DE1767899A1 - Verfahren zur Isolierung von Antigenen und Antikoerpern - Google Patents

Description

Dr. Barbara Polheim_t Graz Verfahren zur Isolierung von Antigenen und Antikörpern

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Antigenen und Antikörpern aus diese enthaltenden Proteingemischen durch Adsorption an wasserunlöslichen, biologisch aktiven, aus Antikörpern bzw. Antigene enthaltenden Lösungen oder Seren erzeugten Proteinpolymerisaten und Elution des Adsorbats.

Es ist bereits bekannt, Antigene in unlöslicher Form für die Isolierung von Antikörpern zu verwenden. So werden nach der USA-Patentschrift Nr. 3 096 250 und er österreichischen Patentschrift Nr. 241 027 Antigene an formalinisierte Erythrozyten gekuppelt, indem man solche Erythrozyten, die Zellen und damit feste Körper sind, in verdünntem Serum suspendiert' · Die bei dieser bekannten Arbeite- · weise erhaltenen, mit Antigen überzogenen Erythrozyten können dann zur Isolierung von Antikörpern verwendet werden.

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Ferner ist es bekannt, das Antigenprotein durch Kuppeln an Cellulosederivate, z.B. diazotierte Aminocellulose, oder synthetische Polymere, z.B. diazotiertes Polyaminostyrol, unlöslich zu machen. Durch Einführung von Sulfydryl· gruppen in das Protein und anschließende Vernetzung können gleichfalls unlösliche Antigenderivate erhalten werden. An diese als Immunoadsorbentien bezeichneten unlöslichen Derivate des Antigenproteina lassen sich Antikörper spezifisch adsorbieren und anschließend aus dem Adsorbat bei stark sauren pH-Werten eluieren. Die Her- W stellung dieser bekannten Immunoadsprbentien 1st umständlich und zeitraubend und die Spaltung des Adsorbats bei r hr niedrigen pH-Werten führt zu einer teilweisen Denaturierung des Antikörperproteins.

Unlösliche Derivate von Antigenen und Antikörpern werden ferner durch Zusatz von Chlorameisensäureäthylester zu wässrigen Lösungen von Antigenen oder Antikörpern erhalten. Wegen der Wasserunlöslichkeit des Chlorameisensäureäthylesters verläuft die Reaktion in einem heterogenen System. Sie führt zu Proteinpolymerisaten, die sich als gut wirksame spezifische Immunoadsorbentien erwiesen ^ haben und leichter zugänglich sind als die bisher angewandten eingangs erwähnten unlöslich gemachte» Proteine oder Proteinderivate. Vor der Verwendung dieser biologisch aktiven wasserunlöslichen Proteinpolymeriaate als Immunoadsorbentien zur Isolierung von Antigenen und Antikörpern wird das Polymerisat gründlich gewaschen, bis die optische Dichte der Filtrate bei 280 ™_u 0 beträgt und sowohl die WaschflUssigkeiten als auch das Polymerioat einen pH-Wert von etwa 7 aufweisen. Anschließend wird das so vorbehandelte Polymerisat mit der Proteinlösung oder dem Serum vermischt, das das zu isolierende Antigen bzw. den zu isolierenden Antikörper enthält. Dabei bildet sich ein Adaorbat aus dem Antikörper bzw.

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Antigen enthaltenden Immunoadsorbens und dem zu isolierenden Antigen bsw. Antikörper. Dieses Adsorbat, in dem ein Antigen-Antikörper-Komplex vorliegt, der dem bei der bekannten Antigen-Antikörper-Reaktion gebildeten vergleichbar ist, kann dann zur Gewinnung des adsorbierten Antigens bzw. Antikörpers mit 0,2 m Glycinhydrochlorid oder 5,5 m Kaliumjodid in 0,05 m Tris-Puffer eluiert werden. Diese Arbeitsweise ist im einzelnen in The Journal of Biological Chemistry, Band 242, Seite 1651 bis 1659 (1967) beschrieben.

Dieses bekannte Verfahren hat zwar zu guten Ergebnissen bei der Isolierung von Antigenen und Antikörpern aus Mischunden mit anderen Proteinen geführt, hat aber den Nachteil, daß zur Ausbildung des Immunoadsorbens der erstickend riechende, giftige und wasserempfindliche Chlorameisensäureäthylest*-"' verwendet und in einem heterogenen System gearbeitet werden muß. Auch die bei dem bekannten Verfahren angewandte Elution mit Glycinhydrochlorid oder Kaliumiodid ist noch nicht befriedigend. da sie verhältnismäßig zeitraubend ist und große Mengen α«ο llutionsmittels erfordert, wodurch unerwünscht stark verdünnte Proteinlösungen erhalten werden.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß feste wasserunlösliche Immunoadajrbentien durch Polymerisation von Antigen- oder Antikörperprotein in dieses enthaltenden Lösungen oder kompletten Seren in homogenem wässrigem Medium erhalten werden können, wenn man als Polymerisationsmittel Pormaldeyhd verwendet. Ferner wurde gefunden, daß wässrige Propionsäure d.n allgemein anwendbares Mittel zum Ablösen des zu isolierenden Antikörpers bzw. Antigens von einem Immunoadsorbens darstellt, das bezüglich seiner

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Elutionswirksamkeit den bisher angewandten Elutionsmittel überlegen iat.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Antigenen und Antikörpern aus diese enthaltende Proteingemischen durch Adsorption an wasserunlöslichen, biologisch aktiven, aus Antikörpern bezw. Antigene enthaltenden Lösungen oder Seren erzeugten Proteinpolymerisaten und Elution des Adsorbats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man durch Fällung von Formaldehyd, vorzugsweise mit etwa.30 bis 40 #-igem Formaldehyd, in wässrigem Medium aus diesen Lösungen oder Seren erzeugte biologisch aktive Proteinpolymerisate zur Adsorption verwendet. Zur Elution verwendet man vorzugsweise Propionsäure und insbesondere etwa 0,1 mm wässrige Propionsäure. Obgleich man schwache Säuren zur Elution bereits verwendet hat, wurde Jedoch bisher niemals mit Propionsäure gearbeitet, uns es wurde überraschenderweise gefunden, daß

gerade mit Propionsäure beste Ergebnisse erhalten werden können.

Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Bindung des zu isolierenden Antigens bzw. Antikörpers an das biologisch aktive Proteinpolymerisat die gleichen Maßnahmen angewandt, die in der oben erwähnten Literaturstelle bschrieben worden sind. Auch die Aufarbeitung der bei der Elution des Adsorbats, d.h. des mit dem Antigen bzw. Antikörper beladenen Immunoadsorbens, erhaltenen Lösungen erfolgt in an sich bekannter Weise.

Es sei darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemfiße Maßnahme, nämlioh die Verwendung von durch Fällung

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mit vorzugsweise 30 bis 40 $-igem Formaldehyd in wässrigem Medium erzeugten, biologisch aktiven Proteinpolymerisaten zur Adsorption von Antigenen oder Antikörpern, von den Maßnahmen unabhängig ist, die zur EIution der Adsrobate angwandt werden. So werden bei der Elution der erfindungsgemäß mit Formaldehyd erhaltenen und zur Adsorption von Antigenen oder Antikörpern verwendeten biologisch aktiven Proteinpolymerisate mit bekannten Elutionsmitteln, beispielsweise Glycinhydrochlorid, bereits beträchtliche "Vorteile gegenüber den bekannten Verfahren erzielt, die weiter unten näher er- ^j läutert werden. Beste Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn man etwa 0,1 m wässrige Propionsäure zur Elution verwendet.

Die Nacharbeitung der aus The Journal of Biological Chemistry, Band 242, Seite 1651 bis 1659 (1967) bekannten Verfahrens hat gezeigt, daß die Reinigung des biologisch aktiven Proteinpolymerisats sehr umständlich und zeitraubend ist, weil große Mengen Waschflüssigkeiten, insbesondere Pufferlösungen, verwendet werden müssen, und die beim Waschen gebildeten Aufschlämmungen schlechte Filtrierbarkeitseigenschaften aufweisen. Im Gegensatz dazu erfordern die erfindungsgemäß durch Fällung mit Formalde- " hyd hergestellten biologisch aktiven Proteinpolymerisate zu ihrer Reinigung vergleichsweise geringe Mengen Waschflüssigkeiten, die einfach durch Zentrifugieren von dem Polymerisat abgetrennt werden können, wodurch der Arbeitsund Zeitaufwand beträchtlich verringert wird.

Wie bereits erwähnt, sind bei der bekannten Elution mit Glycinhydrochlorid oder Kaliumiodid große Mengen an EIutionsmittel erforderlich. Die schließlich erhaltenen Lösungen des zu isolierenden.Antigene bezwi Antikörpers wei sen daher einen unerwünscht hohen Verdünnungsgrad auf,

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wodurch die weitere Aufarbeitung wegen der zu hantierenden großen Volumina erschwert wird und außerdem Denaturierungen unvermeidlich sind, überraschenderweise sind zu einer vollständigen Elution des zu isolierenden Antigens oder Antikörpers aus dem Adsorbat verhältnismäßig geringe Mengen Elutionsmittel erforderlich, wenn wässrige Propionsäure, vorzugsweise etwa 0,1 m mässrige Propionsäure, verwendet wird. Damit entfällt nicht nur das unangenehme Hantieren mit großen Volumina bei der Aufarbeitung, sondern es besteht auch wegen der höheren Konzentration der erhaltenen Lösungen eine geringere Gefahr, daß Denaturierungen eintreten.

E-H weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu erblicken, daß die Lösungen, aus denen das biologisch aktive¹ Proteinpolymerisat mit Formaldehyd ausgefällt wird, eine beträchtlich geringere Eiweißkonzentration aufweisen können als die Lösungen, in denen das Polymerisat mit Chlorameisensäureäthylester erzeugt wird. Während bei dem bekannten Verfahren im Fall der Herstellung des Proteinpolymerisats aus einem kompletten Serum das Serum zunächst gefriergetrocknet und anschließend in einem geringen Volumen einer geeigneten Pufferlösung wieder gelöst werden muß, kann die erfindungsgemäße Fällung mit Formaldehyd direkt auf ein komplettes Serum angewandt werden, das lediglich durch Ultrafiltration, die bekanntlich wenig Zeit beansprucht, auf etwa die Hälfte seines ursprünglichen Volumens eingeengt wurde. Dies ist von besonderer Bedeutung für Seren, die bo empfindliche Antigene bzw. Antikörper enthalten, daß sie der Gefriertrocknung nicht unterworfen werden können.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

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Beispiel 1

1 ml einer 20 #-igen Lösung von Humanserumalbumin in 0,9 #-iger Kochsalzlösung wird tropfenweise unter leich- ' tem Umrühren mit T ml einer 35 #-igen wässrigen Formaldehydlösung versetzt. Dadurch sinkt der pH-Wert auf 4,2. Während der Zugabe der Formaldehydlösung wird der pH-Wert, falls nötig, mif 0,1 η HOl bzw. 0,1 n· NaOH im Bereich von 4»0 bis 4,5 gehalten. Es tritt eine Trübung auf, die nach beendeter Zugabe der Formaldehydlösung in eine gelatinöse Masse übergeht, wobei sich schließ- ^j lieh unter leichtem Rühren Klumpen des Proteinpolymeri-

sats bilden.

Das erhaltene Polymerisat wird etwa 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen und anschließend zerkleinert. Zur Zerkleinerung eignet sich jeder Rührer, dessen Wirkung einem der bekannten mechanischen Hochfrequenzgeräte zum Dispergieren, Homogenisieren, Lösen und Emulgieren entspricht. Ein Beispiel für ein derartiges mechaii-.öches Hochfrequenzgerät ist der sogenannte Ultraturax(Römpp, Chemielexikon, 1958, Spalte 4586). Selbstverständlich können auch andere Geräte dieser Art, z.B. ein Homo- -

genisator nach Frof. P* Willens zur Zerkleinerung ange- ™ wandt werden. Zum Waschen des zerkleinerten Proteinpolymerisats verwendet man folgende Lösungen:

1. 2a KaOl, 0,02 s KH₄Cl, mit KH₄OH auf pH 9 eingestellt

2. 0,2 ir Kaliumphosphatpuffer und 0,9 jC-lge NaCl-Lösung, pH 7

3. 0,9 *-ige KaCl-LUsung

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Mit jeder der vorstehend genannten Lösungen wird dreimal gewaschen. Das Waschen wird in Zentrifugengläsern mit einem Fassungsvermögen von 50 ml durchgeführt und die verbrauchte Waschflüssigkeit wird nach dem Zentrifugieren (5000 Umdrehungen pro Minute) einfach abgegossen. Wie bei dem. bekannten Verfahren wird das Waschen und Zentrifugieren so lange fortgesetzt, bis die überstehende Lösung keine Proteinextinktion mehr aufweist, d.h. bei 280 mu eine Extinktion von 0 zeigt.

Das gereinigte Proteinpolymerisat wird in einem Erlenmeyerkolben mit 150 ml Pferdeantiserum gegen Humanserumalbumin versetzt. 1 ml dieses Antieerums entspricht 0,13 ml einer 0,1 #-igen Albuminlösung. Die Mischung wird etwa 2 Stunden bei Zimmertemperatur und 12 Stunden bei 4⁰O mit einem Magnetrührer gerührt. Danach enthält die überstehende Lösung kein fällbares Antikörperprotein mehr.

Der so gebildete Proteinkomplex wird vom überstehenden Rest-Serum durch Zentrifugieren (5000 Umdrehungen pro Minute) abgetrennt. Der Niederschlag wird, wiederum in Zentrifugengläsern von etwa 50 ml Passungsvermögen, dreimal mit 0,9 #-iger Kochsalzlösung gewaschen, wobei jeweils zentifugiert und die überstehende Lösung abdekantiert wird. In den meisten Fällen ist die Extinktion der überstehenden Lösung bei 280 mu bereite nach dreimaligem Waschen gleich 0.

D_er wie vorstehend beschrieben gewaschene Niederschlag wird mit 0,1 m Propionsäure versetzt, bis der pH-Wert auf 4 abgefallen ist, worauf man 20 Minuten bei Zimmertemperatur rührt und abzentrifugiert. Der Niederschlag

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wird noch zweimal im gleichen Volumen 0,1 m Propionsäure aufgenommen. Insgesamt werden 12,5 ml 0,1 m Propionsäure verwendet. Der Proteingehalt der vereinigten Propionsäurelösungen wird durch Messung der Extinktion bei 280 mu bestimmt. Dann wird die Lösung bei 4°C gegen 0,9 #-ige Kochsalzlösung dialysiert, wodurch die* Propionsäure aus der Antikörperlösung entfernt wird.

Die erhaltene Lösung enthält 62 mg Antikörper. Das Produkt ergibt einen positiven Präzipitintest (Präzi-

pitin- oder Ringtest nach Kabat und Mayer, Experimental ™ Immunochemistry, CH. C. Thomas, Springfield, 111., 1961). Bei der Immunoelektrophorese erhält man eine deutliche. Präzipitationslinie des Albumins.

Nach der Desorption des Antikörpers von dem Antigenproteinpolymerisat wird das Polymerisat noch einmal mit 0,1 m Propionsäure, zweimal mit dem oben beschriebenen Kaliumphosphatpuffer und zweimal mit 0,9 $~iger Kochsalzlösung gewaschen, worauf es erneut zur Adsorption der Antikörper aus Pferdeantiserum gegen Humanserumalbumin verwendet werden kann.

Beispiel. 2

Eine Lösung von 300 g Humanserumalbumin und 25 mg Laktatdehydrogenase (Schweinemuskel) in 5 ml 0,9 $-iger Kochsalzlösung wird wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 1,5 ml einer 35 #-igen wässrigen Formaldehydlösung versetzt. Dor pH-Wert sinkt auf 4,5·

Das erhaltene Oopolymerieat wird wie in Beispiel 1 beschrieben zerkleinert und gewaschen·

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Das gereinigte Copolymerisat wird wie in Beispiel 1 angegeben mit 12,5 ml Kaninchenantiserum gegen Schweinemuskellaktatdehydrogenase vermischt. Die Reinigung und Elution des gebildeten Proteinkomplexes sowie die Aufarbeitung der Eluate erfolgt nach den in Beispiel 1 angegebenen Arbeitsweisen. Bei der Elution werden 5,5 ml 0,1 m Propionsäure verbraucht.

Die schließlich erhaltene Antikörperlösung enthält 1,8 mg Antikörper. Das Produkt ergibt einen positiven Präzipitintest und ein positives Ergebnis bei der serologischen Prüfung naoh Ouchterlony (Ouchterlony-Test vergleiche Int. Arch. Allergy, Band 51 1954, Seite 337 txs 366).

Beispiel 3

Wie im vorhergenenden Beispiel 2 wird die in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Arbeitsweise angewandt.

Man geht von 10 ml komplettem Human-ß-Lipoproteid-Serum aus, die durch Ultrafiltration auf 3 ml eingeengt werden. Zur Fällung verwendet man 3 ml 35 #-iger wässriger Formaldehydlösung. Nach vollständiger Zugabe der Formaldehydlösung liegt der pH-Wert bei 4,2.

Das gereinigte Proteinpolymerisat wird mit 10 ml Pferdeantiserum gegen Human-ß-Lipoproteid (1,8 mg Antikörper/ ml) vermischt.

Für die Elution des gewaschenen Proteinkomplexes werden 15 ml 0,1 m Propionsäure vorbraucht.

Die schließlich erhaltene Lösung enthält 9 mg Antikörper. Das -produkt ergibt einen positiven Präzipltin-

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test und bei der Imraunoelektrophorese erhält man eine deutliche Präzipitationslinie des ß-Lipoproteids.

Beispiel 4

Es wird die in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Arbeitsweise angewandt.

Man geht von . .10 ml komplettem Schwelne-ß-Lipoproteid-Serum aus, die durch Ultrafiltration auf 3 ml eingeengt % werden. Zur Fällung verwendet man 3 ml 35 #-iger wässriger Pormaldehydlöeung. Nach vollständiger Zugabe der Formaldehydlösung liegt der pH-Wert bei 4,2.

Das gereinigte Proteinpolymerisat wird mit 10 ml Pferdeantiserum gegen Schweine-ß-Lipoproteid (1,2 mg Antikörper/ ml) vermischt.

Für die Elution des gewaschenen Proteinkomplexe^ werden 1p ml 0,1 m Propionsäure verbraucht.

Die schließlich erhaltene Lösung enthält 7 ml Anti- |

körper. Das Produkt ergibt einen positiven Präzipitintest und bei der Immunoelektrophorese erhält man eine deutliche Präzipitationslinie des ß-Lipoproteids*

Beispiel 5

Es wird die in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Arbeieweise angewandt.

Man geht von 1,3 ml einer ca. 16 #-igen Lösung von Humangamma-globulin (200 ng) auf* Zur Fällung verwendet man 1 ml 35 ^-iger wässriger Formaldehydlösung. Nach voll-

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ständiger Zugabe der Formaldehydlösung liegt der pH-Wert bei 5,2.

Das gereinigte Proteinpolymerisat wird mit 12 ml Kaninchenantiserum gegen Human-gämma-globulin vermischt.

Für die Elution des gewaschenen Proteinkomplexes werden 9 ml 0,1 m Propionsäure verbraucht.

Die schließlich erhaltene Lösung enthält 11 mg Antikörper. Das Produkt ergibt einen positiven Präzipitintest und bei der Immunoelektrophorese erhält man eine deutliche Präzipitationelinie des gamma-Globulina.

Beispiel 6 ,■-

Es wird die in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Arbeitsweise angewandt. ,· .

Man geht von 10 ml einer 2 #-igen Lösung von aus dem Antiserum isoliertem gamma-Globuliri aus, die mit 1 ml einer 16 #-igen gamma-Globulinlösung vereetzt werden. Zur Fällung verwendet man 6 ml 35 #-iger wässriger Formaldehydlösung. Nach vollständiger Zugabe der Formaldehydlösung liegt der pH-Wert bei 5,1·

Das gereinigte Proteincopolymerisat wird mit 5 ml komplettem Humanserum (Albumin) vermischt.

Für die Elution des gewaschenen Proteinkomplexes werden 8 ml 0,1 m Propionsäure verbraucht.

Die schließlich erhaltene Lösung enthält 16 mg Antigen (Albumin). Das ^rodukt ergibt einen positiven Präzipitin-

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test und bei der Papierelektrophorese die der reinen Substanz entsprechende Bande·

Beispiel 7

Es wxkIdie in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Arbeitsweise angewandt.

Man geht von 10 ml komplettem Pferdeantiserum gegen Humanß-Lipoproteid aus, die durch Ultrafiltration auf 4 ml eingeengt werden. Zur Fällung verwendet man 3 ml 35 J^-iger ™ wässriger Formaldehydlösun'g. Nach vollständiger Zugabe der Formaldehydlösung liegt der pH-Wert bei 4,2.

Das gereinigte Proteincopolymerisat wird mit 10 ml Humanserum (ß-Lipoproteid) vermischt.

Für die Elution des gewaschenen Proteinkomplexes werden 6 ml 0,1 m Propionsäure verbraucht.

Die schließlich erhaltene Lösung enthält 12 mg Antigen (Human-ß-Lipoproteid). Das Produkt ergibt einen positiven Präzipitintest und bei der Papierelektrophorese die der i reinen Substanz entsprechende Bande (Färbung mit Sudanschwarz) ·

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-H-Beispiel 8

Es wird die in Beispiel 1 beschriebene allgemeine Arbeitsweise angewandt.

Man geht von 5 ml komplettem Antiserum gegen Schweine-ß-Lipoproteid aus, sättigt mit (NIL)₂SO- und nimmt in 1 ml Wasser auf. Zur Fällung verwendet man 1 ml 35 #-iger wässriger Pormaldehydlösung. Nach vollständiger Zugabe ™ der Pormaldehydlösung liegt der pH-Wert bei 4.

D_as gereinigte Globulinpolymerisat wird mit 5 ml Schweineserum (ß-Lipoproteid) vermischt.

Für die Elution des gewaschenen Proteinkomplexes werden 6 ml 0,1 m Propionsäure verbraucht.

Die schließlich erhaltene Lösung enthält 8 mg Antigen (ß-Lipoproteid). Das Produkt ergibt einen positiven Präzipitintest und bei der Papierelektrophorese die der reinen Substanz entsprechende Bande (Färbung mit Sudan- L· schwarz).

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Claims (2)

1. Patentansprüche

   1 . Verfahren zur Isolierung von Antigenen und Antikörpern aus diese enthaltenden Proteingemischen durch Adsorption an wasserunlöslichen, biologisch aktiven, aus Antikörper bzw. Antigene enthaltenden Lösungen oder Seren erzeugten Proteinpolymerisaten und Elution des Adsorbats, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Fällung mit vorzugsweise 30 biß 40 #~igem Formaldehyd in wässrigem Medium aus diesen Lösungen oder Seren erzeugte biologisch aktive Proteinpolymerisate zur Adsorption verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Elution wässrige, vorzugsweise 0,1 m Propionsäure verwendet.

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