 0,1 m Tris-HCl - 0,2 m NaCl -0,002 m EDTANa2 - pH = 7>7 - ins Gleichgewicht gebracht worden war und 0,02 S Natriumazid enthielt. Man ließ das Material die Kolonne dreimal passieren (Kreislaufchromatographie).
  • Fraktionen, die das Reagin-Ig enthielten, wurden aufgefangen und durch Ultrafiltratinn bei 40C konzentriert.
  • Das auf diese Weise hergestellte Reagin-Ig war mit weniger als 0>1 % an Gesamptprotein von anderen Immunoglobulinen (IgA, IgD, IgG und IgM) verunreinigt. Das gereinigte Reagin-Ig ergab bei der Elektrophorese bei pH = 8,6 einen einzelnen Peak, 1 = 0,05, welcher im ß-@-Bereich wanderte. Untersuchungen bei der Ultrazentrifugierung zeigten das Vorliegen einer einzigen Grenzschicht; die Sedimentationskonstante, S20O,w, wurde mit 8,20S berechnet. Das Molekulargewicht des Reagin-Ig wurde mit 200.000~ 5.000 berechnet, wobei man ein partielles spezifisches Volumen von 0,173 cm3/g benutzte, das auf der Basis der Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzung des Reagin-Ig bestimmt worden war. Die Dirfusionskonstante, D20O,W, wurde mit 3,71 x 10-7 cm-2/Sek. berechnet.
  • Reduktionsversuche zeigten, daß das Reagin aus zwei Arten von Polypeptidketten besteht, so daß es anderen Serumimmunoglobulinen entspricht. Die Anwesenheit von zwei echten Polypeptidketten mit einem Molekulargewicht von 22.600 konnte in dem Reagin-Ig nachgewiesen werden. Das Molekulargewicht der schweren Polypeptidketten, einschließlich der prosthetischen Kohlehydratgruppe (n) wurde mit etwa 77.400 bere chnet, wobei ein Molverhältnis von 1:1 für die schweren und leichten Polypeptidketten in dem nativen Reagin-Ig angenommen wurde.
  • Die Aminosäure- und Kohlehydratzusammensetzug wird in Tabelle I gezeigt.
  • Tabelle 1 Aminosäure- und Kohlethydratzusammensetzung von Reggin-Ig Aminosäure Aminosäurerest, @ g pro 100 g Protein Tryptophan 3,67 Lysin 4,20 Histidin 2,16 1,34 Arginin 5,63 Asparaginsäure 6,73 Threonin 9,01 Serin 8,52 Glutaminsäure 8,93 Aminosäure Aminosäure rest @ g pro 100 g Protein Prolin 5,24 Glycin 3,13 Alanin 3, 92 Cystein 2,15 Valin 5,59 Methionin 1,17 Isoleucin 2,29 Leucin 6,08 Tyrosin 4,63 Phenylalanin 3. 91 88,29 Kohlehydrat Kohlehydratest, g g pro 100 g Protein N-Acetyl-glucosamin 4,60 Hexose (Galaktose + Mannose) 5,34 L-Fucose 0,51 N-Acetyl-neuraminsäure 1 26 11,71 C. Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-Ig Kaninchen wurde intrasmuskulär eine Mischung aus 0,5 mg Reagin-Ig in 0,2 ml einer 0,15 m Natriumchloridlösung und 0,8 ml vollständiger Freund'scher Zusatzlösung injiziert. Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und dann jede Woche drei Wochen lang wiederholt. Nachdem weitere 10 Tage vergangen waren, wurde den Kaninchen Blut entnommen, aus welchem das Antiserum durch Koagulieren und Entfernen des Koagulats gewonnen wurde.
  • Das Antiserum wurde durch Adsorption während einer Stunde bei +37 0C und 16 Stunden bei +4 0C spezifisch gemacht. Nach dem Abzentrifugieren wurde die Spezifität des Antiserums durch Tmmunoelektrophorese gegen normales Menschenserum und durch Ochterlony-Geldiffusionsanalyse gegen reines Immunoglobulin A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteinen, getested; dabei monate die Spezifität gegen Reagin-Ig festgestellt werden.
  • Das Antiserum wurde als Antikörpermaterial für das Bestimmungsverfahren verwendet.
  • D. Herstellung von mit Jod-125 markiertem Reagin-Ig Reagin-Ig wurde mit 125J nach dem von Hunter und Greenwood in Nature, 194 (1962), Seite 495, beschriebenen Methode markiert.
  • Das Markieren kann auch nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren vorgenommen werden.
  • "Radioaktives Jod (125J)" Es wurde Jod-125, trEgerfrei, das als NaJ in 0,1 m NaO}i gelöst und frei von Reduktionsmitteln war, verwendet.
  • Jodmonochlorid Jodmonochlorid wurde nach dem von J.L. % Izzo, W.F. Bale, M.J.
  • Izzo und A. Roncone in'J. Biol. Chen., 239, Nr. 11, S. 3743 (1964) beschriebenen Verfahren hergestellt, und der Jodgehalt durch Reduktion des gesamten Jods zu Jodid mit Arsenoxid und anschließender Titration mit 0,1 m AgNO3 bestimmt. Die JCl-Stammlösung enthielt 2,54 mg J/ml in 0,02 m KC1, 2,0 m NaCl und 1,0 m HCl, und ist bei Raumtemperatur mindestens 18 Monate beständig. Vor der Verwendung wurde die JCl-Stammlösung auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde eine HCl-NaCl-Lösung hergestellt, deren Konzentration für jeden Versuch individuell eingestellt wurde, um verläßliche Werte Fieber den Mindestkonzentrationen an HC1 und NaCl zu erhalten, bei denen JC1 als beständig bekannt ist. (R. W. Helkamp, M.A. Conteras und W.F. Bals "Int. J.
  • Appl. Radiat. Isotopes, Bd. 18, S. 737 (1967) ).
  • Markierungsverfahren Die Jodierung beruht auf Helkamp's Modifizierung von McBairlane's Jodmonochlorid-Verfahren (A.S. McFairlane, Nature, Bd. 182 (1958), S. 53) mit weiteren Modfikationen (J. L. IIzzo, W.F. Bale, M. J. Izzo und A.Roncone, J. Biol.Chem., Bd. 239, Nr. 11 (1964), S. 3743, W.F.Bale, R.W. Helmkamp, T.P. Davis, M.J. Izzo, R. L. Gooland, Mä.A.Contreras und I.L. Spar, Proc. Soc. Exp. Med., Bd. 122 (1966), S. 407 und R.W. Helmkamp, M.A. Contreras und W.F. Bale, Int. J. appln. Radiat.Isotopes, Bd. 18 (1967), S. 737). Reagin-Ig (100 µg) wurde markiert "in einem Mol-Verhältnis von JCl zu Reagin-Ig von 2:1 und von JCl zu 125J von 1:1. Die folgenden Lösungen wurden verwendet: Lösung 1: Reagin-Ig wurde in 0,2 m Tris-HCl-Puffer mit pH = 8 in einer Konzentration von 11,17 mg/ml gelöst. Dieses Präparat enthielt (3 % Aggregate von Reagin-Ig und <0,5 % IgG.
  • Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die JCl-Vorratslösung wurde durch Lösen von 2,92 g NaCl in 12,5 ml 2,0 m HCl und 87,5 ml destilliertem Wasser hergestellt.
  • Lösung III: Die Jodmonochloridendlö.snng wurde durch Verddünnen von 100 µ1 der JCl-Stammlösung mit 53,55 ml der Lösung II hergestellt.
  • Lösung IV: 17,9 µ1 des Radiojodids (3,0 mCi) wurden zu 45 µ1 der Lösung III gegeben und vor der Verwendung in einem Eisbad aufbewahrt. Alle Lösungen wurden kühl gehalten, und die Jodierung bei Gefriertemperatur durchgeführt. Die Reagenzien wurden in der nachstehenden Reihenfolge in ein kleines Glasrohr ig gefüllt: Zu 200 µ1 Borat-Carbonat-Puffer (0,4m,pH= 9,1) und 8,95 µ1 der Lösung I (100 µg Reagin-Ig), wurden 50 µ1 der Lösung IV gegeben und sofort heftig gemischt. Nach 60 Sekunden wurden 20 µ1 0,1 m Na2S2O3, 50 µ1 2%iges KJ und 200 µ1 5%iges Human-Serum-Alb uminb lau (HSA-Blau) gegeben.
  • HSA-Blau wurde nach dem Verfahren von Melani (F. Melani, K.M. Bartelt, R. Conrads, E.F. Pfeiffer, Z.klin.Chem., 4. Jahrg., 1966, Heft 4) hergestellt. Letzteres wird zur Verminderung von Strahlenschäden und Adsorption von Reagin-Ig an den Glaswänden zugesetzt. Die 125J-jodierten Reagin-Ig-Präparate können durch Verwendung von Gelchromatographie oder Ionenaustauscher gereinigt werden. Fraktionen aus der Kolonne wurden bei etwa +40C in 0,1 m tris-HCl-Puffer (pH = 7,72) mit einem Gehalt von 5 % Human-Serumalbumin gewonnen. Fraktionen, die markiertes Reagin-Ig enthielten, wurden gesammelt und in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
  • Nach diesem Verfahren erhielt man eine 83,0 ziege Bindung des gesamten Jod an Reagin-Ig. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom 125J und etwa 1 Atom 127J pro Molekül (MW 200.000) und hatte eine spezifische Aktivität von etwa 12 m Ci/mg.
  • E. Bestimmungsverfahren Die Analysen wurden in Glas- oder Plastikreagenzgläsern mit einer Größe von 50 x 10 mm durchgeführt.
  • 1. 0,5 ml einer Suspension aus Teilchen mit chemisch gebundenem Allergen, die gemäß A (vgl. weiter vorn) erhalten worden waren, wurden in jeweils zwei Reagenzgläser gefüllt. Die Suspension enthielt 1 mg der Partikel pro ml.
  • 2. 0,05 ml des zu untersuchenden Serums eines Patienten wurde in eines der beiden Reagenzgläser gegeben.
  • 3. 0,05 ml Kontrollserum aus einer nichtallergischen Quelle wurde in das zweite Reagenzglas eingefüllt.
  • 4. Der Inhalt dieser Reagenzgläser wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Reagenzgläser langsam in senkrechter Ebene rotiert wurden.
  • 5. Die Teilchen wurden dann bei 3 000 U/Min. eine Minute lang abzentrifugiert, worauf die überschüssige Flüssigkeit entf&nb wurde.
  • 6. Die Teilchen wurden dreimal mit 0,1 m Trispuffer (pH 7,4), welcher 1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthielt, gewaschen, worauf die Suspension zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit nach jedem Waschvorgang abgesaugt wurde. Bei dem Absaugen wurde jeweils sichergestellt, daß feste Teilchen nicht mitgerissen wurden.
  • 7* 0,1 Mol des Antiserums, das gemäß C (vgl. weiter vorn) erhalten worden war, wurde in jedes Reagenzglas gegeben.
  • 8. Der Inhalt der Reagenzgläser wurde wie bei Stufe 4 inkubiert.
  • 9. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 5 abzentrifugiert.
  • 10. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 6 gewaschen.
  • 11. 0,1 ml einer Lösung, welche 5J-Reagine gemäß D (vgl. weiter vorn) enthielt, wurde in die Reagenzgläser gegeben.
  • 12. Der Inhalt der Reagenzgläser wurde wie bei Stufe 4 inkubiert.
  • 13. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 5 abzentrifugiert.
  • 14. Die Teilchen wurden wie bei Stufe 6 gewaschen.
  • 15. Die Reagenzgläser wurden vor einen Scintillationsdetektor gesetzt, damit die Gamma-Strahlung gemessen werden konnte.
  • Zur Auswertung wurde die Intensität der Strahlung des einen Reagenzglases mit der Intensität der Strahlung des anderen Reagenzglases, welches das Kontrollserum von nichtallergischel Patienten enthielt, verglichen.
  • Es ist auch möglich, im Anschluß an das Zentrifugieren gemäß Stufe 13 (vgl. weiter vorn) eine bestimmte Volumenmenge der überstehenden Flüssigkeit in Zählröhrchen zu überführen, worauf die Gamma-Strahlung des 125J-Reagins frei in der Lösung bestimmt werden kann.
  • Zur quantitativen Bestimmung können 0,05 ml Testserum in verschiedenen Stadien der Verdünnung n Stufe 2 (vgl. weiter vorn) jedem einer Reihe von Reagenzgläsern zugesetzt werden. Eine Reihe von Reagenzgläsgn wurde in derselben Weise mit unterschiedlichen Verdünnungen eines Standardserums versetzt. Der Aktivität kann dann im Vergleich zu der des Standardserums ausgedrückt werden.

Claims (4)

  1. P a t e n t a n s p r U c h e: 1. Reagin-Ig5 verwendbar bei Radio-Immunountersuchungsmethoden zur Bestimmung von Reagin-Ig> gekennzeichnet durch eine Markierung, die sie zur Aussendung einer Strahlung befähigt.
  2. 2. Reagin-Ig nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem radioaktiven Isotop markiert ist.
  3. 3. Reagin-Ig nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das radioaktive Isotop ein Jodisotop ist.
  4. 4. Reagin-Ig nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist.
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